Исследование механизмов митохондриальной деполяризации и кальциевой дизрегуляции, индуцируемой возбуждающим медиатором глутаматом в нейронах мозга

Большаков, Алексей Петрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование механизмов митохондриальной деполяризации и кальциевой дизрегуляции, индуцируемой возбуждающим медиатором глутаматом в нейронах мозга
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов митохондриальной деполяризации и кальциевой дизрегуляции, индуцируемой возбуждающим медиатором глутаматом в нейронах мозга"

На правах рукописи УДК 577 3

ООЗиьичл.-*

Большаков Алексей Петрович

Исследование механизмов митохондриальной деполяризации и кальциевой дизрсгуляции, индуцируемой возбуждающим медиатором глута матом в нейронах мозга

03 00 02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2007

003060414

Работа выполнена на кафедре физики живых систем Московского Физико-1 ехнического Института и в Научно-исследовательском институте патологии и патофизиологии РАМН

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор Борис Израитевич Ходоров

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук Гурия Георгий Геодорович

доктор биологических наук Хаспеков Леонид Георшевич

Ведущая организация Московский Государственный Университет им Ломоносова

Защита диссертации состоится ЛЬО^туЯ- 2007 г в часов на заседании

диссертационного совета при Московском физико-техническом институте по адресу 141700, Московская обл , т Дочгопрудный, Институтский пер , д 9, МФТИ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ

Автореферат разослан «АО»

2007 года

Ученый секретарь

диссертационного совета К 212 156 03 кандидат физико-математических наук

Брагин В Е

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Одной из ключевых стадий повреждения нейронов при ряде патологий центральной нервной системы является токсическое действие нейромедиатора глутамата, избыточно выделяющегося и накапливающегося в межклеточном пространстве (Duchen, 2Q04,Nicholls, 2004) Исследования причин глутаматной нейротоксичности показали, что вход Са2+ через NMDA подтип гчутаматных каналов и последующее накопление Са2+ в митохондриях являются основными факторами, приводящими к клеточной гибели (обзоры (Khodorov, 2004,Nicholls and Budd, 2000))

В исследованиях, проведенных на первичных культурах нейронов, было обнаружено, что гибель нейронов после глутаматного шока тесно связана с развитием вторичного подъема внутриклеточной концентрации Са2+ ([Са2+],) Это вторичное увеличение [Са2+], получило название отсроченной кальциевой дизрегуляции (ОКД) (Tymianski et al, 1993) В последующих исследованиях было продемонстрировано, что ОКД сопровождается синхронной митохондриальной деполяризацией (МД) (Vergun et al, 1999) Было также показано, что МД играет решающую роль в механизме глутамат-индуцированного нарушения Са2+ гомеостаза (Khodorov et al, 1996,Ходоров и др, 2001) и что циклоспорин А (ЦсА) и некоторые его производные замедляют или предотвращают развитие сильной МД и вторичного повышения [Са2+], в культивируемых нейронах центральной нервной системы (Vergun et al, 1999,Alano et al, 2002) Принимая во внимание способность этих веществ противодействовать формированию митохондриальной поры (МП) в изолированных митохондриях, было сделано заключение о том, что открывание МП приводит к коллапсу митохондриального потенциала (A*?«) во время глутаматного воздействия Однако этот вывод в настоящее время поставлен под сомнение рядом других исследований, в которых не удалось воспроизвести защитный эффект ЦсА (Isaev et al, 1996,Castilho et al, 1998,Chinopoulos et al, 2004,Pivovarova et al, 2004) Эти противоречия и некоторые ограничения, связанные с применением ЦсА даже на изолированных митохондриях (Brustovetsky and Dubmsky, 2000) побудили нас использовать для изучения этой проблемы новый экспериментальный подход, основанный на сравнительном анализе изменений митохондриального и цитозочьного рН (рН м и рНц, соответственно) Хорошо известно, что глутамат вызывает закислепие цитозоля (Пинелис и др, 1992, Hartley and Dubmsky, 1993) Однако влияние глутаматного воздействия на динамику нейронального рНм in situ до сих пор не изучалось Между тем, заманчиво было предположить, что открывание митохондриальной поры вызовет снижение рНм (поскольку рНц меньше рНч), в то время как блокада открывания МП предотвратит развитие этого митохондриальпого подкисления Чтобы проверить это предположение мы исследовали изменения рН„ и рНч во время длительного глутаматного воздействия, используя рН-чувствительные флуоресцентные белки, селективно экспрессированные в цитозоле и митохондриях (cytYFP, mtYFP, и экспрессируемый в митохондриях перикам 2mtRP (Porcelli et al, 2005,Nagai et al, 2001) Эти измерения мы проводили в сочетании с одновременным мониторингом изменений [Са2+], В параллельных экспериментах мы регистрировали изменения [Са2+], и ДЧ1« Измерения проводились как в контрольных условиях, так и после воздействий, которые препятствуют открыванию МП в изолированных митохондриях К числу таких воздействий, как известно, относятся замена внеклеточного Са2т на Sr2+ замена или применение ЦсА (Bernardi et al, 1992)

В результате всех проведенных исследований мы пришли к заключению о существовании двух альтернативных механизмов глутамат-индуцированной отсроченной МД открывание поры и беспоровый механизм, при котором происходит подщелачивание митохондриального матрикса

Цечь работы

Изучить механизмы митохондриальной деполяризации и кальциевой дизрегуляции, вызываемой медиатором глутаматом в культивируемых нейронах

Задачи исследования

В опытах на культивируемых нейронах исследовать

1) динамику изменений [Са2+], и Д'Ч'к во время и после глутаматного воздействия,

2) роль Ыа+/Са2+-обмешшка плазматической мембраны и Са2+/Н+-АТФазы в восстановлении [Са2+], после глутаматного воздействия,

3) влияние ингибитора митохондриальной поры циклоспорина А (ЦсА) на динамику [Са2+], и во время глутаматпого воздействия,

4) влияние замены ионов Са2+ на ионы Sr2^ на динамику сш налов fura-2FF и родамина-123,

5) диначику изменений [Са2+]„ рНм и рНц во время глутамагного воздействия в присутствии и отсутствии антагонистов митохондриальной лоры (ЦсА или ионы Sr21),

6) изменения митохондриальной морфологии в нейронах in situ в Са2+- и Sr21"-содержащих средах.

7) влияние блокады I и IV комплексов дыхательной цепи митохондрий на динамику изменений [Са2+], и ДЧ^ во время глутаматного воздействия,

8) вклад различных ионов и транспортных систем в развитие митохондриальной деполяризации, индуцированной глутачатным воздействием в присутствии цианида,

9) роль снижения цитоплазматического уровня АТФ в развитии глутамат-индуцированной митохондриальной деполяризации в присутствии цианида

Научная новизна

В нашей работе впервые ислотьзован новый прием для изучения роли митохондриальной поры в механизмах дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов при длительном действии глутамата - измерения рН митохондриального магрикса (рНм) Измерения рНм in situ в сочетании с другими подходами были использованы для демонстрации роли митохондриальной поры в развитии МД

Нами впервые проведено сопоставление динамики [Са2+], и рН в цигозоле (рНц) и митохондриях при длительном глутаматном воздействии Впервые показано, что снижение рНм во время глутаматного воздействия имеет двухфазный характер, причем вторая фаза падения рН„ возникает с некоторой задержкой после начала ОКД Мы также впервые обнаружили, что антагонисты митохондриальной поры (циклоспорин А и ионы Sr2+) не предотвращают развитие ОКД и сильной МД, но существенно изменяют динамику рНм во время развития ОКД Результаты этих экспериментов свидетельствуют в пользу того, что митохондриальная пора участвует в развитии ОКД и МД при глутаматном воздействии

Впервые проведено сопоставление изменений морфологии митохондрий и динамики [Са2+], и рНч во время глутаматного воздействия Мы показали, что начало вторичного митохондриального подкисления сопровождается изменениями митохондриальной формы, которые, согласно имеющейся литературе, можно рассматривать как митохондриальное набухание Впервые показано, что в Sr-содержащей среде глутаматное воздействие не вызывает никаких изменений митохондриальной морфологии На основании того, что митохондриальное набухание является характерной чертой формирования митохондриальной поры и того, что во время глутаматного воздействия оно возникает лишь в Са2+-содержащей среде было сделано закчючение о том, что вторичное митохондриальное подкисление и сопровождающее его митохондриальное набухание являются следствием открывания митохондриальной поры

Впервые показано, что сильная МД, развивающаяся во время глутаматного воздействия в присутствии цианида, обусловлена снижением активности митохондриальной АТФ-синтазы вследствие глутамат-индуцированного уменьшения внутриклеточного уровня АТФ

Научно-практическая значимость

Полученные данные вносят существенный вклад в понимание механизмов митохондриальной деполяризации и дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов во время токсического воздействия медиатора глутамата Показано, что одним из ключевых моментов в возникновении сильной митохондриальной деполяризации при токсическом действии глутамата является открывание митохондриальной поры Этот факт необходимо учитывать при разработке препаратов, уменьшающих гибель нейронов мозга после ишемического инсульта

В работе показано, что перикам (ratio-metric pericam) - один из широко-используемых сенсоров для измерения концентрации Са2+ в митохондриальном матриксе - обладает высокой чувствительностью к изменениям рН, что на фоне сильных сдвигов митохондриального рН, наблюдающихся во время глутаматного воздействия, не позволяет получать достоверные данные об изменениях митохондриального Са2+ во время глутаматного воздействия Обнаружено также, что повышение митохондриальной концентрации Са2+ при глутаматном воздействии намного превышает чувствительность этого зонда к изменениям Са2+ Эти результаты необходимо учитывать при разработке и использовании сенсоров, предназначенных для измерения Са2+ в митохондриях нейронов

Обнаружено, что слабая митохондриальная деполяризация, вызываемая малыми концентрациями протонофора, значительно усиливается при частичной бчокаде дыхательной цепи Этот факт можно использовать для оценки состояния дыхательной цепи митохондрий в интактных клетках

Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих конференциях Съезд физиологического общества Великобритании (Лондон, 2002), III Съезд Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002), III Российский Конгресс по Патофизиологии, 48-ой Съезд Биофизического Общества (Балтимор, США, 2004), 34-ый Съезд Общества Нейронаук (Сан-Диего, США, 2004), конференции «Нейрохимия фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005), Зб-ой Съезд Общества Нейронаук (Атланта, США, 2006)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 9 тезисов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проводились на культивируемых кортикальных, гиппокампальных и зернистых нейронах мозжечка (7-11 дней в кучьтуре)

Для измерений рН м и рНц, а также исследований митохондриальнои морфологии кортикальные и гиппокампальные нейроны трансфецировали с помощью реагента Lipofectamme 2000 плазмидами, кодирующими изоформы желтого флуоресцентного белка (YFP), селективно экспрессирующегося в митохондриях (mtYFP) и цитозоле (cytYFP), а также митохондриальньш перикам (mitochondrially targeted ratio-metric pericam, 2mtRP) Чувствительность mtYFP и 2mtRP к изменениям рН показаны на рис 1 Мы приводим все данные, полученные с помощью YFP-конструкций и 2mtRP, как относительные изменения флуоресценции, поскольку хорошо известно, что митохондриальный ответ, индуцированный глутаматом внутри единичных клеток, является гетерогенным (см например, Pivovarova et al, 2004)

Для измерения [Са2+], нейроны нагружались Са2+-чуствительными зондами fura-2(АМ), fura-2FF(AM) или MagFura-2(AM) Для измерения ДЧ1« нейроны нагружались потенциал-чувствительным зондом родамин-123 (3 5 мкг/мл, 15 мин, Rhl23)

