Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ион-транспортные системы плазмалеммы в рН-статировании цитозоля растительных протопластов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Ион-транспортные системы плазмалеммы в рН-статировании цитозоля растительных протопластов"

1 7 " Л

- РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ТРОФИМОВА Марина Сергеевна

ИОН-ТРАНСПОРТНЫЕ СИСТЕМЫ ПЛАЗМАЛЕММЫ В рН-СТАТИРОВАНИИ ЦИТОЗОЛЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРОТОПЛАСТОВ

03.00.12 — физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте фпвишоши растений имени К. А. Тимирязева Российской Академии наук.

Научный руководитель: доктор биологических iiaiyiK Ю. Г. МОЛОТКОВСКИЙ

Официальные оппоненты: доктор биологических нар; Р. А. ЗВЯГИЛЬСКАЯ, кандидат биолюгичесшх наук Э. И. ВЫСКРББЕНЦЕВА

Ведущая организация — Московский Государсткотный Уьшырси'гит им. М. В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра биофизики.

на заседании Специализированного совета К 002.45.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Институте Физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН aro адресу: 127276, г. Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией ложно ознакомиться в библиотеке Института.

часов

Автореферат разослан «

Ученый секретарь Спец, и а ля зир ов а нн оло совета, канд. бпол. наук

Л. И. СЕРГЕЕВА

,-»f .< ... У, !• .' ! ¿ iifíH kíi ,

Актуальность проблемы. Величина pH в цитозоле (рНс) является важным параметром клетки. Представления о детерминирующей роли рНс в разнообразных клеточных процессах и необходимости его строгого регулирования основаны на том, что малые отклонения в стационарном значении этого параметра могут приводить к специфическим изменениям в метаболизме и даже менять его направление [Busa.Nuccitelll, 1984]. Поддержание постоянства рН в цитозоле является важным условием сохранения в клетке координированной активности различных энэиматических систем и гомеостаза в целом. Для растений, не обладающих фактороста-том на органиэменном уровне, рассматривается существование двух основных способов рН-статирования: биохимической рН-регуляции и транспортных процессов, активно обменивающих протоны между цитозолем, средой и органеллами [Smith, Raven, 1979]. Поскольку изучение механизмов рН-статирования сопряжено с необходимостью кинетических измерений рН в цитозоле in vivo, а экспериментальные возможности для такой регистрации в растительной клетке появились в последнее время, проблема далека от разрешения.

Локализованные в мембранах ион-транспортные системы растений достаточно хорошо охарактеризованы In vitro, однако не всегда понятно их физиологическое значение и, в частности, в рН-стате. Особая роль, по-видимому, должна принадлежать плазмалемме, через которую растительная клетка взаимодействует со средой, регулируя потоки ионов и метаболитов, а также акцептируя внешние стимулы. Кратковременные и обратимые изменения рП в цитозоле, наблюдаемые в растительной клетке при воздействии гормонов и элиситоров, фотосинтезе, стрессе и других событиях, наиболее вероятно осуществляются через модуляцию активности участвующих в рН-стате ион-транспортных систем.

Перечисленные проблеиы определили актуальность исследования.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось выяснение роли ион-транспортных систем плазмалеммы в процессах регулирования рНс. Были поставлены следующие задачи:

1. Адаптировать метод измерения внутриклеточного рН с помощью "захваченных" флуоресцентных рН-индикаторов для суспензии растительных протопластов

2. Показать, что растительные протопласты способны регулировать рН в цитозоле.

3. Выяснить конкретные ион-транспортные механизмы, участвующие в быстродействующем рН-стате растительных протопластов.

Научная новизна. Применение оптического метода измерения внутри-риклеточного рН с помощью "захваченных" флуоресцентных рН-зондов позволило кинетически регистрировать изменения этого параметра в суспензии протопластов,. изолированных из клеток суспензионной культуры корнеплода сахарной свеклы.

Показано, что растительные протопласты регулируют рН в цитозоле после искусственного импульсного ацидоза, что проявляется в быстром восстановлении этого параметра к исходному стационарному уровню. Это связано с существованием быстродействующего рН-стата, базирующегося на ион-транспортных процессах, основной чертой которого является -многокомпонентное«). Это существенно для растительных клеток, функционирующих в,нестабильных условиях окружения, так как способствует их лабильности и устойчивости к стрессу.

Для изолированных протопластов из суспензионной культуры сахарной свеклы быстродействующий рН-стат исчерпывается участием трех систем, локализованных в плазмалемме: Н*-АТФазы, НС0э~/С1" и К+/'!)+ обменов. Эти ион-транспортные механизмы, из которых два последних являются вторично-энергизованными, работают независимо и обеспечивают возможности быстрого регулирования рНс.

Теоретическая и практическая ценность. Разработанные методики введения флуоресцентных зондов в цитозоль растительных протопластов и создания условий кратковременного искусственного ацидоза могут быть рекомендованы для проведения исследований, связанных с определением кинетических изменений рН цитозоля и функционированием мембранных систем как рН-статирующих механизмов клетки.

Полученные данные подтверждают способность растительных клеток к регулированию рН в цитозоле. Результаты работы и использованные методические приемы могут быть полезны для исследования роли этого параметра в процессах, происходящих в растительной клетке при акцептировании внешних стимулов и стрессовых воздействиях.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на Сабининском семинаре "Ионный обмен и физиология корня" (Москва, 1988); на VI Конгрессе Европейской Федерации Обществ Физиологов растений (Сплит, 1988); на II съезде Всесоюзного Общества физиологов растений (Минск, 1990). В законченном виде работа доложена и обсуждена на межлабораторном семинаре Института физиологии растений РАН имени К.А.Тимирязева (1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения получен-

ных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы.

