Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль низких значений рН0 в биологических механизмах повреждений клеток ЦНС

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль низких значений рН0 в биологических механизмах повреждений клеток ЦНС"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

■ ОД УДК577.325 2 7 ОКГ 1998

ФЕДОРОВИЧ Сергей Викторович

РОЛЬ НИЗКИХ ЗНАЧЕНИЙ рН„ В БИОФИЗИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМАХ ПОВРЕЖДЕНИЙ КЛЕТОК ЦНС.

03.00.02-БИОФИЗИКА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск-1998

Работа выполнена в Институте фотобиологии HAH Беларуси

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

академик HAH Беларуси, Конев C.B.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Черницкий Е.А. доктор биологических наук Заводник И.Б.

Оппонирующая организация:

Белорусский государственный университет

Защита состоится "36Т' О /TSttfpX 1998 года в_1Учасов на заседании совета по защите диссертаций (Д01.37.01) в Институте фотобиологии HAH Беларуси по адресу: 220072 Минск, ул. Академическая, 27. Телефон ученого секретаря- 284-23-57

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт; фотобиологии НАН Беларуси

Автореферат разослан

"П"

1998 года

Ученый секретарь

совета по защите диссертаций,

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертации

Изучение механизмов повреждения нервных клеток при ишемии является одной из основных задач нейрохимии, физиологии и биофизики клетки. Нарушение церебрального кровообращения приводит к снижению как внеклеточного рН (рН0), так и внутриклеточного рН (рЩ, увеличению внеклеточной концентрации глутамата, NO, калия, свободных жирных кислот, активации свободно-радикальных процессов и, в итоге, к гибели нейронов. Механизмы действия отдельных патогенетических факторов ишемии (например, глутамата, свободных жирных кислот) относительно хорошо изучено, тогда как действие других либо долгое время оставалось вне круга интересов ведущих специалистов в области патогенеза ишемии (например, снижение вне- и внутриклеточного рН), либо сам фактор повреждения был открыт сравнительно недавно (например, NO) [см. Siesjo, 1981; Chan and Fishman, 1984; Siesjo and Bengtsson, 1989; Shimizu and Wolfe, 1990; Attwell et al., 1993; Coyle and Puttfarckcn, 1993; Tombaugh and Sapolski, 1993; Dawson and Snyder, 1994; Болдырев, 1995]. Еще менее исследованной остается проблема комбинированного воздействия различных факторов при инсульте головного мозга. Так, остается неясным, усиливается или компенсируется токсическое действие глутамата при одновременном снижении вне- и внутриклеточного рН [Attwell et al., 1993; Tombaugh and Sapolski, 1993]. Следует отмстить, что цереброваскулярныс заболевания являются одной из основных причин смертности даже в странах с высокоразвитой медициной [Зивин и Чой, 1991; Новиков и Лснецов, 1996] и дальнейший прогресс в этой области, безусловно, позволит спасти немало человеческих жизней.

Связь работы с крупными научными програмами Различные этапы данной работы выполнялись в рамках Республиканской программы фундаментальных исследований (регистрационный № 01.89036810) и гранта Б8-305 Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований. Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось выяснение молекулярных и мембранных механизмов действия низких значений рН0 на функциональные свойства синаптосом мозга крыс.

Поставленная цель включала решение следующих задач: 1. Изучение действия закисления инкубационной среды на трансмембранный потенциал синаптосом и интрасинаптосомальных митохондрий, натриевый насос - транспортную систему, обеспечивающую градиент потенциал-образующих ионов.

2. Исследование влияния низких значений рН0 на транспортные системы мембран, контролирующие вход и выход ионов кальция в синаптосомах, захват и освобождение нейромедиаторов в синаптосомах.

3. Изучение действия низких значений рН0 на накопление продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в синаптосомах и активность цитозольной формы супероксиддисмутазы.

Объект и предмет исследования

В качестве объектов исследования использовали синаптосомы (изолированные пресинаптические окончания нейронов мозга крыс), вывернутые везикулы из плазматических мембран синаптосом, пермеабилизованные синаптосомы.

Гипотеза

Предположено, что снижение рН инкубационной среды вызывает деполяризацию мембран синаптосом с последующим освобождении глутамата кальций-зависимым или кальций-независимым способом и активацией процессов ПОЛ.