Измерения [Са2+]„ [Са2+]„, pHu, и рНц, а также исследования митохондриальной морфологии проводились на инвертированном флуоресцентном микроскопе Axiovert-200 ("Zeiss", Германия), оборудованном CCD камерой CoolSnap-fx ("Roper Scientific", США) Флуоресценция зондов возбуждалась светом от ксеноновой лампы, пропускаемым последовательно через светофильтры 340 и 380 нм дтя fura-2 (fura-2FF, Magfura-2) и 490 нм для Rhl23 (mtYFP, cytYFP, 2mtRP) В некоторых экспериментах флуоресценция 2mtRP возбуждалась светом с длиной волны 470 нм

Данные, полученные с помощью Са2+-чувствительных зондов представлены как отношение флуоресценции, возбуждаемой на 340 и 380 нм (F340/F3S0) Сигналы Rhl23 нормировались на базальный уровень

Плазмиды всех флуоресцентных белков любезно предоставлены проф Р Рицутто (R Rizutto, Университет Феррары, Италия)

В экспериментах со Sr2+, Са2+ потностью заменялся на Sr2"1" во внеклеточной среде В экспериментах с циклоспорином А (ЦсА), нейроны инкубировали с указанной

Рис. 1. Чувствительность ггиУИ' (А) п 2шИ{Р (Б) к изменениям рН. Панель (Б) иллюстрирует чувствительность флуоресценции 2гЩЯР, возбуждаемой на 490 нм (2т1КР49о) и 470 нм (2тгКР47о) 2пйЫР47о явтяется Са2+-нечувствительной изобестической точкой перикама

концентрацией ЦсА в течение 40-60 мин перед экспериментом В конце экспериментов добавляли протонофор БССР (1мкМ) в бескальциевой среде, содержащей 100 мкМ ЕвТА, чтобы индуцировать полную митохондриальную деполяризацию

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1 Отсроченная кальциевая дизрегуляция и митохондриальная деполяризация во время глутаматного воздействия в культивируемых нейронах

1 1 Соотношение между [Са2+], и во время и после глутаматного

воздействия

В культивируемых нейронах длительное (15-20 мин) воздействие глутамата (100 мкМ + 10 мкМ глицина) вызывает изменения [Са2+], и ДЧ^, которые можно условно подразделить на две фазы (рис 2) Первая фаза охватывает период от начала глутаматного воздействия до начала вторичного подъема [Са2+], и включает в себя начальный пик [Са2+], и латентный период, предшествующий сильному вторичному подъему [Са2+], В наших опытах длительность латентного периода варьировала между клетками в пределах от секунд до минут В эту фазу [Са2+], ответа митохондрии обычно претерпевали лишь сравнительно слабую деполяризацию

Вторая фаза [Са2+], ответа, так называемая отсроченная кальциевая дизрегуляция (ОКД), включает в себя быстрый подъем [Са2+], до высокого уровня квази-плато Эти изменения [Са2+], сопровождаются сильной практически синхронной митохондриальной деполяризацией (МД, рис 2 В, Г)

Примерно в 50% (п=131) исследованных нами нейронов высокое [Са2+], плато в постглутаматный период было устойчиво к удалению внешнего Са2+ (рис 2), что говорит о нарушении работы механизмов плазматической мембраны, ответственных за выведение Са2+ из нейронов (КЬос1огоу е1 а1,1993,Вапо й а1,2005)

В остальных нейронах восстановление [Са2+], в первые минуты постглутаматного периода все же наблюдалось Процесс восстановления [Са2+], практически во всех клетках начинался раньше восстановления Д^ Синхронное восстановление [Са2+], и Д*РМ наблюдалось только в некоторых нейронах, где ОКД начиналась за нескодько минут до окончания глутаматного воздействия

1.2. Соотношение между [Са2+], и внутриклеточным рН

Известно, что в изолированных митохондриях сильная деполяризация при Са перегрузке матрикса может возникать либо в результате открывания митохондриальной поры (МП) либо вследствие повышения протонного градиента на внутренней митохондриальной мембране (Nicholls and Budd, 2000,N;cholls and Fergusson, 2002) Для выяснения спорного вопроса о том, какой из этих механизмов лежит в основе глутамат-индуцированной МД мы исследовали динамику изменений митохондриального рН (рНм) в нейронах во время длительного действия глутамата При постановке этих опытов мы исходили из гипотезы, что открывание МП должно сопровождаться подкислением митохондриального матрикса (поскольку рНц ниже рНм), а повышение протонного градиента - проявляться в увеличении митохондриального рН (рНм)

Эти опыты проводились на кортикальных нейронах, экспрессирующих в митохондриях или цитозоле рН-чувствительные желтые флуоресцентные белки Для одновременного прослеживания динамики [Са2+], и рН клетки нагружали красителем fura-2 или fura-2FF Однако, одновременные измерения рН„ и Д*РМ было невозможно выполнить вследствие перекрытия спектров возбуждения и эмиссии YFP и Rhl23 Однако большое сходство изменений [Са2+], и Д^м во время глутаматного воздействия можно использовать для того, чтобы рассматривать изменения [Саа+], как очень близкий аналог изменений ДТМ Поэтому о взаимоотношениях ЛЧ^-рН м мы судили по взаимосвязи

Прежде всего, мы исследовали взаимосвязь [Са2+], и цитозольного рН (pHJ Ранее при помощи обычных флуоресцентных зондов (BCECF, SNARF) было установлено, что глутаматное воздействие приводит к сильному снижению рНц (см обзор Khodorov, 2004) Наши эксперименты с использованием cytYFP подтвердили и дополнили результаты этих исследований Первая фаза кальциевого ответа, вызванного глутаматом, сопровождалась в

О Ca^+EGTft

FCCP

Время, мин

10 15 20 Время, мин

глутамат

37 £0 35

33 ^

29 я 252 ц." Ц- 0 25 гм

Z1B С 020

173! UL

-п ,-ДО15

1 3°

09 О 010

10 15 20 Время, мин

10 15 20 25 Время, мин

Рис 2 Динамика [Са2+], и Д'Р,, во время и после глутаматного воздействия в кортикальных (А-В) и гиппокампальных (Г) нейронах

6 8 10 12 14 16 18 20 Время, мин

2 3 4 S Время, мин

Рис. 3. Динамика цитозольного рН (рН„) и fCa +], во время и после глутаматного воздействия Глутамат приводит к повышению [Са +], и снижению рНц Развитие ОКД сопровождается ослаблением цитозольного ацидоза (А), начало которого помечено пунктирной стрелкой Отмывание глутамата не оказывала никакого влияния на [Са2+], и рНц в (А) Панель (Б) показывает как производились измерения времени задержки Тц

кортикальных нейронах развитием сильного цитозольного ацидоза (рис 7), который был обратим при отмывке глутамата Вторичному же подъему [Са2+], сопутствовало ослабление этого ацидоза, причем ослабление ацидоза возникало примерно через 105 ±20 сек (п = 8) после начата ОКД Удаление глутамата в большинстве экспериментов не приводило к восстановлению ни [Са2+], ни рНц

121 ДинамикарНм во время и посче глутаматного воздействия

Изменения митохондриального рН (рН„) во время глутаматного воздействия также имети двухфазный характер В первую фазу развивалось медленное умеренное подкисление митохондриального матрикса, которому предшествовало слабое кратковременное повышение рН„ (рис 4) Учитывая сильную зависимость рНм от цитозольного рН (Addankt et al, 1968,Knstian et al, 2001), мы предположили, что первичное закисчение митохондрий является следствием глутамат-индуцированного снижения рНц, тогда как предшествующее короткое первичное подщелачивание обусловлено усиленным выведением протонов в ответ на вход Са2_г в митохондрии Повышение рНм при входе Са2+ в митохондрии было описано во множестве работ, проведенных на изолированных митохондриях (см (Nicholls and Budd, 2000) и ссылки там)

Во вторую фазу глутамат-индуцированного повышения [Са2+], примерно в 70% (п=23) нейронов происходило значительное ускорение и усиление падения рНм (вторичное закисчение) (рис 4А, В)) В остальных нейронах вторичному закислению в начале развития ОКД предшествовало транзиторное подщелачивание митохондриального матрикса (рис 4Б) Анализ этих данных привел нас к предположению, что оба типа изменений рНч во время ОКД являются результатом кальциевой перегрузки матрикса митохондрий Однако, вторичное снижение рНм происходит только в том случае, когда кальциевая перегрузка ведет к открыванию поры В тех же случаях, когда открывание поры почему-либо затруднено или невозможно происходит лишь повышение протонного градиента на митохондриальной мембране

Для проверки предположения о роли поры в механизмах вторичного подкисления были проведены опыты, в которых Са24 заменялся на Sr24

1.3. Влияние замены ионов Са2+ ионами Sr2* на динамику ЛЧ'„ во время и после глутаматного воздействия.

Хорошо известно, что все клеточные системы, способные транспортировать Са2+, такие как Na+/Ca + обменники, Са2+ насосы, митохондриальный унипортер, и различные ионные каналы также могут транспортировать Sr2" (Xu-Fnedman and Regehr, 1999,Gunter et al, 2000,Hille, 2001) Однако, в отличие от Са2+, ионы Sr2+ не вызывают открывания МП и

1750 1500 „ 1250 О 1000

750 500 250 0

10 15 Время, мин

г2=0 9589

О 100 200 300 400 500 600 700 800 Время, сек

250

500 750 1000 1250 1500

*окд. сек

Рис. 4. Динамика [Са ], и рНм во время и после глутаматного воздействия в кортикальных пейронах. ОКД, возникающая во время глутаматного воздействия, сопровождается подкислением митохондриального матрикса (А-Д), которому в ряде нейронов предшествовало кратковременное повышение рНм (Б, В) Панель (Г) показывает, что удаление глутамата вскоре после возникновения ОКД приводит к быстрому восстановлению [Са2+], и рН„ Панель (Д) показывает, как производились измерения длительности задержек Корреляционной диаграмме (Е) подтверждает наличие корреляции между временами начала ОКД и начала вторичного снижения рНм препятствуют открыванию МП, вызванному Са2+, вследствие вытеснения ионов Са2+ из общего центра связывания (Вегпагс11 е1 а1, 1992)

Прежде всего, мы исследовали как влияет замена Са2+ на вг2+ на динамику [Са +], и Д*Р„ На рис 5 показано, что 8г2+-содержащем растворе глутамат вызывает такую же сильную двухфазную МД, как и в Са2+-содержащей среде На основании этих данных мы сделали вывод, что открывание классической ЦсА-чувствитечьной митохондриалыюй поры не является строго обязательным для развития сильной МД во время глутаматного воздействия Эти результаты, однако, не исключают Возможности того, что глутамат-

глутамат

О S^+EGTA^P

15 20 25

Время, мин

30 35

10 15 20 25 Время, мин

10 15 20 Время, мин

Рис. 5. Динамика сигналов fura-2FF и rhl23 в кортикальных (А-В) и гиппокампальных нейронах (Г) во время глутаматного воздействия в Sr2*-еодержащей среде.