Диссертационная работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков. Список литературы включает 176 наименований, из которых 164 на иностранном языке.

Сокращения, использованные в тексте: рНс - значение рН в цито-золе; рН0 - значение рН в инкубационной среде; Ф - фдуоресцеин, КФ -карбоксифлуоресцеин, ДА - диацетатные эфиры Ф и КФ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования и среды.

Объектами исследования служили протопласты, изолированные фер-ментативно из клеток суспензионной культуры корнеплода сахарной свеклы (Beta vulgaris L., индекс штамма 2 п), мезофилла гороха (Pisum sativum L., сорт Вега) и колеоптилей кукрузы (Zea mays L. сорт Одесская-10).

Суспензионную культуру выращивали в круглодонных колбах на жидкой среде Шенка-Хильдебрандта [Shenk, Hildebrandt, 1972] при постоянном качании с пересадками через 2 недели внесением 10 мл инокулома к SO мл свежей среды.

Протопласты получали из находящихся в конце логарифмического роста 10-дневных клеток по модифицированной методике [Смоленская, Ралдугина, 1981]. Клетки освобождали от среды культивирования декантацией и смешивали в равных объемах с раствором ферментов. Ферментацию проводили без качаний в темноте при 15° С в течение 14-16 часов в среде, содержащей: 360 мМ сорбита, 0,4 X дрейселазы, 0,2 Z целлю-лаэы R-10, 0,1 Z целлшизина и 0,1 Z мацерозима R-10. Выделившиеся протопласты фильтровали через 1 слой ткани мираклот ("Calbiochem", США) и дважды промывали средой А для удаления целлюлитических ферментов центрифугированием 5 мин при 100g.

В разных экспериментальных сериях среда А по составу была близка к последующим средам измерения 1, II или 111 и соде[)жала (в мМ): АI - 3G0 сорбита, макросоли по Щенку-Хильдебрандту (24,7 KNO3, 1,6 MgS04, 2,0 NH4H2PO4. 1,3 СаС12), б MEC-K0H рНо-6,0; АП - 360'сорбита, 5 СаС12, 5 МЕС-трис рНо-6.0; AlII - 360 сорбита, 5 Са304, 5 МЕС-БТП рНо-6,0.

Ошьпио центрифугированием (5 мин, 100g) протопласты переносили дли субку.'йл nijupoiiaiuii! и среды Б, состоящие из ( в мМ): Б1 - 330

сорбита, 10 сахарозы, макросоли Шенка-Хильдебрандта, MEC-КОН рНо-б,0; БП - 330 сорбита, 10 сахарозы,. 5 СаС12, 50 МЭС-трис рНо-6,0; БШ -330 сорбита, 10 сахарозы, 5 CaSO/j, 50 МЭСБТП рНо-6,0 и сохраняли до начала измерений при 4° С.

Среды I, II и III для спектральных измерений были идентичны средам Б, а значение рН0 указано в подписях к рисункам. Среда измерения с СГ содержала (в мМ): 250 сорбита, 10 сахарозы, 5 CaS04, 50 БТП-С1, 50 МЭС-БТП рН0-6,б. Для предотвращения оседания протопластов во время всех экспериментов к среде измерения добавляли фикол в конечной концентрации 10 X.

При измерениях суспензию протопластов в кювете стандартно продували через капилляр воздухом и в отдельных, специально оговоренных случаях, кислородом или азотом с помощью перистальтического насоса Varioperpex 12000 ("LKB", Швеция).

измерение рп^.

Вкдмченио индикаторов в протопласты.

Протопласты были нагружены стандартно рН-индикаторами КФ (100 мкМ) или Ф (20 мкМ) в процессе инкубирования (10 минут при 20° С) с легко проникающими через мембрану их ДА-эфирами в средах Б при рН0-6,0. Непроникающие красители аккумулировались in situ под действием цитоплазматических эстераз. Каждую порцию протопластов (2 мл суспензии) нагружали отдельно. После инкубирования протопласты, содержащие КФ и Ф, отмывали центрифугированием в средах А (5 мин при 100 g), переводили в среды 1,11 или 111 и переносили в кювету измерительного прибора.

Для определения локализации красителей в клетке- суспензию протопластов просматривали в люминесцентном микроскопе Laboval 2a*fl ("Karl Zeiss", Германия).

Спектральные измерения.

За кинетикой изменений рНс следили, регистрируя абсорбционную разность А490-465 или флуоресценцию (эмиссия 530 нм , возбуждение 490 нм, щели по 5 нм) локализованных в протопластах красителей. Автофлуоресценция протопластов в этой области незначительна и не учитывалась. При записи спектров поглощения Б -кювету сравнения' помещали суспензию протопластов, не содержащих зондов. •

Концентрация клеток при абсорбционных измерениях составляла 106 протопластов/мл, при флуоресцентных - Ю5 протопластов/мл.

Спектральные измерения проводились на спектрофотометре Hitachi 557 и флуориыетре Hitachi 850 (Япония).

Определение стационарного значения р!1с методом "нулевой точки".

Процедура была выполнена как в [Babcock, 19831. Нагруженные Ф или КФ протопласты суспендировали в средах 1,11 или III, содержащих по 50 мМ буфера указанного рН0. А490-465 регистрировали до и после пермеабилизации протопластов в присутствии дигитонина в конечной концентрации 0,05 7.. После этого была построена зависимость экспериментально измеренных изменений А490-465 после внесения дигитонина от рН0. рНс соответствовало интерполированному нулевому (точка пересечения со шкалой рН0) значению А490-465-

Калибровка.