Методология и методы проведенного исследования

В работе использовались радиоизотопные, спектрофото-метрические и флуоресцентные методы.

Научная новизна полученных результатов

Показано, что ?окисление инкубационной среды - один из факторов патогенеза ишемии мозга - вызывает быстрое падение потенциала плазматической мембраны синаптосом, связанное с ингибированием натриевого насоса и калиевых каналов. Установлены компенсаторные механизмы, минимизирующие повреждения синаптосом при деполяризации, вызванной снижением рН0. К ним относятся блокада потенциал-чувствительных кальциевых каналов и ингибирование освобождения глутамата, индуцированного калиевой деполяризацией.

Обнаружено, что снижение рН0 способно индуцировать перекисное окисление липидов в синаптосомах, не связанное с изменением проницаемости плазматической мембраны доя кальция.

Практическая значимость полученных результатов

Результаты работы существенно расширяют и углубляют современные представления о биофизических механизмах ишемического повреждения нервных клеток. Полученные данные позволяют разрабатывать новую стратегию поиска лекарственных средств для лечения инсультов головного мозга различной этиологии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Снижение рН0 вызывает быструю деполяризацию плазматических мембран синаптосом, которая не формирует нетто-

потока кальция, направленного внутрь и не ведет к увеличению освобождения глутамата.

2, Закисление инкубационной среды ингибирует транспортные системы мембран, регулирующие гомеостаз кальция в цитоплазме синаптосом.

3. Низкие значения рНо активируют процессы перекисного окисления шшидов в сштптосомах мозга. В эффект увеличения накопления ТБК-активных продуктов при экстраклеточном ацидозе не вовлечены ионы кальция.

Личный вклад соискателя

Экспериментальный материал получен при решающем участии автора. Выбор методов исследований, условий экспериментов, интерпретация результатов и анализ полученных данных проведены автором самостоятельно.

Апробация результатов диссертации

Результаты исследований апробированы на II съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 25-27 июня 1996 г.), Международном симпозиуме "Кислород и свободные радикалы" (Гродно, Беларусь, 19-22 ноября 1996 г.), школе-семинаре ФЕБС "Использование одиночных клеток в изучении сигнальной траисдукции" (Лейден-Амстердам, Нидерланды, 3-10 мая 1997 г), XIII школе по биофизике мембранного транспорта (Ледек-Здрой, Польша, 11-18 мая 1997 г.), Международном конгрессе по стрессу (Будапешт, Венгрия, 1-5 июля 1997 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 статьи в научных журналах и 5 тезисов докладов. Общее количество страниц опубликованных материалов - 21.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из общей характеристики работы, введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования (1 глава), изложения полученных результатов (3 главы), заключения и списка литературы, включающего 195 наименования. Работа изложена на 109 страницах, содержит 36 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования.

Синаптосомы изолировали по методу Хайоша [Hajos, 1975]. Вывернутые везикулы плазматических мембран синаптосом получали по методу Гилла [Gill et al., 1981].

Сдвиг рНо в кислую сторону достигался добавлением HCl в инкубационную среду.

Для определения pHi в синаптосомах мозга крыс в качестве зонда использовали ацетоксиметильное производное карбоксифлуоресцеин-диацетаха (CFDA-AM). Интенсивность флуоресценции измеряли при ХВозб=480 нм и Л.Рег=520 нм.

Целостность синаптосом определяли но выходу лактатдегидрогеназы. Активность фермента оценивали спекгрофотометрически по накоплению никотинамиддинуклеотида восстановленного.

Трансмембранный потенциал плазматической и митохондриальных мембран определяли по стационарному распределению 86Rb+ и равновесному распределению [3Н]тетрафенил-фосфония+ (РН]ТРР*) [Scott and Nicholls, 1980]. В экспериментах по изучению потенциала митохондриальной мембраны использовали данные по захвату [3Н]ТРР+ синаптосомами с деполяризованной плазматической мембраной.

Потенциал на плазматической мембране рассчитывали двумя способами: а) по распределению 86Rb+ [Scott and Nicholls, 1980], б) по распределению [3Н]ТРР+ [Калер и др., 1989].

