Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль протеин киназы С в механизмах нарушения кальциевого гомеостаза в нейронах мозжечка и коры при гиперстимуляции глутаматных рецепторов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль протеин киназы С в механизмах нарушения кальциевого гомеостаза в нейронах мозжечка и коры при гиперстимуляции глутаматных рецепторов"

На правах рукописи х^е^сгы—„

Персиянцева Надежда Александровна

иилБЗЭШ

РОЛЬ ПРОТЕИН КИНАЗЫ С В МЕХАНИЗМАХ НАРУШЕНИЯ КАЛЬЦИЕВОГО ГОМЕОСТАЗА В НЕЙРОНАХ МОЗЖЕЧКА И КОРЫ ПРИ ГИПЕРСТИМУЛЯЦИИ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

03.00.13. — Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 МАР 2008

Москва-2008

003165310

Работа выполнена в лаборатории мембранологии с группой генетических исследований НИИ Педиатрии ГУ Научного центра здоровья детей РАМН (заведующий - доктор медицинских наук, профессор Пинелис Всеволод Григорьевич)

Научный руководитель: д. м н, профессор

Пинелис Всеволод Григорьевич

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

д. б. н, профессор кафедры физиологии человека и животных МГУ им. М В Ломоносова Балезина Ольга Петровна

д. б н Хаспеков Леонид Георгиевич

ГУ Научный центр неврологии РАМН, отдел исследований мозга

Институт ВНД и НФ РАН

Защита состоится «24» марта 2008 г. в 15. ч 30 мин на заседании диссертационного ученого совета Д 501.001.93, созданного при биологическом факультете Московского государственного университета им. М.В Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, ауд М-1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова

Автореферат разослан «24» февраля 2008 г

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Умарова Б А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Заболевания центральной нервной системы являются одной из актуальных проблем медицины, что обусловлено их существенной долей в структуре заболеваемости и смертности населения, высокими показателями временной и стойкой утраты трудоспособности Среди данных заболеваний ведущее место занимает ишемический инсульт По данным ряда авторов он составляет около 80% общего числа инсультов (Bright and Mochly-Rosen, 2005)

В ишемическом каскаде большую роль играют глутаматные рецепторы При спазмах сосудов наблюдается снижение кровотока, гипоксия, что провоцирует выброс нейротрансмиттеров Глутамат (Глу) активирует рецепторы, происходит мощный вход кальция и натрия внутрь клетки и выход калия (Ходоров и др, 2003) Обнаружено, что длительное воздействие Глу на нейроны приводит к увеличению концентрации внутриклеточного кальция ([Са2+],) и развитию так называемой отсроченной Са2+ дизрегуляции (ОКД) (Ходоров и др , 2001, 2003; Khodorov 2004, Nicholls and Budd, 2000) Стойкое повышение [Са2+], способно стимулировать активность Са2+-зависимых протеин киназ и протеин фосфатаз, в частности протеин киназы С (ПКС) Изменения активности ПКС при ишемии были отмечены в тканях многих органов головного мозга, сердца, печени, почек (Speechly-Dick et al, 1994)

Несмотря на интенсивные исследования, вклад ПКС в механизмы повреждения нейронов при гиперстимуляции Глу рецепторов окончательно не установлен Рядом исследователей показано, что предварительное уменьшение активности и содержания ПКС в нейронах защищает их от Глу нейротоксичности (Manev et al., 1989, 1990, Favaron et al, 1990, Coponen et al, 2003) В то же время другие исследователи утверждают, что для защиты клеток необходимо противодействовать инактивации ПКС (Busto 1994, Durkin et al, 19961997, Tremblay et al, 1999)

Со времени открытия ПКС в 1977 году было получено достаточное количество информации о биохимии и молекулярной биологии белков семейства ПКС В понимании их регуляции и участия в различных сигнальных путях множества организмов, от дрожжей до млекопитающих, были достигнуты фундаментальные успехи Однако остается не ясным, какой же вклад вносит ПКС в механизмы повреждения нейронов, вызванные гиперстимуляцией Глу

рецепторов1 активация ПКС или падение активности связаны с повреждающим действием Глу До сих пор мало изучена функциональная роль отдельных изоформ ПКС, которые экспрессируются в одной и той же клетке; практически отсутствуют данные о том, что происходит с ПКС при длительном Глу воздействии, остается ли она при этом на плазматической мембране Имеются данные о влиянии ПКС на Са2+ токи через NMDA каналы (Chihab et al, 1998, Bickler et al, 2004), однако, совершенно не изучено влияние ее активации или ингибирования на нарушение Са2+ гомеостаза, на развитие ОКД. Остается недостаточно изученным, принимает ли участие ПКС в особенностях действия Глу на нейроны разного возраста

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было исследовать роль протеин киназы С в механизмах нарушения кальциевого гомеостаза и гибели культивируемых нейронов мозжечка и коры при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Для достижения поставленной цели в работе решались следующие конкретные задачи:

1 Определить особенности изменений активности ПКС при кратковременном и длительном глутаматном воздействии, при действии активатора - форболового эфира (ФЭ) и ингибиторов ПКС,

2 Изучить изменения [Са2+]! и трансмембранной разности потенциала внутренней мембраны митохондрий при длительном воздействии глутамата, ФЭ и ингибиторов ПКС,

3 Изучить поведение изоформы ПКСрИ в нейронах коры при длительном действии глутамата, ФЭ, ингибитора ПКС и Са2+ ионофора - иономицина,

4 Оценить выживаемость нейронов после длительного глутаматного воздействия при действии ФЭ и ингибиторов ПКС Научная новизна исследования.

В работе впервые было обнаружено, что транслокация изоформы ПКСрП происходит параллельно с изменениями [Са2+]15 вызванными длительным Глу воздействием Во время первой фазы повышения [Са2+], ПКС перемещается из цитозоля на плазматическую мембрану нейронов Обратная транслокация ПКС|ЗП с плазматической мембраны в цитозоль (в органелло-подобные структуры в цитоплазме) происходит одновременно с развитием ОКД и осуществляется с помощью транспортного белка RACK1 Впервые было показано, что развитие ОКД с одной стороны, может быть

причиной последующей гибели нейронов, с другой стороны, несмотря на ОКД, нейроны остаются живыми Обнаружено, что в молодых нейронах ингибиторы ПКС защищают клетки от действия Глу, задерживают развитие ОКД и уменьшают количество клеток с дизрегуляцией кальция Установлено, что 24 часовое действие ФЭ уменьшает активность ПКС до минимальных значений и приводит к развитию "с!оут-ге^1а1:10п" ПКС Впервые показано, что в этих условиях длительное воздействие Глу не вызывает гибели молодых нейронов, уменьшает число клеток с ОКД, замедляет время ее наступления Обнаружено, что ингибитор фосфатаз окадаевая кислота на фоне длительного действия Глу вызывает эффекты, подобные ФЭ, ускоряя развитие ОКД В то же время в старых нейронах "с1о\уп-ге§и1а1:юп" ПКС не влияет на гибель нейронов после Глу воздействия

Научное и практическое значение работы.

Полученные в работе данные, раскрывающие вклад ПКС в механизмы нарушения Са2+ гомеостаза и гибели нейронов, вызванные длительным Глу воздействием, важны для понимания процессов, лежащих в основе повреждения нейронов при ишемии/гипоксии мозга Способность некоторых ингибиторов ПКС защищать нейроны от токсического действия Глу может иметь практический выход это создание лекарственных препаратов, нацеленных на изменение активности ПКС. Очевидную практическую ценность имеют полученные в работе данные об изменениях активности ПКС и эффекты "(1о\уп-^и1а1:юп" на механизмы нарушения Са2+ гомеостаза и повреждения нейронов Это способствует выявлению причин повреждения нейронов при гиперстимуляции глутаматных рецепторов и, тем самым, поможет подойти к решению актуальной проблемы, направленной на профилактику и терапию ряда заболеваний центральной нервной системы Положения, выносимые на защиту.

1 Глутамат приводит к изменению активности ПКС в нейронах, которая зависит от длительности его воздействия

2 Глутамат вызывает транслокацию изоформы ПКСрИ из цитозоля на плазматическую мембрану, а затем обратно в цитозоль в виде органелло-подобных структур с помощью транспортирующего белка ЯАСК1. По времени транслокация ПКСрП совпадает с динамикой развития ОКД и запускается кальцием, входящим в нейроны по NN10А каналам

з

3 На фоне Глу ингибиторы ПКС задерживают развитие ОКД и

уменьшают число нейронов с ОКД Апробация диссертации.

Результаты исследований были представлены на Международной Конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2005), Научной Конференции "Нейрохимия: Фундаментальные и прикладные аспекты" (Москва, 2005); Международной Конференции "Neuroscience 2005" (Вашингтон, 2005); XIII Международной Конференции и Дискуссионном Научном Клубе «Новые инфоФЭционные технологии в медицине, биологии, фаФЭкологии и 4 экологии» (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2005), Втором Международном Междисциплинарном Конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Украина, 2006). Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Структура и объём диссертации.

Диссертационная работа изложена на_страницах

машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы

Работа иллюстрирована_рисунками и_таблицами

Список литературы включает_источника

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Эксперименты проводили на культивируемых гранулярных нейронах мозжечка (7-9 дней и 14-16 дней в культуре, ДВК) и кортикальных нейронах крыс (7-9 дней в культуре)

Для получения гранулярных клеток мозжечка и коры использовали 7 и 1-дневных крысят линии Wistar, соответственно Черепную коробку вскрывали в соответствии с этическими требованиями по работе с животными (анестезия Холодовым способом) После декапитации животных выделяли мозжечок или кору, которые измельчали, трипсинизировали и переносили полученную суспензию клеток на покровные стекла, покрытые поли-Б-лизином или 24-луночные планшеты в концентрации 10б клеток/мл. На 3-ий день добавляли арабинозинмоноцитозид для предупреждения пролиферации не нейрональных клеток

Измерения активности ПКС в плазматической мембране культивируемых нейронов мозжечка и коры проводились в лизатах с помощью набора PepTag®-aнaлиз для нерадиоактивного определения

ПКС (Promega) Для количественного определения активности ПКС цифровое изображение электрофореграмм с разделенным фосфорилированным и нефософрилированным флуоресцентным субстратом ПКС анализировали с помощью программы ScanArrayExpress (Perkm Elmer)