Калибровку абсорбционных изменений в единицах рНс проводили в конце каждого измерения, пермеабилизуя протопласты ь присутствии дигитонина и •последовательно добавляя НС1 или NaOH для построения А490-465 как функции рН. Тагаке использовали зависимость от рН0 абсорбционного А490/А465 или флуоресцентного F490/F440 отношений, определенных для КФ и Ф после лизиса протопластов дигитонином в конечной концентрации 0,05 X.

Искусственное смещение рНс

Искусственное понижение рНс вызывали добавлением к суспензии протопластов: i) нигерицина в среде без К+ при рНо-7.0, 11) изомас-ляной кислоты в форме БТП- или трис- соли (рКа-4,84), ili) свежеприготовленного бикарбоната Na (pKai-6,2),1 111) уксусной кислоты в форме трис-соли (рКд-4,75). Искусственное повышение рНс вызвали добавлением NH4CI (рКд-9,1). Количество добавляемой, электронейтральной формы кислоты или основания рассчитано по уравнению Хендерсона-Хас-сельбалха.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

l£3i£FEH!E рНс

Включение рН-индикаторов в протопласты • Оптический метод определения рНс с помощью "захваченных" рН-индикаторов получил широкое распространение в разносторонних исследованиях животных клеток, но не занял пока должного места в биологии клеток рг\стительных. Вместе с тем, первые работы с применением этого метода в после довешии механизма действия аутеина дали интересные результаты [,Нсще1,Wosei , 1985; Gehring et al, 1990].

Ф и КI как слабые кислоты линейно изменяют свои абсорбционные и (||луорес!К'Н1ние свойства в зависимости от рН в области рКа-6,5 [Thomas et al, l-JHi'l. !!>.. jl.A iipon.?водные легко проникают через плазалем-

вакуоль рН 5

цитозоль рН 7

П-—'

итх рН 8

, - - * .

-О Ас-«—^^

№п(4с)2«

зстеразы

ВДп(Ас)2

Рис. 1. Схема "загрузки" в цитозоль флуоресцентных рН-индикато-ров через ДА-производные.

Рис. 2. Определение стационарного значения рНс методом "нулевой точки"

А. Протопласты, нагруженные КФ, суспендированы в среде II, содержащей 50 ыМ МЕС-трис буфер указанного рН0. А4до-4б5 измеряли до и после внесения дигитонина (указано стрелкой) в конечной концентрации 0.05Х. ' ■"' . " ".■■."

Б. Зависимость А4эо-465 от рН0 после добавления дигятонина' к протопластам, нагруженным КФ (1) или Ф (2). Стационарное значение рНс соответствует нулевому значению А4эо~4б5-

/ - 9 -

му в цитозоль,. где под действием эстераз переходят в Ф и КФ (рис. 1). Поскольку, молекула Ф при физиологических значениях рН несет два отрицательных заряда, а КФ - три, то это определяет их ограниченную способность выходить через плазмалемму в среду, либо поступать в различные клеточные компартменты. В результате красители оказываются "захваченными" в объеме цитозоля.

Включение красителей в протопласты из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы велось при рНо-6,0, когда КФДА и ФДА прото-нироваш и представлены в электронейтральной форме. Кинетика поглощения красок достигала насыщения в течение 30 минут.

Просмотр суспензии изолированных протопластов с включенными Ф и КФ под флуоресцентным микроскопом выявляет две особенности. Флуоресценция сосредоточена в основном в цитозоле, вакуоль обычно выглядит в виде темного пятна и не содержит индикаторов. Заметна гетерогенность протопластов по интенсивности флуоресценции. Это может быть в равной мере как результатом различий в значениях рНс, так и способностью протопластов накапливать разное количество индикаторов.

Скорость утечки красителей из клеток не превышала 10 от общего количества в течение 1 часа измерений. Состав среды измерения практически не влиял на кинетику "утечки" Ф и КФ из протопластов. Следует отметить, что проблема "утечки" индикаторов из цитозоля во внеклеточную среду при. таз-сом способе нагрузки не представляла больших сложностей в опытах с изолированными протопластами по сравнению с идентичными работами на животных клетках [Steinberg et al, 19871.

К сожалению, введение таких индикаторов в интактные клетки более трудоемкая процедура, поскольку более 50 % ДА-эфиров подвергается гидролизу экзогенными эстеразами в толще клеточных стенок.

Определение стационарного рНс методом "нулевой точки"

Поскольку протопласты из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы,: а также из мезофилла гороха и колеоптилей кукурузы, представляют крайне гетерогенные по морфологическим признакам популяции, это делает сложным точное определение объема клеток, а тем более объема цитозоля. Не зная' объема цитозоля, нельзя определить концентрацию индикатора в цитозоле и на этом основании калибровать наблюдаемые A49Q-46G в единицах рНс.

Для определения' рНс был использован более трудоемкий, но корректный метод "нулевой точки" [Babcock, 1983]. Метод состоит в том, что у нагруженных t> или КФ щютопластов в кювете спектрофотометра иронии-■■¡-мехть ил.'^малемми повышалась «несением дигитонина в средах с

различными значениями рН0. Регистрируемые значения Ä490-465 , отражающие установление равновесия по Н+ между цитозолем и средой (рис. 2А), на графике зависимости А490-465 от рН0 пересекают шкалу pH в точке, равной рНс (рис. 2Б).

При воздействии 0,05 % дигитонином практически сохранялась морфологическая целостность протопластов, и не менялись оптические свойства суспензии, не содержащей Ф или КФ.

"Нулевые точки" для протопластов из суспензионной культуры корнеплода сахарной свеклы, нагруженных Ф и КФ, соответствовали рН-7,4± 0,04 (п-3) и рН-7,1±0,05 (п-5) в среде I; pH ~7,3±0,05 (п-3) и pH-6,9i0,07 (п-7) в среде II; рН-7,1±0,05 (п-5) рН-6,6±0,0б (п-3) в среде III. рНс для протопластов, йзолированных из колеоптилей кукурузы и мезофилла гороха, были измерены с помощью Ф и оценены как 7,2±0,06 (п-3) и 7,0±0,05 (п-5) соответственно.