Кинетику деполяризации изучали по флуоресценции зонда diS-Сз-

(5). Интенсивность флуоресценции ИЗМСрЯЛИ ПрИ А.возб-640 НМ И =675 нм.

Активность натриевого насоса измеряли по уабаин-чувствительному захвату 86Rb\

Активность систем транаюрта кальция определяли но захвату 45Са2+. О состоянии потенциал-чувствительных каналов судили по захвату кальция в высококалиевой (60 мМ К+) среде. Активность NaVCau

обменника измеряли по приросту захвата 45Са2+ в безнатриевой среде [Конев и др., 1989]. О кальциевом насосе судили по приросту захвату кальция в вывернутых везикулах в присутствии АТФ (0.5 мМ). Для изучения транспорта кальция, стимулируемого набуханием, измеряли прирост захвата 45Са2+ в гипотонической среде (230 мОсм). Митохондриальный транспорт кальция изучали в синаптосомах, пермеабилизованных дигитонином. Активность митохондриального унипортера рассчитывалась как разность захвата 45Са2+ в присутствии 10 мкМ рутениевого красного и без него.

Высокоаффинный захват холина измерялся по захвату [14С]холина в присутствии 4 мкМ холина.

Освобождение глутамата определяли флуориметрически по методу Николлса [Nicholls et al., 1987].

Содержание продуктов ПОЛ в мембранах оценивали по поглощению комплекса малонового диальдегида с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) при 532 нм. Активность супероксидцисмутазы (СОД)

определяли спектрофотометрически по методу Мисры [Misra and Fridovich, 1972].

Количественное определение белка проводили но методу Лоури [Lowryetal., 1951].

Результаты экспериметов подвергали статистической обработке методами вариационной статистики [Рокинкий, 1973].

Основные результаты н их обсуждение

Устойчивость синаптосом мозга к повреяедающему действию ацидоза.

На первом этапе мы изучили зависимость рН внутри синаптосом от внеклеточного рН, и нашли, что pHi отличается от рН0 не более, чем на 0,2 единицы, что позволяет манипулировать рН,-, изменяя рН0.

На следующем этапе работы предстояло выяснить, какие значения кислых рН0 вызывают необратимые повреждения синаптосом мозга. Для оценки повреждения (гибели) клеток были использованы традиционные подходы (определение выхода в среду цитоплазмати-ческого маркера лакгатдегидрогеназы (ЛДГ) и апробированы некоторые новые тесты на гаггактность мембранной системы.

В диапазоне рН0 5,0-7,4 мы не нашли увеличения выхода ЛДГ, что свидетельствует об отсутствии лизиса. Далее, было измерено распределение потенциал-чувствительных проникающих катионов РН|ТРР+ и 86Rb+ между средой и клетками. Синаптосомы выдерживали при различных рН0 в течение 30 мин, после чего рН0 возвращали к контрольном значению (7,4) и каждую пробу инкубировали с РЬЦТРР* или S6Rb+ 30 мин до установления равновесного распределения. Рис. 1 демонстрирует, что необратимая деполяризация начинается лишь при рН0 < 6, что указывает на устойчивость структуры нейрональных мембран к ацидозу (в данной работе под ацидозом понимается закисление инкубационной среды) вплоть до рН0 6,0. В дальнейших исследованиях по изучению ионного транспорта нами тестировался диапазон рНо 6,0-7,4.

Влияние ацвдоза на мембранный потенциал, транспорт кальция и нейромедиаторов в синаптосомах мозга крыс.

Из рис. 1 видно, что стационарное содержание 86Rb+ (отражающее потенциал на плазматической мембране) и [3Н]-ТРР^ (отражающее суммарный потенциал на плазматической и митохондриальной мембранах) в синаптосомах падает при понижении рНо, причем в диапазоне рНо 7,4-6,0 этот эффект полностью обратим.

Рис. 1. Зависимость равновесного распределения 86КЬ4 (1, 3) и [3Н]-ТРР+ (2, 4) в синаптосомах от рН0. 1, 2- распределение ионов в условиях ацидоза; 3, 4- распределение ионов при рН0 7,4 после предобработки кислой средой. За 100% взято равновесное распределение изотопов ( 8ЙШ>+ для кривой 1 и 3; РН]-ТРР+ для кривой 2 и 4) при рН0 7,4. Представлены средние значения двух экспериментов по шесть независимых измерении в каждом ± Б*.