Для измерения [Са2+], нейроны нагружались высокоафинным или низкоафинным Са2+-чуствительными зондами Fura-2/AM или Fura-2FF/AM соответственно. Для измерения митохондриального потенциала (ЛЧ'т) нейроны нагружались потенциал-чувствительным зондом Rh-123 Измерения [Са2+], и ДЧ'т проводились на инвертированном флуоресцентном микроскопе Axiovert-200 ("Zeiss", Германия), оборудованном CCD камерой CoolSnap-fx ("Roper Scientific", США) и системой синхронной смены фильтров "Lambda 10-2 ("Shutter") Флуоресценция зондов возбуждалась светом от ксеноновой лампы, пропускаемым последовательно через светофильтры 340 и 380 нм для Fura-2 и 490 нм для Rh-123 Динамика изменений флуоресценции зондов была проанализирована во всех нейронах, находящихся в поле зрения, с помощью компьютерной программы Metafluor 6 1 (Universal Imaging Corp ) Данные, полученные с помощью Са2+-чувствительных зондов представлены как отношение флуоресценции (505 нм), возбуждаемой светом с длинами волн 340 и 380 нм (F340/F380) Сигналы Rh-123 (535 нм) нормировались к базальному уровню флуоресценции. Для изучения перемещения изоформы ПКС(Ш культивируемые нейроны коры головного мозга крыс трансфецировали с помощью химеры, содержащей ген ПКСРИ, соединенный с зеленым флуоресцентным белком, и реагента Lipofectamine-2000 Плазмида была любезно предоставлена Dr Rizzuto (Университет Феррары, Италия)

Для изучения перемещения изоформы ПКСрН и белка RACK1 использовали иммунофлуоресцентное окрашивание. После пермеабилизации клетки инкубировали с первичными антителами (Mouse anti-RACKl и mouse anti-ПКСрП) и со вторичными антителами (Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse) С помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert-200 с CCD камерой получали цифровые изображения экспериментов

Выживаемость нейронов оценивали морфологическим и биохимическим методами Морфологическая оценка включала исследование ядерной фрагментации для анализа апоптоза с

помощью флуоресцентного красителя Hoechst 33342 и Ethidium bromide для анализа некроза С помощью красителя SYTO-13 оценивали количество живых нейронов Анализ проводили через 2 и 24 часа после часового воздействия Глу или Глу в сочетании с ФЭ или ингибиторами ПКС (хелеритрином, кальфостином С или стауроспорином). Окрашенные клетки исследовали под инвертированным флуоресцентным микроскопом Axiovert-200 Биохимическая оценка включала определение оптической плотности формазана МТТ (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) с помощью спектрофотометра Униплан (Россия) при 540 нм МТТ восстанавливается в формазан только митохондриями живых клеток

Статистическую обработку данных проводили не менее, чем в 3 параллельных пробах для каждого данного образца в 3-7 независимых экспериментах Результаты представлены в виде «среднее значение±стандартное отклонение» Обработку результатов проводили с помощью программы PRIZM 3.0, используя для сравнения полученных выборок тест one-way ANOVA Достоверными считали различия при t<0.05

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование активности ПКС при действии глутамата. Учитывая особенности культивирования нейронов в наших условиях (смешанные культуры), мы исследовали изменения активности при гиперстимуляции Глу рецепторов и действии ингибиторов ПКС, а также ее активатора ФЭ (неактивный аналог ФЭ 4аРМА во всех контрольных экспериментах не влиял на эффекты Глу) В первой серии экспериментов исследовали активность ПКС при кратковременном (рис 1) и длительном Глу воздействиях Согласно литературным данным, 15 мин Глу воздействия достаточно для временной активации ПКС (Durkm et al, 1997). В своих исследованиях мы измерили активность ПКС после 15 и 60 мин Глу воздействия Выбор указанных временных интервалов обусловлен тем, что после 15 мин с Глу не наблюдалось развития ОКД Как видно из рис 1, после 15 мин действия Глу активность ПКС увеличивалась более, чем в 3 раза После отмывки от Глу активность постепенно уменьшалась и через 4 часа она достигала контрольных величин. Полученные в настоящей работе результаты соответствуют литературным данным (Durkm et al, 1997, Tremblay et al., 1999, Busto et al, 1994)

Рисунок 1. Изменение активности ПКС нейронов мозжечка (7 ДВК) после 15 минутного воздействия Глу в концентрации 100 |хМ. Глу - 15 мин, Глу 1 ч -через час после отмывки, Глу 2ч- через 2 часа, Глу 3 ч - через 3 часа, Глу 4ч-через 4 часа. Приведены данные ^независимых экспериментов. Длительное Глу воздействие (60 мин) приводило к падению активности ПКС до 49±7% и 70±3% для клеток мозжечка и коры. Необходимо отметить, что в литературе нет единого мнения о роли изменений активности ПКС в Глу нейротоксичности: авторы, которые утверждают, что активность повышается, основываются на результатах, полученных после 15 мин с Глу (Favaron et al., 1990; Kubo and Hagiwara, 2005). Авторы, которые считают, что в основе эксайтотоксичности — падение активности ПКС, регистрируют это падение через 4 часа после отмывки от кратковременного действия Глу (Durkin et al., 1997; Tremblay et al., 1999; Busto et al., 1994).

Рисунок 2. Изменение активности ПКС нейронов мозжечка (7 ДВК) после воздейсвия в течение 1 часа ингибитора хелеритрина в концентрациях 1 -5 цМ. Приведены данные 3 независимых экспериментов.

В гранулярных клетках мозжечка стауроспорин (1 цМ, 60 мин) уменьшал активность ПКС на 84±2%, в клетках коры на 73±3% от контрольных величин. Кальфостин С в концентрации 100 пМ резко уменьшил активность ПКС как в клетках мозжечка (19±3% от контрольных величин), так и коры (9±2%). Хелеритрин значительно меньше ингибировал ПКС в нейронах обеих культур (рис. 2). В следующей серии экспериментов было изучено влияние активатора ПКС ФЭ. Как видно на рис. 3, ФЭ в дозах 100 и 500 пМ вызывал достоверное увеличение активности ПКС, которая сохранялась в течение часа после добавления ФЭ. На рис. 3 так же видно, что инкубация нейронов с ФЭ в течение 24 часов приводила к практически полному падению активности ПКС. Favaron et al. (1990) обнаружил, что 24-часовая инкубация нейронов мозжечка с ФЭ приводит к уменьшению количества ¿ТКС в клетках .на 90%. При длительном воздействии ФЭ на клетки наступает десенситизация ПКС в ответ на агонисты и DAG (Newton, 1995; Huwiler et al., 1994), наступает так называемая "down-regulation" ПКС.

Рисунок 3. Изменение активности ПКС нейронов коры (7 ДВК) после воздейсвия в течение 1 или 24 часов активатора ПКС ФЭ в концентрациях 100 и 500 пМ. Приведены данные 3 независимых экспериментов. *р<0.01 по сравнению с контролем.

Инкубация нейронов мозжечка и коры с ФЭ или хелеритрином и последующее добавление Глу (100 ¡¿М 1 час) не вносило изменений в активность ПКС, выявленную только при действии активатора или ингибитора ПКС. Аналогичные данные были получены при развитии "down-regulation" ПКС.

2. Влияние активатора и ингибиторов ПКС на нарушение кальциевого гомеостаза, вызванное действием глутамата.

В нашей лаборатории ранее было показано, что в культивируемых нейронах мозжечка, коры и гиппокампа длительное (до 1 часа) воздействие Глу вызывает двухфазное повышение [Са2+];, причём вторая фаза сопровождается синхронным падением митохондриального потенциала (так называемая отсроченная кальциевая дизрегуляция, ОКД) (КЪо<1огоу е1 а1., 2000, К1юс1огоу, 2004, Вабниц и др., 2006). В настоящих исследованиях мы изучили влияние ФЭ, окадаевой кислоты и ингибиторов ПКС на нарушения С а21 гомеостаза, вызванные действием Глу. В контрольных экспериментах, выполненных нами на нейронах коры и мозжечка, длительное (45-60 мин) воздействие Глу вызывало изменения [Са2+]1 и АТгп, которые можно так же условно разделить на две фазы (рис. 4А).

Я

ц.

ЦТ 6-

Глу

РССР

0 Са2*

- 1опо

1200 1800 2400 ЗООО 3600

Время, сек

о 12-

Глу

РССР

__Л.!— к)ПО

0 Са2 _

600 1200 1800 2400 3000 3600

Время, сек

Глу+Хелер

РССР - „ 2+— !опо 0 Са —

1200 1800 2400 3000

Время, сек

м н вЛ и

о.

1.0-

Глу+Хелер

РССР _ •—! !оло 0 Са2+ —

1200 1 800 2400 ЗООО 3600

Время, сек

в

30-

со

fe р 25-

со

ц. 20-

а.

и.

см 1Ь-

Я!

3 10-

Гпу+ФЭ

600 1200 1800 2400 3000 3600

Время, сек

о i* и_

г

N 6-

а.

Глу+ФЭ

FCCP,

lono

1000 2400

Время, сек

ЗООО 3600

1800 2400 3000 3600

Время, сек

Глу

FCCP.

tono

-ОСа24——

1200 1800 2400 3000

Время, сек

Рисунок 4. Типичные кривые динамики изменения [Са (слева) и ДЧКт (справа) нейронов мозжечка (7-9 ДВК) при действии Глу и Глу с ФЭ или хелеритрином. Воздействие (А) глутамата (100 ^М, без с 10 ¡иМ глицина) (975 нейронов), (Б) Глу и 5 цМ хелеритрина (988 нейронов), (В) Глу и 100 пМ ФЭ (1005 нейронов), (Г) Глу после 24 часового воздействия 100 пМ ФЭ (945 нейронов). Количество независимых экспериментов 5.

Первая фаза охватывает период от начала Глу воздействия до начала

вторичного подъёма [Са2+]1 и включает в себя начальный пик [Са^], и латентный период, предшествующий сильному вторичному подъёму [Са2+];. В наших опытах длительность латентного периода варьировала между клетками в пределах от секунд до десятков минут. В эту фазу [Са2_г]; ответа митохондрии обычно претерпевали сравнительно слабую деполяризацию.

Вторая фаза [Са24^ ответа включает в себя быстрый подъём [Са2+^ до высокого уровня квази-плато. Эти изменения [Са2"], сопровождаются сильной практически синхронной митохондриальной деполяризацией (рис. 4Б).