Полученные значения рНс близки к величинам, измеренным другими методам:*, и на других объектах [Aerts et а1И9Я5; Felle et el, 1986; Felle, 1986; Guern et al, 1986; Smith,1986].

Величина pHc, определяемая методом "нулевой точки" имеет усредненное значение по причине популяционного разнообразия клеток в культуре. Как было показано, с помощью высокоразрешающего микрофлуоресцентного оборудования, колебания в значении этого параметра в разных клетках происходят в узком диапазоне [Bright et al, 1987). Гетерогенность клеток по величине рНс может определяться нахождением клеток в разных фазах клеточного цикла, различной активностью метаболизма и рН-статирующих мёханизмов [Busa, Nuccitelli, 19841.

Измеренные для протопластов значения рНс, при соответствующей корректировке локализации используемых красителей, совпадают с данными, полученными для животных [Moolenaar et al, 1983; Rogers et al, 1983; Aerts et al, 1985) и растительных [Felle et al, 1986; Guern et al, 1986; Smith, 1986] клеток. Очевидно, pHc, близкий к 7,0 или слабо его превышающий, характерен для большинства эукариотических клеток и лишь в случае их специализации или опухолевого перерождения наблюдается отклонение от этого значения [Thomas et al, 1982; Babcock, 19833. ..

Анализ представленных данных обнаруживает различные свойства Ф й КФ при измерении внутриклеточного pH протопластов, инкубированных в средах разного состава. Определенное методом "нулевой точки" с помощью Ф стационарное значение рНс несколько выше, чем оцененное с КФ. Это может быть результатом локализации некоторой части индикато-

ров в других клеточных компартментах.

Все последующие измерения проводились с протопластами, изолированными из клеток суспензионной культуры корнеплода сахарной свеклы.

Внутриклеточная локализация индикаторов, изменения митохондри-ального рК

Антимицин А индуцированные pH-переходи в митохондриальном ком-партменте вызывали высокоамплитудные изменения в дифференциальной абсорбции Ф-нагруженных протопластов, но низкоамплитудные изменения в нагруженных КФ (рис.3). Последующее подавление митохондриальной Н+-АТФазы олигомицином дополнительно изменяло А490-465 в нагруженных Ф протопластах, но не оказывало влияния на протопласты с КФ. Очевидно часть Ф распределяется, в щелочной компартмент митохондрий и диссипация Л pH через митохондриальнуга мембрану антимицином А и олиго-иицино?л вызывает изменения в ¿490-405 •

Поглощение митохондриями КФ затруднено из-за дополнительного заряда в молекуле и поэтому указанные ингибиторы вызывают низкоамплитудные изменения А490-465 Для протопластов, нагруженных КФ, отражая изменения pH в цитозоле. Значительных смещений рНс (более 0,1 единиш pH) в течение короткого анаэробиоза и подавленного в присутствии антимицина А дыхания в наших экспериментах не наблюдалось.

В то же время КФ как дианион при физиологических pH может быть частично секвестрирован в вакуолярном компартменте, как это предполагает и показывает Лларка в экспериментах с часовыми инкубациями красителя с растительными клетками tOparka, 19913. В наших исследованиях это происходило в определенных условиях, о чем свидетельствует более низкое значение рНс, полученное для КФ-нагруженных протопластов, инкубированных в среде III. Каким образом КФ может частично перераспределяться в вакуоль за минутные экспозиции, и как это связано с составом внеклеточной среды, пока остается неясным.

Калибровка оптических ответов ,

Для перевода регистрируемых оптических сигналов в единицы рНс было использовано несколько методических приемов.

Наиболее удобно для калибровки использовать абсорбционное или флуоресцентное отношения, определенные для Ф или КФ нагруженных протопластов при различных рН0 после 'пермеабиливации дигитонином. Линейные изменения А490/А465 и F490/F440 в указанных пределах рН0 определяются величиной рКа красок, равной 6,5 [Graber et al, 1986]. При рН0 ниже 5,5 и выше 7, 5 линейность отсутствует.

Следует заметить что флуоресцентное отношение более чувстви-

о

II -4

- 12 -анси^ицин А

2 кин (-1

олигоиицин

олигоиицин

I

Рис. 3. Изменения абсорбции протопластов, нагруженных Ф и КФ, под влиянием антимицина и олигомицина.

Суспензия протопластов, нагруженных Ф (А) и КФ (Б), суспендирована в среде ! (рНо~6,0).'- Добавления в конечных концентрациях 12,5 мкМ антимицина А и 5 мкг/мл олигомицина указаны стрелками.

о

аа

о. •

<о ш

иаооутират

ацетат

а)

б)

нигерицин

бикарбонат

в)

г)

2 шш

Рис. 4. Кинетика изменений рНс, вызванных искусственным закис-лением цитозоля

Протопласты, нагруженные КФ, суспендированы в среде II с рНо-7,0. Стрелками указаны добавления в конечных концентрациях: 10 мМ изобути-рат-триса, 12,5 мМ ацетат-триса, 5 мкМ нигерицина, 10 мМ НаНСОэ.

тельно к изменениям рН, чем абсорбционное и это позволяет работать с более высокой точностью с суспензией нагруженных протопластов низкой плотности. Кроме того, величины отношений не могут зависеть в данных условиях от внутриклеточной концентрации красок, что позволяет применять установленную зависимость оптических отношений от рН в разных экспериментальных сериях.

Обращает внимание, что значение рНс интактных протопластов при рНо от 5,5 до 7,5 практически не менялось. Объяснение этому, заключающееся в низкой проницаемости плазмалеммы растительных клеток для протонов и существовании рН-стата, будет рассмотренно ниже.