РН0

Потенциал на плазматической мембране, рассчитанный по распределению [3Н]ТРР', составил 69,5±0,2 мВ при рН0 7,4 и 57,2±0,4 мВ при рНо 6,0. Деполяризация мембраны на величину порядка 9 мВ зарегистрирована при рН0 6,0 также и по распределению 8бЛЬ+.

Для того, чтобы оценить скорость ацидоз-индуцированной деполяризации, был использован флуоресцентный зонд сЦБ-С3-(5),

который в противоположность [3Н]ТРР+ и 8бЯЬ+ быстро реагирует на изменения потенциала. Полная деполяризация интрасинаптосомаль-ных митохондрий комбинацией ротенона и олигомицина не сказывется немедленно на интенсивности флуоресценции зонда, что указывает на его преимущественную локализацию у внутренней поверхности плазматической мембраны. Напротив, сдвиг рНо до 6,0 или повышение внешнего К+ до 120 мМ приводит к быстрому (в пределах времени смешивания в кювете) возрастанию флуоресценции.В контрольных опытах синаптосомы с предварительно деполяризованной внешним калием плазматической мембраной не реагировали на сдвиг рН0.

Хорошо известно, что трансмембранный потенциал поддерживается натриевым насосом. Благодаря . высокому соотношению поверхность/объем в нервных окончаниях ингибирование натриевого насоса может очень быстро нарушить распределение Иа+ и 1С между цитоплазмой и средой, что приводит к деполяризации. Рис. 2 демонстрирует, что уже при рНо 7,0 уабаин-чувствитеяьный захват 86Ш>+ подавляется вдвое, а при рН0 6,0 - втрое. Трансмембранный потенциал синаптосом определяется также состоянием калиевых каналов. Известно, что они могут блокироваться низкими значениями рН0. Таким образом, обнаруженная нами

деполяризация может индуцироваться как ингибированием натриевого насоса, так и калиевой проводимости. Для выяснения того, какой го названных механизмов вызывает обнаруженное нами падение потенциала, мы изучили влияние ацидоза на флуоресценцию зонда Сз-(5) в синагггосомах, обработаных ингибитором Ма+,К+-АТФазы уабаином или блокатором калиевых каналов тетраэтиламмонием. Мы обнаружили, что низкие значения рН0 способны вызывать дополнительную деполяргоацшо и после обработки мембран каждым из вышеназванных реагентов. Таким образом, падение потенциала плазматических мембран синаптосом определяется ингибирующим действием протонов как на калиевые каналы, так и на натриевый насос.

Можно предположить, что обнаруженная нами деполяризация вызывает активацию потенциал-чувствительных кальциевых каналов с последующим увеличением входа кальция. Для того, чтобы оценить величину и направленность результируемого нетто-потока кальция, был измерен базальный вход 45Са2+ при различных рНо. Нам не удалось выявить какого-либо увеличения входа изотопа, который даже падает в кислой области. Нами было обнаружено, что снижение рН0 ингибирует прирост накопления 45Са2+ в ответ на деполяризацию (величина, характеризующая функциональную активность потенциал-чувствительных кальциевых каналов). Таким образом, влияние ацидоза на базальный захват 45Са2+ в данном случае определяется

Рис. 2. Зависимость активности натриевого насоса (1), кальциевого насоса (3) и Ма+/Са2+ (2) обменника синаптосом от рН0. Представлены средние значения двух экспериментов по четыре независимых измерения в каждом ±8Х.

•л-

О

6,0 6,5 7,0 7,5 РНо

суперпозицией эффектов деполяризации и ацидоз-индуцированного ингибирования кальциевых каналов.

Обнаруженное ингибирование натриевого насоса вызывает диссипацию натриевого градиента, что должно снижать обмен через плазматическую мембрану. Действительно, Ка7Са2+ обменник синаптосом оказался столь же чувствительным к низким значениям рН0, как и натриевый насос (см. рис. 2), что согласуется с таким предположением. Вторая система, ответственная за негго-отгок Са2+ из нейрона,- кальциевый насос. В отличие от Ма+/Са2+ обменника, кальциевый насос значительно слабее подавляется при ацидозе: на 40% при рН0 6,0 по сравнению с рН0 7,4 (см. рис. 2).

Важной функцией митохондрий является удаление избыточного кальция из цитозоля. Мы оценили активность митохондриального кальциевого унипортера в пермеабилизованных синаптосомах по захвату кальция, чувствительному к рутениевому красному. Рис. 3 показывает, что эта транспортная система очень чувствительна к ацидозу, при рН0 6,0 она блокируется на 75%. Так как основной движущей силой транспорта кальция в митохондриях является трансмембранный потенциал, то мы изучили влияние ацидоза на митохондриальный потенциал. рН-зависимости входа кальция и захвата [3Н]ТРР+ митохондриями практически совпадают (см. рис. 3). Вероятно, падение трансмембранного потенциала при снижении рНо является основной причиной ингибирования митохондриального кальциевого унипортера.

80£

100-

Рис. 3. рН-зависимость захвата 45Са2+, чувствительного к рутениевому красному пермеабил-изованными синаптосомами (1) у, захвата [3Н]-ТРР+ синаптосомами I среде, содержащей 60 мМ К+ (2) Представлены средние значеню трех экспериментов с четырьм) независимыми измерениями каждьп

6,0 6,5 7,0 7,5

Известно, что инкубация нейронов при низких значениях рН0 вызывает отсроченную гибель, по своим свойствам напоминающую апоптоз, индуцированный глутаматом. Мы предположили, что деполяризация плазматической мембраны при ацидозе ведет к освобождению глутамата и далее инициируется механизм эксайтотоксичности (гибель нейронов, индуцируемая возбуждающими нейромедиаторами).

Рис. 4 показывает, что базальное освобождение глутамата не различается при рН0 7,4 и рН0 6,0. Однако, индуцированное деполяризацией (увеличение концентрации КС1 в среде до 60 мМ) освобождение глутамата ингибируется на 30% при закислении (рН0 6,0). Таким образом, вызываемая ацидозом деполяризация синаптосом не ведет к освобождению глутамата. Возможно, ингибирование индуцированного калиевой деполяризацией освобождения нейромеди-аторов при снижении рН0 является компенсаторным механизмом, позволяющим внеклеточной концентрации глутамата оставаться неизменной, что в конечном итоге позволяет нейронам пережить период ишемии.

Кроме освобожде:тя нейромедиаторов, ацидоз также ингибирует их захват, например, высокоаффинный захват холина (см. рис. 4).

Таким образом, снижение рН0 до 6,0 ведет к быстрой обратимой деполяризации, которая, однако, не вызывает ни увеличения входа кальция, ira освобождения глутамата.

1 2 3 4 5 6

Рис. 4. Влияние рН<> на захват холина и освобождение глутамата. 1 -захват холина, рН0 7,4; 2 -захват холина, рНо 6,0; 3 -освобождение глутамата, 5 мМ KCl, рН0- 7,4; 4-освобождение глутамата, 5 мМ KCl, рНо- 6,0; 5- освобождение глутамата, 60 мМ KCl, рНо 7,4; 6-освобождение глутамата, 60 мМ KCl, рНо 6,0. Представлены средние значения двух экспериментов с четырьмя независимыми измерениями каждый ±SX.

Влияние факторов ишемического повреждения на процессы накопления продуктов ПОЛ в синаптосомах мозга крыс.

Известно, что ишемия активирует ПОЛ в нервной ткани. Однако, в опубликованных работах авторы не вычленяли вклада снижения вне-и внутриклеточного рН в регистрируемую величину ПОЛ. Мы изучили действие низких значений рНо на накопление малонового диальдегида в синаптосомах мозга крыс. На рис. 5 представлена рН-зависимость накопления ТБК- реактивных продуктов в синаптосомах при 40-минутной инкубации при 37°С. При рН0<7 наблюдается отчетливый рост продуктов вплоть до рНо 5,5. Хорошо известно, что действие глутамата инициирует изменение ионной проницаемости плазматической мембраны нейронов, что приводит к свободно-радикальным повреждениям. Так же вполне вероятен вклад повреждения митохондрий в индукцию ПОЛ, так как активность некоторых антиоксидантных ферментов ингибируется при энергетическом дефиците. Поскольку ацидоз вызывает изменения проницаемости плазматических и митохондриальных мембран мы проверили, не связан ли обнаруженный нами прирост ПОЛ с деполяризацией мембраны или энергетическим дефицитом. Мы нашли, что деполяризация плазматической мембраны вератрином, открывающим натриевые каналы, и ингибитором натриевого насоса уабаином или высокими концентрациями КС1 не изменяет уровень ТБК-реакгивных продуктов в синаптосомах при рН0 7,4.

140-

о4

§120

о

пЮСН

Н

-й. вен

«

а &

>> 60-^

5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 РН0

гис.э. зависимость уровня ТБК-продуктов в суспензии синаптосом от рН среды инкубации. За 100% принято содержание ТБК-продуктов при рНо 7,4 (2,97 ± 0,22 нмоль/мг белка). Представлены средние значения четырех экспериментов с четырьмя независимыми измерениями каждый ±8Х.

Столь же неэффективными оказались кальциевый ионофор А-23187, деполяризация внутренней мембраны митохондрий (добавление

олигомицина и карбошищианид-М-хлорфешшгидразона (СССР)) и инкубации в среде без глюкозы. Следовательно, снижение АТФ, характерное для ишемических состояний, не играет существенной роли в развитии ПОЛ. То есть, изменение ионной проницаемости плазматической мембраны и энергетический дефицит не вовлечены в активацию ПОЛ в синаптосомах при ацидозе.

Мы нашли, что ацидоз приводит к необратимому ингибированию активности СОД, ключевого фермента антиоксидантной защиты клетки. Вполне вероятно, что обнаруженное нами снижение активности данного фермента приводит к увеличению концентрации активных форм кислорода, и как следствие, к инициации ПОЛ.

Таким образом, к вероятным причинам активации ПОЛ можно отнести образование протонированной формы супероксидрадикала, способной инициировать образовать малонового диальдегида (литературные данные) и/или повреждение антиоксидантной системы клетки, например, снижение активности СОД.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Закисление инкубационной среды (до рН 6,0) вызывает снижение потенциала плазматических и митохондриальных мембран изолировашшн пресинаптических окончаний (синаптосом) головного мозга крыс, не связанное с их необратимыми изменениями, происходящими при более низких значениях рН (5,0-5,5) [1, 3, 4, 5, 7, 8,

2. Деполяризация плазматических мембран синаптосом, индуцированная низкими значениями рНо (6,0-7,0) опосредована ингибированием натриевого насоса и блокадой калиевых каналов [3, 5, 7,8,9].

3. Снижение рНо блокирует такие системы кальциевого гомеостаза синаптосом, как потенциал-чувствительные кальциевые каналы, Иа^/Са21" обмсиник, кальциевый насос, а также захват кальция внутрисинаптосомальными митохондриями [1,3,5,7,8,9].

4. Захват нейромедиаторов синаптосомами (высокоаффинный захват холина) ингибируется при снижении рНо до 6,0. Индуцированная низкими значениями рНо деполяризация синаптосом не ведет к освобождению нейромедиаторов (глутамата) из синаптосом. Закисление инкубационной среды блокирует индуцированное калиевой деполяризацией мембран освобождение внутриклеточного глутамата из синаптосом, играющего важную роль в синаптической передаче и ишемическом повреждении нервных клеток [4, 7, 8].

5. Снижение рН инкубационной среды стимулирует процесс перекис-

ного окисления липидов в синаптосомах и ингибирует цитозольную форму синаптосомальной супероксидцисмутазы, принимающей участие в антиоксидантной защите клеток [2,6].

6. Таким образом, расшифрованы основные биофизические механизмы действия закисления внешней среды - одного из основных факторов ишемического повреждения нервной ткани и заключающиеся в нарушении процессов транспорта ионов калия и кальция, освобождения и захвата нейромедиаторов, активации процессов ПОЛ [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9].

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Fedorovich, S.V., Aksentsev, S.L., Konev, S.V. Acidosis inhibits calcium accumulation in intrasynaptosomal mitochondria // Acta Neurobiol. Exp.-4 1996,- Vol. 56, N3.- P. 703.

2. Лыскова Т.И., Аксенцев С.Л., Федорович C.B., Левко A.B., Ракович A.A., Самойленко С.Г., Федулов A.C., Конев C.B. Влияние факторов ишемического повреждения на перекисное окисление липидов в синаптосомах мозга крыс // Биофизика.- 1997,- Т. 42, N2.- С. 408-411.

3. Федорович C.B., Аксенцев C.JL, Лыскова Т.И., Калер Г.В., Федулов A.C., Конев C.B. Влияние ацидоза на мембранный потенциал и транспорт кальция в синаптосомах мозга крыс // Биофизика.- 1997.-Т. 42, N2,- С. 412-416.

4. Федорович C.B., Аксенцев С.Л 7 Калер Г.В., Лыскова Т.И., Конев C.B. Ацидоз вызывает деполяризацию синашосом и снижает высокоаффинный захват холина // Нейрохимия,- 1997.- Т. 14, N4.- С. 373-377.

5. Федорович C.B., Лыскова Т.И., Левко A.B., Калер Г.В., Ракович A.A. Влияние ацидоза на ионный транспорт в синаптосомах мозга крыс // Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем: Тез. докл. 11-го Респ. Съезда БОФБ, Минск, 25-27 июня 1996 г. / Белгосуннверситет.- Минск, 1996,- С. 134.

6. Федорович C.B., Лыскова Т.И., Левко A.B., Аксенцев С.Л., Конев C.B. Влияние факторов ишемического повреждения на перекисное окисление липидов в синаптосомах мозга 1фыс // Кислород и свободные радикалы: Тез. докл. международного симпозиума, Гродно, 19-22 ноября 1996 г. / Гродненский государственный медицинский институт,- Гродно, 1996,- С. 98-99.

7. Fedorovich S.V., Aksentsev S.L., Kaier G.V., Lyskova T.I., Konev S.V. Acidosis induces depolarization of rat brain synaptosomes but not leads to release of glutamate // Single Cell Technique in Signal Transduction Research: Abstract Book FEBS Advanced Course, Leiden-Amsterdam, The Netherlands, May 3-10,1997.-Leiden, The Netherlands, 1997.- P. 179.

8. Fedorovich S.V., Aksentsev S.L., Lyskova T.I., Kaler G.V., Rakovich A.A., Konev S.V. Plasma membrane potential and systems controlling calcium content in rat brain synaptosomes at low pH // Stress of Life. Stress and Adaptation from Molecules to Man: Abstract Book International Congress of Stress, Budapest, Hungary, 1-5 July, 1997.- Budapest, Hungary, 1997,- P. 35.

9. Fedorovich S.V., Aksentsev S.L., Lyskova T.I., Kaler G.V., Rakovich A.A., Konev S.V. The influence of acidosis on ion transport systems in rat brain synaptosomes. // Biophysics of Membrane Transport: School proceedings, Ladek-Zdroy, Poland, 11-18 May, 1997 / Cellular & Molecular Biology Letters.- 1997,- Vol. 2, Suppl. 1, Part II.- P. 224.

РЭЗЮМЭ

Федармйч Сяргей Вистарашч

Роля HÍ3KÍX значэнняу рН0 у б1яф131,шых механизмах пашкоджання клетак ЦНС.

Юпочавыя словы: сшаптасомы, ацыдоз, натрыявая помпа, мгсахондрыя, кальцый, глутамат, nepaKicnae аюслеттпе тпгпдау, супер-аксщдысмутаза, мембранны патэнцыял.

Вывучауся уплыу hÍ3kíx значэнняу рН0 на ioHHbi транспарт, вызваленне i захоп нейрамедыятарау, працэсы перак!снага агаслення лшщау у ¡заляваных прэсшаптычных канчатках нейронау (ciHairracoMax) мозга пацука.

Пры выкарыстанш ¡затопных i флуарэецэнтных метадау мы наказал!, што пашжэнне рН0 да 6,0 выклЬсае хуткую абарачальную дэпалярызацыю плазматычных мембран с1наптасом, звязаную з ÍHri6ipaBaHHeM натрыявай помпы i кашевых каналау. 1ндудыраванае ацьщозам падзенне мембраннага патэнцыялу не вядзе hí да павсл1чэння уваходу кальцыя, hí да вызвалення глутамата. Устаноулена, што шзия значэнш рН0 ÍOTÍ6ipyioub цатэнцыял-адчувальныя калыдыевыя каналы, Na+/Ca2+ абменнж, кальцыевую i натрыявую помпу, высокааф!нны захоп хал!ну, ¡ндуныраванае кал1евай дэпалярызацыяй вызваленне глутамата. Была высвятлена актывацыя пераюснага агаслення j:ini/iay у сшаптасомах, абумоуленная ÍHri6ipaBaHHeM цытазольнай формы супераксщдысмутазы.

Вышк1 гэтай работы могуць быць выкарастаны пры распрацоуцы стратэгй пошуку лекавых сродкау супраць ¡шэмй мозгу.

РЕЗЮМЕ

Федорович Сергей Викторович

Роль низких значений рН»в биофизических механизмах повреждений

клеток ЦНС.

Ключевые слова: синаптосомы, ацидоз, натриевый насос, митохондрии, кальций, глутамат, перекисное окисление липидов, супероксидцисмугаза, мембранный потенциал.

Изучалось влияние низких значений рН0 на ионный транспорт, освобождение и захват нейромедиаторов, процессы перекисного окисления липидов в изолированных пресиналгаческих окончаниях нейронов (синаптосомах) головного мозга крыс.

Используя изотопные и флуоресцентные методы, мы показали, что снижение рН0 до 6,0 вызывает быструю обратимую деполяризацию плазматической мембраны синаптосом, связанную с ингибированием натриевого насоса и калиевых каналов. Индуцированное ацидозом падение мембранного потенциала не ведет ни к увеличению входа кальция, ни к освобожденшо глутамата. Установлено, что низкие значения рН0 ингибируют потенциал-чувствительные кальциевые каналы, Ка+/Са2+ обменник, натриевый и кальциевый насосы, захват кальция митохондриями, высокоаффинный захват холина, индуцированное калиевой деполяризацией освобождение глутамата. Обнаружена активация процессов перекисного окисления липидов в синаптосомах. обусловленная ингибированием цитозольной формы супероксидцисмугазы. •

Результаты работы могут бьпъ использованы при разработке стратегии поиска лекарственных средств против ишемии мозга.

SUMMARY Fedorovich S.V.

Role of low pH0 in biophysical mechanisms of the damage of CNS

cells.

Key words: synaptosomes, acidosis, sodium pump, mitochondria, calcium, glutamate, lipid peroxidation, superoxide dismutase, membrane potential.

The influence of low pH0 on the ion transport, release and uptake of neurotransmitters, lipid peroxidation processes in isolated endings of neurons (synaptosomes) from rat brain has been investigated.

Using isotopic and fluorescent methods we have shown that lowering pH0 down to 6.0 results in fast reversible depolarization of synaptosomal plasma membrane, cased by with inhibition of sodium pump and potassium channels. Acidosis-induced decrease of membrane potential resulted in neither elevation of calcium uptake nor glutamate release. Low pHo have been established to inhibit voltage-dependent calcium channels, Na+/Ca2+ exchanger, sodium and calcium pumps, mitochondrial calcium uptake, high affinity choline uptake and potassium depolarization-induced glutamate release. Activation of lipid peroxidation processes in synaptosomes was detected, which caused by inhibition of cytosolic form of superoxide dismutase.

The results can be used for developing the strategy of search for drugs against the brain ischemia.

ФЕДОРОВИЧ Сергей Викторович

БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ПОВРЕЖДЕНИЙ КЛЕТОК ЦНС: РОЛЬ НИЗКИХ ЗНАЧЕНИЙ рН„.

Специальность 03.00.02 -биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано к печати 1998 г. Формат 60 х 90 1/16

Бумага типографская. Печать офсетная. Бесплатно Объем 1Д$л.л. 06 уч.- изд лит. Тираж 100 экз. Заказ N Р{

Лицензия ЛП N20 от 20 августа 1997 года

Институт физики им. Б.И. Степанова Национальной АН Беларуси 220072, г. Мши, пр-т Скорины, 70

Отпечатано на ротапринте Института физики им. Б.И. Степанова НАНБ