Так как клетки отвечают на Глу несколькими фазами изменения [Са2+^ , изучение влияния ПКС на кальциевый гомеостаз было целесообразно начать с вляния ПКС на первую фазу. Эти опыты мы

проводили следующим образом. Глу действовал 60 секунд, затем, после 20 минутной отмывки, когда [Са2+], возвращалась к исходному уровню, вновь добавлялся Глу на 60 секунд. Повторное добавление Глу вызывало повышение уровня свободного кальция, которое в среднем составило 52±6% от первого (3 независимых эксперимента, п=128), с этим значением сравнивалось действие изученных веществ на фоне Глу, табл 1. Ни ФЭ, ни хелеритрин сами по себе не вызывали изменений [Са2+], Однако, добавление ФЭ на фоне Глу увеличивало [Са2+], по сравнению с контрольным в 4 раза, в то же время хелеритрин уменьшал [Са2+], в 8 раз

Таблица 1. Изменение уровня свободного кальция в нейронах коры (7-9 ДВК) при действии ФЭ (100 пМ), хелеритрина (5 цМ) и окадаевой кислоты (1 цМ) на фоне Глу (100 цМ) 3 независимых эксперимента__

Воздействие Глу Глу+ФЭ Глу+Хелеритрин Глу+ОА

Вход Са2+ в % 52±6% 200±11%* 7±4%* 76±4%*

*р<0 05 по сравнению с контролем

Эти данные свидетельствуют о том, что ПКС оказывает стимулирующее влияние на проводимость NMDA канала Действительно, как показали Chihab et al (1998), Bickler et al (2004), при действии ФЭ на фоне NMDA происходило повышение степени фосфорилированности NR1 субъединицы NMDA канала протеин киназой С и усиление входящего кальциевого тока, а ингибиторы ПКС тормозили вход Са2+

Необходимо отметить, что фосфорилирование белков - это сбалансированный процесс, на чашах весов которого находятся киназы и фосфатазы. Когда подобный баланс потерян, нейрон может погибнуть. Для изучения вклада фосфатаз обычно используется окадаевая кислота (специфичный ингибитор протеин фосфатаз 1 и 2A) Manev et al (1992) в исследованиях на гранулярных клетках мозжечка впервые описали токсический эффект окадаевой кислоты, связанный с блокированием процесса дефосфорилирования белков. В этих опытах инкубация нейронов с окадаевой кислотой вызывала значительную гибель, которая блокировалась ингибитором ПКС или предшествующей "down-regulation" ПКС Был сделан вывод, что в Глу нейротоксичности огромную роль играет длительное фосфорилирование, частично опосредованное ПКС К таким же выводам пришли Jiang et al (2000)

В наших экспериментах окадаевая кислота увеличивала [Са2+], во время кратковременного воздействия Глу (60 сек) в полтора раза.

Таким образом, дисбаланс фосфорилирования и дефосфорилирования

и

сказывается уже на характере первой фазы входа Са2+: при активации ПКС или блокировании дефософорилирования субстратов ПКС окадаевой кислотой количество вошедшего кальция увеличивается. Далее мы проанализировали эффекты ФЭ, окадаевой кислоты и ингибиторов ПКС на 2 фазу изменений [Са2+]ь т.е. на развитие ОКД, вызванной длительным воздействием Глу. Для характеристики ОКД использовались понятия среднего времени возникновения ОКД и процент клеток с ОКД к общему количеству нейронов, которые достаточно полно отражали различия между контрольным и опытным экспериментами (табл. 2 и рис. 5).

Таблица 2. Среднее время возникновения ОКД и процент нейронов мозжечка (7-9 ДВК) с ОКД. Глу 100 цМ, ФЭ 100 пМ, хелеритрин 5 цМ, окадаевая кислота 1 цМ. 5 независимых экспериментов. _____

Вид воздействия Глу ФЭ 24 часа+Глу ФЭ+Глу Хелеритрин+Глу ОА+Глу

Процент клеток с ОКД 83+7 57+9* 8817* 54+2** 91±4

Среднее время возникновения ОКД, сек 890±47 1308185* 693+51* 1427+62* 356+42

* р<0.05, ** р<0.01 по сравнению с действием Глу.

Необходимо отметить, что молодые нейроны коры оказались более чувствительны к Глу, чем гранулярные клетки мозжечка (330±39 сек и 890±47 сек соответственно, р<0.05)._

0 1000 2000 3000 4000 Время, сек

Рисунок 5. Динамика возникновения ОКД в нейронах мозжечка (7-9 ДВК). ■ - Глу 100 цМ; ▲ - ФЭ 100 пМ+Глу; □ - ФЭ 100 пМ 24 ч+Глу; о -хелеритрин 5 |1М+Глу. 5 независимых экспериментов.

ФЭ и окадаевая кислота на фоне Глу приводили к ускорению наступления ОКД и дизрегуляция наступала в большем числе нейронов

Ингибитор ПКС хелеритрин и "down-regulation" ГПСС приводили к замедлению ОКД, количество нейронов с ОКД достоверно уменьшалось (рис 5) На культуре нейронов коры были получены аналогичные данные

Окадаевая кислота на фоне Глу вызывала ускорение наступления кальциевой дизрегуляции, процент клеток с ОКД по сравнению с Глу изменился незначительно. Иными словами, OA и ФЭ при действии Глу оказывают аналогичное действие на кальциевый гомеостаз нейронов

На основании полученных данных можно предположить, что активированная ПКС увеличивает кальциевый ток NMDA каналов, окадаевая кислота и ФЭ способствуют этому, вследствие чего ОКД наступает быстрее

3. Изучение поведения изоформы ПКСРП и белка RACK1 при длительном действии глутамата.

ПКСРП - это такая изоформа, которая обладает основными свойствами и функциями, характерными для всего семейства ПКС В работе были исследованы внутриклеточные перемещения специфической изоформы ПКСрП, генетически соединенной с зеленым флуоресцентным белком, при длительной активации Глу рецепторов нейронов коры головного мозга крысы Одновременно с изучением транслокации ПКС измеряли внутриклеточный уровень Са2+ с помощью флуоресцентного зонда Fura-2FF В нейронах, которые демонстрировали характерный монофазный обратимый подъём уровня кальция в ответ на Глу (100 цМ, 15 мин), ПКСрП транслоцировалась на плазматическую мембрану и оставалась на всем протяжении Глу воздействия. Однако, в нейронах, в которых наступала ОКД, во время первой фазы кальциевого ответа ПКСрП также транслоцировалась на плазматическую мембрану, но во время 2-ой фазы, когда Са2+ начинал выходить на плато, ПКСрП отделялась от мембраны и перегруппировывалась в органелло-подобные структуры в цитоплазме, резко отличающиеся от равномерного распределения ПКСрП до Глу воздействия (рис 6)

Рисунок 6. Одновременная регистрация изменения [Са и перемещения ПКСрП в нейроне коры (7 ДВК). Цифрами обозначено время в секундах. Глу 100 рМ. 5 независимых экспериментов.

Уборка кальция из среды после транслокации ПКСрП приводила к восстановлению [Садо базального уровня, при этом ПКС(Ш равномерно распределялась в цитозоле; при возвращении Са2+ в среду инкубации вновь наступала ОКД, синхронно с ней ПКСрП вновь образовывала в цитозоле органелло-подобные структуры (рис. 6).

При добавлении иономицина, который, являясь кальциевым ионофором, резко увеличивает [Са2+];, наблюдалось перемещение ПКСРН в органелло-подобные структуры в цитоплазме. Присутствие в среде ингибитора ПКС стауроспорина не оказывало заметного влияния на картину транслокации при действии Глу. При действии ФЭ ПКСРИ транслоцировалась на мембрану, но при

-Са2++ЕСТА

■ 2001

О 800 1200 1800 2400

время, сек

повышении [Са2+], , вызванном Глу или иономицином, IlKCßll оставалась на мембране. Это указывает на то, что ФЭ способствует необратимому сильному связыванию IlKCßll с мембраной Анализ механизмов транслокации ПКС был проведён в специальной серии экспериментов, в которой изучали перемещение IlKCßll и белка RACK1 с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания Как известно, RACK1 связывает активированную ПКС, выступая как белок-транспортер (Schechtman and Mochly-Rosen, 2001) RACK1 перемещается с ПКС к внутриклеточным органеллам Связывание ПКС с RACKs специфическое, RACK1 взаимодействует с IlKCßll С помощью окраски антителами к ПКС было показано, что при Глу воздействии ПКС транслоцируется на мембрану, и затем, по данным Popp et al, 2006, в различные внутриклеточные компартменты, в зависимости от изоформы ПКС После воздействия ФЭ ПКС детектировалась только на плазматической мембране клеток (Büchner et al, 1999).

Обнаруженные нами изменения в транслокации nKCßll при длительном воздействии Глу были сопоставлены с перемещениями белка RACK1. В контроле nKCßll и RACK1 были равномерно распределены в цитоплазме и начальных участках нейритов При длительном воздействии Глу, когда имела место ОКД, оба белка выявлялись во внутриклеточных органелло-подобных структурах цитоплазмы нейронов Активация nKCßll ФЭ приводила к транслокации обоих белков на плазматическую мембрану нейронов При сравнении распределения RACK1 и nKCßll наблюдалась колокализация белков. На обеих культурах нейронов были получены аналогичные результаты

Полученные данные указывают на то, что при наступлении кальциевой перегрузки, вызванной гиперстимуляцией Глу рецепторов, активная, связанная с RACK1 ПКС перемещается из плазматической мембраны в органелло-подобные структуры в цитоплазме, возможно в комплекс Гольджи (Ron et al, 1999), и, вероятно, происходит дальнейшая передача сигнала на системы, приводящие к повреждению и последующей гибели нейронов 4. Оценка выживаемости молодых и старых культур нейронов после длительного глутаматного воздействия при действии активатора и ингибиторов ПКС.

В следующей серии экспериментов мы оценили влияние ФЭ и ингибиторов ПКС на выживаемость нейронов спустя 24 часа после 60

мин воздействия Глу с помощью морфологического и биохимического методов. Результаты, полученные обоими методами, совпали. Процент гибели культивируемых нейронов в контроле не превышал 8-10%. Исследования, проведённые на интактных нейронах, показали, что ингибиторы ПКС стауроспорин и кальфостин С оказались более токсичными, чем хелеритрин. Часовое воздействие Глу вызывало гибель нейронов мозжечка и коры примерно в одинаковой степени (22±6% и 24±4% соответственно). Как видно на рис.7, 0.2 иМ стауроспорина, 20 пМ кальфостина С оказывали определённый защитный эффект при действии Глу.

100 3? ш 80 о X о ,S 60 о X g 40 О ю S u 20 0 * 1 * Г г; * 1 •8 * t : 1 * §" 1 1 1 9 I * р>.

Глу Стауро 0,2 Стауро1 КальфС20 КальфСЮО Хелер 1 Хелер5 Хелер 8

Рисунок 7. Влияние ингибиторов на гибель нейронов мозжечка (7-9 ДВК) при действии Глу. Левые столбики - ингибиторы, правые - ингибиторы с Глу. Глу 100 |iM 1 час. Стауроспорин в концентрациях 0,2 и 1 цМ, кальфостин С 20 и 100 пМ, хелеритрин 1, 5, 8 ц.М. Выживаемость измерялась через 24 часа. МТТ тест, гибель нейронов по отношению к контролю. Приведены данные 7 независимых экспериментов. *р<0.05 по сравнению с действием ингибитора. Большие дозы этих ингибиторов, добавленные во время Глу воздействия, усиливали гибель нейронов, вероятно, из-за высокой исходной токсичности этих препаратов. В то же время практически все применённые дозы хелеритрина защищали зернистые клетки мозжечка от токсического действия Глу. Аналогичные данные были получены при исследовании нейронов коры.

В следующей серии исследований мы оценили эффекты кратковременного и длительного действия ФЭ на выживаемость нейронов разного возраста на фоне Глу. В молодых нейронах (7-9 ДВК) ФЭ сам по себе и "down-regulation" ПКС не вызывали гибели нейронов. Добавление ФЭ к молодым нейронам мозжечка, подвергнутым токсическому действию Глу, увеличивало количество погибших нейронов. В тоже время после развития "down-regulation" ПКС Глу практически не вызывал гибель нейронов (рис. 8).

Аналогичные данные при 24 часовом воздействии ФЭ на нейроны мозжечка были получены Ра\;агоп е1 а1. (1990).

Рисунок 8. Влияние ФЭ на гибель нейронов мозжечка (7-9 ДВК) при действии Глу. Глу 100 цМ, ФЭ 100 пМ 1 час или 24 часа. Выживаемость измерялась через 24 часа. МТТ тест, гибель нейронов по отношению к контролю. Приведены данные 7 независимых экспериментов. *р<0.05 по сравнению с действием Глу.

Иные эффекты ФЭ и хелеритрина были выявлены в старых нейронах мозжечка (14-16 ДВК).

Рисунок 9. Гибель нейронов мозжечка (14 ДВК) при действии Глу. Глу 100 (iM, ФЭ 100 пМ, хелеритрин 5 цМ 1 час. Выживаемость измерялась через 24 часа. МТТ тест, гибель нейронов по отношению к контролю. Приведены данные 4 независимых экспериментов. *р<0.05 по сравнению с действием Глу. Как видно на рис. 9, Глу вызывал 50±4% гибель нейронов, хелеритрин в дозе 5 цМ сам по себе был высокотоксичен, а в сочетании с Глу гибель нейронов увеличилась до 69±8%. В отличие от молодых нейронов, в старых клетках 60 мин воздействие ФЭ защищало клетки от Глу нейротоксичности. При "down-regulation" ПКС после действия Глу гибель была такой же, что и при действии

одного Глу Механизмы таких возрастных особенностей действия активатора и ингибитора ПКС не совсем понятны и требуется проведение специальных исследований, направленных на изучение процессов фосфорилирования NMDA каналов.

Hartley et al (1993) в исследованиях на нейронах коры показали, что при увеличении концентрации Глу (10-100 цМ) и времени его воздействия (0-10 мин) количество накопленного 45Са2+ коррелировало с гибелью клеток через 24 часа Присутствие в растворах наряду с Глу антагонистов NMDA-каналов уменьшало как накопление Са2+, так и долю погибших нейронов Эти результаты позволили предположить, что избыточный вход кальция через NMDA-каналы является ключевым звеном в цепи процессов, ведущих к нейрональной гибели, индуцируемой Глу Для того, чтобы ответить на вопрос, насколько связана ОКД с гибелью нейронов и какова роль при этом ПКС, в следующей серии исследований мы проследили в течение 2 часов за судьбой клеток, подвергнутых токсическому действию Глу после "down regulation" ПКС. Протокол этих исследований был следующим- молодые нейроны мозжечка были загружены Са2+ чувствительным зондом Fura-2FF, было зафиксировано появление ОКД, затем через 2 часа после отмывки от Глу нейроны были окрашены флуоресцентным красителем Syto-13 для определения числа живых клеток Как следует из табл. 3, при действии Глу ОКД развивалась в 60±4% нейронов и большинство из них погибло В то же время после "down regulation" ПКС ОКД развилась в значительно меньшем числе нейронов, а погибших клеток было всего 2%

Таблица 3. Влияние "down regulation" ПКС (ФЭ 100 пМ, 24 ч) в молодых нейронах мозжечка на ОКД и гибель нейронов через 2 часа после 45 мин Глу (100

|iM) воздействия Проведено 3 независимых эксперимента

Вид воздействия Всего нейронов % клеток с ОКД % погибших нейронов

Контроль 290 0 3±1*

Глу 871 60±4* 43±4*

ФМА 500 пМ 24 часа, Глу 707 23±3* 2±1*

05 по сравнению с действием Глу

Дальнейший анализ этих данных показал, что после Глу воздействия нейроны можно разделить на три группы (а) имеется только первая фаза и большинство нейронов остаются живыми, (б) есть вторая фаза, нейроны окрашиваются Syto-13, (в) есть ОКД и нейроны не окрашиваются Syto-13, т е мертвые клетки Итак, погибли только те нейроны, в которых развилась ОКД, но ее наличие оказалось не обязательно для гибели клеток В этих экспериментах так же была проанализирована первая фаза входа Са2+ Оказалось, что ни количество вошедшего кальция, ни длительность первой фазы во всех трех популяциях нейронов друг от друга существенно не отличаются. То есть по характеру первой фазы нельзя предсказать дальнейшую судьбу клетки, погибнет она или нет В экспериментах с "down-regulation" ПКС длительность первой фазы была короче и составила 52±12 секунд, в контроле - 112±16 секунд (данные по 3 независимым экспериментам) В случае "down-regulation" ПКС, когда количество киназы в клетке сильно понижено, нейроны с ОКД не погибли С учетом этих данных можно выделить несколько необходимых факторов, наличие которых приведет к гибели нейронов при действии Глу. (а) наличие ПКС в клетке, (б) активация ПКС, (в) появление ОКД.

Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о важной роли ПКС в нарушениях Са2+ гомеостаза, развитии отсроченной Са2+ дизрегуляции и повреждении нейронов при гиперстимуляции Глу рецепторов

выводы

1 Изменения активности ПКС, вызванные действием глутамата на культивируемые нейроны мозжечка и коры головного мозга, зависят от времени его воздействия Кратковременное (15 мин) действие глутамата приводит к увеличению активности ПКС В тоже время при длительной гиперстимуляция глутаматных рецепторов (45-60 мин) выявляется ее уменьшение

2 В опытах на нейронах коры и мозжечка показано, что при глутаматном воздействии происходит двухфазное увеличение [Са2+]„ 2-ая фаза повышения [Са2^ сочетается с сильной митохондриальной деполяризацией - наступает отсроченная кальциевая дизрегуляция

3 Во время 1-ой фазы увеличения [Ca2+]t выявлена транслокация ПКСрП из цитозоля на плазматическую мембрану Развитие ОКД сопровождается перемещением ПКСрП с помощью транспортного бежа RACK1 из мембраны в цитозоль, а затем в органелло-подобные структуры в цитоплазме

4 В культивируемых молодых нейронах мозжечка и коры (7-9 ДВК) подавление активации ПКС ингибиторами в малых дозах замедляет развитие ОКД и защищает клетки от токсического действия глутамата Высокие дозы ингибиторов ПКС являются токсичными и не оказывают защитного действия

5 В молодых нейронах активатор ПКС форболовый эфир усиливает 1-ую фазу вызванного глутаматом повышения [Са2+], и ускоряет развитие ОКД При "down-regulation" ПКС, когда активность ПКС после 24 часовой аппликации форболового эфира падает до нуля, наблюдается задержка появления ОКД и повышается выживаемость молодых нейронов.

6 В старых нейронах мозжечка (14-16 ДВК) ингибиторы ПКС увеличивают глутамат-вызванную гибель нейронов, "down-regulation" ПКС не защищает нейроны от токсического глутаматного воздействия, в этих клетках защитным эффектом обладает форболовый эфир

7 Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что активация ПКС участвует в нарушениях Са2+ гомеостаза, развитии отсроченной Са2+ дизрегуляции, вызванной гиперстимуляцией Глу рецепторов. Представленные результаты показывают, что при действии глутамата активная ПКС принимает участие в каскаде сигнальных механизмов, приводящих к повреждению и последующей гибели нейронов

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1 Коровкина Н. А. (Персиянцева), Пинелис В Г, Бирих К Р, Михайлова M M, Большаков А П Протеин киназа С и глутаматная нейротоксичность/УСборник тезисов Второго Международного Междисциплинарного Конгресса «Нейронаука для медицины и психологии» - Судак, Крым, Украина, 2006 -С 110

2 Бирих К Р, Михайлова M M, Большаков А П, Коровкина Н. А. (Персиянцева), Пинелис В Г Ретранслокация протеинкиназы Cpil (ПКСрИ) с плазматической мембраны во внутриклеточные кластеры при кальциевой перегрузке в культивированных нейронах//Материалы международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" - Пущино, 2005 - С 107

3 Коровкина Н. А. (Персиянцева), Пинелис В Г, Бирих К Р, Михайлова M M, Большаков А П Роль протеин киназы С при глутаматной нейротоксичности//Материалы международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" -Пущино, 2005 -С 135

4 Бирих К Р, Большаков А П, Михайлова M M, Коровкина H. А. (Персиянцева), Пинелис В Г Ретранслокация протеин киназы Cpil (ПКСрН) с плазматической мембраны во внутриклеточные кластеры при кальциевой перегрузке в культивированных нейронах//Материалы научной конференции "Нейрохимия Фундаментальные и прикладные аспекты" -Москва, 2005 -С. 156

5. Pmehs V G, Binkh К R, Korovkina N. A. (Persiyantseva), Mikhailova M M., Bolshakov A P Retranshcation of protein kinase С from plasma membrane to distinct intracellular sites under [Ca2+] overload induced with glutamate in primary cultured cortical пеигопз//Материалы международной конференции "Neuroscience 2005"/ - Вашингтон, США, 2005 - Poster 946 7

6 Сорокина Е Г, Пинелис В Г, Реутов В П, Крушинский A JI, Кузенков В. С , Кошелев В Б, Сторожевых Т П, Сенилова Я. Е, Коровкина Н. А. (Персиянцева), Гранстрем О К Новые данные в изучении механизмов повреждения мозга при эпилепсии и гипоксии//Материалы XIII Международной Конференции и Дискуссионного Научного Клуба "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", Приложение к журналу «Открытое образование» - Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2005 - С 288

7 Персиянцева Н. А., Бирих К. Р , Дворецкова Е А., Пинелис В Г, Ходоров Б И Вклад протеин киназы С в механизмы нарушения Са2+ гомеостаза в культивируемых нейронах крысы при гиперстимуляции глутаматных рецепторов//Бюлл. Эксп Медицины и Биологии - 2008.- № 3

Подписано в печать 20 02 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 102 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Персиянцева, Надежда Александровна

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Научная новизна работы

1.4. Практическая ценность работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Физиологическая роль глутамата

2.2. Патологическая роль глутамата

2.2.1. Влияние глутаматного удара на внутриклеточную концентрацию кальция

2.2.2. Роль глутамата при ишемии 15 2.3 Протеин киназа С

2.3.1. Строение и функции ПКС

2.3.2. Активация ПКС

2.3.3. RACKs

2.3.4. ПКС и СаМ

2.3.5. "Down-regulation" ПКС

2.3.6. Активность ПКС в культурах нейронов, гибель клеток

2.3.7. Транслокация ПКС

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Реагенты

3.2. Приготовление первичных культур нейронов коры и мозжечка

3.3. Индукция гибели

3.4. Биохимические и флуоресцентные методы анализа жизнеспособности нейронов

3.4.1. Флуоресцентное окрашивание Hoechst 33342, Ethidium bromide, SYTO

3.4.2. MTT

3.5. Микрофлуориметрические исследования

3.5.1. Измерение [Са ],

3.5.2. Измерение относительного уровня Ау/т

3.5.3. Математический анализ

3.6. Определение активности ПКС

3.7. Трансфекция ПКСрП

3.8. Иммунофлуоресцентное окрашивание ПКС

3.9. Статистический анализ результатов

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Исследование действия ФЭ и ингибиторов на активность ПКС

4.1.1. Влияние ингибиторов и ФЭ на активность ПКС в культивируемых нейронах

4.1.2. Активность ПКС при глутаматном воздействии

4.2. Влияние ингибиторов ПКС, ФЭ и окадаевой кислоты на индуцированные глутаматом изменения динамики [Са2+], и Д\|/т

4.2.1. Влияние ингибиторов ПКС и ФЭ на первую фазу индуцированного глутаматом изменения динамики [Са2*],

4.2.2. Влияние ингибиторов ПКС и ФЭ на вторую фазу индуцированного глутаматом изменения динамики [Са2т]

4.2.3. Влияние окадаевой кислоты на индуцированные глутаматом изменения динамики [Са2 ],

4.3. Транслокация ПКСрП в нейронах коры при стимуляции глутаматных рецепторов

4.4. Изучение перемещений изоформы ПКС(ЗП и белка RACK1 в нейронах коры и мозжечка при длительном действии глутамата

4.5. Оценка выживаемости молодых и старых культур нейронов после длительного глутаматного воздействия при действии активатора и ингибиторов ПКС

4.5.1. Влияние ингибиторов на гибель нейронов

4.5.2. Исследование гибели нейронов при глутаматном воздействии. Влияние ингибиторов и ФЭ

4.5.3. Исследование "down-regulation " ПКС и выживаемости нейронов

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

6. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль протеин киназы С в механизмах нарушения кальциевого гомеостаза в нейронах мозжечка и коры при гиперстимуляции глутаматных рецепторов"

Актуальность проблемы Заболевания центральной нервной системы являются одной из актуальных проблем медицины, что обусловлено их существенной долей в структуре заболеваемости и смертности населения, высокими показателями временной и стойкой утраты трудоспособности. Среди данных заболеваний ведущее место занимает ишемический инсульт. По данным ряда авторов он составляет около 80% общего числа инсультов [19].В ишемическом каскаде большую роль играют глутаматные рецепторы.При спазмах сосудов наблюдается снижение кровотока, гипоксия, что провоцирует выброс нейротрансмиттеров. Глутамат (Глу) активирует рецепторы, происходит мощный вход кальция и натрия внутрь клетки и выход калия [11, 101]. Обнаружено, что длительное воздействие Глу на нейроны приводит к увеличению концентрации внутриклеточного кальция ^ i 0-4-([Са" ],) и развитию так называемой отсроченной Са дизрегуляции (ОКД) [10, 11, 63, 83]. Стойкое повышение [Са ]j способно стимулировать активность Са -зависимых протеин киназ и протеин фосфатаз, в частности протеин киназы С (ПКС). Изменения активности ПКС при ишемии были отмечены в тканях многих органов: головного мозга, сердца, печени, почек [113].Несмотря на интенсивные исследования, вклад ПКС в механизмы повреждения нейронов при гиперстимуляции Глу рецепторов окончательно не установлен. Рядом исследователей показано, что предварительное уменьшение активности и содержания ПКС в нейронах защищает их от Глу нейротоксичности [48, 75, 76]. В то же время другие исследователи утверждают, что для защиты клеток необходимо противодействовать инактивации ПКС [23, 43, 44, 120].Со времени открытия ПКС в 1977 году было получено достаточное количество информации о биохимии и молекулярной биологии белков семейства ПКС. В понимании их регуляции и участия в различных сигнальных путях множества организмов, от дрожжей до млекопитающих, были достигнуты фундаментальные успехи. Однако остаётся не ясным, какой же вклад вносит ПКС в механизмы повреждения нейронов, вызванные гиперстимуляцией Глу рецепторов: активация ПКС или падение активности связаны с повреждающим действием Глу. До сих пор мало изучена функциональная роль отдельных изоформ ПКС, которые экспрессируются в одной и той же клетке; практически отсутствуют данные о том, что происходит с ПКС при длительном Глу воздействии, остаётся ли она при этом на плазматической мембране. Имеются данные о влиянии ПКС на Са?+ токи через NMDA каналы [18, 32], однако, совершенно не изучено влияние её активации или ингибирования на нарушение Са2+ гомеостаза, на развитие ОКД. Остаётся недостаточно изученным, принимает ли участие ПКС в особенностях действия Глу на нейроны разного возраста.1.2. Цель и задачи исследования Целью данной работы было исследовать роль протеин киназы С в механизмах нарушения кальциевого гомеостаза и гибели культивируемых нейронов мозжечка и коры при гиперстимуляции глутаматных рецепторов.Задачи исследования: 1. Определить особенности изменений активности ПКС при кратковременном и длительном глутаматном воздействии, при действии активатора — форболового эфира (ФЭ) и ингибиторов ПКС; 2. Изучить изменения [Са"+]} и трансмембранной разности потенциала внутренней мембраны митохондрий при длительном воздействии глутамата, ФЭ и ингибиторов ПКС; 3. Изучить поведение изоформы ПКСРП в нейронах коры при длительном действии глутамата, ФЭ, ингибитора ПКС и Са ионофора -иономицина; 4. Оценить выживаемость нейронов после длительного глутаматного воздействия при действии ФЭ и ингибиторов ПКС.

1.3. Научная новизна работы В работе впервые было обнаружено, что транслокация изоформы ПКСрП происходит параллельно с изменениями [Са ]„ вызванными длительным Глу воздействием. Во время первой фазы повышения [Са2+]; ПКС перемещается из цитозоля на плазматическую мембрану нейронов.Обратная транслокация ПКСрП с плазматической мембраны в цитозоль (в органелло-подобные структуры в цитоплазме) происходит одновременно с развитием ОКД и осуществляется с помощью транспортного белка RACK1.Впервые было показано, что развитие ОКД с одной стороны, может быть причиной последующей гибели нейронов, с другой стороны, несмотря на ОКД, нейроны остаются живыми. Обнаружено, что в молодых нейронах ингибиторы ПКС защищают клетки от действия Глу, задерживают развитие ОКД и уменьшают количество клеток с дизрегуляцией кальция.Установлено, что 24 часовое действие ФЭ уменьшает активность ПКС до минимальных значений и приводит к развитию "down-regulation" ПКС. Впервые показано, что в этих условиях длительное воздействие Глу не вызывает гибели молодых нейронов, уменьшает число клеток с ОКД, замедляет время её наступления. Обнаружено, что ингибитор фосфатаз окадаевая кислота на фоне длительного действия Глу вызывает эффекты, подобные ФЭ, ускоряя развитие ОКД. В то же время в старых нейронах "down-regulation" ПКС не влияет на гибель нейронов после Глу воздействия.1.4. Практическая ценность работы Полученные в работе данные, раскрывающие вклад ПКС в механизмы нарушения Са гомеостаза и гибели нейронов, вызванные длительным Глу воздействием, важны для понимания процессов, лежащих в основе повреждения нейронов при ишемии/гипоксии мозга. Способность некоторых ингибиторов ПКС защищать нейроны от токсического действия Глу может иметь практический выход: это создание лекарственных препаратов, нацеленных на изменение активности ПКС. Очевидную практическую ценность имеют полученные в работе данные об изменениях активности ПКС и эффекты "down-regulation" на механизмы нарушения Са гомеостаза и повреждения нейронов. Это способствует выявлению причин повреждения нейронов при гиперстимуляции глутаматных рецепторов и, тем самым, поможет подойти к решению актуальной проблемы, направленной на профилактику и терапию ряда заболеваний центральной нервной системы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Персиянцева, Надежда Александровна

6. выводы

1. Изменения активности ПКС, вызванные действием глутамата на культивируемые нейроны мозжечка и коры головного мозга, зависят от времени его воздействия. Кратковременное (15 мин) действие глутамата приводит к увеличению активности ПКС. В тоже время при длительной гиперстимуляция глутаматных рецепторов (45-60 мин) выявляется её уменьшение.

2. В опытах на нейронах коры и мозжечка показано, что при глутаматном воздействии происходит двухфазное увеличение [Ca2+]j, 2-ая фаза повышения [Ca2+]j сочетается с сильной митохондриальной деполяризацией — наступает отсроченная кальциевая дизрегуляция.

0 А

3. Во время 1-ой фазы увеличения [Са ]j выявлена транслокация ПКС|ЗП из цитозоля на плазматическую мембрану. Развитие ОКД сопровождается перемещением ПКС|311 с помощью транспортного белка RACK1 из мембраны в цитозоль, а затем в органелло-подобные структуры в цитоплазме.

4. В культивируемых молодых нейронах мозжечка и коры (7-9 ДВК) подавление активации ПКС ингибиторами в малых дозах замедляет развитие ОКД и защищает клетки от токсического действия глутамата. Высокие дозы ингибиторов ПКС являются токсичными и не оказывают защитного действия.

5. В молодых нейронах активатор ПКС форболовый эфир усиливает 1-ую фазу вызванного глутаматом повышения [Са" ]; и ускоряет развитие ОКД. При "down-regulation" ПКС, когда активность ПКС после 24 часовой аппликации форболового эфира падает до нуля, наблюдается задержка появления ОКД и повышается выживаемость молодых нейронов.

6. В старых нейронах мозжечка (14-16 ДВК) ингибиторы ПКС увеличивают глутамат-вызванную гибель нейронов, "down-regulation" ПКС не защищает нейроны от токсического глутаматного воздействия, в этих клетках нейропротекторным эффектом обладает форболовый эфир.

78

7. Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что активация ПКС способствует нарушениям Са гомеостаза, развитию отсроченной Са2+ дизрегуляции, вызванной гиперстимуляцией Глу рецепторов. Представленные результаты показывают, что при действии глутамата ПКС принимает участие в каскаде сигнальных механизмов, приводящих к повреждению и последующей гибели нейронов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает признательность своему научному руководителю д.м.н. профессору Пинелису В. Г. за помощь в написании работы, за полученные знания, заботу, неусыпное внимание и руководство исследованиями. Особенно хочется поблагодарить к.б.н. Бирих К. Р. за ценные советы, плазмиду с nKC(3II-GFP и помощь в определении активности ПКС.

Также хочу сказать спасибо. д.м.н. проф. Ходорову Б. И. за идею проведения исследований по изучению роли ПКС при глутаматной нейротоксичности.

Сениловой Я. Е. за обучение основам культивирования нейронов и моральную поддержку. д.б.н. Сторожевых Т. П. за своевременные подсказки. . .к.б.н. Горбачёвой JI. Р. за помощь в интерпретации данных. .к.б.н. Сорокиной Е. Г. за помощь в публикации материалов. .к.б.н. Большакову А. П. и к.б.н. Михайловой М. М. за эксперименты по трансфекции нейронов. к.б.н. Давыдовой О. Н. за советы по оформлению диссертации.

Как уже было отмечено, в литературе существуют противоречивые выводы о роли изменений активности ПКС в повреждении нейронов при гиперстимуляции Глу рецепторов. Имеются данные, что глутамат вызывает быстрое увеличение, а потом падение активности ПКС, ингибиторы ПКС значительно усиливают глутаматную нейротоксичность. На основании этих результатов было сделалано заключение, что быстрая потеря активности ПКС - характерная особенность ишемии мозга и всегда происходит при NMDA-индуцированной гибели нейронов [44, 120]. С другой стороны были получены данные, что при действии Глу активность ПКС увеличивается, её ингибиторы повышают выживаемость клеток и блокируют эффект Глу. Это позволило сделать вывод, что активация и транслокация ПКС вследствие стимуляции Глу рецепторов может способствовать отсроченному входу Са" , что провоцирует гибель клеток [25, 75, 76]. Для того, чтобы внести в этот вопрос ясность, в настоящей работе было оценено влияние активатора и ингибиторов ПКС на гибель нейронов при действии Глу.

В культивируемых нейронах мозжечка и коры часовая инкубация с Глу вызывала в среднем 25% гибель клеток. Ингибиторы ПКС в низких концен фациях способствовали снижению Глу нейротоксичности (гл. 4.4.2., рис. 24). При действии Глу ингибирование повышенной, по сравнению с интактными клетками, активности ПКС приводило к увеличению выживаемости нейронов. Полученные данные созвучны результатам Нага et al. [55], Manev et al.[75, 76] и др. Высокие дозы ингибиторов ПКС были токсичными и не оказывали защитного действия. Известно, что кальфостин С ингибирует клеточную пролиферацию и вызывает апоптоз [87], хелеритрин способствует разрушению гетеродимера Bax-BcL-XL, выходу цитохрома с из митохондрий, и, следовательно, апоптозу [31]. Jiang et al. [61] на культуре коры показали, что ингибирование ПКС, блокирование NMDARs и изъятие внеклеточного кальция способствует выживаемости нейронов при глутаматной эксайтотоксичности. Вышесказанное даёт право заключить, что именно активация ПКС способствует эксайтотоксичности. Это заключение было подтверждено нашими экспериментами с ФЭ.

На обеих культурах клеток, используя эффект "down-regulation" ПКС после 24 часовой инкубации с активатором киназы ФЭ, была проверена гипотеза [48, 55, 73, 75], что именно активация ПКС вносит вклад в нейротоксичность Глу. "down-regulation" ПКС сама по себе не способствовала гибели нейронов (гл. 4.4.2., рис. 25), возможно потому, что клетки включали компенсаторные механизмы, обеспечивающие достаточный уровень фосфорилирования для нормальной жизнедеятельности, в пользу этого заключения говорит тот факт, что геном человека содержит более 1 ООО генов протеин киназ [7]. При "down-regulation" ПКС наблюдалась полная защита нейронов от Глу эксайтотоксичности.

Активность ПКС при действии ФЭ увеличивалась в 2 раза по сравнению с контролем (гл. 4.1.1., рис. 7), такая активация длилась не менее часа, хотя согласно данным Favaron et al. [48], эффект ФЭ длится менее 15 минут. Однако то, что активность сохраняется, подтвердили эксперименты с нейронами коры, трансфецированными ПКСрП-GFP (гл. 4.3., рис. 19) и

73 окрашенными антителами к ПКСрП и RACK1 (гл. 4.3., рис. 21). Оказалось, что через час инкубации с ФЭ ПКСрП и RACK1 остаются на плазматической мембране клеток. В опытах с трансфецированными нейронами, ни Глу, ни иономицин не смогли повлиять на локализацию ПКСрП. Таким образом, форболовый эфир обеспечивает гораздо более сильное связывание ПКС с плазматической мембраной, чем естественный активатор DAG, который активирует ПКС путем увеличения ее сродства к

Са и фосфолипидам [7, 70, 98, 102]. Интересно, что при активации ПКСРП форболовым эфиром в астроцитах происходит её перемещение на плазматическую мембрану. Однако этот процесс не синхронен с транслокацией RACK1; количество RACKl-nKCpTI в мембране возрастает постепенно, что говорит о связывании RACK1 с активированной ПКСрП на плазматической мембране, а не в цитозоле. Существующее предположение, что в процессе транслокации ПКС на мембрану задействован цитоскелет, подтвердилось тем, что после разрушения его актиновой компоненты перемещение ПКСРП было прекращено [91].

Для того, чтобы изучить влияние ПКС на нарушение кальциевого гомеостаза, вызванного Глу, исследовали влияние ФЭ, окадаевой кислоты и ингибиторов ПКС на вход кальция во время первой фазы, на время возникновения ОКД и количество нейронов с ОКД. Активатор ПКС ФЭ и

Л t ингибитор фосфатаз окадаевая кислота на фоне Глу усиливали вход Са в первую фазу изменений [Са ]j. Хелеритрин резко уменьшал количество кальция, вошедшего в клетки (гл. 4.2.1., рис. 12). Таким образом, баланс фосфорилирования и дефосфорилирования сказывается уже на характере

24* первой фазы входа Са . Эти данные соответствуют литературным, согласно которым при активации ПКС происходило усиление входа кальция через NMDARs [15, 18, 36, 40, 71]. Глу также способствовал тому, что ПКС фосфорилировала автоингибиторный домен кальциевого насоса плазматической мембраны нейронов [46], тем самым, препятствуя откачке кальция. Таким образом, быстрая активация ПКС является одной из причин развития так называемой второй фазы [47].

Castilho et al. [27] в опытах па молодых гранулярных клетках мозжечка крыс обнаружили, что после 20-60 мин действия глутамата в этих клетках возникает вторичный подъём [Са" ];. Они показали также, что для индивидуальных молодых нейронов, в которых наблюдался двухфазный подъём [Са2+];, латентный период (между первой и второй фазами) значительно варьировал. В данной работе впервые было изучено влияние ПКС на развитие ОКД, Са" плато и митохондриальной деполяризации при действии Глу. White and Reynolds [126] показали, что нарушение работы митохондрий является первичным событием в глутаматной нейротоксичности. Митохондриальная деполяризация вовлечена в механизм нарушения нейронального кальциевого гомеостаза, вызванного глутаматом и всегда сопровождает появление кальциевого плато [10, 21, 22, 27]. I

Есть данные, что активная ПКС фосфорилирует сайты СаМ или Са" -СаМ-связывающих доменов множества клеточных субстратов. В него входят NR1 субъединицы NMDA рецептора [61, 100, 1.19] и автоингибирующий домен кальциевого насоса плазматической мембраны [46]. В первом случае фосфорилирование увеличивает активность рецептора-канала, в другом, наоборот, блокирует выброс кальция из клетки

С а

-насосом, что является ещё одной причиной того, что даже после удаления глутамата возникает кальциевая дизрегуляция [28, 18, 129]. Выведение Са2+ из клетки осуществляется преимущественно Са2+-насосом плазматической мембраны, поскольку обмен наружнего Na+ на цитоплазматический Са2+,

1 9+ осуществляемый Na /Са обменником, при действии глутамата- резко ослабляется или даже реверсирует вследствие как повышения [Na+]j , так и деполяризации плазматической мембраны [9].

При "down-regulation" ПКС наблюдалась задержка появления кальциевой дизрегуляции и значительно уменьшалось количество нейронов с ОКД (гл. 4.2.2., рис. 13 и 14). Несмотря на то, что в клетках наступала дизрегуляция, Глу не оказывал токсического эффекта на нейроны коры и мозжечка. Ингибиторы ПКС в высоких^ дозах хотя и замедляли развитие ОКД, но не защищали от действия Глу. В малых концентрациях, при использовании которых наблюдалась не полная инактивация ПКС (гл. 4.1.1., рис. 6) и отсутствие исходной токсичности (гл. 4.4.2., рис. 23), ингибиторы ПКС защищали клетки от гибели, вызванной Глу.

В молодых нейронах активатор ПКС форболовый эфир и окадаевая кислота ускоряли развитие ОКД. Полученные данные не противоречат описанным выше и позволяют сделать заключение, что чем больше Са2+ входит в нейроны при первой фазе, тем быстрее наступит вторая.

При анализе гибели нейронов было показано, что Глу вызывал в среднем 25% гибель нейронов (гл. 4.4.2., рис. 24). Количество же клеток с ОКД в культуре мозжечка было 83±7% и 63±9% в культуре коры. Это доказывает то, что ОКД является необходимым, но недостаточным условием для запуска механизма Глу нейротоксичности.

Для того, чтобы однозначно проследить за судьбой клеток с кальциевой дизрегуляцией, после её наступления нейроны оставлялись на несколько часов под микроскопом и затем окрашивались флуоресцентным красителем для определения количества живых клеток. Эксперименты выявили три популяции нейронов: (а) имеется только первая фаза и остаются живыми; (б) есть вторая фаза, живые; (в) есть кальциевая дизрегуляция, погибшие. При "down-regulation" ПКС, когда количество киназы в клетке сильно понижено, ОКД развивалась с задержкой и в меньшем числе нейронов, однако гибель практически отсутствовала. В этих экспериментах также была проанализирована первая фаза входа Са" . Оказалось, что ни количество вошедшего Са , ни длительность первой фазы во всех трёх популяциях нейронов друг от друга существенно не отличается. То есть по характеру первой фазы нельзя предсказать дальнейшую судьбу клетки, погибнет она или нет. В экспериментах с "down-regulation" ПКС длительность первой фазы была короче и составила 52±12 секунд (в контроле - 112±16 секунд), ОКД была выявлена в меньшем числе нейронов, это связано с тем, что активная ПКС способствовала усилению входа и торможению выброса Са" из клеток [15, 18, 29, 36, 46]. Можно предположить, что при "down-regulation" ПКС создаются условия для уменьшенного входа кальция, ОКД

76 развивается в меньшем числе нейронов, более интенсивно работает Са" насос плазматической мембраны, что, в конечном итоге, способствует защите клеток от Глу нейротоксичности.

Таким образом, можно выделить несколько обязательных факторов, наличие которых приведёт к гибели нейронов при действии Глу: (1) наличие ПКС в клетке; (2) активация ПКС; (3) появление ОКД; (4) наличие фактора, возможно генетического, связанного с соотношением про- и антиапоптических изоформ ПКС в нейроне [41, 62, 67]. То, что фактор 4 играет важную роль в гибели и выживаемости нейронов говорит тот факт, что погибают не все клетки с кальциевой дизрегуляцией.

В старых нейронах мозжечка (14-16 ДВК) ингибиторы ПКС действовали, в отличие от молодых, иным образом: ингибиторы ПКС увеличивали глутамат-вызванную гибель нейронов, "down-regulation" ПКС не защищала их от токсического Глу воздействия, в этих клетках нейропротекторным эффектом обладал форболовый эфир (гл. 4.4.2., рис. 26). Полученные данные согласуются с результатами Durkin et al. [43, 44] и Tremblay et al. [120] для старых нейронов. Это может быть связано с тем, что в нейронах 14-16 ДВК экспрессия и степень фософрилированности субъединиц NMDA рецептора может отличаться от той, что наблюдается в молодых нейронах [16, 53]. Точные механизмы таких возрастных особенностей действия активатора и ингибитора ПКС не совсем понятны и требуется проведение специальных исследований, направленных на изучение процессов фосфорилирования NMDA каналов.

Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о важной роли ПКС в нарушениях кальциевого гомеостаза, развитии отсроченной кальциевой дизрегуляции и повреждении нейронов при гиперстимуляции Глу рецепторов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Персиянцева, Надежда Александровна, Москва

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Д. и др. Молекулярная биология клетки. — Т. 1.-М.: Мир, 1994.

2. Ашмарин A.JI. Биохимия мозга. Изд. С.-Петербургского университета, 1999. - 328 с.

3. Галактионов В.Г. Иммунология. -М.: Мир, 1998. С. 179-181.

4. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Коваленко А.В., Соколов М.А. Механизмы повреждения ткани мозга на фоне острой фокальной ишемии мозга//Журн. невропатологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. —1999. -Т. 99.-№2.-С. 65-70.

5. Гусев Н.Б. Внутриклеточные Са-связывающие белки//СОЖ. — 1998. -№5. С. 2-9.

6. Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Внутриклеточная сигнализация. — Пущино, 2003.

7. Зозуля Ю.А., Барабой В.А., Сутковой Д.А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга. — М.: Знание-М., 2000. С. 344.

8. Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Винская Н.П., Сурин A.M., Ходоров1. Л I

9. Б.И. Ведущая роль Са АТФазы плазматической мембраны в восстановлении Са2+ гомеостаза нейронов после глутаматного удара//Бюлл. Эксп. Биологии и Медицины. — 2003. — Т. 135. № 2. — С. 162-165.

10. П.Ходоров Б.И. Нарушение нейронального кальциевого гомеостаза при гиперстимуляции глутаматных рецепторов // Патогенез. 2003. - № 1. -С. 20-33. .

11. Adamec Е., Didier М., Nixon R. Developmental regulation of the recovery process following glutamate-induced calcium rise in rodent primary neuronal cultures/ZBrain Res Dev Brain Res. 1998. - V. 108. - № 1-2. - P. 101-110.

12. Akita Y. Protein kinase C-epsilon (PKC-epsilon): its unique structure and function/Л. Biochem. (Tokyo). 2002. - V. 132. - № 6. - P. 847-852.

13. Bartschat D.K., Rhodes Т.Е. Protein kinase С modulates calcium channels in isolated presynaptic nerve terminals of rat hippocampus//J. Neurochem. -1995. V. 64. - № 5. - P. 2064-2072.

14. Battaini F., Pascale A. Protein kinase С signal transduction regulation in physiological and pathological aging//Ann. N. Y. Acad. Sci. 2005. — V. 1057.-P. 177-192.

15. Baude A., Nusser Z., Roberts J.D. The metabotropic glutamate receptor (mGluRl alpha) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction // Neuron. 1993. - V. 11.-№4.-P. 771-787.

16. Bickler P.E., Fahlman C.S., Ferriero D.M. Hypoxia increases calcium flux through cortical neuron glutamate receptors via protein kinase C//J. Neurochem. 2004. - V. 88. - № 4. - P. 878-884.

17. Bright R. and Mochly-Rosen D. The Role of Protein Kinase С in Cerebral Ischemic and Reperfusion Injury//American Heart Association. — 2005. — V. 27. -№36. -P. 2781-2800.

18. Buchner K., Adamec E., Beermann M.L., Nixon R.A. Isoform-specific translocation of protein kinase С following glutamate administration in primary hippocampal neurons/ZBrain. Res. Mol. Brain. Res. 1999. — V.64.- № 2. — P. 222-235.

19. Budd S.L., Nicholls D.G. A revaluation of the role of mitochondria in neuronal Ca homeostasis//!. Neurochem. 1996. - V. 66. - № 1. — P.403-411.

20. Budd S.L., Nicholls D.G. Mitochondria, calcium regulation, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells//J. Neurochem.- 1996.- V. 67. № 6.-P. 2282-2291.

21. Busto R., Globus M.Y., Neary J.T., Ginsberg M.D. Regional alterations of protein kinase С activity following transient cerebral ischemia: effects of intraischemic brain temperature modulation//!. Neurochem. 1994. — V. 63.- № 3. P. 1095-1103.

22. Candeo P., Favaron M., Lengyel I., Manev R.M., Rimland J.M., Manev H. Pathological phosphorylation causes neuronal death: effect of okadaic acid in primary culture of cerebellar granule cells//J. Neurochem. — 1992. V. 59. -№4.-P. 1558-1561.

23. Cardell M., Bingren H., Wieloch Т., Zivin J., Saitoh T. Protein kinase С is translocated to cell membranes during cerebral ischemia//Neurosci. Lett. — 1990. V. 119. - № 2. - P. 228-232.

24. Castilho R.F., Hansson O., Ward M.W., Budd S.L., Nicholls D.G. Mitochondrial control of acute glutamate excitotoxicity in cultured83cerebellar granule cells//J. Neurosci. 1998. - V. 18. - № 24. - P. 1027710286.

25. Chakravarthy В., Morley P., Whitfield J. Ca2+-calmodulin and protein kinase Cs: a hypothetical synthesis of their conflicting convergences on shared substrate domains//Trends Neurosci. 1999. - V. 22. - № 1. - P. 12-16.

26. Chauhan V.P., Chauhan A., Deshmukh D.S., Brockerhoff H. Lipid activators of protein kinase C//Life Sci. 1990. - V. 47. - № 12. - P. 981986.

27. Chan S.L., Lee M.C., Tan K.O., Yang L.K., Lee A.S., Flotow H., Fu N.Y., Butler M.S. Identification of chelerythrine as an inhibitor of BclXL function//! Biol. Chem. 2003. - V. 278. - № 23. - P. 20453-20456.

28. Chihab R., Bossenmeyer C., Oillet J., Daval J.L. Lack of correlation between the effects of transient exposure to glutamate and those of hypoxia/reoxygenation in immature neurons in vitro//J. Neurochem. 1998. -V. 71.-№3.-P. 1177-1186.

29. Chinopoulos C., Gerencser A.A., Doczi J., Fiskum G., Adam-Vizi V. Inhibition of glutamate-induced delayed calcium deregulation by 2-APB and La3+ in cultured cortical neurons//J. Neurochem. — 2004. V. 91. - № 2. - P. 471-483.

30. Choi D.W. Calcium: still center-stage in hypoxic-ischemic neuronal death//Trends Neurosci. 1995. - V. 18. - № 2. - P. 58-60.

31. Choi D.W., Rothman S.M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death//Annu. Rev. Neurosci. 1990. -V. 13. - P. 171182.

32. Choi D.W. Ionic dependence of glutamate neurotoxicity//! Neurosci. -1987. V. 7. - № 2. - P. 369-379.

33. Codazzi F., Teruel M.N., Meyer T. Control of astrocyte Ca(2+) oscillations and waves by oscillating translocation and activation of protein kinase C//Curr. Biol. 2001. - V. 11. - № 14. - P. 1089-1097.

34. Crumrine R.C., Dubyak G., LaManna J.C. Decreased protein kinase С activity during cerebral ischemia and after reperfusion in the adult rat//J. Neurochem. 1990. -V. 55. - № 6. - P. 2001-2007.

35. Danysz W., Wroblewski J.T. Concanavalin A increases N-methyl-D1. Л1aspartate-induced Ca influx in cerebellar granule cells in culture//Pol. J. Pharmacol. 1995.-V. 47. -№ l.-P. 31-36.

36. Dempsey E.C., Newton A.C., Mochly-Rosen D., Fields A.P., Reyland M.E., Insel P.A., Messing R.O. Protein kinase С isozymes and the regulation of diverse cell responses//Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2000. - V. 279. -№3.- P. 429-438.

37. Didier M., Mienville J.M., Soubrie P., Bockaert J., Berman S., Bursztajn S., Pin J.P. Plasticity of NMDA receptor expression during mouse cerebellar granule cell development//Eur. J. Neurosci. 1994. - V. 6. - № 10. — P. 1536-1543.

38. Emaus R.K., Grunwald R., Lemasters J.J. Rhodamine 123 as a probe of transmembrane potential in isolated rat-liver mitochondria: spectral and85metabolic properties//Biochim. Biophys. Acta. 1986. - V. 850. - № 3. - P. 436-448.

39. Faux M.C., Scott J.D. Regulation of the AKAP79-protein kinase С interaction by Ca2+/Calmodulin//J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - № 27. -P. 17038-17044.

40. Gerendasy D.D., Sutcliffe J.G. RC3/neurogranin, a postsynaptic calpacitin for setting the response threshold to calcium influxes//Mol. Neurobiol. — 1997.-V. 15.-№2.-P. 131-163.

41. Gopalakrishna R., Anderson W.B. Reversible oxidative activation and inactivation of protein kinase С by the mitogen/tumor promoter periodate//Arch. Biochem. Biophys. 1991. - V. 285. - № 2. - P. 382-387.

42. Gopalakrishna R., Anderson W.B. Susceptibility of protein kinase С to oxidative inactivation: loss of both phosphotransferase activity and phorbol diester binding//FEBS Lett. 1987. - V. 225. - № 1-2. - P. 233-237.

43. Gray M.O., Karliner J.S., Mochly-Rosen D. A selective epsilon-protein kinase С antagonist inhibits protection of cardiac myocytes from hypoxia-induced cell death//J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - № 49. - P. 3094530951.

44. Hara H., Onodera H., Yoshidomi M., Matsuda Y. Staurosporine, a novel protein kinase С inhibitor, prevents postischemic neuronal damage in the gerbil and rat//J. Cereb. Blood Flow Metab. 1990. - V. 10. - № 5. - P. 646-653

45. Hartley D.M., Kurth M.C., Bjerkness L., Weiss J.H., Choi D.W. Glutamate receptor-induced 45Ca2+ accumulation in cortical cell culture correlates with subsequent neuronal degeneration//J. Neurosci. 1993. - V. 13. - № 5. — P. 1993-2000.

46. Hisatsune C., Umemori H., Inoue Т., Michikawa Т., Kohda K., Mikoshiba K., Yamamoto T. Phosphorylation-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptors by calmodulin//J. Biol. Chem. 1997. - V. 212. - № 33. -P. 20805-20810.

47. Huwiler A., Fabbro D., Pfeilschifter J. Comparison of different tumour promoters and bryostatin 1 on protein kinase С activation and down-regulation in rat renal mesangial cells//Biochem. Pharmacol. — 1994. — V. 48.-№4.-P. 689-700.

48. Inoue M., Kishimoto A., Takai Y., Nishizuka Y. Studies on a cyclic nucleotide-independent protein kinase and its proenzyme in mammalian tissues//J. Biol. Chem. 1977. -V. 252. - № 21. - P. 7610-7616.

49. Jiang Q., Gu Z., Zhang G. Activation, involvement and nuclear translocation of c-Jun N-terminal protein kinase 1 and 2 in glutamate-induced apoptosis in cultured rat cortical neurons//Brain Res. 2002. - V. 956. - № 2. - P. 194201.

50. Kawakami Т., Kawakami Y., Kitaura J. Protein kinase С beta (PKC beta): normal functions and diseases//.!. Biochem. 2002. - V. 132. - № 5. - P. 677-682.

51. Khodorov B. Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurons//Prog. Biophys. Mol. Biol. 2004. - V. 86. - № 2. - P. 279-351.

52. Khodorov В., Pinelis V., Vergun O., Storozhevykh Т., Vinskaya N. Mitochondrial deenergization underlies neuronal calcium overload following a prolonged glutamate challenge//FEBS Lett. 1996. - V. 397. - № 2-3. - P. 230-234.

53. Kikkawa U., Matsuzaki H., Yamamoto T. Protein kinase С delta (PKC delta): activation mechanisms and functions//! Biochem. 2002. — V. 132. -№ 6. - P. 831-839.

54. Koponen S., Kurkinen K., Akerman K.E., Mochly-Rosen D., Chan P.H., Koistinaho J. Prevention of NMDA-induced death of cortical neurons by inhibition of protein kinase Czeta//J. Neurochem. — 2003. — V. 86. № 2. — P. 442-450.

55. Kunishima N., Shimada Y., Tsuji Y. Structural basis of glutamate recognition by a dimeric metabotropic glutamate receptor//Nature. 2000. — V. 407. - № 6807. - P. 971-977.

56. Legendre P., Rosenmund C., Westbrook G.L. Inactivation of NMDA channels in cultured hippocampal neurons by intracellular calcium//J. Neurosci. 1993. -V. 13. - № 2. - P. 674-684.

57. Lester D.S., Brumfeld V. Ligand-induced conformational changes in cytosolic protein kinase C//Int. J. Biol. Macromol. 1990. - V. 12. - № 4. -P. 251-256.

58. Lu W.Y., Jackson M.F., Bai D., Orser B.A., MacDonald J.F. In CA1 pyramidal neurons of the hippocampus protein kinase С regulates calcium-dependent inactivation of NMD A receptors//J. Neurosci. 2000. — V. 20. -№ 12.-P. 4452-4461.

59. Macdonald R.D., Wallace M.C., Coyne T.J. The effect of surgery the severity of vasospasm//J. of Neurosurg. 1994. - Vol. 80. - №3. - P. 433439.

60. Maher P. How protein kinase С activation protects nerve cells from oxidative stress-induced cell death//J. Neurosci. — 2001. V. 21. № 9. — P. 2929-2938.

61. Manev H., Favaron M., Guidotti A., Costa E. Delayed increase of Ca influx elicited by glutamate: role in neuronal death//Mol. Pharmacol. 1989. -V.36.l.-P. 106-112.

62. Manev H., Favaron M., Vicini S., Guidotti A. Ganglioside-mediated protection from glutamate-induced neuronal death//Acta Neurobiol. Exp. — 1990. V. 50. - № 4-5. - P. 475-488.

63. Manev H., Candeo P., Favaron M., Lengyel I., Manev R.M., Rimland J.M. Pathological phosphorylation causes neuronal death: effect of okadaic acidin primary culture of cerebellar granule cells//J. Neurochem. 1992. - V. 59. -№4.-P. 1558-1561.

64. Mochly-Rosen D., Gordon A.S. Anchoring proteins for protein kinase С: a means for isozyme selectivity//FASEB J. 1998. -V. 12. - № 1. - P. 35-42.

65. Mochly-Rosen D. Localization of protein kinases by anchoring proteins: a theme in signal transduction//Science. 1995. - V. 268. - № 5208. - P. 247251.

66. Newton A.C. Protein kinase C: structure, function, and regulation//.!. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - № 48. - P. 28495-28498.

67. Nicholls D., Attwell D. The release and uptake of excitatory amino acids//Trends Pharmacol. Sci. 1990. - V. 11. - № 11. - P. 462-468.

68. Nicholls D.G., Budd S.L. Mitochondria and neuronal survival//Physiol. Rev. -2000. — V. 80.-№ l.-P. 315-360.

69. Nishizuka Y. The molecular heterogeneity of protein kinase С and its implications for cellular regulation//Nature. 1988. - V. 334. - № 6184. - P. 661-665.

70. Parekh D.B., Ziegler W., Parker P.J. Multiple pathways control protein kinase С phosphorylation//EMBO J. 2000. - V. 19. - № 4. - P. 496-503.90

71. Parsons C.G., Danysz W., Quack G. Glutamate in CNS disorders as a target for drug development: an update//Drug News Perspect. 1998. - V. 11. - № 9.-P. 523-569.

72. Pascale A., Alkon D.L., Grimaldi M. Translocation of protein kinase C-betall in astrocytes requires organized, actin cytoskeleton and is not accompanied by synchronous RACK1 relocation//Glia. — 2004. V. 46. - №2.-P. 169-182. •

73. Pellegrini-Giampietro D.P., Chtrici Alesiani M. Excitatory amino acid release and free radical formation may cooperate in the genesis of ischemia — induced neuronal damage // J. Neurosci.- 1990. — Vol. 10. — P. 10351041.

74. Pin J.P., Duvoisin R. The metabotropic glutamate receptors: structure and • functions//Neuropharmacology. 1995. - V.34. - № 1. - P. 1-26.

75. Popp R.L., Velasquez O., Bland J., Hughes P. Characterization of protein' kinase С isofonns in primary cultured cerebellar granule cells//Brain Res. — 2006.-V. 1083.-№ l.-p. 70-84.

76. Raulli R., Alho H., Wroblewski J.T. yV-Methyl-D-aspartate receptor-induced ' translocation of protein kinase С to the nucleus in rat cerebellar slices//Neurochem. -1994. V. 24. - P. 209-214.

77. Rechsteiner M., Rogers S.W. PEST sequences and regulation by proteolysis//Trends Biochem. Sci. 1996. - V. 21. - № 7. - P. 267-271.

78. Ron D., Jiang Z., Yao L., Vagts A., Diamond I., Gordon A. Coordinated movement of RACK1 with activated betall PKC//J. Biol. Chem. 1999. -V. 274. - № 38. - P. 27039-27046.

79. Ron D., Kazanietz M.G. New insights into the regulation of protein kinase С and novel phorbol ester receptors/ZFASEB J. 1999. - V. 13. - № 13. - P. 1658-1676.

80. Ron D., Luo J., Mochly-Rosen D. C2 region-derived peptides inhibit translocation and function of beta protein kinase С in vivo//J. Biol. Chem. — 1995. V. 270. - № 41. - P. 24180-24187.

81. Rosenmund С., Feltz A., Westbrook G.L. Calcium-dependent inactivation of synaptic NMDA receptors in hippocampal neurons//J. Neurophysiol. 1995. - V. 73. - № 1. - P. 427-430.

82. Rothman S.M., Thurston J.H., Hauhait R.E. Delayed neurotoxicity of excitatory amino acids in vitro//Neuroscience. — 1987. — V. 22. № 2. - P. 471-480. ' .

83. Ryves W.J., Evans A.T., Olivier A.R., Parker P.J., Evans F.J. Activation of the PKC-isotypes alpha, beta 1., gamma, delta and epsilon by phorbol esters of different;biological activities//FEBS Lett. 1991. - V. 288. -№ 1-2.-P. 5-9. - P 4

84. Saito N., Shirai Y. Protein kinase С gatnma (PKC gamma): function of neuron specific isotype//J. Biochem. 2002. - V. Л32. - №,5. - P. 683687.

85. Sano K. Acute ishemic and delayed ishemic neurological deflcite as ~ the causes of bad grading in aneurismal .subarachnoid hemorrhage // Neurolog. Res. 1994: - Vol. 16. - P. 35-39. < "< ^ f

86. Schechtman D., Mochly-Rosen D. Adaptor proteins in protein kinase • C-mediated signal transduction//Oncogene. 2001. - V. 20. - № 44. — P. 6339-6347.

87. Schinder A.F., Olson E.C., Spitzer N.C., Montal M. Mitochondrial dysfunction is a primary event in glutamate neurotoxicity//!. Neurosci. -1996. V. 16. - № 19.-P. 6125-6133.

88. Shigemoto R., Kinoshita A., Wada E. Differential presynaptic localization of metabotropic glutamate receptor subtypes in the rat hippocampus//! Neurosci. 1997. V. 17. - № 19. - P. 7503-7522.

89. Shigemoto R., Kulik A., Roberts J.D. Target-cell-specific concentration of a metabotropic glutamate receptor in the presynaptic active zone //Nature. 1996. -V. 381. - № 6582. - P. 523-525.

90. Smart T.G. Regulation of excitatory and inhibitory neurotransmitter-gated ion channels by protein phosphoiylation//Curr.: Opin. Neurobiol. —1997.-V. 7.-№3.-P. 358-367. " '

91. Souroujon M.C., Mochly-Rosen' D. Peptide-modulators of protein-' protein interactions in intracellular signaling//Nat. Biotechnol. — 1998. — V. 16.-№ 10.-P. 919-924.

92. Speechly-Dick M.E., Mocanu M.M., Yellon D.M. Protein kinase C. It's role in ischemic preconditioning in the rat//Circ. Res. — 1994. V. 75. —■ P. 586-590.

93. Spillson A.B., Russell J.W. Metabotropic glutamate receptor' regulation of neuronal cell death//Exp. Neurol. 2003. - V. 184. - № 1. - P. 97-105.

94. Stoll G., Jander S., Schroeter M. Inflammation and glial responses in ischemic brain lestions // Progr. in Neurobiol. 1995. - Vol. 46. - P. 607636.

95. Takai Y., Yamamoto M., Inoue M., Kishimoto A., Nishizuka Y. A proenzyme of cyclic nucleotide-independent protein kinase and its activation by calcium-dependent neutral protease from rat liver//Biochem. Biophys.

96. Vergun O., Keelan J., Khodorov B.I., Duchen M.R. Glutamate-• induced mitochondrial depolarisation i and perturbation of calcium homeostasis in cultured rat hippocampal neurons//J. Physiol. 1999. — V. 519.-№2.-P. 451-466.

97. Webb B.L., Hirst S.J., Giembycz M.A. Protein kinase С isoenzymes: a review of their structure, regulation and role in regulating airways smooth muscle tone and mitogenesis/ZBritish J. of Pharmacology. — 2000. — V. 130. -P. 1433-1452.

98. Westermann P., Knoblich M., Maier O., Lindschau C., Haller H. Protein kinase С bound to the Golgi apparatus supports the formation of constitutive transport vesicles//J Biochem.1996. V. 320. - P. 651-658: .;

99. White R.J., Reynolds I.J. Mitochondrial .depolarization; in glutamate-, stimulated neurons: an early signal specifici to excitotoxin: exposure//J.! Neurosci.-1996.-V. 16.-№ 18.-P. 5688-5697. i

100. Yaka R., Thornton C., Vagts A J., Bonci A., Ron. D. NMDA receptor function is regulated by the inhibitory scaffolding protein, RACK1//PNAS. — 2002. — V. 99.-№8.-P. 5710-5715 .-'2002: У. - .Ч-г -7;u57

101. Zidovetzki R., Lester D.S. The. fmechanism, of activation of protein kinase C: a biophysical perspective//Biochim. Biophys. Acta.;;— 1992. — V.1134.-№3.-P. 261-272.