Оптический способ измерения отличается возможностью регистрировать кинетику быстрых и небольших по величине изменений рН, происходящих непосредственно в цитозоле. О конкретной локализацию индикаторов в протопластах судили по определяемым значениям рНс, с помощью флуоресцентной микроскопии, чувствительности к митохондриальным рН изменениям. Основная преимущество метода заключается в возможности кинетической регистрации изменений рНс после его искусственного сдвига. Последнее наиболее ярко демонстрируется в опытах с кислотной нагрузкой.

Ш!-тРАнстортньгЕ сютш1 плазуалеш* в регулуовакк!

Pile ПОСХЕ МЖЯГШОЙ НАГРУЗКИ ЩГГОЗШЯ

Представленные,ниже ; эксперименты были предприняты для изучения способности протопластов, изолированных из клеток суспензионной культуры корнеплода сахарной свеклы, регулировать рНс. Регулирование рНс может быть определено как сумма.процессов, следующих после искусственного закисления или защелачивания цитоэоля и возвращающих рНс к стационарному значению СВогоп,1983]. Это также предполагает, что в нормальных физиологических условиях это способствует непрерывному удалению нз клетки Н+ и кислых эквивалентов, образукцихся в ме-таболизие и при пассивно« поглощении Н+.

Традищкжным способом, позволяющим показать активвые механизмы рН-стата в клетке, является наблюдение за процессами восстановления стационарного значения рНс после кратковременного искусственного смещения параметра Б кислую или блочную стороны, вызванного добавлением к суспензии клеток проникасеих слабых кислот или оснований iBoron, 1&83]. Меибраяный потенциал со знаком "минус" внутри и избыток Н*в мета&лических путях делают особенно интересной реакцию клеток и их транспортных'систем на закисление цитозоля.

Реакция протопластов на разные способы кислотной нагрузки

На рис. 4 представлены изменения рНс при некоторых способах кислотной нагрузки. Как показано, в кинетике изменений рНс, кроме варианта с ацетатом, присутствовало две фазы: быстрое закисление цитозоля и более медленное восстановление рНс к исходному уровню.

Изобутират. При рН0 - 7,0 добавление 10 ^ изобутирата (70 мкМ электронейтральной формы кислоты) сопровождалось быстрым ( менее 2 минут) уменьшением рНс (рис. 4, кривая а). Это связано с потоком через плазмалемму незаряженной кислоты, диссоциация которой в цитозоле вызывала его подкисление. Медленная фаза релаксации рНс к новому стационарному уровню, отражает существование быстродействующих механизмов регулирования рНс.

Ацетат. При добавлении к протопластам 12,5 мМ ацетата (также 70 мкМ кислоты в протонированном виде) наблюдали только фазу закисления цитозоля (рис. 4, кривая б). Плазмалемма, по-видимому, проницаема для аниона ацетата. . - -

Бикарбонат. Внесение 10 мМ НаНСОз в среду с рН0-6.6 сопровождается образованием 2.8 мМ СОг. СОг легко проникает через мембраны. Образование и диссоциация угольной кислоты в цитозоле вызывает его подкисление, с последующей релаксацией рНс к исходному стационарному значению ( рис. 4, кривая г). При внесении бикарбоната начальная скорость релаксации и достигаемый стационарный уровень рНс выше, чем в случае с изобутиратом.

Нигерицин. Ионофорный антибиотик в среде без К+ и при рН0-рНс осуществляет стехиометрический электронейтральный обмен внутриклеточного К+ на экстраклеточный Н+. С этим процессом связано наблюдаемое закисление цитозоля (рис.4, кривая в). Затем следовала фаза восстановления рНс, как и в случае с изобутиратом.

Таким образом релаксация рНс (кроме варианта с ацетатом) после импульсного закисления цитозоля не зависела от способа смещения этого параметра, что позволяет считать ее общим свойством растительных клеток. Активность рН-статирущих механизмов достаточна высока, так как восстановление рНс происходит даже в том случае, если из среды не удалены проникающие слабые кислоты или нигерицин.

Присутствие фазы релаксации подтверждает активность механизмов, статирования рНс в протопластах. В этих условиях изменение ионного состава среды и использование ингибиторов делают возможным выяснение быстродействующих механизмов рН-стата.

Участие Н+-АТФазы плазмалеммы в регулировании рНс "

7,2 ниг.

РНС М

+ортованадат

nh4CI

ниг.

I

ЗДАПК

♦N-8M

ын^сх

НН4С1

7,2 ниг

М

НИГ.

Ш4С1

ЫН4С1

Рис. 5. Влияние ингибиторов Н+-АТФазы плагмалеммы на скорость восстановления pf?c после зачисления цитозоля Протопласты, нагруженные КФ> суспендированы в среде II (рНо-7,0) и 15 мин предъшпсубированы в присутствии ортованадата Na, Н-Ш и ЛИДС в конечных концентрациях: бООмкМ, 400' мкМ и 750 мкМ соответственно! Затем к этим же протопластам добавлен нигерицин в конечной концентрации 5 мкМ (указано стрелкой). ДЗС и ЭДАПК в »сонечных концентрациях .100 мкМ я 1 мМ соответственно внесены непосредственно перед введшем нигерицина. Скорость- восстановления рНс в контроле составляла 0,08 * 0,005ед, рНс/мйн (п-3).

Предварительная обработка изолированных протопластов ортована-датсы натрия подавляла начальную скорость восстановления рНс после кислотной нагрузки (рис. 5, кривая б). Ортованадат является специфическим ингибитором Н*-АТФаз Р-тина. Как видно из рис. 5, предобработка (1Ь мин, 1 мМ ортоьанадата) не влияла на величину начального уменьшения рНс при кислотной нагрузке. Это показывает, что за это время не произошло изменений в стационарном значении рНс. Последующее добавление NH4CI (20 мМ) приводило к быстрому защелачиванию, обусловленному диссипацией трансмембранного Д рНс проникновением в цитоаоль NII3 и его протонированием. Это также подтверждает, что КФ локализован внутри протопластов, жизнеспособность клеток и целостность плззмалеммы сохранились.

'¿ффективное (до 8û Z) ингибирование начальной скорости релакса-ци;' рНс после кислотной нагрузки наблюдалось е прмсустьии ЛЕС (рис. б, кривая в). Сохранение величины Д рНс при кислошой нагрузке и последующее защелачиьание рНс в присутствии NH4CI свидетельствуют об интактности протопластов во время эксперимента.

Доказательством того, что в основе быстрого рНс регулирования нреле нагрузки кислотой лежит поток Н+, . может служить чувствительность релаксации к водорастворимому карбодиимиду - ЭДАПК, известному ингибитору Н+-каяалов в составе Н^-АТФазы (рис. 5, кривая г).

Начальная скорость релаксации р!1с после кислотной нагрузки также уменьшалась ь присутстьии лииидраствориыого £Н - реагента - НШ (рас. 5, кривая д).

Предварительное инкубирование суспензии протопластов с блокато-ром транспорта анионов - ЛИДС полностью подавляло процессы регулирования рНс после кислотной нагрузки ( рис. 5, кривая е).

Частичное сохранение релаксационных процессов в протопластах в присутствии ортоьанандата натрия и ДЕС (рис. 5,кривые С и в) и-полное подавление на фоне высот« концентраций ДНДС (рис. 5, кривая е) не исключает возможного участил в регулировании рНс анион-транспор-тирующих механизмов.

Добавление к протопластам антимищша А бистро блокировало окислительное фос4орилироваиие, что вызывало диссипации градиента рН через ыитохрндриальную мембрану и незначительные (менее. 0,1 единицы) изменения рНс (рис. 3). Подавление дыхания протопластов в присутствии антмыицина А сопровождалось заметным уменьнением скорости ьос-стшювдениа рНс после кислотной нагрузки (не предегавлеао). 'ого ука аывайт на прямую свявь процессов регулирования plie с энергетикой ые-

ТКИ. .

Стационарное значение рНс. Добавление к суспензии протопластов ЭДАПК, N-EM, ДЭС, ЛИДС (рис. 5) не оказывало влияния на величину стационарного значения рНс. Однако кверцетин - неспецифический ингибитор практически всех известных типов Н+-АТФзз вызывал быстрое уменьшение рНс (не показано). По-видимому, в формировании уровня рНс в растительной клетке принимает участие несколько первично-энергозависимых транспортных процессов, конкретизация которых требует изучения.

В то же время сохранение, в небольшой степени, протопластами способности восстанавливать рНс в условиях ингибирования окислительного фосфорилирования, может служить подтверждением включения в-ре-гулирование рНс компонентов, прямо не зависящих от энергетического состояния клетки. Н+-АТФаза плазмалеммы может рассматриваться только как один из возможных рН-статирующих механизмов. Высокая чувствительность процессов релаксации рНс к ЛИДС - ингибитору транспорта анионов, и высказываемые предположения о роли НСОз" в регулировании рНс для растительных клеток Г Murthy et al,1983; Mathieu et,al, 1986; Smith, f?eld et al, 1991J предопределили поиск анионного обмена, в протопластах,-аналогичного НС0з"/С1 "антипортеру животных клеток.

НС0з"/С1~ обмен как компонент рН-стата цитозоля .

Процессы релаксации рНс после кислотной нагрузки в присутствии изобутирата и НСОз" различаются по своей чувствительности к ингибитору Н+-АТФазы плазмалеммы - ДЭС. При номинальном отсутствии в среде НСОз" ГОС полностью блокировал релаксацию рНс (рис.в А), тогда как ДЭС-нечувствительную Часть релаксации в присутствии ИСОЗ" полностью . подавлял ДОДС в низкой концентрации (200 мкМ) (рис.6 Б). Начальная скорость восстановления рНс после закисления бикарбонатом умеиыпа-лась внесением в среду измерения ионов СГ в высокой концентрации. Если при этом была также "выключена" Н+-АТФа8а, то процессы релаксации рНс подавлялись полностью (рис. 6Б)..

Эти данные по двум критериям-: зависимость от градиентов ионов , СГ и НСОз". а также чувствительности к стилбеновым .производным, указывают на возможность работы анионного обмена в протопластах.

Однако НСОзVCOg буфер - один из основных буферов цитозоля и внесение свежей порали бикарбоната должно приводить к «вменению буферной емкости. Действительно предварительная инкубация протопластов в присутствии НСОз" уменьшала влияние изоСуткрата на рНс (рис.7). Начальное смешение рНс при внесении кислоты составляло 0.4 .-Ю.05

7,2

изо|утира!

- 18. -

д, оикарбоаа*

Б.

контроль

рнг

6,6

Рис. 6. Влияние ингибиторов Н'-АТФааы и [C1~J0 на скорость ьосстшюЕления pllc после искусственного закисления цитозоля Протопласты, нагруженные 4>, суспендированы в среде III (рН0-6,6) ¡иш, где указано, в среде с СГ (Сы. МЕТОДЫ). Добавление в конечной кпнцертрации 1Q мМ изаСутйрит-БТП (А) и 10 мш КаНСОзЧБ; показано сгрелклап. 100 uitf.l ДЭС И £00 ыкМ ЛИДС внесены непосредственно Перед 1ичалом намерений.

иэобутират V Г t

рНс

М

А.