индуцированная МД в Зг^-содержащей среде быта обусловлена неспецифическим повышением протонной проводимости мембраны (Холмухамедов и др 1991, Ichas and Mazat, 1998) или открыванием ЦсА-нечувствительной поры в митохондриальной мембране в результате взаимодействия Sr2* с липидами этой мембраны (Sultan and Sokolove, 2001а, б) Для выяснения механизма МД, индуцированной глутаматом в 8г2+-содержащей среде, мы исследовали происходящие в этих условиях изменения рНц и рНм

Изменения [Sr2+], и рНц оказались качественно сходными с теми изменениями, которые [Са2+], и рНц претерпевают в присутствии Са2+ (рис 6) Однако, ослабление ацидоза возникало со значительно большей задержкой по сравнению с Са2+-содержащей средой (186 ± 39 сек по сравнению с 105 ± 20 сек, р < 0 05, t тест)

В отличие от этого, динамика изменений рН„ после Ca2+/Sr2+ замены претерпевала значительные изменения вслед за первичным закислением вместо его вторичного усиления возникало четко выраженное транзиторное митохондриальное защелачивание (рис 7) Этот результат мы расцените как свидетельство в пользу высказанного нами предположения о том, что вторичное закисление матрикса, возникающее в большинстве нейронов в Са2+-содержащей среде, является результатом открывания митохондриальной поры Посте замены Са + на Sr2"1" его накопление в митохондриальном матриксе не открывало поры вследствие чего вместо снижения рНм произошло его сильное транзиторное увеличение Как уже указывалось, в Са2+-содержащем растворе сходное по динамике, но менее выраженное по амплитуде митохондриальное защелачивание, наблюдалось только в 30% нейронов

глута мат

FCCP

Рис 6 Динамика [Sr^^Jt и рНц во время глутаматного

•о

X воздействия

£ 04

<п

0 2

О 5 10 15 20 25 30 35

Время, мин

Возникновение вторичного защелачивания в самом начале ОКД также говорит о том, что сильная МД в Sr24 -содержащей среде не была обусловлена открыванием поры Заключение о том, что МД в стронций-содержащей среде при действии глутамата не является следствием открывания митохондриальной поры получило подтверждение при исследовании влияния Са ^VSr2"1" замены на глутамат-индуцированные изменения морфологии митохондрий

Известно, что в открывание митохондриальной поры сопровождается набуханием митохондрий в суспензии и захват Sr24 митохондриями не вызывает их набухания (Bernardi, 1999)

В покое нейрональные митохондрии имели палочкообразную форму, и первая фаза [Са2+], и рН„ ответа на гяутаматное воздействие сопровождалась малозаметными изменениями митохондриальной морфологии Во время развития ОКД также не наблюдалось изменений формы митохондрий до тех пор, пока не начиналось вторичное подкисление митохондриального матрикса Во вторую фазу снижения рНм форма митохондрий существенно менялась из палочкообразных митохондрии превращались в шарообразные (п=5 экспериментов) Подобные изменения морфологии митохондрий классифицировались ранее как их набухание (Dubinsky and Levi, 1998,Pivovarova et al, 2004) Митохондриальное набухание, вызываемое длительным глутаматным воздействием, является обратимым Известно, что прекращение глутаматного воздействия в самом начале развития ОКД приводит к достаточно быстрому восстановлению [Са2+], и ДТ», (Khodorov, 2004) Мы обнаружили, что такое восстановление [Са2+], сопровождается не только восстановлением рН„ (рис 4В), но и восстановлением палочкообразной формы митохондрий

Необходимо подчеркнуть, что глутамат-индуцированное набухание митохондрий является Са2+-зависимым после замены Са2+ на Sr2+ глутаматное воздействие не вызывает заметных изменений формы митохондрий, а значит митохондриальное набухание являлось следствием открывания МП

1.3 Влияние циклоспорина А на динамику [Са2+]„ ЛЧ'„, рН„ и рН„ во время глутаматного воздействия

Наряду со стронцием, мы использовали другой антагонист МП - циклоспорин А (ЦсА), который не предотвращает открывание МП, но существенно повышает пороговую концентрацию Са2+ необходимую для открывания МП (Bernardi, 1999,Chalmers and Nicholls,

Мы обнаружили, что прединкубация нейрональных культур с циклоспорпноч А (ЦсА, гиппокампальные - 0 5 мкМ, кортикальные - 0 5, 1, 3, и 5 мкМ) не повлияла заметным образом на развитие ОКД и МД (п = 71 кортикальные (рис 8А, Б), п = 325 гиппокампальные (рис 8В, Г)

2003)

На первый взгляд, присутствие ЦсА (0 5 мкМ) не повлияло на динамику рНц во время глутаматного воздействия так же как и в контроле первичный подъем [Са2+], сопровождался цитозольным подкислением, а вслед за ОКД возникало повышение рНц (рис 9) Однако, оказалось, что ЦсА, так же как и Sr2^ достоверно отсрочил повышение рНц 188 + 24 сек по отношению к 105 ±20 сек в контроле (р < 0 05)

Присутствие ЦсА (0 5 мкМ) также существенно повлияло на динамику рНм во время глутаматного воздействия в кортикальных нейронах Неожиданно оказалось, что нейрональные ответы в присутствии ЦсА подразделяются на 3 подтипа К нейронам первого типа можно отнести клетки, в которых ЦсА не оказал видимого эффекта, т е в этих клетках (11 из 29 нейронов) ОКД сопровождалось вторичным снижением рН„ Ко второй группе клеток можно отнести нейроны (п = 8), в которых ОКД в присутствии ЦсА сопровождалось значительным повышением рН митохондриального матрикса (рис 10 А) Последнее было очень схоже с кратковременным повышением рНм, вызываемым глутаматом в Sr24-содержащей среде (см рис 7) По нашим представлениям, в этих нейронах ЦсА

О «о 12

s Ц- 1 0

UL Ц.

еч 1 0 8

и.

- 06

со

4 5 6 7 Время, мин

200 300 400

Время, сек

800i

700

600

О 500

400

3 300

200

100

(Н

=0 7843

100 200 300 400 500 600 700 800

[окд>

сек

Рис. 1. Соотношение мевду [Бг^], и рНи в кортикальных нейронах во время глутаматного воздействия. (А) и (Б) показывают типичные соотношения между [Бг2*], и рНм в нейронах во время глутаматного воздействия Панель (Б) показывает, как производились измерения времен (В) показывает наличие корреляции между временем начала митохондриального подщелачивания и временем начала вторичного подъема Ч|

глутамат

15 20 25 Время, мин

10 15 20 25 Время, мин

9 12 15 18 Время, мин

Рис 8. Динамика [Са2+], и АЧ'М в кортикальных (А, Б) и гиппокампальных (В, Г) нейронах во время глутаматного воздействия в присутствии ЦсА (0 5 мкМ)

предотвратил открывание МП и, следоватечьно, МД, вызванная глутаматом развивалась по «беспоровому» механизму В третьей группе кортикальных нейронов (п = 10) вторичное митохондриальное подщелачивание возникало после развития ОКД (рис 10 Б) Необходимо отметить, что в таких клетках начало ОКД сопровождалось вторичным митохондриальным подкислением

Таким образом, развитие ОКД и синхронной с ней МД сопровождается в большинстве нейронов отсроченным подкислением и набуханием митохондрий Это снижение рНм и изменение формы митохондрий обустовлены открыванием митохондриальной поры Формирование МП подтверждается тем, что митохондриальное набухание является Са2+-зависичым и не наблюдается в 8г2+-содержащей среде В пользу того, что вторичное подкисление является следствием открывания митохондриальной поры, говорит то, что антагонисты поры (ЦсА и 8г2+) существенно изменяют динамику рНм в их присутствии вместо вторичного митохондриального подкисления наблюдается выраженное митохондриальное подщелачивание

Анализ взаимоотношений между изменениями рН*, [Са2+], и помогли сделать заключение о механизме сильной МД во время глутаматного воздействия По нашим представлениям, в нейронах, где вторичное подкисление развивалось практически синхронно с ОКД, эта МД индуцировалась открыванием МП В клетках же, где открывание МП (вторичное снижение рНм) было отсрочено по сравнению с началом ОКД и сопровождалось подъемом рНм, развитие МД происходило по беспоровому механизму Наиболее вероятно, что сильная МД и повышение рН„ во время гтутаматного воздействия вшивались входом Са2+ (или Бгг+) в митохондрии на фоне ослабления транспорта фосфата в митохондрии Этот механизм развития МД более типичен для нейронов, подвергнутых

Время, мин

глутамат

10 15 Время, мин

15 20 25 30

Время, мин

200 400 600 800 1000 1200 1400 toKfl. сек

Рис 10. Влияние ЦсА на динамику рНм в кортикальных нейронах. Панель (А) демонстрирует пример нейрона, в котором ОКД сопровождалось подщелачиванием мйтохондриального матрикса В нейроне, показанном на (Б), подъем рНм начинался только после развития ОКД и вторичного снижения рНм Панель (В) показывает корреляцию между временем начала ОКД и моментом начала вторичного митохондриального подщелачивания Времена измерялись как показано на рис 7Б

глутаматному воздействию в присутствии антагонистов МП В отсутствии же этих антагонистов такой механизм МД наблюдался лишь в 30% нейронов

2. Механизмы митохондриалъной деполяризации, вызываемой глутаматным воздействием в присутствии блокаторов дыхания

В первой части вашей работы мы исследовали механизмы МД, вызываемой глутаматом в присутствии кислорода Однако, при таких патологических состояниях, как ишемия/гипоксия глутамат воздействует на нейроны в условиях пониженного содержания кислорода Поэтому следующим этапом наших исследований было изучение механизмов митохондриальной деполяризации, вызываемой глутаматом в условиях гипоксии

Снижение содержания кислорода при гипоксии ингибирует процессы переноса электронов в IV комплексе дыхательной цепи, что, в свою очередь, приводит к ингибированию всей дыхательной цепи (Nicholls and Budd, 2000) Фармакологическая блокада IV комплекса дыхательной цепи имеет схожее с гипоксией влияние на митохондриальную энергетику - она тормозит перенос электронов по дыхательной цепи Это сходство между эффектами фармакологических ингибиторов и гипоксии широко используется для моделирования гипоксии Одним из широко используемых ингибиторов дыхательной цепи является цианид, снижающий активность IV комплекса дыхательной цепи В своей работе мы также использовали этот ингибитор (химическая гипоксия, ХГ

Рис. 11. Динамика [Ca2+Jf и ДЧ'„ во время химической гипоксии, глутамата и их совместного применения. KCN (3 мМ) сам по себе не оказывал влияния на [Са2+], и вызывал 1.6 5 лишь слабую МД, которая значительно усиливалась при глутамата

Последующее применение олигомицина (Ohgo), и затем FCCP не вызывало

дополнительной МД, указывая на то, что МД, возникшая при глутаматном воздействии, была практически максимальной Кривые получены усреднением по 35 нейронам

глутамат

1 ^ У добавлении Т|

2 5 5 0 7 5 10 0 12 5 15 0 17 5 20 0 Время, мин

iffiMaTOS^+EGTA

9 12 15 Время, мин

Рис 12 Влияние глутаматного воздействия в 8г:+-содержащей среде в присутствии цианида на ДЧ*« Культивируемые зернистые нейроны мозжечка помещали сначала в среду, содержащую KCN и ионы Sr2+ вместо Са2+, а затем обрабатывали глутаматом Глутамат вызвал сильную МД Плавное снижение сигнала родамина-123 после окончания глутаматного воздействия связано с постепенным вытеканием зонда из клетки, а не с реполяризацией митохондрий (Ward et al, 2000) Представленные кривые являются усреднением по 27 нейронам

А Б

Рис. 13. Влияние митохопдриальных ядов на A4*», (А) Протонофоры ДНФ (200 чкМ) и FCCP (1 мкМ) вызывали коллапс А¥и в гиппок&мпальных нейронах Блокада IV комплекса дыхательной цепи с помощью NaCN (3 мМ) индуцировала слабую МД, которая усиливалась до максимума при ингибировании митохондриальной АТФазы олигомицином (2 5 мкг/мл, Oligo) (Б) В зернистых нейронах мозжечка ингибирование I комплекса дыхательной цепи ротеноном не вызывает МД и последующее добавление олигомицина вызывает лишь незначительную МД, которая усиливается только при применении цианида Представленные кривые являются усреднением по 10 (А) и 27 (Б) нейронам

(Dubinsky and Rothman, 1991)) и сравнили его эффекты с эффектами блокады I комплекса дыхательной цепи ротеноном

2.1. Эффекты блокаторов дыхательной цепи

Опыты проводились на культивируемых (6-10 дней в культуре) нейронах мозжечка Во всех нейронах блокада дыхательной цепи с помощью NaCN или KCN (3 мМ) приводила к развитию сравнительно слабой митохондриальной деполяризации (-15-20% от максимальной МД, вызываемой применением протонофора, >300 нейронов), последующее же применение глутамата индуцировало сильную МД и значительный подъем [Са2+], (рис

И)

Одной из возможных причин развития сильной МД во время глутаматного воздействия в присутствии цианида может являться повышение проводимости митохондриальной мембраны, и, в частности, открывание митохондриальной поры Наши опыты показали, что эта МД не была связана с открыванием митохондриальной поры, поскольку качественно схожая сильная МД (рис 12) наблюдалась во время глутаматного воздействия в присутствии цианида в Бг^-содержащей среде Однако эти результаты не исключают возможности того, что глутамат вызывал повышение проводимости по механизму, обусловленному митохондриальной порой нечувствительной к ЦсА (Sultan and Sokolove, 2001а,b) В подтверждение возможности существования такого механизма говорит тот факт, что повышение протонной проводимости протонофором динитрофенолом (ДНФ) значительно усиливает МД, индуцированную цианидом (рис 13 А) Необходимо подчеркнуть, что для значительного усиления МД, индуцированной цианидом, достаточно очень малой дозы ДНФ (8 мкМ), которая при нормальном функционировании дыхательной цепи вызывает лишь слабую МД

Необходимо отметить, что в условиях блокады дыхатечьной цепи цианидом А^м поддерживается реверсированной митохондриальной АТФ-синтазой и блокада этого механизма олигомицином (2 5 мкг/мл, Ohgo) приводит к полной МД (рис 13 А)

10 15 20 25 Время, мин

15 20 25 30 Время, мин

Рис. 14 Потенцирование протонофором динитрофенолом МД, вызванной ингибиторами дыхательной цепи КСМ (0 5 мМ (А)) и ротенон (2 мкМ (Б)) значительно потенцируют МД, вызываемую малыми дозами разобщителя ДНФ (8, 10 или 20 мкМ) Представленные кривые явтяются усреднением по 15-25 нейронам

Мы сравнили эффекты, производимые CN, с эффектами блокады I комплекса дыхательной цепи ротеноном Опыты показали что ротенон сам по себе не вызывает МД, но так же как и цианид, значительно усиливает МД, вызываемую малыми дозами протонофора (рис 14Б) Однако блокада митохондриальной АТФазы/синтазы олигомицином в присутствии ротенона не вызывала такой сильной МД, как в присутствии цианида (рис 13) Схожие различия в эффектах цианида и ротенона были описаны ранее на гепатоцитах (Akerman and Jarvisalo, 1980) и отнесены к работе шунтирующих механизмов в дыхательной цепи Ротенон ингибирует I комплекс дыхательной цепи, но поступление электронов в дыхательную цепь возможно через II комплекс этой цепи Наличие ротенона препятствует также накоплению оксалоацетата, возникающего при дыхании опосредованном II комплексом и способного ингибировать II комплекс (см например (Brustovetsky and

FCCP

23 ,21-

£ 191

со

а:

17 1 5)

5 1 3-< 1 1 0 91

ротенон

01'до,

:£ССР

9 12 15

Время, мин

9 12 15

Время, мин

18 21

Рис 15 Динамика [Са2+], и АЧ'М во время воздействия глутамата и/или ротенона

Ротенон сам по себе не оказывал практически никакого влияния на [Са2+], (А) и Д1?« (Б) Добавление глутамата привело к двухфазному подъему [Са2+], (А) и сигнала родамина (Б) Сильная МД развивалась только при вторичном подъеме [Са2+],

Рис. 16. Зависимость МД, вызываемой глутаматом в условиях химической гипоксии, от ионного состава внеклеточной среды. Применение КСЫ вызвало слабую МД, которая усилилась только при добавлении глутамата в Ка+-содержащей среде Последующее добавление Са+ индуцировало дополнительный прирост МД Снижение флуоресценции в конце эксперимента отражает медленное вытекание зонда из клеток Кривая является усреднением по 15 нейронам

БиЫшку, 2000) и ссылки там) Иными словами, присутствие ротенона переводит митохондрии внутри клетки на окисление субстратов II комплекса, но не вызывает полной блокады дыхательной цепи Поэтому, различие в эффектах ротенона и цианида может быть обусловлено именно тем, что первый ингибитор лишь снижает активность дыхательной цепи, в то время как второй полностью ингибирует дыхание митохондрий

Таким образом, повышение протонной проводимости митохондриальной мембраны значительно усиливает МД, вызываемую блокадой любого звена дыхательной цепи Следовательно, если МД, индуцированная глутаматом в присутствии цианида, была результатом повышения проводимости митохондриальной мембраны, то сходная сильная МД должна наблюдаться во время действия глутамата в присутствии ротенона Однако, применение глутамата в присутствии ротенона вызвало лишь умеренные МД и [Са2+], подъем, которые после некоторого латентного периода сменялись сильной МД и увеличением [Са2+], до максимума (рис 15) На основании того, что сильная МД развивалась только при совместном применении глутамата и цианида, но не глутамата и ротенона мы пришли к заключению о том, что сильная глутамат-индуцированная МД в присутствии цианида не была обусловлена повышением проводимости митохондриальной мембраны

Одним из возможных механизмов, индуцирующих сильную МД в присутствии цианида является снижение активности митохондриальной АТФазы, поддерживающей Д1?», в условиях блокады дыхания Функционирование этой АТФазы в значительной степени зависит от наличия АТФ В настоящее время установлено, что глутамат вызывает снижение внутриклеточного уровня АТФ (Богачев и др , 1992, Пинетис и др, 1997,Киз1шагеуа й а1, 2005) путем активации Ка+/К+-АТФазы и Са2+-АТФазы плазматической мембраны Это, в свою очередь, может привести к развитию МД в присутствии цианида

Применение глутамата в присутствии цианида не вызывает МД, если во внешней среде отсутствуют ионы, проникающие в клетки (рис 16, Са2+ заменен на БЭТА (100 мкМ), заменен на М-метил-О-глюкамин (ИМО) - ион, не проникающий в клетки) Последующее возвращение нейронов в Ыа+-содержащую среду приводит к развитию митохондриальной деполяризации, которая усиливается при возвращении в Са -содержащую среду (п = 90 клеток)

Однако механизмы МД, вызываемой Кта+ во время глутаматного воздействия в условиях химической гипоксии, могут быть разными Развитие МД может происходить вследствие унипортер-опосредованного электрофоретического входа в митохондрии (КтсЫзк й а1, 2004) Повышение [№+], может также приводить к снижению внутриклеточного уровня АТФ за счет активации №+/К+-АТФазы Для выяснения механизма этой МД был проведен эксперимент в присутствии ингибитора Ыа+/К+-АТФазы уабаина (0 5 мМ) Уабаин предотвратил МД, вызываемую глутаматом в присутствии цианида в

1.1; 0.9;

^Контроль т I /••.!. "+Уаба и н

РССР

0 200 400 600 800 1000 1200 Время, сек

Рис 17 Влияние уабаина на митохондриальную депотяризацию, вызываемую глутаматом во время химической гипоксии Нейроны мозжечка подвергались действию глутамата в условиях химической гипоксии в присутствии (уабаин) и отсутствии (контроль) уабаина (0 5 мМ) Применение глутамата в бескальциевой среде в присутствии цианида вызывает развитие МД Уабаин практически снимает эту МД, но не предотвращает МД, вызываемую добавлением Са2+ (п = 85)

бескальциевой среде (рис 17, п = 82) Необходимо отметить также, что применение цианида вызывало одинаковую МД как в контроле, так и в присутствии уабаина Этот факт говорит о том, что повышение Ка+, которое могло бы возникнуть в присутствии уабаина, само по себе не усиливало МД, вызванную цианидом

Известно, что уабаин уменьшает расход АТФ вследствие ингибирования Ка+/К+-АТФазы, но не предотвращает вход Ыа+, поэтому мы пришли к выводу о том, что митохондриальная деполяризация, вызванная глутаматом в присутствии цианида, является следствием снижения уровня АТФ

Однако накопление натрия, во время глутаматного воздействия в бескальциевой среде приводит лишь к частичной МД, которую можно усилить с помощью возвращения в Са2+ -содержащую среду (рис 16, 17) Следовательно, вход Са в нейроны запускает ряд процессов, приводящих к МД

Одним из Са2+-зависимых механизмов МД, вызываемой глутаматом в присутствии цианида, может бьггь электрофоретический захват Са2+ митохондриями По всей видимости, этот механизм может вносить вклад в глутамат-индуцированную МД в присутствии цианида, однако, проверка этого предположения требует дальнейших исследований

Другим возможным механизмом Са^+-зависимой МД является снижение активности митохондриальной АТФазы вследствие работы Са2+/Н+-АТФазы плазматической мембраны К сожалению, в настоящее время отсутствуют специфические ингибиторы этого насоса плазматической мембраны, и нам не удалось проверить вклад падения АТФ, индуцированного работой Са2*/Н*-АТФазы, в развитие МД, вызванной глутаматным воздействием в присутствии цианида Однако, сравнение динамики развития Са2+-индуцированной МД в присутствии и отсутствии уабаина показывает, что снижение АТФ является доминирующим фактором, обуславливающим развитие этой МД Так, в контроле добавление Са2+ вызывает быстро развивающуюся МД, которая достигает максимума через ~1 5 мин В присутствии уабаина, сохранившего АТФ, МД развивается значительно медленнее - она достигает максимума только через 5 мин после возвращения в Са2+-содержащую среду Мы полагаем, что это замедление развития Са2+-зависимой МД обусловлено именно уменьшением расхода АТФ в присутствии уабаина и, как следствие, поддержанием высокой активности митохондриальной АТФазы

выводы

1 В опытах на культивируемых кортикальных и гиппокампальных нейронах показано, что первичное повышение [Са2+], и слабая митохондриальная деполяризация (МД), вызванные глутаматным воздействием, у всех нейронов сочетались с параллельным снижением цитозольного и митохондриального рН (рНц и рН„, соответственно)

2 Вторая фаза подъема [Са2+], (отсроченная кальциевая дизрегуляция, ОКД) и синхронная с ней сильная МД, развивающиеся во время глутаматного воздействия, у большинства нейронов сопровождались вторичным сильным закислением матрикса и ослаблением цитозольного ацидоза, свидетельствуя о перераспределении протонов между цитозолем и матриксом У небольшой группы нейронов вторичному падению рН„ предшествовало повышение рНм, сочетающееся с началом ОКД

3 Воздействия, блокирующие формирование классической митохондриальной поры (замена Са2+ на Si2* или инкубация клеток в среде, содержащей циклоспорин А) препятствовали усилению вторичного митохондриального закисления в начале ОКД Вместо этого закисления возникало выраженное транзиторное защелачивание митохондрий, что исключает возможность объяснения сильной МД открыванием не только классической, но и какой-либо другой поры в митохондриальной мембране

4 В опытах на гиппокампальных нейронах показано, что вторичное митохондриальное закисление сопровождается набуханием митохондрий, которое может быть предотвращено заменой ионов Са2+ на антагонист митохондриальной поры ионы Sr2+

5 Сопоставление динамики рН„ в присутствии и отсутствии ингибиторов митохондриальной поры привело нас к заключению о том, что существует два альтернативных механизма МД, сопровождающей ОКД (1) открывание митохондриальной поры, ведущее к коллапсу митохондриального потенциала и закислению матрикса, и (2) беспоровая МД, сочетающаяся с митохондриальным защелачиванием В отсутствии блокаторов митохондриальной поры глутамат-индуцированная МД в большинстве нейронов возникает только при активации митохондриальной поры

6 Блокада четвертого комплекса дыхательной цепи цианидами значительно усиливает митохондриальную деполяризацию, вызываемую глутаматным воздействием В основе этого эффекта лежит быстрое истощение АТФ, необходимого для поддержания митохондриального потенциала в условиях, когда этот потенциал генерируется реверсированной митохондриальной АТФ-синтазой

7 В отличие от цианидов, блокатор первого комплекса дыхательной цепи ротенон лишь слабо потенцирует эффекты глутамата, поскольку в этих устовиях митохондриальный потенциал поддерживается не реверсированной АТФ-синтазой, а редуцированной (II-IV комплексы) дыхательной цепью

8 Замена Са2+ на Sr2+ не предотвращает развития сильной МД при совместном применении глутамата и цианида, свидетельствуя о том, что открывание митохондриальной поры не является необходимым для усиления глутаматом митохондриальной деполяризации вызываемой цианидами

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Bolshakov А Р . Mikhailova М М, Jurevicius А, Surin А М , Pmehs V G , Khodorov В I (2003) Contribution of Са2+ and Na to glutamate-induced mitochondrial depolarization in cerebellar granule cells Биологические Мембраны 20 443-445

2 Сурин A M, Большаков А П . Михайлова М М, Сорокина Е Г, Сенилова Я Е , Пинелис В Г, Ходоров Б И (2006) Арахидоновая кислота усиливает рост концентрации Са2+ и митохондриальную деполяризацию, вызванные глутаматом в гранулярных нейронах мозжечка Биохимия 71(8) 1066-73

3 Shalbuyeva N , Brustovetsky Т, Bolshakov А, Brustovetsky N (2006) Calcium-dependent spontaneously reversible remodeling of brain mitochondria J Biol Chem 281(49) 37547-

4 Михайлова М М , Большаков \ П . Сурин А М , Пинелис В Г Ходоров Б И (2003) Снижение устойчивости нейронов к токсическому воздействию глутамата в отсутствие глюкозы Биологические Мембраны, 20 446-448

5 Khodorov В, Sunn A, Bolshakov А . Mikhailova М, Storozhevykh Т, Jurevicius А, Sorokma Е, Vmskaya N, Pinelis V Prolonged glucose deprivation causes dramatic changes m [Cai+], and mitochondrial responses to a toxic Glu challenge m young cerebellar granule cells (CGC) The Physiological Society Meeting, London-2002 J Physiology 547P PC23

6 Сурин A M, Сторожевых T П , Большаков А П. Винская H П , Пинелис В Г, Ходоров Б И, MR Duchen О роли FlFo-АТРазы в нарушениях кальциевого гомеостаза, индуцированного токсическими дозами глутамата в зрелых гиппокампальных нейронах Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино, 16-18 июня 2003, стр 198-200

7 Khodorov В , Bolshakov А . Jurevicius А , Mikhailova М , Sorokma Е , Sunn А, Cooper М , Pmelis V Mitochondrial depolarization induced by cyanide m cultured central neurons is age-dependent 48th Annual Meeting of Biophysical Society, Baltimore, February 2004, 2357-pos/B454

8 Ходоров Б И , Вабниц А В , Михайлова М М , Большаков А П. Сорокина Е Г, Сурин А М, Пинелис В Г О природе отсроченных нарушений кальциевого гомеостаза нейрона при гиперстимутяции глутаматных рецепторов Третий Российский Конгресс по патофизиологии Москва 9-12 ноября 2004 Тезисы докладов, стр 146

9 Сурин А М , Большаков А П . Михайлова М М , Сенилова Я Е , Сорокина Е Г , Пинелис В Г Влияние арахидоновой кислоты на индуцированные глутаматом изменения Са2+ и митохондриального потенциала в культивируемых нейронах Третий Российский Конгресс по патофизиологии Москва 9-12 ноября 2004 Тезисы докладов, стр 144

10 Khodorov ВI, Bolshakov АР. Mikhailova MM, Vabmtz А V, Sunn AM, Storozhevykh Т Р , Sorokma Е G , Senilova Y Е, Pmelis V G A difference m the mechanisms of mitochondrial depolarization induced by cyanides, glucose deprivation or glutamate exposure m cerebellar granule cells 34th Annual Meeting of Society for Neuroscience, San Diego 2004, Itinerary viewer 795 5

11 Сурин A M , Большаков А П . Михайлова M M , Сорокина E Г , Сенилова Я E , Пинелис В Г Роль арахидоновой кислоты в нарушениях Са2+ гомеостаза, вызванных глутаматом в культивируемых нейронах Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино, 6-8 июня 2005

12 Большаков А П . Михайлова М М , Пинелис В Г , Ходоров Б И Влияние глутаматного воздействия на митохондриатьный рН в кортикальных нейронах Конференция «Нейрохимия фундаментальные и прикладные аспекты» Москва 14-16 марта 2005 Тезисы докладов, стр 135

13 Brustovetsky N, Shalbuyeva N, Brustovetsky T, Bolshakov A Calcium-dependent spontaneously reversible morphological changes m CNS mitochondria 36th Annual Meeting of Society for Neuroscience, Atlanta 2006, Neuroscience meeting planner 19 7

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Большаков, Алексей Петрович

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор данных литературы.

Цели и задачи исследования.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

Глава 3. Результаты исследования.

Глава 4. Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование механизмов митохондриальной деполяризации и кальциевой дизрегуляции, индуцируемой возбуждающим медиатором глутаматом в нейронах мозга"

Актуальность проблемы.

Одной из ключевых стадий повреждения нейронов при ряде патологий центральной нервной системы является токсическое действие нейромедиатора глутамата, избыточно выделяющегося и накапливающегося в межклеточном пространстве (Duchen, 2004;Nicholls, 2004). Исследования причин глутаматной нейротоксичности показали, что вход Са через NMDA подтип глутаматных каналов и последующее накопление Са2+ в митохондриях являются основными факторами, приводящими к клеточной гибели (обзоры (Khodorov, 2004;Nicholls and Budd, 2000)).

В исследованиях, проведенных на первичных культурах нейронов, было обнаружено, что гибель нейронов после глутаматного шока тесно связана с развитием вторичного подъема внутриклеточной концентрации Са ([Са ];). Это вторичное увеличение [Са ]j получило название отсроченной кальциевой дизрегуляции (ОКД) (Tymianski et al., 1993). В последующих исследованиях было продемонстрировано, что ОКД сопровождается синхронной митохондриальной деполяризацией (МД) (Vergun et al., 1999). Было также показано, что МД играет решающую роль в механизме глутамат-индуцированного нарушения Са2+ гомеостаза (Khodorov et al., 1996;Ходоров и др., 2001) и что циклоспорин А (ЦсА) и некоторые его производные замедляют или предотвращают развитие сильной МД и вторичного повышения [Са ]; в культивируемых нейронах центральной нервной системы (Vergun et al., 1999;Alano et al., 2002). Принимая во внимание способность этих веществ противодействовать формированию митохондриальной поры (МП) в изолированных митохондриях, было сделано заключение о том, что открывание МП приводит к коллапсу митохондриального потенциала (A*FM) во время глутаматного воздействия. Однако этот вывод в настоящее время поставлен под сомнение рядом других исследований, в которых не удалось воспроизвести защитный эффект ЦсА (Isaev et al., 1996;Castilho et al., 1998;Chinopoulos et al., 2004;Pivovarova et al., 2004). Эти противоречия и некоторые ограничения, связанные с применением ЦсА даже на изолированных митохондриях (Brustovetsky and Dubinsky, 2000) побудили нас использовать для изучения этой проблемы новый экспериментальный подход, основанный на сравнительном анализе изменений митохондриального и цитозольного рН (рНм и рНц, соответственно). Хорошо известно, что глутамат вызывает закисление цитозоля (Пинелис и др., 1992; Hartley and Dubinsky, 1993). Однако влияние глутаматного воздействия на динамику нейронального рНм in situ до сих пор не изучалось. Между тем, заманчиво было предположить, что открывание митохондриальной поры вызовет снижение рНм (поскольку рНц меньше рНм), в то время как блокада открывания МП предотвратит развитие этого митохондриального подкисления. Чтобы проверить это предположение мы исследовали изменения рНц и рНм во время длительного глутаматного воздействия, используя рН-чувствительные флуоресцентные белки, селективно экспрессированные в цитозоле и митохондриях (cytYFP, mtYFP, и экспрессируемый в митохондриях перикам 2mtRP (Porcelli et al., 2005;Nagai et al., 2001). Эти измерения мы проводили в сочетании с одновременным мониторингом изменений [Ca2+]j. В параллельных экспериментах мы регистрировали изменения [Ca2+]j и A4V Измерения проводились как в контрольных условиях, так и после воздействий, которые препятствуют открыванию МП в изолированных митохондриях. К числу таких воздействий, как известно, относятся замена внеклеточного Са2+ на Sr2* замена или применение ЦсА (Bernardi et al., 1992).

В результате всех проведенных исследований мы пришли к заключению о существовании двух альтернативных механизмов глутамат-индуцированной отсроченной МД: открывание поры и беспоровый механизм, при котором происходит подщелачивание митохондриального матрикса.

Научная новизна

В нашей работе впервые использован новый прием для изучения роли митохондриальной поры в механизмах дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов при длительном действии глутамата - измерения рН митохондриального матрикса (рНм). Измерения рНм in situ в сочетании с другими подходами были использованы для демонстрации роли митохондриальной поры в развитии МД. у.

Нами впервые проведено сопоставление динамики [Са ]* и рН в цитозоле (рНц) и митохондриях при длительном глутаматном воздействии. Впервые показано, что снижение рН„ во время глутаматного воздействия имеет двухфазный характер, причем вторая фаза падения рНм возникает с некоторой задержкой после начала ОКД. Мы также впервые обнаружили, что антагонисты митохондриальной поры (циклоспорин А и ионы Sr2*) не предотвращают развитие ОКД и сильной МД, но существенно изменяют динамику рНм во время развития ОКД. Результаты этих экспериментов свидетельствуют в пользу того, что митохондриальная пора участвует в развитии ОКД и МД при глутаматном воздействии.

Впервые проведено сопоставление изменений морфологии митохондрий и динамики [Са ]j и рНм во время глутаматного воздействия. Мы показали, что начало вторичного митохондриального подкисления сопровождается изменениями митохондриальной формы, которые, согласно имеющейся литературе, можно рассматривать как митохондриальное набухание. Впервые показано, что в

Si* -содержащей среде глутаматное воздействие не вызывает никаких изменений митохондриальной морфологии. На основании того, что митохондриальное набухание является характерной чертой формирования митохондриальной поры и того, что во время глутаматного воздействия оно возникает лишь в Са -содержащей среде было сделано заключение о том, что вторичное митохондриальное подкисление и сопровождающее его митохондриальное набухание являются следствием открывания митохондриальной поры.

Положения, выносимые на защиту

1. Вторичное митохондриальное подкисление, сопровождающее отсроченную кальциевую дизрегуляцию (ОКД) во время глутаматного воздействия, является следствием открывания митохондриальной поры.

2. В присутствии ингибиторов классической митохондриальной поры (ионов Sr2"1" или циклоспорина А) развитие сильной митохондриальной деполяризации (МД), сопровождающей ОКД, происходит по «беспоровому» механизму.

3. Существует два альтернативных механизма МД, сопровождающей ОКД: (1) открывание митохондриальной поры, ведущее к коллапсу митохондриального потенциала и закислению матрикса, и (2) беспоровая МД, сочетающаяся с митохондриальным защелачиванием. В отсутствии блокаторов митохондриальной поры глутамат-индуцированная МД в большинстве нейронов возникает только при активации митохондриальной поры.

4. В основе развития сильной МД, наблюдающейся во время глутаматного воздействия в присутствии цианидов, лежит быстрое истощение АТФ, необходимого для поддержания митохондриального потенциала в условиях, когда этот потенциал генерируется реверсированной митохондриальной АТФ-синтазой.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Большаков, Алексей Петрович

выводы

1. В опытах на культивируемых кортикальных и гиппокампальных нейронах показано, что первичное повышение [Са ]\ и слабая митохондриальная деполяризация (МД), вызванные глутаматным воздействием, у всех нейронов сочетались с параллельным снижением цитозольного и митохондриального рН (рНц и рНм, соответственно).

2. Вторая фаза подъема [Са ]j (отсроченная кальциевая дизрегуляция, ОКД) и синхронная с ней сильная МД, развивающиеся во время глутаматного воздействия, у большинства нейронов сопровождались вторичным сильным закислением матрикса и ослаблением цитозольного ацидоза, свидетельствуя о перераспределении протонов между цитозолем и матриксом. У небольшой группы нейронов вторичному падению рНм предшествовало повышение рНм, сочетающееся с началом ОКД.

3. Воздействия, блокирующие формирование классической митохондриальной поры (замена Са2+ на

Sr2+ или инкубация клеток в среде, содержащей циклоспорин А) препятствовали усилению вторичного митохондриального закисления в начале ОКД. Вместо этого закисления возникало выраженное транзиторное защелачивание митохондрий, что исключает возможность объяснения сильной МД открыванием не только классической, но и какой-либо другой поры в митохондриальной мембране.

4. В опытах на гиппокампальных нейронах показано, что вторичное митохондриальное закисление сопровождается набуханием митохондрий,

Л I которое может быть предотвращено заменой ионов Са на антагонист митохондриальной поры ионы Sr24".

5. Сопоставление динамики рНм в присутствии и отсутствии ингибиторов митохондриальной поры привело нас к заключению о том, что существует два альтернативных механизма МД, сопровождающей ОКД: (1) открывание митохондриальной поры, ведущее к коллапсу митохондриального потенциала и закислению матрикса, и (2) беспоровая МД, сочетающаяся с митохондриальным защелачиванием. В отсутствии блокаторов митохондриальной поры глутамат-индуцированная МД в большинстве нейронов возникает только при активации митохондриальной поры. Блокада четвертого комплекса дыхательной цепи цианидами значительно усиливает митохондриальную деполяризацию, вызываемую глутаматным воздействием. В основе этого эффекта лежит быстрое истощение АТФ, необходимого для поддержания митохондриального потенциала в условиях, когда этот потенциал генерируется реверсированной митохондриальной АТФ-синтазой.

В отличие от цианидов, блокатор первого комплекса дыхательной цепи ротенон лишь слабо потенцирует эффекты глутамата, поскольку в этих условиях митохондриальный потенциал поддерживается не реверсированной АТФ-синтазой, а редуцированной (II-IV комплексы) дыхательной цепью.

Замена Са2+ на Sr2"1" не предотвращает развития сильной МД при совместном применении глутамата и цианида, свидетельствуя о том, что открывание митохондриальной поры не является необходимым для усиления глутаматом митохондриальной деполяризации вызываемой цианидами.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает сердечную благодарность своему научному руководителю профессору, доктору медицинских наук Борису Израилевичу Худый-Ходорову за чуткое отношение, терпение и понимание.

Автор также благодарен своему руководителю профессору, доктору медицинских наук Всеволода Григорьевича Пинелиса за ценные обсуждения, критику, техническую поддержку и методические рекомендации.

Автор очень признателен Александру Михайловичу Сурину за предоставленные данные, помощь в проведении экспериментов и обсуждение результатов, а также всем сотрудникам Лаборатории мембранологии НЦЗД РАМН за постоянную поддержку.

Отдельная благодарность профессору Николаю Брустовецкому (Университет Индианы, США) за предоставленные результаты и критические замечания в процессе работы.

Автор признателен профессору Р. Рицутто и Г. Сзабадкай (Университет Феррары, Италия) за предоставленные плазмиды.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№ гранта: 05-04-49409), гранта «Ведущие научные школы» (№9124.2006.4), и гранта НАТО.

Заключение

Таким образом, в нашей работе показано, что развитие ОКД и синхронной с ней МД сопровождается отсроченным митохондриальным подкислением, обусловленным открыванием МП. Вывод о формировании МП во время развития ОКД сделан на основе данных по исследованию морфологии митохондрий, а также результатов, полученных при применении антагонистов МП.

Сравнение динамики рНм, а также синхронность развития ОКД и МД помогли сделать заключение о механизме сильной МД во время глутаматного воздействия. По нашим представлениям, в нейронах, где вторичное подкисление развивалось практически синхронно с ОКД (и МД), эта МД индуцировалась открыванием МП. В клетках же, где открывание МП (вторичное снижение рНм) было отсрочено по сравнению с началом ОКД, развитие МД инициировалось входом Са2+ в митохондрии, которое сменялось последующим формированием МП.

Кроме того, мы выяснили механизм МД, вызываемой глутаматом в Sr2+-содержащей среде, когда открывание МП невозможно. Согласно результатам, полученным нами, развитие МД инициировалось митохондриальным захватом Sr2"1", который сменялся, по всей видимости, стронциевым циклом.

Суммируя все наши данные мы пришли к выводу, что существует два альтернативных механизма глутамат-индуцированной митохондриальной деполяризации: электрофоретический захват Са2+ (или Sr2*), сопровождающийся подщелачиванием митохондриального матрикса, и открывание митохондриальной поры, сопровождающееся подкислением митохондрий.

Мы также обнаружили, что механизмы МД, индуцированной глутаматом, различаются в присутствии и отсутствии блокаторов дыхания. Оказалось, что в присутствии цианида сильная глутамат-индуцированная МД является следствием недостатка АТФ в условиях реверсии митохондриальной АТФ-синтазы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Большаков, Алексей Петрович, Долгопрудный

1. Богачев АП, Быкова ЛП, Ходоров БИ, Андреева Н, Хаспеков ЛГ, Пинелис ВГ, Викторов ИВ (1992) Устойчивое снижение содержания АТФ в культивируемых нейронах мозжечка и гиппокампа во время и после глутаматного воздействия. Биол мембраны 9:1057-1059.

2. Бородин АВ, Ходоров БИ (2003) Математическое моделирование нарушений Са2+ гомеостаза в нейронах мозга после гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Биол мембраны 19:322-335.

3. Вабниц АВ, Сенилова ЯЕ, Колесникова ТВ, Сурин AM, Пинелис ВГ, Ходоров БИ (2006) Отсроченная Са дисрегуляция в молодых нейронах мозжечка при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Роль NMDA-каналов. Биол мембраны 23:311-319.

4. Исаев НК, Андреева НА, Стельмашук ЕА, Зоров ДБ (2005) Роль митохондрий в глутаматной токсичности. Биохимия 70(6):741-750ю

5. Пинелис ВГ, Быкова ЛП, Богачев АП, Исаев НК, Викторов ИВ, Ходоров БИ (1997) Токсическое воздействие глутамата на зернистые нейроны мозжечка снижает внутриклеточный уровень АТФ. Роль ионов Са2+. Бюлл Эксп Биол Мед 123:162-164.

6. Aarts М, Iihara К, Wei WL, Xiong ZG, Arundine M, Cerwinski W, MacDonald JF, Tymianski M (2003) A key role for TRPM7 channels in anoxic neuronal death. Cell 115:863-877.

7. Abad MF, Di BG, Magalhaes PJ, Filippin L, Pozzan T (2004) Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem 279:11521-11529.

8. Abercrombie RF, Hart СЕ (1986) Calcium and proton buffering and diffusion in isolated cytoplasm from Myxicola axons. Am J Physiol 250:C391-C405.

9. Adamec E, Didier M, Nixon RA (1998) Developmental regulation of the recovery process following glutamate-induced calcium rise in rodent primary neuronal cultures. Brain Res Dev Brain Res 108:101-110.

10. Agranoff BW, Wayne Albers R, Altermus M, Neerlands TR, Nestler EJ, Uhl GR, Uhler MD, Vanier MT, Youdim MBH, Yudkoff M (1999) Basic neurochemistry. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers.

11. Akerman KE (1978) Changes in membrane potential during calcium ion influx and efflux across the mitochondrial membrane. Biochim Biophys Acta 502:359-366.

12. Akerman KE, Jarvisalo JO (1980) Effects of ionophores and metabolic inhibitors on the mitochondrial membrane potential within isolated hepatocytes as measured with the safranine method. Biochem J 192:183-190.

13. Alano CC, Beutner G, Dirksen RT, Gross RA, Sheu SS (2002) Mitochondrial permeability transition and calcium dynamics in striatal neurons upon intense NMDA receptor activation. J Neurochem 80:531-538.

14. Almeida A, Bolanos JP (2001) A transient inhibition of mitochondrial ATP synthesis by nitric oxide synthase activation triggered apoptosis in primary cortical neurons. J Neurochem 77:676-690.

15. Andreeva N, Khodorov B, Stelmashook E, Cragoe E Jr, Victorov I (1991) Inhibition of Na+/Ca2+ exchange enhances delayed neuronal death elicited by glutamate in cerebellar granule cell cultures. Brain Res 548:322-325.

16. Andreyev AY, Fahy B, Fiskum G (1998) Cytochrome с release from brain mitochondria is independent of the mitochondrial permeability transition. FEBS Lett 439:373-376.

17. Ankarcrona M, Dypbukt JM, Bonfoco E, Zhivotovsky B, Orrenius S, Lipton SA, Nicotera P (1995) Glutamate-induced neuronal death: a succession of necrosis or apoptosis depending on mitochondrial function. Neuron 15:961-973.

18. Ankarcrona M, Dypbukt JM, Orrenius S, Nicotera P (1996) Calcineurin and mitochondrial function in glutamate-induced neuronal cell death. FEBS Lett 394:321324.

19. Bano D, Young KW, Guerin С J, Lefeuvre R, Rothwell NJ, Naldini L, Rizzuto R, Carafoli E, Nicotera P (2005) Cleavage of the plasma membrane Na+/Ca2+ exchanger in excitotoxicity. Cell 120:275-285.

20. Baron KT, Wang GJ, Padua RA, Campbell C, Thayer SA (2003) NMDA-evoked consumption and recovery of mitochondrially targeted aequorin suggests increased Ca2+ uptake by a subset of mitochondria in hippocampal neurons. Brain Res 993:124-132.

21. Bernardi P (1999) Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers, and permeability transition. Physiol Rev 79:1127-1155.

22. Bernardi P (1992) Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. J Biol Chem 267:8834-8839.

23. Bernardi P, Broekemeier KM, Pfeiffer DR (1994) Recent progress on regulation of the mitochondrial permeability transition pore; a cyclosporin-sensitive pore in the inner mitochondrial membrane. J Bioenerg Biomembr 26:509-517.

24. Bernardi P, Vassanelli S, Veronese P, Colonna R, Szabo I, Zoratti M (1992) Modulation of the mitochondrial permeability transition pore. Effect of protons and divalent cations. J Biol Chem 267:2934-2939.

25. Blaustein MP, Lederer WJ (1999) Sodium/calcium exchange: its physiological implications. Physiol Rev 79:763-854.

26. Boron WF (2004) Regulation of intracellular pH. Adv Physiol Educ 28:160-179.

27. Brocard JB, Tassetto M, Reynolds IJ (2001) Quantitative evaluation of mitochondrial calcium content in rat cortical neurones following a glutamate stimulus. J Physiol 531:793-805.

28. Brustovetsky N, Brustovetsky T, Jemmerson R, Dubinsky JM (2002) Calcium-induced cytochrome с release from CNS mitochondria is associated with the permeability transition and rupture of the outer membrane. J Neurochem 80:207-218.

29. Brustovetsky N, Dubinsky JM (2000a) Dual responses of CNS mitochondria to elevated calcium. J Neurosci 20:103-113.

30. Brustovetsky N, Dubinsky JM (2000b) Limitations of cyclosporin A inhibition of the permeability transition in CNS mitochondria. J Neurosci 20:8229-8237.

31. Budd SL, Nicholls DG (1996) Mitochondria, calcium regulation, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. J Neurochem 67:2282-2291.

32. Budd SL, Tenneti L, Lishnak T, Lipton SA (2000) Mitochondrial and extramitochondrial apoptotic signaling pathways in cerebrocortical neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 97:6161-6166.

33. Canzoniero LM, Sensi SL, Choi DW (1996) Recovery from NMDA-induced intracellular acidification is delayed and dependent on extracellular bicarbonate. Am J Physiol 270:C593-C599.

34. Castilho RF, Hansson O, Ward MW, Budd SL, Nicholls DG (1998) Mitochondrial control of acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. J Neurosci 18:10277-10286.

35. Chalmers S, Nicholls DG (2003) The relationship between free and total calcium concentrations in the matrix of liver and brain mitochondria. J Biol Chem 278:1906219070.

36. Chesler M (2003) Regulation and modulation of pH in the brain. Physiol Rev 83:11831221.

37. Chinopoulos C, Gerencser AA, Doczi J, Fiskum G, dam-Vizi V (2004) Inhibition of glutamate-induced delayed calcium deregulation by 2-APB and La3+ in cultured cortical neurones. J Neurochem 91:471-483.

38. Choi DW (1988) Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron 1:623-634.

39. Crompton M (1999) The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death. Biochem J 341 (Pt 2):233-249.

40. Czyz A, Baranauskas G, Kiedrowski L (2002) Instrumental role of Na+ in NMDA excitotoxicity in glucose-deprived and depolarized cerebellar granule cells. J Neurochem 81:379-389.

41. Dawson TM, Steiner JP, Dawson VL, Dinerman JL, Uhl GR, Snyder SH (1993) Immunosuppressant FK506 enhances phosphorylation of nitric oxide synthase and protects against glutamate neurotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 90:9808-9812.

42. DiPolo R, Beauge L (2006) Sodium/calcium exchanger: influence of metabolic regulation on ion carrier interactions. Physiol Rev 86:155-203.

43. Dubinsky JM (1993) Intracellular calcium levels during the period of delayed excitotoxicity. J Neurosci 13:623-631.

44. Dubinsky JM, Levi Y (1998) Calcium-induced activation of the mitochondrial permeability transition in hippocampal neurons. J Neurosci Res 53:728-741.

45. Dubinsky JM, Rothman SM (1991) Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury. J Neurosci 11:2545-2551.

46. Duchen MR (2004) Mitochondria in health and disease: perspectives on a new mitochondrial biology. Mol Aspects Med 25:365-451.

47. Duchen MR, Jackson JB, Keelan J, Mojet MH, Vergun О (2001) Functional imaging of mitochondria within cells. In: Methods in cellular imaging pp 88-111. Oxford university press.

48. Erdelt H, Weidemann MJ, Buchholz M, Klingenberg M (1972) Some principle effects of bongkrekic acid on the binding of adenine nucleotides to mitochondrial membranes. Eur J Biochem 30:107-122.

49. Filippin L, Abad MC, Gastaldello S, Magalhaes PJ, Sandona D, Pozzan T (2005) Improved strategies for the delivery of GFP-based Ca2+ sensors into the mitochondrial matrix. Cell Calcium 37:129-136.

50. Filippin L, Magalhaes PJ, Di BG, Colella M, Pozzan T (2003) Stable interactions between mitochondria and endoplasmic reticulum allow rapid accumulation of calcium in a subpopulation of mitochondria. J Biol Chem 278:39224-39234.

51. Forte M, Bernardi P (2005) Genetic dissection of the permeability transition pore. J Bioenerg Biomembr 37:121-128.

52. Frieden M, James D, Castelbou C, Danckaert A, Martinou JC, Demaurex N (2004) Ca(2+) homeostasis during mitochondrial fragmentation and perinuclear clustering induced by hFisl. J Biol Chem 279:22704-22714.

53. Gunter ТЕ (1994) Cation transport by mitochondria. J Bioenerg Biomembr 26:465-469.

54. Gunter ТЕ, Buntinas L, Sparagna G, Eliseev R, Gunter К (2000) Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium 28:285-296.

55. Gunter ТЕ, Pfeiffer DR (1990) Mechanisms by which mitochondria transport calcium. Am J Physiol 258:C755-C786.

56. Gursahani HI, Schaefer S (2004) Acidification reduces mitochondrial calcium uptake in rat cardiac mitochondria. Am J Physiol Heart Circ Physiol 287:H2659-H2665.

57. Halestrap AP, Quinlan PT, Whipps DE, Armston AE (1986) Regulation of the mitochondrial matrix volume in vivo and in vitro. The role of calcium. Biochem J 236:779-787.

58. Halestrap AP, Woodfield KY, Connern CP (1997) Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. J Biol Chem 272:3346-3354.

59. Hansson MJ, Mansson R, Mattiasson G, Ohlsson J, Karlsson J, Keep MF, Elmer E (2004) Brain-derived respiring mitochondria exhibit homogeneous, complete and cyclosporin-sensitive permeability transition. J Neurochem 89:715-729.

60. Hardingham GE, Fukunaga Y, Bading H (2002) Extrasynaptic NMDARs oppose synaptic NMDARs by triggering CREB shut-off and cell death pathways. Nat Neurosci 5:405-414.

61. Hartley DM, Kurth MC, Bjerkness L, Weiss JH, Choi DW (1993) Glutamate receptor-induced 45Ca2+ accumulation in cortical cell culture correlates with subsequent neuronal degeneration. J Neurosci 13:1993-2000.

62. Hartley Z, Dubinsky JM (1993) Changes in intracellular pH associated with glutamate excitotoxicity. J Neurosci 13:4690-4699.

63. Herscher CJ, Rega AF (1997) On the mechanism of inhibition of the PMCa(2+)-ATPase by lanthanum. Ann N Y Acad Sci 834:407-409.

64. Hille В (2001) Ion channels of excitable membranes. Massachusets, USA: Sinauer Associates Inc.

65. Hoyt KR, Arden SR, Aizenman E, Reynolds IJ (1998) Reverse Na+/Ca2+ exchange contributes to glutamate-induced intracellular Ca2+ concentration increases in cultured rat forebrain neurons. Mol Pharmacol 53:742-749.

66. Hyrc KL, Bownik JM, Goldberg MP (1998) Neuronal free calcium measurement using BTC/AM, a low affinity calcium indicator. Cell Calcium 24:165-175.

67. Hyrc KL, Bownik JM, Goldberg MP (2000) Ionic selectivity of low-affinity ratiometric calcium indicators: mag-Fura-2, Fura-2FF and BTC. Cell Calcium 27:75-86.

68. Ichas F, Mazat JP (1998) From calcium signaling to cell death: two conformations for the mitochondrial permeability transition pore. Switching from low- to high-conductance state. Biochim Biophys Acta 1366:33-50.

69. Irwin RP, Lin SZ, Long RT, Paul SM (1994) N-methyl-D-aspartate induces a rapid, reversible, and calcium-dependent intracellular acidosis in cultured fetal rat hippocampal neurons. J Neurosci 14:1352-1357.

70. Keelan J, Vergun 0, Duchen MR (1999) Excitotoxic mitochondrial depolarisation requires both calcium and nitric oxide in rat hippocampal neurons. J Physiol 520 Pt 3:797-813.

71. Khodorov В (2004) Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurones. Prog Biophys Mol Biol 86:279-351.

72. Khodorov B, Pinelis V, Golovina V, Fajuk D, Andreeva N, Uvarova T, Khaspekov L, Victorov I (1993) On the origin of a sustained increase in cytosolic Ca2+ concentration after a toxic glutamate treatment of the nerve cell culture. FEBS Lett 324:271-273.

73. Khodorov B, Pinelis V, Storozhevykh T, Vergun O, Vinskaya N (1996a) Dominant role of mitochondria in protection against a delayed neuronal Ca2+ overload induced by endogenous excitatory amino acids following a glutamate pulse. FEBS Lett 393:135-138.

74. Khodorov B, Pinelis V, Storozhevykh T, Yuravichus A, Khaspekhov L (1999) Blockade of mitochondrial Ca2+ uptake by mitochondrial inhibitors amplifies the glutamate-induced calcium response in cultured cerebellar granule cells. FEBS Lett 458:162-166.

75. Khodorov B, Pinelis V, Vergun O, Storozhevykh T, Vinskaya N (1996b) Mitochondrial deenergization underlies neuronal calcium overload following a prolonged glutamate challenge. FEBS Lett 397:230-234.

76. Kiedrowski L (1999) N-methyl-D-aspartate excitotoxicity: relationships among plasma membrane potential, Na(+)/Ca(2+) exchange, mitochondrial Ca(2+) overload, and cytoplasmic concentrations of Ca(2+), H(+), and K(+). Mol Pharmacol 56:619-632.

77. Kiedrowski L, Brooker G, Costa E, Wroblewski JT (1994a) Glutamate impairs neuronal calcium extrusion while reducing sodium gradient. Neuron 12:295-300.

78. Kiedrowski L, Costa E (1995) Glutamate-induced destabilization of intracellular calcium concentration homeostasis in cultured cerebellar granule cells: role of mitochondria in calcium buffering. Mol Pharmacol 47:140-147.

79. Kiedrowski L, Wroblewski JT, Costa E (1994b) Intracellular sodium concentration in cultured cerebellar granule cells challenged with glutamate. Mol Pharmacol 45:10501054.

80. Kirichok Y, Krapivinsky G, Clapham DE (2004) The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature 427:360-364.

81. Koch RA, Barish ME (1994) Perturbation of intracellular calcium and hydrogen ion regulation in cultured mouse hippocampal neurons by reduction of the sodium ion concentration gradient. J Neurosci 14:2585-2593.

82. Kristal BS, Dubinsky JM (1997) Mitochondrial permeability transition in the central nervous system: induction by calcium cycling-dependent and -independent pathways. J Neurochem 69:524-538.

83. Kristian T, Bernardi P, Siesjo BK (2001) Acidosis promotes the permeability transition in energized mitochondria: implications for reperfusion injury. J Neurotrauma 18:10591074.

84. Kristian T, Gertsch J, Bates ТЕ, Siesjo BK (2000) Characteristics of the calcium-triggered mitochondrial permeability transition in nonsynaptic brain mitochondria: effect of cyclosporin A and ubiquinone O. J Neurochem 74:1999-2009.

85. Kristian T, Weatherby TM, Bates ТЕ, Fiskum G (2002) Heterogeneity of the calcium-induced permeability transition in isolated non-synaptic brain mitochondria. J Neurochem 83:1297-1308.

86. Kushnareva YE, Sokolove PM (2000) Prooxidants open both the mitochondrial permeability transition pore and a low-conductance channel in the inner mitochondrial membrane. Arch Biochem Biophys 376:377-388.

87. Kushnareva YE, Wiley SE, Ward MW, Andreyev AY, Murphy AN (2005) Excitotoxic injury to mitochondria isolated from cultured neurons. J Biol Chem 280:28894-28902.

88. Litsky ML, Pfeiffer DR (1997) Regulation of the mitochondrial Ca2+ uniporter by external adenine nucleotides: the uniporter behaves like a gated channel which is regulated by nucleotides and divalent cations. Biochemistry 36:7071-7080.

89. Lukacs GL, Kapus A (1987) Measurement of the matrix free Ca2+ concentration in heart mitochondria by entrapped fura-2 and quin2. Biochem J 248:609-613.

90. Lukacs GL, Kapus A, Fonyo A (1988) Parallel measurement of oxoglutarate dehydrogenase activity and matrix free Ca2+ in fura-2-loaded heart mitochondria. FEBS Lett 229:219-223.

91. Matsuyama S, Reed JC (2000) Mitochondria-dependent apoptosis and cellular pH regulation. Cell Death Differ 7:1155-1165.

92. McCormack JG, Halestrap AP, Denton RM (1990) Role of calcium ions in regulation of mammalian intramitochondrial metabolism. Physiol Rev 70:391-425.

93. Meech RW, Thomas RC (1977) The effect of calcium injection on the intracellular sodium and pH of snail neurones. J Physiol 265:867-879.

94. Nagai T, Sawano A, Park ES, Miyawaki A (2001) Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proc Natl Acad Sci U S A 98:3197-3202.

95. Nicholls D, Attwell D (1990) The release and uptake of excitatory amino acids. Trends Pharmacol Sci 11:462-468.

96. Nicholls DG (2004) Mitochondrial dysfunction and glutamate excitotoxicity studied in primary neuronal cultures. Curr Mol Med 4:149-177.

97. Nicholls DG, Budd SL (2000) Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev 80:315-360.

98. Nicholls DG, Fergusson SJ (2002) Bioenergetics 3. Elsevier Science Ltd.

99. Nieminen AL, Petrie TG, Lemasters JJ, Selman WR (1996) Cyclosporin A delays mitochondrial depolarization induced by N-methyl-D-aspartate in cortical neurons: evidence of the mitochondrial permeability transition. Neuroscience 75:993-997.

100. Nowicky AV, Duchen MR (1998) Changes in Ca2+.i and membrane currents during impaired mitochondrial metabolism in dissociated rat hippocampal neurons. J Physiol 507 (Pt 1):131-145.

101. Ouyang YB, Kristian T, Kristianova V, Mellergard P, Siesjo BK (1995) The influence of calcium transients on intracellular pH in cortical neurons in primary culture. Brain Res 676:307-313.

102. Pallen С J, Wang JH (1984) Regulation of calcineurin by metal ions. Mechanism of activation by Ni2+ and an enhanced response to Ca2+/calmodulin. J Biol Chem 259:6134-6141.

103. Peng TI, Jou MJ, Sheu SS, Greenamyre JT (1998) Visualization of NMDA receptor-induced mitochondrial calcium accumulation in striatal neurons, Exp Neurol 149:1-12.

104. Pinelis VG, Segal M, Greenberger V, Khodorov BI (1994) Changes in cytosolic sodium caused by a toxic glutamate treatment of cultured hippocampal neurons. Biochem Mol Biol Int 32:475-482.

105. PivovarovaNB, Hongpaisan J, Andrews SB, Friel DD (1999) Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics. J Neurosci 19:6372-6384.

106. Pivovarova NB, Nguyen HV, Winters CA, Brantner CA, Smith CL, Andrews SB (2004) Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. J Neurosci 24:5611-5622.

107. Porcelli AM, Ghelli A, Zanna C, Pinton P, Rizzuto R, Rugolo M (2005) pH difference across the outer mitochondrial membrane measured with a green fluorescent protein mutant. Biochem Biophys Res Commun 326:799-804.

108. Rajdev S, Reynolds IJ (1994) Glutamate-induced intracellular calcium changes and neurotoxicity in cortical neurons in vitro: effect of chemical ischemia. Neuroscience 62:667-679.

109. Reeves J (1985) The sarcolemmal sodium-calcium exchange system. In: Current topics membrane transport pp 77-127.

110. Regan RF, Panter SS, Witz A, Tilly JL, Giffard RG (1995) Ultrastructure of excitotoxic neuronal death in murine cortical culture. Brain Res 705:188-198.

111. Rintoul GL, Bennett VJ, Papaconstandinou NA, Reynolds IJ (2006) Nitric oxide inhibits mitochondrial movement in forebrain neurons associated with disruption of mitochondrial membrane potential. J Neurochem.

112. Rintoul GL, Filiano AJ, Brocard JB, Kress GJ, Reynolds IJ (2003) Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J Neurosci 23:78817888.

113. Rossi DJ, Oshima T, Attwell D (2000) Glutamate release in severe brain ischaemia is mainly by reversed uptake. Nature 403:316-321.

114. Sattler R, Charlton MP, Hafner M, Tymianski M (1998) Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J Neurochem 71:2349-2364.

115. Sattler R, Xiong Z, Lu WY, Hafner M, MacDonald JF, Tymianski M (1999) Specific coupling of NMDA receptor activation to nitric oxide neurotoxicity by PSD-95 protein. Science 284:1845-1848.

116. Schinder AF, Olson EC, Spitzer NC, Montal M (1996) Mitochondrial dysfunction is a primary event in glutamate neurotoxicity. J Neurosci 16:6125-6133.

117. Schreier MH, Baumann G, Zenke G (1993) Inhibition of T-cell signaling pathways by immunophilin drug complexes: are side effects inherent to immunosuppressive properties? Transplant Proc 25:502-507.

118. Schwiening CJ, Boron WF (1994) Regulation of intracellular pH in pyramidal neurones from the rat hippocampus by Na(+)-dependent Cl(-)-. J Physiol 475:59-67.

119. Schwiening С J, Willoughby D (2002) Depolarization-induced pH microdomains and their relationship to calcium transients in isolated snail neurones. J Physiol 538:371-382.

120. Selivanov VA, Ichas F, Holmuhamedov EL, Jouaville LS, Evtodienko YV, Mazat JP (1998) A model of mitochondrial Ca(2+)-induced Ca2+ release simulating the Ca2+ oscillations and spikes generated by mitochondria. Biophys Chem 72:111-121.

121. Stout AK, Raphael HM, Kanterewicz BI, Klann E, Reynolds IJ (1998) Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake. Nat Neurosci 1:366-373.

122. Stout AK, Reynolds IJ (1999) High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations. Neuroscience 89:91-100.

123. Sultan A, Sokolove PM (2001a) Free fatty acid effects on mitochondrial permeability: an overview. Arch Biochem Biophys 386:52-61.

124. Sultan A, Sokolove PM (2001b) Palmitic acid opens a novel cyclosporin A-insensitive pore in the inner mitochondrial membrane. Arch Biochem Biophys 386:37-51.

125. Szabo I, Bernardi P, Zoratti M (1992) Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. J Biol Chem 267:2940-2946.

126. Tymianski M, Charlton MP, Carlen PL, Tator CH (1993a) Secondary Ca2+ overload indicates early neuronal injury which precedes staining with viability indicators. Brain Res 607:319-323.

127. Tymianski M, Charlton MP, Carlen PL, Tator CH (1993b) Source specificity of early calcium neurotoxicity in cultured embryonic spinal neurons. J Neurosci 13:2085-2104.

128. Vergun О, Keelan J, Khodorov BI, Duchen MR (1999) Glutamate-induced mitochondrial depolarisation and perturbation of calcium homeostasis in cultured rat hippocampal neurones. J Physiol 519 Pt 2:451-466.

129. Vergun 0, Reynolds IJ (2005a) Distinct characteristics of Ca(2+)-induced depolarization of isolated brain and liver mitochondria. Biochim Biophys Acta 1709:127137.

130. Vergun 0, Sobolevsky Al, Yelshansky MV, Keelan J, Khodorov BI, Duchen MR (2001) Exploration of the role of reactive oxygen species in glutamate neurotoxicity in rat hippocampal neurones in culture. J Physiol 531:147-163.

131. Vergun OV, Reynolds IJ (2005b) Developmental changes in the properties of Ca2+-induced depolarization in brain mitochondria. In: 35th Annual meeting of society for neuroscience pp 550.6. Washington, DC: Society for Neuroscience.

132. Wabnitz AV, Storozhevykh T, Senilova YE, Pinelis V, Khodorov BI (2005) The permeability transition pore is not a prerequisite for glutamate-induced calcium deregulation and mitochondrial depolarization in brain neurons. Биол мембраны 22:346350.

133. Wang GJ, Randall RD, Thayer SA (1994) Glutamate-induced intracellular acidification of cultured hippocampal neurons demonstrates altered energy metabolism resulting from Ca2+ loads. J Neurophysiol 72:2563-2569.

134. Wang GJ, Thayer SA (1996) Sequestration of glutamate-induced Ca2+ loads by mitochondria in cultured rat hippocampal neurons. J Neurophysiol 76:1611-1621.

135. Ward MW, Rego AC, Frenguelli BG, Nicholls DG (2000) Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. J Neurosci 20:7208-7219.

136. Werth JL, Thayer SA (1994) Mitochondria buffer physiological calcium loads in cultured rat dorsal root ganglion neurons. J Neurosci 14:348-356.

137. White RJ, Reynolds IJ (1996) Mitochondrial depolarization in glutamate-stimulated neurons: an early signal specific to excitotoxin exposure. J Neurosci 16:5688-5697.

138. Wu ML, Chen JH, Chen WH, Chen YJ, Chu КС (1999) Novel role of the Ca(2+)-ATPase in NMDA-induced intracellular acidification. Am J Physiol 277:C717-C727.

139. Xu-Friedman MA, Regehr WG (1999) Presynaptic strontium dynamics and synaptic transmission. Biophys J 76:2029-2042.

140. Zoratti M, Szabo I (1995) The mitochondrial permeability transition. Biochim Biophys Acta 1241:139-176.

Информация о работе

Большаков, Алексей Петрович
кандидата физико-математических наук
Долгопрудный, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование механизмов митохондриальной деполяризации и кальциевой дизрегуляции, индуцируемой возбуждающим медиатором глутаматом в нейронах мозга - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы