Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протекторное действие активированного протеина C при нейротоксичности и ишемии мозга

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Протекторное действие активированного протеина C при нейротоксичности и ишемии мозга"

На правах рукописи

САВИНКОВА Ирина Григорьевна

ПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ АКТИВИРОВАННОГО ПРОТЕИНА С ПРИ НЕЙРОТОКСИЧНОСТИ И ИШЕМИИ МОЗГА

03.03.01 — физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

Москва-2013

005543193

005543193

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» (заведующий кафедрой - доктор биологических наук, профессор A.A. Каменский).

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

СТРУКОВА Светлана доктор биологических наук, профессор

Михайловна

ПИНЕЛИС Всеволод Григорьевич доктор медицинских наук, профессор

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

СТЕПАНИЧЕВ Михаил Юрьевич

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории функциональной

биохимии нервной системы ФГБУН Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

ШЕВЦОВА Елена Феофановна кандидат химических наук,

заведующая лабораторией биомолекулярного скрининга ФГБУН Институт физиологически активных веществ РАН

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ФГБУ «НИИ общей патологи и патофизиологии» РАМН

Защита состоится 23 декабря 2013 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при Московском государственном университете имени М.ВЛомоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 22 ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Б.А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Ишемический инсульт - острое нарушение мозгового кровообращения, сопровождается гибелью клеток мозга и нарушением его функций вследствие стеноза и/или тромбообразования. По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) инсульт - одно из основных заболеваний, уносящих больше всего человеческих жизней. Так, ежегодно от ишемического и геморрагического инсульта погибает около 6,4 млн человек. Поэтому исследование механизмов развития и регуляции нейродегенеративных процессов при ишемических инсультах и травмах мозга и поиск протекторных агентов, в том числе среди регуляторов гемостаза, является одной из важнейших проблем современной физиологии и фундаментальной медицины.

При ишемии мозга происходит мощный выброс глутамата в межклеточное пространство, приводящий к гиперактивации пре- и постсинаптических глутаматных рецепторов. Массивный вход Са2+ в нервные клетки нарушает внутриклеточный уровень этого вторичного посредника, запускает каскад реакций, которые завершаются быстрой или отсроченной гибелью клеток по механизму апоптоза или некроза (Bano et al, 2007).

В нашей работе для изучения роли ключевых сериновых протеиназ гемостаза -тромбина, свертывающего фибриноген в фибрин - основу тромба, и антикоагулянта -активированного протеина С (АРС), в нейропротекторных и нейродегенеративных процессах в мозге использована модель глутаматной эксайтотоксичности. Кроме того мы исследовали участие другой сериновой протеиназы - энтеропептидазы (ЭП), в регуляции процессов нейрональной гибели. Ранее была показана экспрессия мРНК ЭП в мозге (Yahagi et al, 1996). Однако данные о механизмах протекторного и/или повреждающего действия энтеропептидазы на нейроны отсутствуют.

Ишемическое повреждение мозга сопровождается нарушением целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и увеличением его проницаемости, что приводит к появлению в нервной ткани протеиназ системы свертывания крови, таких как тромбин, фактор Ха (ФХа) и активированный протеин С (АРС).

Активированный протеин С - мультифункционапьный фермент, участвующий в регуляции не только свертывания крови, но также воспаления и апоптоза, проявляя антивоспалительные и цитопротекторньге свойства (Riewald et al., 2002; O'Brien et al., 2006). При ишемии мозга происходит нарушение проницаемости эндотелия сосудов мозга и целостггости ГЭБ, развитие процессов нейровоспаления и гибели нейронов. АРС стабилизирует эндотелиальные клетки сосудов (Riewald, Ruf, 2005), поддерживает целостность ГЭБ и предотвращает вызванное эксайтотоксичностью повреждение нейронов (Guo et al., 2004; Strukova et al.„ 2007; Mosnier et al., 2007; Gorbacheva et al., 2008; Zlokovic et al., 2011). Однако механизмы действия АРС на гиппокампальные нейроны при глутаматной эксайтотоксичности еще не достаточно изучены. Кроме того, актуальным представляется также выяснение особенностей влияния АРС на выживаемость и количественные характеристики нейронов, а также нейроглии в перифокапьной зоне экспериментального инфаркта мозга крыс, вызванного окклюзией средней мозговой артерии.

Одним из ключевых ферментов свертывающей системы крови является тромбин, образующийся в результате ограниченного протеолиза протромбина фактором Ха свертывания крови в участках повреждения ткани, в том числе нервной, при травме, ишемических и геморрагических инсультах, нарушении ГЭБ при воспалении, гипертензии, эпилептическом статусе. Тромбин может индуцировать ретракцию нейритов, пролиферацию глии и модулировать процессы гибели нейронов, в зависимости от концентрации и длительности воздействия (Yamazaki et al., 2008; Nürnberg et al., 2008; Струкова и др., 2005; Henrich-Noack et al., 2005).

Протеиназы системы свертывания крови, взаимодействуя с мембранными рецепторами, активируемыми протеиназами (PARs), отщепляют экзодомен рецептора и передают сигналы клеткам, в том числе нервной системы. В нервной системе изменение экспрессии PARs всех четырех типов наблюдали при травмах, воспалении и ишемии мозга (Ossovskaya et al., 2004; Luo et al., 2007). Поэтому несомненный интерес представляет исследование действия АРС на уровень экспрессии PARs и эндотелиального рецептора протеина С (EPCR), через которые осуществляется передача сигнала.

Недавно обнаружено, что разнонаправленное действие тромбина и АРС может быть обусловлено смещённым агонизмом (biased agonism) при действии протеиназ -тромбина и АРС, на PARI клеток эндотелия (Soh et al., 2011; Mosnier et al., 2011; 2012). При смещённом агонизме вместо канонического расщепления тромбином экзодомена PARI по Arg41Ser идентифицировано APC-специфичное не каноническое расщепление экзодомена PARI по Arg46Asn(R46N). Новый привязанный лиганд PARI - пептид N47, освобождаемый АРС, на культивируемых клетках эндотелия имитировал вызванную АРС сигнализацию, но не сигнализацию, индуцируемую тромбином (Mosnier et al., 2012). Показано, что пептид N47, повторяющий структуру остатка PARI N47-66, стимулирует цитопротекторный путь сигнализации в клетках эндотелия, включающий фосфорилирование Akt и GSK3P, активацию Racl и стабилизацию эндотелиального барьера (Mosiner et al., 2012). Поэтому особый интерес представляет сравнение влияния АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда N47"66 на выживаемость гиппокампальных нейронов в модели глутаматной эксайтотоксичности.

Кроме того известно, что PARI с корецептором EPCR, локализованным в кавеолах, связан с p-аррестинами - мультифункциональными адапторными белками. Воздействие АРС ведет к диссоциации PARI и адапторной молекулы. (3-аррестин необходим для активации малой ГТФазы Racl, что является ключевым механизмом в реализации цитопротекторного эффекта АРС на клетки (Soh et al., 2011). Исследование действия АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда PARI, освобождаемого АРС, на гиппокампальные нейроны мышей нокаутных по 2 изоформе Р-аррестина позволит установить участие адапторного белка p-аррестина в реализации эффектов АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда.

Ишемический инсульт - комплексный патологический процесс, обеспечивающий активацию процессов воспаления и нейродегенерации, в которых принимают участие иммунокомпетентные клетки, в том числе - тучные. У крыс показано повышение числа тучных клеток в мозговой ткани при её повреждении и их участие в формировании ишемического отека мозга на ранних сроках очаговой церебральной ишемии (Strbian et al., 2006, Jin et al., 2007). Сравнительно небольшой концентрации тучных клеток может быть достаточно для изменения проницаемости ГЭБ и нарушения его целостности (Esposito et al., 2001). В связи с этим представляется важным исследование эффектов АРС на гиппокампальные нейроны, ко-культивированные с активированными тучными клетками, что позволит оценить возможность реализации протекторного действия исследуемых препаратов при наличии активированных воспалением тучных клеток в системе.

Таким образом, исследование роли АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда, освобождаемого АРС, а также низких концентраций тромбина и энтеропептидазы в процессах нейропротекции и нейродегенерации представляет интерес как для физиологии, так и для практической медицины и фармакологии.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось выяснение влияния АРС как агониста PARI рецептора и ЭП на клетки мозга при токсическом воздействии глутамата и действия АРС в экспериментальной ишемии мозга крыс.

Для достижения цели в ходе работы решались следующие задачи:

1. Оценить влияние АРС и тромбина на экспрессию рецепторов, активируемых протеиназами (PARs) и эндотелиального рецептора протеина С (EPCR) в культивируемых нейронах гиппокампа крысы и выживаемость клеток при глутаматной эксайтотоксичности.

2 Исследовать влияние АРС на размеры ишемического очага и морфометрические показатели нейронов и нейроглии в перифокапьной зоне фокального инсульта, моделируемого в мозге крысы с помощью окклюзии средней мозговой артерии.

3 Сравнить действие АРС с влиянием пептидов-аналогов привязанного лиганда PARI, освобождаемого АРС, на выживаемость культивируемых гиппокампальных нейронов крысы при глутаматной эксайтотоксичности.

4 Оценить зависимость нейропротекторного действия АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда PARI от р-аррестина 2 в модели глутаматной эксайтотоксичности на гиппокампальных нейронах с использованием линии мышей, нокаутных по гену [5-аррестина 2.

5 Оценить влияние энтеропептидазы на выживаемость культивируемых гиппокампальных нейронов при глутаматной эксайтотоксичности.

6 Проанализировать влияние АРС на нейродегенеративный эффект активированных воспалением тучных клеток, кокультивируемых с гиппокампальными нейронами крысы.

Научная новизна работы

В работе впервые выявлены следующие закономерности:

• АРС нормализует экспрессию рецепторов PARs и EPCR в нейронах гиппокампа, нарушенную при глутаматной эксайтотоксичности;

• синтетические пептиды-аналоги «привязанного лиганда» PARI, освобождаемого АРС, обладают нейропротекторным действием при глутаматной эксайтотоксичности;

• АРС защищает культивируемые гиппокампальные нейроны от токсического влияния активированных тучных клеток;

• Низкие концентрации энтеропептидазы, подобно АРС, проявляют нейропротекторное действие в условиях глутаматной токсичности;

• Действие энтеропептидазы в низких концентрациях реализуется через активацию PARI, а в области высоких концентраций - через инактивацию этого рецептора.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в работе факты расширяют представления о механизмах протекторного действия АРС и демонстрируют новые свойства энтеропептидазы. Впервые обнаруженное PARI-опосредованное протекторное действие энтеропептидазы

в условиях токсичности, вызванной глутаматом, позволяет высказать предположение о наличии протекторных свойств у некоторых других эндогенных протеиназ, кроме протеиназ гемостаза. Кроме того, в работе продемонстрирована возможность использования синтетических пептидов, сходных по строению с привязанным лигандом N47 рецептора PARI, образующимся при его активации АРС, для защиты клеток от гибели при ишемии мозга. Исследование механизмов действия пептидов-агонистов PARI, а также разработка их модифицированных укороченных версий с высокой нейропротекторной активностью, может быть важным и актуальным направлением в поиске новых нейропротекторных препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний и последствий инсульта. Использование низкомолекулярных соединений вместо крупных рекомбинантных белков имеет существенные преимущества, увеличивая скорость и точность доставки препаратов.

Апробация материалов диссертации

Основные результаты работы были представлены на II Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (2008. Кишинев, Молдова), XXII Congress of ISTH (2009, Бостон, США), на V международном междисциплинарном конгрессе «Нейро-наука для медицины и психологии» (2009, Судак, Украина), XXth ISFP Congress (2010, Амстердам, Нидерланды), на III Съезде физиологов СНГ (2011, Ялта, Украина), 7th International Interdisciplinary Congress «Neuroscience for Medicine and Psychology» (2011, Судак, Украина), на Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (2013, Пущино), на Всероссийской научной конференции с международным участием «Фармакологическая нейропротекция» (2013, Санкт-Петербург).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 5 работ в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, и 11 в материалах российских и международных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 140 страницах и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы (содержит 183 источника). Работа иллюстрирована 44 рисунками и 2 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы следующие препараты: Активированный протеин С (APC) (Sigma), тромбин человека (Sigma), NaCl, KCl, СаСЬ, MgCl2) КН2Р04, HEPES, глюкоза, глутамат, MTT(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide), Triton X-100, поли-О-лизин (Sigma,USA); нейробазапьная среда - A (NBM), содержащая 2% Supplement В-27 и L-глутамин («Gibco», США); ARAC (арабинозид), PEI (ethyleneimine polymer solution) (Sigma,USA); флуоресцентные красители Hoechst 33342, SYTO-13; Ethidium bromide (HPLC) (Sigma); агароза, ТВЕ-буфер (Bio-rad, США), ß-меркаптоэтанол, ¡Script cDNA synthesis kit (Bio-Rad, США), iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, США), маркер молекулярных весов Gene Ruler 100 bp DNA Ladder (Fermentas, США), SCH 79797 - антагонист PAR-1 (TOCRIS), флуоресцентные красители Hoechst

33342, SYTO-13, SYTOX (Molecular Probes, Eugene OR, США); первичные антитела Thrombin R (H-lll) (Santa Cruz), EPCR (p-20) (Santa Cruz); anti-neuron specific enolase (Millipore), вторичные антитела Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit и Alexa Fluor 350 Rabbit anti-goat (Invitrogen), парафин.

Синтез пептида-9 (NPNDKYEPF-амид) и пептида-11 (NPNDKYEPFWE) был осуществлен в лаборатории синтеза пептидов ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава РФ Беспаловой Ж.Д. по стандартной технологии пептидного синтеза на твердой фазе с применением методологии Fmoc-(9-флуоренилметоксикарбонил). Структура пептидов подтверждена данными 'Н-ЯМР-спектроскопии, а их гомогенность - данными аналитической ВЭЖХ.

Энтеропептидаза (ЭП) была выделена Михайловой А.Г. из слизистой дуоденума быка и очищена по разработанному ранее методу (Mikhailova et al, 2000). Активность препаратов фермента определяли по скорости активации трипсиногена и гидролиза (Z-Lys-S-Bzl) (Михайлова и др., 2005). Рекомбинантная легкая цепь энтеропептидазы человека любезно предоставлена М.Е.Гаспарян, ИБХ РАН.

Все эксперименты с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларацией о гуманном отношении к животным.

Исследования проводили на первичных культурах нейронов гиппокампа (9-10 дневных), извлеченного из мозга 1-3 дневных крысят линии Вистар или 1-3 дневных контрольных и нокаутных по 2 изоформе ß-аррестина мышах. Контрольные и нокаутные по 2 изоформе ß-аррестина мыши были любезно предоставлены И.И.Полетаевой (биологический факультет МГУ имени М.ВЛомоносова).

Получение культуры гиппокампальных нейронов

Исследования проводили на первичных культурах нейронов гиппокампа (9-10 дневных), извлеченных из мозга 1-3 дневных крысят или мышат. Суспензию клеток (10б клеток/мл) получали по ранее описанному методу (Ходоров с соавт., 2001) и переносили на покровные стекла, покрытые поли-О-лизином (10 мг/мл). Через час добавляли 1,5 мл культурапьной среды (нейробазальная среда - A (NBM), содержащая 2% Supplement В-27 и 0.5 мМ L-глютамина). На 3-4 день добавляли арабинозид (ARAC, 10"5М) на сутки для подавления роста глиальных клеток.

Получение ко-культуры первичных гиппокампальных нейронов и активированных перитонеальных тучных клеток

К первичной гиппокампальной культуре нейронов, культивированной в течение 1012 дней, добавляли тучные клетки, выделенные в день эксперимента, в концентрации 105на 1 культуральную чашку с прикрепленным стеклом. Далее ко-культуру оставляли в ССЬ инкубаторе на 1 сутки. На следующий день проводили морфологическую оценку гибели нейронов.

Для получения активированных тучных клеток использовали модель острого воспаления, когда крысам внутрибрюшинно вводили раствор 40% тиогликолата из расчета 4 г/кг веса животного. Через 1,5 часа после введения тиогликолата животных наркотизировали диэтиловым эфиром, декапитировали и выделяли из перитонеальной жидкости тучные клетки (совместно с A.A. Ерухимович).

Моделирование глутаматной эксайтотоксичности

Для моделирования глутаматной токсичности в культуре нейронов NBM заменяли на HEPES-солевой буфер (HBSS) и далее клетки инкубировали 40 минут в присутствии глутамата (100 мкМ). Состав HBSS в мМ: NaCl - 145, KCl - 5, СаС12 - 1.8, MgCl2 - 1.0 (без MgCh в случае экспозиции клеток с глутаматом); Gly, 0.01; HEPES - 20, глюкоза - 5 (pH 7.4). Исследуемое вещество добавляли за 15 минут до последующего добавления глутамата или других веществ.

Оценка гибели нейронов

Гибель нейронов в культуре определяли через сутки после действия глутамата и протекторных агентов.

Гибель оценивали двумя способами: биохимическим (MTT-(3-(4,5-DimethyI-2-th¡azolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazol¡um bromide) метод (Castoldi et al., 1998)) и морфологическим методами. МТТ добавляли в культуральную среду до конечной концентрации 1 мг/мл и инкубировали клетки 3 часа при 37 °С. Затем среду отбирали и добавляли DMSO для растворения формазанов. Оптическую плотность измеряли спектрофотометрически (590 нм) на универсальном микропланшетном Rider. Оценивали результаты в процентах по отношению к контролю.

Морфологическая оценка гибели нейронов включала исследование ядерной фрагментации (апоптоза) с помощью флуоресцентного ДНК-тропного красителя Hoechst 33342 и витального красителя SYTO-13 (доля живых клеток). Количество некротических нейронов оценивали с использованием этидиума гомодимера (EthD-1), который окрашивает клетки с нарушеной плазматической мембраной, что является первичным морфологическим критерием ее смерти. Окрашенные клетки исследовали, подсчитывали визуально под флуоресцентным микроскопом (Axiovert 200 Zeiss, Германия).

ПЦР в реальном времени

Для изучения изменений экспрессии мРНК исследуемых генов проводили ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). В качестве референсного гена был выбран ген Hmbs (hydroxymethylbilane synthase). Дизайн праймеров для ПЦР проводили на основании данных GeneBank. Выбор праймеров для ПЦР проводили с учетом экзон/интронной структуры исследуемых генов, чтобы избежать коамплифицирования геномной ДНК. Оценка специфичности выбранных праймеров проводилась с использованием программы NCBI Primer-Blast. Для проведения ПЦР-РВ были выбраны следующие праймеры:

PARI forward 5-AGC-CTG-TGC-GGT-CCT-TTG-3, reverse 5-GGG-GGT-TTG-GCG-TAG-CAT-3; PAR2 forward 5-GAA-GTC-TCA-GCC-TGG-CGT-3, reverse 5-GCG-TGT-CCA-ATC-TGC-C AA-TCA-3; PAR3 forward 5-GCA-CAC-TTA-GTG-ACA-TCC-CAT-AAC-3, reverse 5-GTT-GCC-ATT-AAA-ACT-CTC-AGC-AG-3; PAR4 forward 5-CTC-GGG-TTC-AGC-ATC-AGC-3, reverse 5-GGG-GAC-TTC-GAC-TCA-TTA-AGT-TCT-A-3;EPCR forward 5'-CGA CGT GGT CTT ТСС TCT GAC-3, reverse 5'-TCA GGA TAC CCA GGA CCA GTG-3'; Hmbs forward 5-CCA-TCT-GCA-AAC-GGG-AAA-ACC-3, reverse 5-TGA-GGG-AAC-TTT-CTC-TGT-AGC-TG-3.

Для проведения ПЦР-РВ был выбран следующий режим: 95°С, 3 мин; далее 94°С, 30 сек; 58°С, 30 сек; 72°С, 30 сек в течение 50 циклов в автоматическом амплификаторе. Затем в течение 1 мин при 95°С и 1 мин при 56°С (см.). После проводили построение кривых плавления для определения однородности полученного продукта реакции.

Длины образующихся продуктов реакции оценивали при помощи электрофореза в 1,5% агарозном геле с бромистым этидием при 80 Вольт/200 мА в течение 25 минут. В качестве маркера использовали Gene Ruler 100 bp DNA Ladder (Fermentas, USA).

Анализ данных ПЦР-РВ проводили на основании значений пороговых циклов амплификации. Для сравнения уровней экспрессии полученные данные для каждого исследуемого гена нормализовали к уровню референсного гена Hmbs с учетом эффективности реакции с каждой парой праймеров по формуле:

fold change= E(housekeeper)A(Ct(exp) - Ct(ctrl)) / E(target)A(Ct(exp) - Ct(ctrl)), где

housekeeper - контрольный ген, target - целевой ген, Ctrl - контрольные условия (напр. нормальные клетки), ехр - экспериментальные условия (напр. патологические клетки), Е - эффективность ПЦР, Ct - пороговый цикл амплификации.

Кроме того, сравнение уровней экспрессии проводилось с использованием программного обеспечения ¡Cycler Optical System Software Version 3.0a (Bio-Rad).

Иммунофлуоресцентный анализ

Иммунофлуоресцентный анализ проводился на культурах первичных гиппокампальных нейронов, зафиксированных ПФА (персульфат аммония), и пермеабилизованных 0,1% Тритон Х-100. Для оценки уровня рецепторов PARI и EPCR клетки инкубировали с первичными антителами PARI rabbit a-rat thrombin R (H-lll) (1:50, Santa Cruz Biotechnology, Inc) и goat a-rat EPCR (p-20) (1:30, Santa Cruz Biotechnology, Inc). Для визуализации экспрессии рецепторов клетки инкубировали со вторичными антителами goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (1:500) или donkey anti-goat 630 (1:100) . Фотографии были получены с использованием конфокального микроскопа Leica ТС S SPE.

№кВр65 в ядерной и цитоплазматической фракции определяли с помощью первичных антител к NF-KBp65 ((С22В4) rabbit mAb в разведении 1:100) и вторичных антител Alexa Fluor® 488 (1:500) или Alexa Fluor®)546 (1:250)). Для визуализации ядра использовали ядерный краситель SYTOX (разведение 1:10000, Molecular Probes). Изображения получали с помощью инвертированного конфокального лазерного сканирующего микроскопа, LSM Pascal (Carl Zeiss, Германия).

Исследование ишемического очага и перифокальной зоны в модели окклюзии левой ветви средней мозговой артерии.

Опыты выполнены на самцах крыс массой 250-300 г. Фокальное ишемическое повреждение создавали необратимой окклюзией левой ветви средней мозговой артерии (ОСМА) и подходящей к ней вены с одновременной перевязкой ипсилатеральной сонной артерии для стабилизации размера поражения (Гаврилова и др., 2008). Через 72 часа после ОСМА оценивали локализацию и размеры ишемического очага методом магнитно-резонансной томографии (МРТ): ЯМР спектрометр BioSpec 70/30 USR, Bruker, с напряженностью магнитного поля 7 Тесла. Его размеры определяли планиметрически на фронтальных МРТ снимках, используя программу Image J. Кроме того, площадь инфаркта и плотность распределения нейронов в слоях III и V сенсомоторной коры и нейроглии оценивали на гистологических срезах мозга под микроскопом.

Статистическая обработка данных.

Обработку данных проводили по t-тесту. Дня анализа использовали данные 3-5 независимых экспериментов. Различия считали достоверными при р<0,05, п - число независимых экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование влияния активированного протеина С и механизмов реализации его эффектов при нейротоксичности и ишемии мозга

Ишемическое повреждение головного мозга приводит к избыточному высвобождению в межклеточное пространство возбуждающего медиатора глутамата, активирующего глутаматергические рецепторы и патологически увеличивающего внутриклеточный [Ca2+]¡ в нейронах (Hazell, 2007). При этом происходит запуск каскада внутриклеточных реакций, приводящего к гибели клеток механизмами апоптоза или некроза (Bano et al., 2007). APC защищает эндотелиальные клетки сосудов от апоптотической гибели и поддерживает целостность ГЭБ. АРС при ишемии может напрямую защищать нейроны головного мозга от гибели (Guo et al., 2004; Griffin et al., 2007; Walker et al., 2010; Gorbacheva et al., 2008). Однако, молекулярные основы антивоспалительного и антиапоптотического действия АРС еще не выяснены.

1.1. Исследование действия активированного протеина С на выживаемость культивируемых нейронов в норме и при эксайтотоксичности, вызванной глутаматом

Задачей первой серии наших исследований было изучить влияние низких концентраций АРС на выживаемость нейронов при глутаматной эксайтотоксичности.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что АРС в низких концентрациях (0,0110 нМ) не вызывает гибели нейронов, но в узком диапазоне низких концентраций существенно (в 2 и более раз) снижает гибель клеток от токсического действия глутамата. АРС в высоких концентрациях (>50 нМ) вызывает гибель гиппокампальных нейронов, подобную токсическому действию глутамата. (Горбачева и др., 2008). Однако, влияние низких концентраций АРС на гиппокампальные нейроны при глутаматной эксайтотоксичности еще мало изучено.

В первой серии экспериментов мы оценивали выживаемость культивируемых гиппокампальных нейронов через 24 часа после 30-минутного воздействия 100 мкМ глутамата биохимическим (МТТ-тест) и морфологическим методами и АРС (1 нМ) на выживаемость гиппокампальных нейронов при действии глутамата. Показано, что действие 100 мкМ глутамата на клетки приводит к трехкратному увеличению гибели гиппокампальных нейронов относительно контроля (рис.1 А).

Далее мы исследовали влияние АРС (1 нМ) на выживаемость гиппокампальных нейронов в условиях токсического действия глутамата.

Предварительная 15-минутная инкубация клеток с 1 нМ АРС снижала нейротоксическое действие глутамата. В этих условиях наблюдали уменьшение клеточной гибели в 2 раза (р<0,05) (рис.1).

Данные морфологических исследований (рис.1 Б) подтверждают данные, полученные биохимическим методом (рис.1А). Так морфологическое исследование гибели культивируемых гиппокампальных нейронов с использованием флуоресцентных красителей SYTO-13, Hoechst 33342 и EthD выявило снижение количества апоптотических клеток после 15-минутной инкубации с 1 нМ АРС в условиях глутаматной эксайтотоксичности в 2,4 раза по сравнению с действием высоких концентраций глутамата (р<0,05).

патологических состояниях головного мозга, является тромбин (Suo et al., 2004). Однако данных относительно механизмов действия низких концентраций тромбина на гиппокампальные нейроны при нейротоксичности не достаточно.

Мы исследовали изменения уровней экспрессии мРНК PAR и EPCR в гиппокампальных нейронах при предынкубации с низкой (ЮнМ) концентрацией тромбина в модели глутаматной эксайтотоксичности. Ранее в нашей лаборатории было показано протекторное действие этой низкой концентрации тромбина на выживаемость гиппокампальных нейронов в данной модели (Горбачева и др., 2006).

А

£Е

« 3.5-

DC <

£ 3.0-х

I 2.5-

I 2.0-

I 1'5"

; 1.0-

I 0.5-

Q.

0.0-

^ / ^ J? №

y

1.00.8- ■ 0.6- • 0.4- • 0.2-

■

S y

у

Рис.9. Изменение уровня экспрессии мРНК РА112(а), PAR4 (б) и ЕРСИ (в) на гиппокампальных нейронах после 15-минутной предынкубации с 10 нМ тромбином в условиях глутаматной эксайтотоксичности (100 цМ). * р<0,05 по сравнению с контролем, **р<0,05 по сравнению с глутаматом. п=4.

Нами установлено, что тромбин также может выступать фактором, модулирующим уровень экспрессии, исследуемых рецепторов. Показано, что инкубация культивируемых гиппокампальных нейронов с 10 нМ тромбина в течение 45 минут приводит к достоверному изменению экспрессии РА1^2 через 4 часа после воздействия (рис. 9а).

При предынкубации нейронов с 10 нМ тромбином в условиях глутаматной эксайтотоксичности происходит уменьшение экспрессии мРНК PAR4 в 3,2 раза(рис. 96).

При токсическом воздействии глутамата наблюдалось снижение экспрессии мРНК EPCR в 3,17 раза. При этом после 15-минутной инкубации с 10 нМ тромбином отмечается тенденция к возвращению значения экспрессии мРНК рецептора к контрольному уровню (рис.8в).

Таким образом, показано влияние низкой концентрации тромбина на изменение профиля экспрессии мРНК PAR2 и PAR4.

7. Влияние энтеропептидазы на выживаемость культивируемых нейронов в сравнении с действием низкой концентрации тромбина и АРС

Показано, что в контроле процессов нейродегенерации и нейрорегенерации могут участвовать, по-видимому, не только сериновые протеиназы гемостаза, такие, как тромбин и АРС, но также и другие протеиназы (Wang et al 2008). Показано что сериновая протеиназа - энтеропептидаза (ЭП), расщепляющая трипсиноген в процессе пищеварения, может регулировать в нейронах Са2+ -сигнал, индуцируемый тромбином (Rumsh et al., 2008). Однако данные о механизмах протекторного и/или повреждающего действия на нейроны двух ее форм - энтеропептидазы быка и легкой цепи рекомбинантной энтеропептидазы человека отсутствуют.

В следующей серии экспериментов нами было изучено влияние высокоспецифической протеиназы процессинга трипсиногена - ЭП, на выживаемость культивируемых гиппокампапьных нейронов. Известно, что активируя трипсиноген в процессе пищеварения, энтеропептидаза с высокой эффективностью отщепляет N-концевой активационный пептид после последовательности -Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-, Рецептор 1 типа, активируемый протеиназами (PARI) содержит последовательность, подобную активационному пептиду трипсиногена. При гидролизе PARI энтеропептидазои по сайту Lys6l-Asn62 (K6IN) , видимо, происходит неспецифическое расщепление связи в структуре рецептора и удаление привязанного лиганда, что делает рецептор не чувствительным к тромбину (рис.10.).

тромбин АРС

Ф ;

R27RPESKATNATLDPR41 SFLLR46 NPNDKYEPFWE57DEEKe1 NESGLTEYRLVSINKS-

f f ЭП ЭП

Рис. 10. Модель протеолиза N-концевого пептида PARI человека тромбином, АРС или энтеропептидазой (ЭП).

Мы предположили что ЭП, подобно АРС, имеет способность расщеплять PARI по сайту Arg46-Asn47 (R46N47)h также, как АРС, защищать нейроны от гибели при эксайтотоксичности (рис.10). Мы проверил это предположение, анализируя действие высокой (10 нМ) и низкой (0,1 нМ) концентраций полноразмерной энтеропептидазы быка (ВЕК) и легкой цепи рекомбинантной энтеропептидазы человека (L-HEP) на выживаемость гиппокампапьных нейронов при глутаматной эксайтотоксичности. Ранее в нашей лаборатории было показано, что сериновые протеиназы тромбин, FXa и АРС имеют разнонаправленное действие в низких и высоких концентрациях (Strukova et al 2006,Горбачева и др, 2007; Горбачева и др,2008).

Нами показано, что предварительная 15-минутная инкубация культур с антагонистом PARI SCH 79797 в концентрации 0,2 мкМ не отменяла действия энтеропептидазы быка в концентрации 10 нМ на выживаемость нейронов при глутаматной цитотоксичности, как в присутствии, так и в отсутствии тромбина (рис.12). SCH 79797 в используемой концентрации не влиял на вызванную глутаматом гибель нейронов. О направленном действии низких концентраций (0,1 нМ) L-HEP и ВЕК свидетельствуют тот факт, что предварительная 15-минутная инкубация культур с антагонистом PARI рецептора - SCH-79797 отменяла действие энтеропептидаз при глутаматной цитотоксичности, как в присутствии, так и в отсутствии тромбина.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что действие низких концентраций двух форм энтеропептидазы (L-HEP и ВЕК) реализуется через PARI, подобно действию тромбина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что протеиназы появляются в тканях мозга при травме, воспалении, нарушении гематоэнцефалического барьера и могут генерироваться нейронами мозга (Wang et al, 2008, Ossovskaya, Bunnett, 2004). Сериновые протеиназы регулируют функции клеток через трансмембранные PARs, сопряженные с G-белками (Coughlin, 2000,2005; Hollenberg, Houle, 2005; Saito, Bunnett, 2005). Экспрессия PARs обнаружена в областях мозга, наиболее уязвимых для ишемического повреждения, среди них - кора, стриатум, гипоталамус, гиппокамп и мозжечок (Rohatgi et al, 2004а). Изменение экспрессии данных рецепторов наблюдали при травмах, воспалении и ишемии мозга, однако данные о роли PAR и протеиназ гемостаза в травматическом и ишемическом повреждении мозга крайне противоречивы и нет данных о влиянии АРС на экспрессию PAR. Антивоспалительный эффект АРС на клетки эндотелия реализуется через PARI или PAR2 сигнальный путь (Riewald et al, 2002, 2003) при непосредстенном участии EPCR (Bunnett, 2006).

Нами было исследовано влияние сериновых протеиназ - тромбина, АРС и ЭП - на выживаемость культивируемых гиппокампальных нейронов мозга крысы в условиях токсического воздействия ЮОмкМ глутамата на клетки, а также влияние АРС и низкой концентрации тромбина (ЮнМ) на изменение экспрессии всех 4 подтипов PAR и EPCR. Впервые показано, что АРС нормализует экспрессию мРНК рецепторов PARs и EPCR. Действие глутамата на фоне низких концентраций АРС не сопровождалось значимым повышением уровня NF-KBp65 в ядерной фракции, что свидетельствует о защитном эффекте АРС при эксайтотоксичности.

Протекторное действие АРС на количественные характеристики нейронов и нейроглии в перифокальной зоне инфаркта было продемонстрировано в модели фокальной ишемии мозга, вызванной окклюзией средней мозговой артерии крыс. АРС не только уменьшал размеры инфаркта по сравнению с зоной инфаркта у контрольных крыс, но и предотвращал гибель нейронов в слое V перифокальной зоны инфаркта, способствовал росту количества глиоцитов в перифокальной зоне очага. Известно, что нейроглия поддерживает тканевой гомеостаз нервной ткани и нормальное функционирование нейронов (Panickar, Norenberg, 2005; Verkhartsky, Boot, 2007). Поэтому активацию нейроглии в зоне пенумбры ишемического очага в наших экспериментах можно расценить как компенсаторно-восстановительный ответ структур мозга на поддержание функции нервных клеток при ишемии, что подтверждается данными литературы (Panickar, Norenberg, 2005; Kuboyama et al. 2011).

Мы также сопоставили нейропротекторные эффекты АРС с действием новых синтетических пептидов-аналогов привязанного лиганда PARI, освобождаемого АРС (пептид-9 и пептид-11). Нами впервые установлено, что неканонические пептиды

снижали уровень апоптоза нейронов при эксайтотоксичности, оказывая протекторное действие при глутаматной эксайтотоксичности, подобное действию АРС.

Кроме того нами было показано, что протекторные эффекты АРС реализуются видимо по р2-аррестин-независимому пути, так как защитное действие АРС и пептидов сохранялось на гиппокампальных нейронах мышей, нокаутных по гену р2-аррестина.

В нашей работе впервые выявлено протекторное действие ЭП в низкой (0,1 нМ) концентрации на выживаемость гиппокампальных нейронов при глутаматной цитотоксичности и нейротоксическое действие ЭП в более высокой концентрации (10 нМ). Эффекты, реализуемые двумя исследованными формами ЭП (ВЕК и L-HEP), сопоставимы с действием АРС при глутаматной эксайтотоксичности. Эффект токсичности ВЕК и L-HEP в области высоких концентраций можно объяснить инактивацией РАР1 рецептора в результате гидролиза по связи Lys61-Asn62 (Румш, 2008).

С помощью специфического антагониста PARI рецептора (SCH 79797) мы показали, что действие ЭП реализуется через PARI, подобно действию тромбина.

Таким образом, полученные данные указывают на способность низких концентраций обеих форм ЭП защищать нейроны гиппокампа от глутаматной токсичности.

При ишемическом инсульте происходит активация процессов воспаления и нейродегенерации при участии иммунокомпетентных клеток. Одними из важнейших адресатов провоспалительных медиаторов являются клетки глии и микроглии, входящие в состав нейроваскулярной единицы и обеспечивающие ответ на провоспалительные сигналы, поступающие от иммунокомпетентных клеток. Особую роль в сигнализации играют тучные клетки (Strbian, 2009). Тучные клетки могут проникать в ЦНС в результате повреждения ГЭБ (Skaper et al, 2012), что может приводить к увеличению отека и клеточной гибели при ишемическом поражении мозга, благодаря прямому токсическому действию на нейроны и опосредованному действию в виде синтеза провоспалительных медиаторов. В нашей работе было впервые показано, что АРС увеличивает выживаемость гиппокампальных нейронов, в кокультуре с активированными воспалением тучными клетками крыс.

Исследованные нами механизмы действия АРС, пептидов-аналогов привязанного лиганда PARI, освобождаемого АРС и ЭП открывают возможности синтеза и использования новых протекторов для лечения ишемического повреждения мозга.

ВЫВОДЫ

1. В культивируемых гиппокампальных нейронах мозга крысы экспрессируется EPCR (эндотелиапьный рецептор протеина С) и все четыре подтипа рецепторов, активируемых протеиназой (PAR) - PARI, PAR2, PAR3 и PAR4. Действие глутамата (100 мкМ, в течение четырех часов) приводит к повышению уровней экспрессии мРНК PARI и PAR4 и снижению уровня экспрессии EPCR. Прединкубация с АРС (1нМ) и тромбином (10 нМ) приводит к восстановлению уровеня экспрессии мРНК PAR 1, PAR4 и EPCR, нарушенной при глутаматной эксайтотоксичности.

2. АРС уменьшает размер инфаркта в модели окклюзии средней мозговой артерии крыс, снижая гибель нейронов и увеличивая количество глиапьных клеток.

3. Пептиды-аналоги привязанного лиганда PARI, освобождаемого АРС (пептид-9 (NPNDKYEPF-амид) и пептид-11 (NPNDKYEPFWE)), как и сам АРС, обладают нейропротекторным действием на культивируемые гиппокампальные нейроны при глутаматной эксайтотоксичности, которое реализуется по пути, независимому от р-аррестина 2.

4. Энтеропептидаза в низких концентрациях (0,1 нМ) обладает нейропротекторным действием в условиях глутаматной токсичности. Действие энтеропептидазы в низких концентрациях реализуется через активацию PARI, а энтеропептидаза в высоких концентрациях вызывает инактивацию этого рецептора.

5. АРС увеличивает выживаемость гиппокампальных нейронов в кокультуре с активированными тучными клетками, полученными в модели острого воспаления.

6. Эндогенные сериновые протеиназы - тромбин, ЭП, АРС и синтетические пептиды-аналоги привязанного лиганда PARI, освобождаемого АРС, служат регуляторами выживаемости нейронов в условиях глутаматной эксайтотоксичности и могут быть использованы для разработки новых препаратов, направленных на коррекцию ишемических повреждений мозга.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в ясурналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Савинкова И.Г., Горбачева JI.P., Беспалова Ж.Д., Пинелис В.Г., Струкова С.М. Неропротекторное действие при глутаматной эксайтотоксичности пептидов-аналогов привязанного лиганда, освобождаемого активированным протеином С // Биологические мембраны. 2013. Т.30 (5-6). С.468-473.

2. Макарова A.M., Горбачева JI.P., Савинкова И.Г., Михайлова А.Г., Румш Л.Д., Пинелис В.Г. Влияние энтеропептидазы на выживаемость культивируемых гиппокампальных нейронов в условиях глутаматной токсичности // Биохимия. 2010. Т. 75(9). С. 1290-1298.

3. Gorbacheva L., Savinkova I., Pinelis V., Ishiwata S., Reiser G. Activated protein С prevents neuronal apoptosis at excitotoxicity via inhibition of p53 // J. Thromb. Haemost. 2010. 8, p37.

4. Savinkova I., Gorbacheva L., Pinelis V., Reiser G. Activated protein с modulates EPCR and PARI expression in neurons at exitotoxicity // J.Thromb. Haemost. 2011. 9,suppl 2. p. 971-1027

5. Gorbacheva L., Savinkova I., Pinelis V., Ishiwata S, Reiser G. Anti-apoptotic effect of activated protein С during glutamate toxicity: molecular mechanism// J.Thromb.Haemost. 2011. 9, suppl 2, p.507.

Публикации в других изданиях:

6. Горбачева JI.P., Савинкова И.Г., Пинелис В.Г., Райзер Г., Струкова С.М. Рецептор первого типа, активируемый протеиназами (PAR-1) опосредует нейропротекторное действие активированного протеина С и тромбина на нейроны при глутаматной эксайтотоксичности // Научные труды II Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». Кишинев. 2008. С.575.

7. Горбачева JI.P., Савинкова И.Г., Пинелис В.Г. Нейропротекторное действие активированного протеина С на гиппокампальные нейроны // Материалы Всеросс. Конфер. с междунар. участием "Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: совр. подходы к диагностике и лечению". Москва. 2008. С. 31

8. Gorbacheva L., Savinkova I., Pinelis V., Ishiwata S., Reiser.G. Activated protein с prevents the NF-kB activation at glutamate- and thrombin- induced toxicity // Journal of Thrombosis and Haemostasis, V7, (Abs XXIIst Congress of ISTH, Boston). Boston. 2009, OC-WE-143.

9. Горбачева JI.P., Савинкова И.Г., Пинелис В.Г., Райзер Г. Возможный механизм нейропротекторного действия активированного протеина С // Материалы V-го международного междисциплинарного конгресса «Нейро-наука для медицины и психологии». Судак. 2009. С.82-83.

10. Gorbacheva L., Savinkova I., Pinelis V., Reiser G. Possible mechanism of neuroprotective action of activated protein С // Материалы VI-го международного междисциплинарного конгресса «Нейро-наука для Медицины и Психологии». Судак. 2009. С.82-83.

11. Gorbacheva L., Savinkova I., Pinelis V., Ishiwata S., Reiser G. Thrombin receptor antagonists prevent the protective anti-apoptotic effect of activated protein с (ape) // Pathophysiol Haemost Thromb. 2010. 37(Suppl.l):p.l48.

12. Михайлова А.Г., Горбачева JI.P., Макарова A.M. , Савинкова И.Г., Румш Л.Д Рецепторы, активируемые протеиназами- потенциальные субстраты энтеропептидазы в регуляции выживаемости гиппокампальных нейронов при глутаматной токсичности // Труды XVIII междунар. Конфер. и дискусс. научного клуба Новые информ. технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Ялта-Гурзуф. 2010. Т. 2. С. 119.

13. Горбачева Л.Р., Савинкова И.Г., Пинелис В.Г., Ишивата С., Райзер Г. Активированный протеин С как регулятор выживаемости нейронов при токсических воздействиях глутамата и тромбина // Научные Труды III Съезда физиологов СНГ. Ялта. 2011

14. Горбачева Л., Савинкова И., Пинелис В., Райзер Г., Активированный протеин С предотвращает каспаз-независимый и -зависимый апоптоз гиппокампальных нейронов // Материалы 7th International Interdisciplinary Congress «Neuroscience for Medicine and Psychology». Судак. 2011.

15. Бибинейшвили E.3., Савинкова И.Г., Юсипович А.И., Горбачева Л.Р., Струкова С.М, Максимов Г.В. Изучение морфологии и структуры цитоплазмы нейрона при действии медиаторов или изменении состояния плазматической мембраны. // Материалы Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация. Пущино. 2013. С.257-261.

16. Савинкова И.Г., Горбачева Л.Р., Беспалова Ж.Д., Пинелис В.Г., Струкова С.М. Нейропротекторное действие при глутаматной эксайтотоксичности пептидов-аналогов привязанного лиганда, освобождаемого активированным протеином С // Материалы Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация. Пущино. 2013. С.148-151.

: V -X

V

Савинкова Ирина Григорьевна Протекторное действие активированного протеина с при нейротоксичности и ишемии мозга Формат 60x90/16 Тираж 100 экз. Подписано в печать 21.11.2013 Заказ № 142 Типография ООО «Генезис» 8 (495) 434-83-55 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савинкова, Ирина Григорьевна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра физиологии человека и животных

На правах рукописи

04201455223

Савинкова Ирина Григорьевна

ПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ АКТИВИРОВАННОГО ПРОТЕИНА С ПРИ НЕЙРОТОКСИЧНОСТИ И ИШЕМИИ МОЗГА

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03.03.01- Физиология

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Струкова Светлана Михайловна; доктор медицинских наук, профессор Пинелис Всеволод Григорьевич

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Сопряжение процессов воспаления, свертывания и нейродегенерации.....14

1.2.Активированный протеин С (АРС): структура, образование, функции......21

1.2.1. Использование АРС в моделях ишемического повреждения головного мозга............................................................................................30

1.3.Тромбин: структурные особенности тромбина и свойства.....................31

1.4. Энтеропептидаза........................................................................33

1.5.Рецепторы, активируемые протеиназами...........................................38

1.5.1.Новые механизмы смещённого агонизма при активации PARI АРС.....44

1.5.2.Экспрессия рецепторов, активируемых протеиназами........................49

1.6. Эндотелиальный рецептор протеина С (EPCR)..................................51

1.6.1. Экспрессия EPCR.....................................................................52

1.7. Эксайтотоксичность, как модель нейродегенерации............................53

1.8.Участие тучных клеток в воспалительной реакции..............................56

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................60

РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Исследование влияния активированного протеина С и механизмов реализации его эффектов на культивируемые гиппокампальные нейроны при глутаматной эксайтотоксичности.........................................................75

3.1.1. Исследование действия активированного протеина С на выживаемость культивируемых нейронов в норме и при эксайтотоксичности, вызванной глутаматом.....................................................................................76

3.1.2. Исследование действия активированного протеина С на активацию проапоптотического каскада NfkB и транслокации NFKBp65 в ядро нейронов.......................................................................................79

3.1.3. Исследование влияния активированного протеина С на экспрессию мРНК PAR и EPCR в гиппокампальных нейронах при глутаматной эксайтотоксичности........................................................................81

3.1.4, Исследование влияния активированного протеина С на экспрессию белка PARI и EPCR в гиппокампальных нейронах при глутаматной эксайтотоксичности.........................................................................86

3.2. Исследование действия пептидов-аналогов привязанного лиганда, освобождаемого активированным протеином С, на выживаемость гиппокампальных нейронов при глутаматной эксайтотоксичности.............89

3.3. Исследование действия АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда PARI на выживаемость гиппокампальных нейронов мышей, нокаутных по 2 изоформе Р-аррестина, в модели глутаматной эксайтотоксичности.............93

3.4. Исследование влияния активированного протеина С на кокультуру гиппокампальных нейронов и перитонеальных тучных клеток, полученных в модели острого воспаления...............................................................95

3.5. Влияние активированного протеина С на размеры зоны поражения и морфометрические показатели нейронов и нейроглии в перифокальной

зоне.............................................................................................98

3.6. Исследование действия тромбина в низкой концентрации на экспрессию мРНК PAR и EPCR в гиппокампальных нейронах при глутаматной эксайтотоксичности.......................................................................103

3.7. Исследование влияния полноразмерной энтеропептидазы быка и легкой цепи рекомбинантной энтеропептидазы человека на выживаемость культивируемых нейронов в сравнении с действием низкой концентрации тромбина.....................................................................................107

4. Обсуждение...............................................................................114

5.Вывод ы......................................................................................121

6.Список литературы......................................................................123

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека Глу - глутамат

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер ДНК - дезоксирибонуклиновая кислота мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота ОТ - обратная транскрипция ПНС- периферическая нервная система ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

ТМ - тромбомодулин

АРС - активированный протеин С

EPCR - эндотелиальный рецептор протеина С

ТФ - тканевой фактор

ФХа - фактор X активированный

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЦНС - центральная нервная система

ЭП - энтеропептидаза

[Са ]j - внутриклеточная концентрация ионов кальция АМРА рецептор - ионотропный глутаматный рецептор, синтетический агонист DL-a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxasole propionic acid ARAC - арабинозинмоноцитозид ВЕК - полноразмерная энтеропептидаза быка CG - катепсин G

EPCR - эндотелиальный рецептор протеина С

GRK - киназы рецепторов, сопряженных с G-белком

HBSS - Hepes-солевой буфер

1кВ - ингибитор каппа В

IL-4 - интерлейкин 4

IP3 - инозитолтрисфосфат

L-HEP - легкая цепь рекомбинантной энтеропептидазы человека МТТ - 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide NF-кВ - ядерный фактор каппа В

NMDA рецептор - ионотропный глутаматный рецептор, синтетический агонист N-methyl-D-aspartate PC - протеин С PLC - фосфолипаза С

PAR - рецепторы, активируемые протеиназами

RT-PCR - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

sEPCR - растворенная форма EPCR

TNF-a - фактора некроза опухоли-а

ВВЕДЕНИЕ

Ишемический инсульт - острое нарушение мозгового кровообращения, сопровождается гибелью клеток мозга и нарушением его функций вследствие тромбообразования, вазоспазма и затруднения или прекращения поступления крови к тому или иному отделу. По данным Всемирной Организации Здравоохранения инсульт - одно из основных заболеваний, уносящих больше всего человеческих жизней. Так, ежегодно от ишемического и геморрагического инсультов погибает около 6,4 млн человек. Поэтому исследование механизмов развития и регуляции нейродегенеративных процессов при ишемических инсультах и травмах мозга и поиск протекторных агентов является одной из важнейших проблем современной физиологии.

При ишемии мозга происходит освобождение глутамата в межклеточное пространство, приводящее к активации пре- и постсинаптических глутаматных рецепторов. Последующее увеличение внутриклеточного [Са ]¡ может приводить к дисфункции митохондрий, генерации активных форм кислорода и активации протеиназ, фосфорилаз и эндонуклеаз (Hazell,2007). Массивный вход Са в нервные клетки нарушает гомеостаз этого внутриклеточного посредника, запускает каскад внутриклеточных реакций, которые завершаются быстрой или отсроченной гибелью клеток механизмами апоптоза или некроза (Baño et al, 2007). В настоящей работе для изучения роли ключевых сериновых протеиназ гемостаза - активированного протеина С и тромбина, в нейропротективных и нейродегенеративных процессах в мозге использована модель глутаматной эксайтотоксичности. Первичная культура нейронов является удобной экспериментальной моделью для изучения нейродеструктивных процессов, вызываемых глутаматом, так как цитологические и биохимические характеристики культивируемых нейронов близки тем, что наблюдаются у нейронов in situ (Хаспеков, 1995).

Известно, что система свертывания крови и её протеиназы одними из первых в организме осуществляют запуск сложной ответной реакции на повреждающее воздействие. Ишемическое повреждение мозга сопровождается нарушением целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и увеличением его проницаемости, что приводит к появлению в нервной ткани ключевых сериновых протеиназ системы свертывания крови, таких как тромбин, фактор Ха (ФХа) и активированный протеин С (АРС).

Активированный протеин С - мультифункциональный фермент, участвующий в регуляции не только свертывания крови, но также воспаления и апоптоза, проявляя антивоспалительные и цитопротекторные свойства (Riewald et al., 2002; O'Brien et al., 2006). При ишемии происходит апоптотическая гибель эндотелиальных клеток и нарушение целостности ГЭБ, приводящая к нейровоспалению и гибели нейронов. АРС защищает эндотелиальные клетки сосудов, поддерживает целостность ГЭБ и предотвращает вторичное повреждение нейронов, опосредованное входом из кровотока нейротоксических веществ. АРС при ишемии может напрямую защищать нейроны головного мозга от гибели. Однако молекулярные основы антивоспалительного и антиапоптотического действия АРС еще не выяснены. АРС ингибирует апоптоз и блокирует воспаление, снижая образование р53, каспазы-3 и нормализуя соотношение про- и антиапоптотических генов Bax/Bcl-2 (Riewald M et al, 2002; Griffin et al, 2007; Cheng et al, 2003; Guo et al, 2009; Guo et al. 2004). Кроме того APC блокирует транслокацию NFkB в ядро и, как следствие, ингибирует экспрессию молекул адгезии, цитокинов, предотвращает апоптоз и модулирует выживаемость клеток эндотелия (Joyce et al, 2001; Levi et al, 2004). В нашей лаборатории было показано, что АРС в низких концентрациях (0,01-10 нМ) не вызывает гибель нейронов, но в узком диапазоне низких концентраций существенно (в 2 и более раз) снижает гибель клеток от токсического действия глутамата. АРС в высоких концентрациях (>50 нМ) вызывает гибель гиппокампальных нейронов, подобную токсическому действию

глутамата. (Горбачева и др., 2008) Однако влияние АРС па гиппокампальные нейроны при глутаматной эксайтотоксичности еще мало изучено. Поэтому исследование механизмов анти/проапоптотического действия АРС на различных экспериментальных моделях представляет интерес как для фундаментальной физиологии, так и для практической медицины и фармакологии.

Одним из ключевых ферментов свертывающей системы крови является тромбин, образующийся в результате ограниченного протеолиза протромбина фактором Ха свертывания крови в участках повреждения ткани, в том числе нервной, при травме, ишемических и геморрагических инсультах, нарушении ГЭБ при воспалении, гипертензии, эпилептическом статусе. Тромбин может индуцировать ретракцию нейронов, пролиферацию глии и модулировать процессы гибели нейронов, в зависимости от концентрации и времени воздействия (Струкова и др. 2005; Henrich-Noack et al., 2005).

Сериновые протеиназы регулируют функции клеток через трансмембранные рецепторы, активируемые протеиназами (PARs), сопряженные с 0-белками(Сои§ЬНп, 2002). К настоящему времени клонированы четыре подтипа PAR (PARI- рецептор тромбина, АРС, плазмина , PAR2 - рецептор трипсина, триптазы тучных клеток, ФХа и PAR 3- рецептор тромбина, и PAR 4- рецептор тромбина, плазмина) (Adams et al., 2011).

Протеиназы системы свертывания, взаимодействуя с мембранными семидоменными PAR, могут передавать сигналы клетка нервной системы при травме или воспалении, когда происходит увеличение сосудистой проницаемости. Протеиназы расщепляют одну пептидную связь экзодомена рецептора, что приводит к образованию нового N-конца («привязанный лиганд»), который обладает способностью специфически взаимодействовать со второй внеклеточной петлей той же рецепторной молекулы и активирует рецептор (Coughlin et al, 2005; Hollenberg et al, 2002; Trejo, 2003). Изменение

экспрессии данных рецепторов наблюдали при травмах, воспалении и ишемии мозга (Smith-Swintosky et al, 1997; Junge et al, 2004). Поэтому несомненный интерес представляет действие сериновых протеиназ гемостаза АРС и тромбина на регуляцию клеточной гибели при эксайтотоксичности, вызванной глутаматом, а также изменение экспрессии рецепторов, активируемых протеиназами и эндотелиальиого рецептора протеина С (EPCR), через которые осуществляется передача сигнала.

В связи с выше сказанным весьма актуальным представляется выяснение особенностей влияния АРС на выживаемость нейронов, и на количественные характеристики нейронов и нейроглии в перифокальной зоне экспериментального инфаркта крыс при окклюзии средней мозговой артерии.

Недавно обнаружено, что разнонаправленное действие тромбина и АРС может быть обусловлено смещённым агонизмом (biased agonism) при действии протеиназ тромбина и АРС на PAR-1 клеток эндотелия (Soh et al, 2011; Mosnier et al, 2011; Mosnier et al, 2012). При смещённом агонизме вместо канонического расщепления тромбином по Arg41 в экзодомене PARI идентифицировано APC-специфичное неканоническое расщепление по Arg46 в экзодомене PARI. Новый привязанный лиганд - пептид N47, на культивируемых клетках эндотелия имитировал вызванную АРС сигнализацию, но не сигнализацию, индуцируемую тромбином (Mosnier et al,

* 17 ¿I "7

2012). Показано, что пептид N' , повторяющий структуру остатка PARI N

66

, стимулирует цитопротекторныи путь сигнализации в клетках эндотелия посредством фосфорилирования Akt и GSK3ß, активации Racl и стабилизации эндотелиальиого барьера (Mosiner et al, 2012). Поэтому особый интерес представляет сравнение влияния АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда на выживаемость гиппокампальных нейронов в модели глутаматной эксайтотоксичности.

Кроме того известно, что PARI с корецептором EPCR , локализованный в кавеолах, связан с ß-аррестинами - мультифуикциональными адапторными

белками. Воздействие APC ведет к диссоциации рецептора и адапторной молекулы, но Р-аррестин в свою очередь необходим для активации малой ГТФазы Racl, что является ключевым механизмом в реализации цитопротекторного эффекта. (Soh et al, 2011). Исследование эффектов APC и пептидов-аналогов привязанного лиганда PARI, освобождаемого АРС, на гиппокампальные нейроны мышей нокаутиых по 2 изоформе Р-аррестина позволит установить участие адапторного белка Р-аррестина в реализации эффектов АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда.

Однако ишемический инсульт представляет собой комплексный патологический процесс, обеспечивающий активацию не только процессов воспаления и нейродегенерации, но также участие иммунокомпетентных клеток, в частности тучных клеток. У крыс показано участие тучных клеток в формировании ишемического отека мозга на ранние сроках после начала очаговой церебральной ишемии (Strbian et al, 2006). Сравнительно небольшой концентрации тучных клеток может быть достаточно для изменения проницаемости ГЭБ и нарушения его целостности (Esposito et al, 2001). В связи с этим представляется важным исследование эффектов АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда, освобождаемого АРС, на гиппокамппальные нейроны, кокультивированные с активированными тучными клетками, позволяющую оценить возможность реализации протекторного эффекта веществ при наличии активных тучных клеток.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось выяснение влияния АРС как агониста PARI рецептора и ЭП на клетки мозга при токсическом воздействии глутамата и действия АРС в экспериментальной ишемии мозга крыс.

Для достижения цели в ходе работы решались следующие задачи:

1. Оценить влияние APC и тромбина на экспрессию рецепторов, активируемых протеиназами (PARs) и эпдотелиального рецептора протеина С (EPCR) в культивируемых нейронах гиппокампа крысы и выживаемость клеток при глутаматной эксайтотоксичности.

2 Исследовать влияние АРС на размеры ишемического очага и морфометрические показатели нейронов и нейроглии в перифокальной зоне фокального инсульта, моделируемого в мозге крысы с помощью окклюзии средней мозговой артерии.

3 Сравнить действие АРС с влиянием пептидов-аналогов привязанного лиганда PARI, освобождаемого АРС, на выживаемость культивируемых гиппокампальных нейронов крысы при глутаматной эксайтотоксичности.

4 Оценить зависимость нейропротекторного действия АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда PARI от Р-аррестина 2 в модели глутаматной эксайтотоксичности на гиппокампальных нейронах с использованием линии мышей, нокаутных по гену р-аррестина 2.

5 Оценить влияние энтеропептидазы на выживаемость культивируемых гиппокампальных нейронов при глутаматной эксайтотоксичности.

6 Проанализировать влияние АРС на нейродегенеративный эффект активированных воспалением тучных клеток, кокультивируемых с гиппокампальными нейронами крысы.

Научная новизна работы

В работе впервые выявлены следующие закономерности:

• АРС нормализует экспрессию мРНК рецепторов PARs и EPCR в нейронах гиппокампа, нарушенную при глутаматной эксайтотоксичности;

• синтетические пептиды-аналоги «привязанного лиганда» PARI, освобождаемого АРС, обладают нейропротекторным действием при глутаматной эксайтотоксичности;

• АРС защищает культивируемые гиппокампальные нейроны от токсического влияния активированных тучных клеток;

• Низкие концентрации энтеропептидазы, подобно АРС, проявляют нейропротекторное действие в условиях глутаматной токсичности;

• Действие энтеропептидазы в низких концентрациях реализуется через активацию PARI, а в области высоких концентраций - через инактивацию этого рецептора.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в работе факты рас