изобутират

ДЭС+С1 ДЭС+ДИДС

Б.

ДБС

ДЭС+ФС 0,3 ДЭС*ЭК ДЭС+ФС 0,6

4 мин

Рис. 7. Влияние ингибиторов транспорта ашюшв на 'кинетику ДЭС-нечувствительной части релаксации рНс после искусственно выаьан-ного закисления цитозоля

Протопласты, натру пенные Ф, суспендированы » среде 111 (рН0-б,6) или, где указано, в среде с СГ. Во всех вариантах, кроме контрольного, добавлено 5 uM NalICOg и 100 мкМ ДЗС. Протопласты выдержаны в этих условиях не.менее 5 мин для завершения переходных процессов, связанных с перераспределением С02- Ингибиторы (0,2 mU ДЭС; 0,3 и 0,6 им фуросешща; 1 иЫ этакриновой кислоты) добавлены перед внесением Ш мМ иаойутират-БТП (укагано стрелкой)

ед. (рис.7), в отсутствии бикарбоната - 0.010.04 ед. (ряс.6).

Добавление к протопластам НС0з~" качественно изменяло картину релаксации рНс после кислотной нагрузки изобутиратом. Появлялось ДГХ: нечувствительная компонента, не связанная с активностью И^-АТФазы плазмалеммы. На рис. 7 представлены данные, где протопласты предвари тельно выдерживались в среде с 5 мМ НСОз'.по крайней мере, 5 минут для завершения переходных процессов в цитоэоле. В этих экспериментах Н+-АТФаза плазмалеммы блокировалась предварительным внесением Л?0 или ЭДАПК.

ДВДС в низкой концентрации полностью подавлял релаксацию рНс л среде с бикарбонатом после эакисления, вызванного добавлением изобу-тирата (рис.7А).

Уменьшение начальной скорости восстановления рНс после внесения изобутирата происходило в присутствии ионов С1~ в среде ( при -СС1~]0- 50 тМ скорость релаксации была близка к 0) (рис. 7А). Наличие СГ в среде может тормозить сопряженное с выходом С1~ поступление НСОз" в цитозоль протопластов, которое благодаря высокому сродс-■ тву НСОз" к Н+, должно приводить к повышению рНс.

Дополнительным критерием, подтверждающим сущестцование анионного обмена, помимо чувствительности к стильбенам и градиенту С1~, может служить чувствительность к ингибиторам транспорта анионов: этак-риновой кислоте и фуросемиду.

Известно, что этакриновая кислота блокирует потенциал-зависимые и ДИДС-нечувствительные анионные каналы протопластов [Schauf., Wilson, 19891. В то же время это - один из специфических ингибиторов ^-независимого НС0з~/С1~ антипортера жйвотных клеток. Влияния ионов Na4" на ДЭС-нечувствительную компоненту релаксации рНс не обнаружили. Однако этакриновая кислота полностью подавляла ДЭС-нечувстви'-тельную компоненту релаксации рНс в бикарбонатной среде (рис. 7Б), но не влияла на ДЭС-зависимую. Одновременная чувствительность и к ЛИДС, и к этакриновой кислоте может предполагать транспорт С1~ через антипортер с НСОз", а не через канал.

Диуретик фуросемид также ингибировал ДЭС-независимую компоненту, причем в' концентрациях таких же, что и в модельных экспериментах по изучению анионного обмена на вывернутых везикулах плагмаяеммы (рис. 7Б).

Эти факты позволяют говорить о существовании на плазмалемме дополнительного механизма рН-статирования, активного при "рьпупо-^ште" Н+-АТФазн плазмалеммы и присутствии в среде ионов НСОу".

КГ/|Г сОнчи .

освобождение iiJhwMiiii'ifCKuM мембраны or. нигерицина сорбцией -на д|.,.о;шЛснном к суспензии протопластов БСА и последующее внесение в срецу KCl ускоряли иоостаноьление рНс к исходному уровню (рис. 8А).

Щюцессы релаксации в этом случае могут обеспечиваться Н+-АТФа-ju»i нлазмалс-ммы. Причина влияния [К*]0 может бить двоякой и объясняться, с одной стороны, открыванием К+-каналоБ, активирующихся при пшерполиризации, в результате чего Н*-АН>аза не ингибируется создаваемым ею мембранным. потенциалом [Blatt, 1UU01. С другой, ьакисление шггозоля служит сигналом к включению альтернативного механизма рН-стата - электронейтрадьного KMl*" обмена [Felle, 1989; Bentrup,. lti'jOJ.

Если И' -АНаэа илаамалеммы "выключена" в присутствии ДЭС (рис. (Ш), то внесение КНШз стимулировало процесс релаксации рНс, частично из-за активности |1С0з"/С1" антипортера. Добавление в идентичных условиях ЭКпИМСШлрпЫл КОНЦе Iii peuitfn KCl И К^Зо4 ТоКлс НрИВОДИдО К К восстановлению pile после его смещения, но с меньшей скоростью (рис.ВВ). NaCl и llavSO^, введенные зкзогенно, были не активны. Таким образом при ингиоироьании Н + -АТФаэы присуствие в среде К^ обеспечивает регулирование рНс после кислотной нагрузки.

Предварительное инкубирование протопластов не менее 15 мин с •эквимолярными концентрациями KCl, UaCl и ТРРС1 не вызывало значи-гсльиых изменений ь стационарном значении pllc, о чем свидетельствует сох решен ив ьеличшш Л рН£: после закисления цитоьоля, ьыаванного до-Оавдениеы изобугирата." Ь ю же время присутствие ь среде KCl обеспечивало большую скорость восстановления рЦс поели кислотной нагрузки» вызванной изобутиратом ( рис. «Г). Кинетики восстановления pllc на ¿сне NaCl и ТРРС1 били практически идентичны контрольным. Отсутствие стимуляции процесса релаксации р)1с в среде с щыншеающим катионом TPPi предполагает: для функционирования Н^-АТФазе плазмалеммы, по-видимому, необходим эндогенный С Г", а не экзогенный К*. Поэтому Солее вероятно, что при закислении цитозоля К' обменивается электронейгрально с Hf через переносчик, а не через канал.

Основные компоненты рН-стата, показанные шши дли протопластов, изолированных из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы, приведены на рис. 9. Это - Н4 -АТФааа, НС0а~/ 01" и Kf/ll1' ¿штшюргеры, ' локализованные в плазмалемме. Функционированием этих нон- транонор тных систем обеспечивается регулирование pllc.

с as о.

А.

нигерицин

b.V^.'-I

изобутират ' KCl ♦ БСА

В.

изобутират

ДИГ

контроль ДЭС

+ДЭС

г. t

изобутират

КИ003

KCl K2S04

NaCl

KCl

NaCl

TPPCI

2 иин

Рис. 8, Влияние [K+]0 на кинетику восстановления рНс после кис лотной нагрузки цитозоля.

Протопласты нагружены КФ и суспендированы в среде II с рН0™7,О (А) или Ф и суспендированы в среде III с рН0-6,6 (Б,В,Г). Смешенио pile вызвано добавлением 5 мкМ нигерицина или 10 мМ изобутират-БТП. Где указано, перед кислотной нагрузкой внесено 100 мкМ ДЭС- Добавления (в конечной концентрации): 10 мМ КНСОз, 10 мМ KCl, 5мМ K2SO4, 10 мМ NaCl. 1 мМ ТРРС1 - .сделаны во время измерения (В) или до изобутират-БТП (Г).

Рис. 9. Компоненты рН-стата цитозоля растительного протопласта

Для протопластов впервые показано существование НС0з"/С1" обмег на. Сопряженный перенос анионов запускался внесением в среду НСОз", зависел от трансмембранного градиента СГ , блокировался производными стильбена и ингибиторами транспорта анионов - этакриновой кислотой и фуросемидом. В условиях эксперимента обмен работал на увеличение pilc.

Третьим компонентом рН-стата является К+/Н* обмен. По сравнению с 11*" АКазой и анионным антипортером, активность катионного обмена в нротопластах из суспензионной культуры сахарной сьскли невелика. Как было показано, обмен активируется аакислением цитозолн н регулирует pllc независимо от И^-АТФазы.

К сожалении, отсутствие специфических ингибиторов.делает достаточно сложным изучение сопряженных процессов на целых клетках. Поэтому полученные результаты несут качественный характер. Количественная оценка , на наш взгляд, была бы не совсем корректна.

ВЫВОДЫ

1. Использование спектрофлуорометрического метода измерения внут-• ршеле точного pll-c помощью "захваченных" рН-зондов позволила кинетически регистрировать иаменешы этого параметра ъ растительной клетке.

2. Стационарное значение рН в цитозоле, определенное с помощью указанного метода, было равно: 7,1 ± 0,05 Oi-Б) в протопластах из суспензионной культуры корнеплода сахарной свеклы ; 7,2 i 0,06 (п-3) в протопластах из колеоптилей кукурузы и 7,0 t 0,05 (n-G) ь протопластах из мезофилла гороха.

3. В растительных протопластах aiuwemie pli ь цитозоле поддерживается на постоянном уровне при изменении рН среды от 5,5. до 7,5. Это обусловлено низкой проницаемостью плазмалеммы для протонов-и су-щестованием системы рН-статирования.

4. Регулирование рН в цитозоле проявляется в быстром восстановлении этого параметра к исходному стационарному уровню при искусственном импульсном ацидозе и не зависит от химической природы агента, вызывающего вакисление. Это прямо указывает на существование в растительных протопластах быстродействующего рИ-сгата, реагирующего на изменения рНс.

5. Важной чертой быстродействующего рН-стата цитоьоли, базирующегося на ион-транспортных процессах, является его ' шкл окошюнент - ' ность.4

6; Величина стационарного рНс ьгшисит от окислительного ме-габо-

лизма и активности других (возможно, тонопластной) АТФаз растительной клетки.

7. Основной вклад в регулирование рНс вносит Н+-АТФаза плазма-леммы, непосредственно активирующаяся понижением рН в цитозоле. Другими компонентами рН-стата изолированных протопластов являются вторично- энергизованные транспортные, системы плазмалеммы: НС0з~/С1" и К+/Н+ обмены. Доля их участия может определяться трансмембранными градиентами соответствующих ионов.

8. Эти ион-транспортные системы плазмалеммы работают независимо и обеспечивают возможности быстрого регулирования рН. в цитозоле. Это существенно для растительных клеток, существующих "в изменяющихся условиях окружения, так как способствует их лабильности и устойчивости к стрессу. . .

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Трофимова М.С., Молотковсюш Ю.Г. рН цитозоля изолированных протопластов и его искусственное изменение // Физиология растений. 1988. т.5. вып.4. с.629-640. . ' .

2. Gaivoronskaya L.M., Troflmova M.S., Tlmonina V.N., Molotkovsky Yu.G. Ion-transport systems of plasma membrane Involved -ln_cytoso] pH regulation // 6-th Congress of the FESPP. 1988. Abs. 5-05. Spilt.

3. Трофимова М.С. Н+-АТФава плазмалеммы как компонент рН-стата цитозоля изолированных протопластов // Физиология растений. 1992. т.39. вып.1. с.5-14.

4. Трофимова М.С., Молотковский Ю.Г. Роль Н00з~/С1" обмена в регулировании рН цитозоля // Физиология растений. 1993. т.40. вып.1. с.94-100.'

и: