Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Измерение уровня свободного Са2+ в цитозоле растительных протопластов с помощью флуоресцентных хелаторов и поиск внутриклеточных механизмов его статирования

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Измерение уровня свободного Са2+ в цитозоле растительных протопластов с помощью флуоресцентных хелаторов и поиск внутриклеточных механизмов его статирования"

РОССИЙСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО РАСТЕНИЙ «и.

АКАДЕМИЯ НАУК

ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЮГНИ К. А .ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

БНЯШЕВА Асоль Эржановна

ИЗМЕРЕНИЕ УРОВНЯ СВОБОДНОГО Са2+ В ЦНТОЗОЛБ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРОТОПЛАСТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ХЕЛАТОРОВ Я ПОИСК ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ ЕГО СТАТНРОВАНИЯ

(03.00.12 - физиология растений)

Автореферат на сойсканиа ученой степени кан-идата биологических наук

/

Москва - 1992

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знаквив Институте физиологи« р&стенкК .имени К.Л.Тимирязева

Российской Академик наук ■ •

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ - доктор биологических наук

ю. г. иолотковскиВ

ОФФНЦИАПЬНЫЕ оппоненты - доктор биологических наук

р. А.звягнльская

кандидат биологических наук

Э. Н.ВЫСКРЕБЕНЦЕВА

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - ИосковскиП Государственный Университет кк. Н. В. Ломоносова. Биологический факультет, кафедра биофизика

► Залита состоятся " 23 " февраля 1Э92 г. в часов иа

заседании Специализированного совета К 002.45.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Институте фиаиологии растениВ ик.!иА.Тимирязева РАИ по адресу! 127276 г.Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан * 25

УченыВ секретарь Специализированного совета канд. бвол- наук

января 1992 г.

Л.Н.Сергеева «

Актуальность проблемы. Известно, что Са выполняет

функции вторичного посредника при передача и усилении

2+

экстраклеточных сигналов в животных клетках. Роль Са в процессах

внутриклеточного регулирования у растений исследован; фрагментарно

из-за отсутствия пряного я надежного катода измерения концентрации 2+

свободного Са в цитозоле, хотя у растений обнаружено множество

клеточных процессов, регулируемых или по меньшей мере зависящих от 2+ ■

уровня {Са J [Poovalah, Reddy 1987].

Функционирование Са2+ как универсально^ медиатора требует

топкого регулирования активности этого иона в цитозоле. Клеточные

систены статирования [Са2+]_, способные обеспечить как поддержание

2+

низкого регулируемого уровня tea )с, так и генерацию сигнала в

ответ на внешний стимул (кратковременное транзиторное увеличение 2+

[Са ]с, либо ее осцилляции), у растений практически не изучены.

Активно -применяемые в практике физиологии- животных

Са2+-чувствятельные фяуорйсцентные индикаторы квин 2, Фура 2 и

к идо 1 [Taien et al.r 1982* Grynkiewicz et al., 1905 J не смогли

найти широкого распространения у физиологов рас»зний, поскольку

для вх использования требовалась разработка 'специальных лриенов

введения индикаторов в объём цнтозоля.

Перечисленные проблемы определяли актуальность нашего

исследования. '

Цель я задачи исследований - 2+

1. Поиск адекватного метода измерения [Са ] в растительных протопластах с помощью флуоресцентных индикаторов фура 2 и индо 1.

2. Подтвердить факт изменений [Са2+]с при внешних воздействи-

2 +

ях, показать существование мембранных Са с: тирующих механизмов.

3. Показать важность стабилизирующего регулирования [Са ]

2+

(статирования) и процессов транспорта Са в изменяющихся условиях окружения растительной клетки, в частности при тепловом стрессе.

Научная новизна. На основа собственной разработанной нетодики

—- 2+

введения флуоресцентных Са -хелаторов в цитозоль растительных

2+

протопластов измерена концентрация свободного Са в цитозоле протопластов из мезофилла гороха (170+39 пМ, п=18) и из суспензионной культуры корнеплода сахарной свеклы (653+160 пМ, п=4).

Показано, что искусственно индуцированные смещения pi! цито-зольного и вакуоля]ного компартментов сопровождаются изменениями [Са2+)с, что указывает на возможность моделирования кальциевого сигнала путем коррекции протонного транспорта через п.алемму и

(

тонопласт.

Получен рад новых фактов, подтверждающих функционирование в растительной клетке сложно организованной снстены са^+-стата, ком*

понентамк которой являются активные АТФ-потребляющие механизмы

2+ ' транспорта и Са -каналы, блокируемые верапамилом я иифодвпинок.

Найдено, что в близких к критическим условиях теплового 2+

стресса деятельность Са -статирующей системы нарушается, что

2 +

».¿иводит к 1.-¡контролируемому росту 1Са ]с, вызывающему необратимые изменения метаболизма и гибель клетки.

Практическая ценность. Разработанная методика введения флуоресцентных зондов в цитозоль растительных протопластов может быть

рекомендована для проведения1 исследований, связанных с

2 +

определением кинетических изменений [Са ]с-

Полученные данные существенно дополняют современные представления о клеточной регуляции у растений. Результаты работы, а также использованная методология могут найти 'применение в экспериментальных исследованиях соответствующего профиля (при изучении процессов передачи внеклеточной информации внутрь клетки, различных аспектов регулирования клеточных функций. стрессовых воздействий).

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на 4 Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Нинск, 1990). В законченном виде работа доложена s обсуждена на межлабораторном заседании Института физиологии растений имени К.А.Тимирязева "АН СССР (1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы. Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

Диссертационная работа изложена на _ страницах машинописного текста, содержит 12 рисунков и 1 таблицу. Список„литературы включает 192 наименования, из которых 185 из иностранном языке.

Сокращения, использованные в тексте:

2+ 2+ [Са } - концентрации свободного Са в цитозоле;

2+ 2+ [Са }о - концентрация свободного Са во внеклеточной среде;

рН - значение рИ цитозоля; АН-производные - ацетонеткльные эфиры; с •

ПП -п. отопласты.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служила протопласты, ферментативно изолированные яз мезофилла гороха (Pisum sativum h., сорт Яегалова) и клетки я протопласты из суспензио-ной культуры сахарной свеклы (Beta vulgaris L., штамм 2n).

Получение протопластов кз мезофилла гороха. Закончившие рост листья 10-12 дневных растений нарезали на 1нн полоски и помешали иа среду А, содержавшую 0,6И сорбита, 5кН СаС12, 5мК буфера НЭС-бис трис пропан рН 5,7 и ферменты! 0,5% целлюлизина и 0,1% наце-розима. «ориентацию' проводили .на свету при 20°С в течение 16-17 часов. После фильтрования через 1 слой ткани мираклот (Calbiochem, США) к 2-кратной отнывки средой А без ферментов При центрифугирования (ЮОд, 5 нин) протопласты.переносили на среду субкультивиро-ванил, включавшую 0Л47М сорбит, соли по Шейку-Хильдебранту (в мМ: 24,4 КН03, 2,6 NH4H2P04, 1,6 MgS04), 50мМ сахарозы, 5иН СаС12, 5кК МЭС-бпс трис пропана рИ 6,0 и оставляли до использования в опыт при комнатной температуре на свату на 2-4 часа в опытах с индо 1 > или на 16-18 часов в опытах с фура 2.

Ацетонетильныа эфяры ».вина и фура ■ (quin 2/АМ, fi'ra 2/АМ), растворенные в диметилсульфоксиде добавляли к аликвотак суспензии протопластов (50-100 нкМ; концентрация растворителя не превьпнала 0,01%) и инкубировали при коннатной температуре 60 нин. Перед измерениями протопласты дважды отмывали от зондов.

Пермеабилизацлю гипоосмотическин шоком проводили как в работе (Saleem, Cutler 1986]» ПП На 30 мин пометали в условия гипоосмоти-ческого шока (среда А с 0,2Н сорбитом) в прг-:утствии 5кН флуоресцентного индикатора. Для предотвращения агглютинация ПП суспензию осторожно перекешивали. Нормальную осмотичность среды воостг 1авли-вали путем постепенного добавления среды А с 0,ЗбМ сорбитом. Концентрацию красителя в среде поддерживали постоянной.

3лектропорация. ПП и клетки отмывали растворами, содержащими Ihn MgClj и сорбит в концентрации, поддерживающей исходную осмотичность среды; pH 7,2 при 4°С. Суспензии ПП или клеток (плотность ок. 107кл_1) в той же среде с 5мМ зонда переносили в ячейку для электропорации, которая представляла собой кварцевую кювету объемом 1,5мл с двумя плоскими параллельными электродами, отстоящими на 0,5см друг от друга. Ус

'с

собранная согласно схеме (Zimmermann

г

давать разряды длительностью 5нс я напряженностью 2 кВ/ск, Через 10 мин после электропорации суспензию быстро нагревали до 25°С и инкубировали еще 30-90 мин для восстановления нормальной проницаемости ж электрических свойств иенбран. Перед флуориметря— ческими измерениями ПП и клетки двукратно отмывали средой А без зондов.

АТФ-пернеабилизация. ПП и клетки 10 мин отмывали средой А без C-i2+ с добавь-)» 5нМ ЭГТА; рН 6,7 и переносили в среду пермеабили-зации, содержавшую (мМ)t 50 КС1, 25 NaCl, 5 индикатор, 0,1-5,0 АТС и сорбит в концентрации, необходимой для поддержания первоначальной осмотичности среды. Инкубацию вели 30 мнн при 25°С и рН от 6,5 до 8,0, причем для поддержания рН > 7,0 в среду вводили 15мМ трис-HCl буфера нужного рН. Пермеабилизацию останавливали разбавлением суспензии в соотношении 1:1 холодной средой без АТФ с добавлением 5мН MgCl2, 1 мм СаС12 и ЗОмИ МЭС-КОН, рН 6,5 [Stienberg at al., 1987]. Отмывали клетки дважды средой А без зондов и микроскопировали.

Загрузку зондов в цитозоль при пониженных рН среды проводили согласно методика, предложенной Бушем и Джонсон [Bush, Jones 1987, 1988] и адаптированной для наших объектов . [Бияшева, Молотков-ский 1990,1991]. Аликвоты суспензии протопластов после субкультивирования отмывали средой отмывки и переводили на кислую среду со 100 мкН зонда, содержавшую кроне того 0,47м сорбита, 50иМ галактозы, 10-25мН КС1, 1кМ CaClj и 50нМ буфера, поддерживающего нужный рН: для квина 2 и фура 2 - Глутаминовую кислоту рН 4,0, для индо 1 - ИЭС рН 5,0. Объем каждой пробы составлял 200 мкл, плотность суспензии порядка 5*106mn_1, время инкубации 2 часа. Для преодоления возможного, повреждающего действия кислого- рН (4,0) протопласты гороха все время инкубации освещали через оранжевый светофильтр ЖС-18 и водный экран. Инкубации с индо 1 (рН 5,0) проводили в темноте.

После 2-часовой инкубации в кислой среде протопласты нуждаются в репарации; на этой стадии рН сречы быстро доводили до *5,8-6,0 с помощью 1Н раствора бис трис пропана, а для замедления утечки зондов из клетг- в среду вносили 5мМ пробенесида [Steinberg et al., 1987]. Длительность репарационной стадии при работе с Фура 2 составляла 30 мин, а для индо 1 - 5-15 мин, поскольку условия встраивания индо 1 более мягкие. Затем протопласты дважды отмывали от зондов и переносили в кювету на среду измерений, включавшую

0,47м сорбита, 50мИ сахарозы, 10-25мМ КС1, 100 мкМ ДТП* (хелатора двухвалентных тушителей флуоресценции зондов) и 25нМ буфера: либо МЭС-бис трие пропан рН 5,9, либо ХЕПЕС-бис трис пропан рН 7,0; в ряде случаев в сроду вносили 5мМ пробенесида - инг.битора транспорта органических анионов у животных клеток. При 'работе с протопластами свеклы концентрация сорбита во всех средах составляла 0,36М.

Стандартно в среду измерений вносили 1 нМ CaClj, но в

указанных случаях СаС1_ не добавляли, в тогд^ по нашик оценкам в

2+

среде присутствовало 1б-20мкМ Са в качество примесей в

ч 0 +

реактивах. Для полного хелатирования [Са ] в среду вводили либо

ЭГТА, либо высокоаффинный и специфичный хелатор диброно-БАПТА (10-

50мкМ). Расчеты вносимых концентраций реагентов производили на

компьютере, используя злаченая констант связывания, приведенных в

работах« [Pershadsingh, McDonald 1980, Pething at al., 1989].

Для предотвращения бседания протопластов при измерениях в

среду вводили фиколл в конечной концентрации 10%, запись в ряде 1

случаев веля при продувке суспензии воздухом через капилляг-

Измерения флуоресценции проводили в 'стандартной (1-см)

кварцевой кювете на спектрофлуоримэтре модели 850 фиркь "Hitachi"

(Япония), регистрируя либо спектры возбуждения и эмиссии, либо

2+

кинетику изменений флуоресценции комплекса зонд*Са . В последнем случае возбуждение и эмиссию записывали для квина 2 соответственно при 339 и 492 нх, дл* фура 2 при 350 и 525 ни, для индо 1 при 331 и 400 им; ширина щелей 5 нм. Объем суспензии не превышал 1 мл, плотность составляла ( 1-5)♦Ю^нл"'''.

_ 2+

Калибровку сигнала осуществляли в единя,ах концентрации Са

(как в работе [Tsien et al., 1982]), по формуле:

[Са2+] =K.*(F-F .„)/(Fm2, -F), 1 Jc а 1 min' ' max ' 2+

где К^ - константа диссоциации комплекса зонд * Са , равная для квина 115 нМ, для фура 2 - 224 нН, для индо 1 - 250 нМ при 37°С [Cobbold, Rink 1987]. F -экспериментальное значение флуоресценции. Флуоресценцию зонда в присутствии насыщающей концентрации Са

регистрировали после обработки протопластов 0,05% тритоном

щах

Х-100 либо иономицином (2,5 мкМ при рН > 7,0), а в бескальциовой

т |

форме (Fm^n) - после перехода Са в комплекс с избытком ЭГТА (4-5нМ) в присутствии ;риса (40-50 мМ, pit > 8,2).

Изнерсниа рН^ проводили нетодом "захваченных зондов" [Трофимова, Молотковский 1988] с помошыо карбоксифлуоресце..нд..ацетата.

Измерения вели в двухволновом режиме на спектрофотометре Hitachi 557, регистрируя йА4дд_4б5 Для оценки кинетики изменений pile.

"Тепловому стрессу нлетни и протопласты подвергали, инкубируя их в водяном термостате в стеклянных тонкостенных пробирках в X мл среды. По окончании необходимого срока прогрева (5-20 мин) пробирки быстро охлаждали, помещая их в воду комнатной температуры.

2+

При изучении влияния температурного стресса на [Са }с использовали следующий прием: суспензию протопластов, нагруженных индо 1, делили пополам на две пробы для строгого выравнивания в них эличества клеток и зонда. Одну пробу суспендировали в среде, нагретой до повреждающей тенпературы (39°С для протопластов гороха, 43°С для протопластов сахарной свеклы) и вели запись кинетики

флуоресценции в терностатированной кювете при соответствующей тен-

2+

пературе;' другая проба служила контрольной, [Са ] измеряли в ней

при комнатной температуре. Интервалы времени между пробами сводили

до мининума (= 5 мин).

2 +

Влияние [Са ] на клетки при тепловом стрессе. Среда инкубирования содержал^ • 150 мН сорбита, 5 нМ буфера бис-трис-пропан -

2+

ИЭС (рН 7,2) и 1,25 mm CaClj. Для изменения уровня [Са ]Q d рреду вводили либо дополнительно CaClj до конечной, концентрации 15 мм, либо 3 мМ ЭГТА. Повреждающее действие повышенной температуры оценивали по сохранению клетками способности исключать краситель Эвамс голубой через 2 часа после прекращения нагревания.

В микроскопических исследованиях использовали обыкновенный световод микроскоп Ienaval и флуоресцентный микроскоп Laboval 2а fl ("Karl Zeiss", ГДР). Локализацию вакуолей определяли по поглощению нейтрального красного, целостность мембраны - по окрашиванию флуоресцеиндиацетатом. Оценивали окраску не менее 100 протопластов в 3-5 случайно выбранных полях зрения.

Статистическую обр^ лотку данных микроскопических исследований вели по Стьюденту с р < 0,95. В каждом варианте приведены значения среднего с учетом стандартного отклонения.

* РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

.2 +

'с

Целью данного этапа исследований была разработка оптимальной

2 +

нотодики искусственного введения флуоресцентных Са - зондов фура 2 и индо 1 в обьем цитозоля. Были исследованы три различных подхода: с использованием АМ-производных (1), при обратимой пермеабилизации

плазмаленмы (2) и из сред с пониженными значениями pH (3).

АН-зфиры представляют собой гидрофобные производные зондов, у

которых все карбоксильные группы экранированы ацетометильнымя

группами, за счет чего они легко проникают через плазмалемму в цч-

тозоль животных клеток, где гидролкзуются неспецкфическяни эстера-

2+

заии с освобождением индикаторов в Ca -чувствительной фо^ме. Наши эксперименты и работы других исследователей показали, что этот подход неприменим для клеток я протопластов растений, поскольку в большинстве случаев гидролиз АН-связей протекал экстрацеллюлярно (Cork 1986J, я внутриклеточного накопления зондов не происходило. Другое объяснение заключается а том, что стерт* :кие особенности АК-прохэводных Фура 2 я индо 1, имеющих 4 или 5 эфирных групп на одном конце молекулы, затрудняли работу клеточных эстепаз [Bush, Jones 1990).

Пря пермеабияизацня гипоосмотическим шоком количество ПП, встроивших зонд не превышало 15 % от общего их числа. Предварительная 15-нвнутная обработка ПП в среде с повышенной осмотич-ностью (0,5 Н) сорбита перед гипооскотичаскик шоком приводила к некоторому повышению числа окрашенных ПП. Пе^эмеабилизация только гипероснотическик шоком (0,7-0,8 M сорбита) оказалась безуспешной.

Проведение перкеабилнзацки в более жестких условиях в средах без 2+

Ca или о отмывкой ПП ЭГТА (5 мМ) лишь увеличивало долю поврежденных ПП.

При исследовании метода элекгропорации показана зависимость между напряженностью приложенного поля и числом пермеабилизованных протопластов с одной стороны, я лизированных ПП - с другой. Лучшие

о

результаты получены при однократном пробое (2 кВ/си ) когда окрашенными оказались 30-35% ПП, а разрушенными - 15-20%, что несколько хуже, чем наблюдали на ПП из Phaseolua mungo [Gilroy et al., 1986). Увеличение числа импульсов или повышенйо температуры в ячейке при пробое приводило к более сильным . повреждениям, до 50-60%. Наблюдавшееся равномерное распределение зондов в объеме клетки может указывать на их вакуолярную локализацию. Действительно, при приложении внешнего поля достаточной интенсивности электрическому пробою должны подвергаться мембраны всех частиц, диаметр который превышает некоторое пороговое значение [Mehrle et al., 1985]; исходя из реальных разнеров органелл, ножно предположить, что nopi будут формироваться и в плазмалемме, и в тоно^пласте.

Оптимальные условия АГФ-периеабилизации описаны в работ*

[Б^епЬегд еЪ а1., 1987]. В наших экспериментах АТФ (0,1-5,0 кМ) не оказывала устойчивого пермеабилизующего действия на клетки. Очевидно, при значениях рН немногим выше .7,2-7,4 плазналемна обратимо меняет свои барьерные свойства и без участия АТФ. Замена АТФ эквимолярной сиесыо ЭГТА и ЭДТА не привела к усилению аффекта лер-меабилизации.

Испытанные методы пермеабилизации не дают возможности точно кс 1тролироват1 , в какой клеточный компартнент поступит или распределится инородный экстраклеточный материал. Кроме того, методы недостаточно эффективны, чтобы обеспечить встраивание адекватных

2+

-- концентраций именно слабо светящих Са зондов.

Результаты методической работы суммированы на рис.1.

ЗК метод результат

1/ АМ-производные

2. пермеабилизация

-оси.шоком (0,5М) -электрич. разрядом (2 кВ/см2, 5нс)

4_

-АТФ (0,1-5,0 мН)

3. инкубация в кислой среде

(рН 4,5-5,0)

экстраклеточный гидролиз

малая эффективность повреждения всех клеточных

не>4бран малая эффективность удовлетворительный результат

СРЕДА рН <5-5,0

Рис.1. Результаты испытания методов встраивания флуоресцентных зондов в цитозоль (А) и схематическое изображение принципа метода "кислого встраивания" (Б).

Метод встраивания Са2* на том что при рН среды < рК зондов протонируются, и и" молекулы в нейтральной форме диффундируют че-

зондов при пониженных рН среды основан карбоксильные группы зондов

роз плазкалемму• В цнтозоло, где значения pH близки к 7,0, протоны

2+

диссоциируют » зонды накаппнваются в Ca -чувствительной форме [Bush, Jones 19Û7, 1988J. Применение этой методики оказалось в наших экспериментальных условиях успешным и позволило эффективно 2+

нагружать Ca индикаторами фура 2 к индо 1 ПП из мезофилла гороха и суспензионной культуры сахарной свеклы. Внутриклеточная концентрация зонда, достижимая при эгон методе загрузки, была достаточной для ведения спектрофлуориметрических измерений в суспензии ПП, давала калибруемый сигнал и спектр, совпадающий со спектром зонда в чистом растворе (рис.2).

А

ТРИТОН х-ко

jrTA + ТАКС

n F

! 1

-

МАХ

- F

F

нш

5 cArfWV**» «kiV^C

IM

Л „„./MI

¿за

Рнс.2. Споктр фура 2 (А) и пример калибровки (Б)

2+

(А) Сплошной линией обозначены спектры Са -насыщенной (а) и свободной (б) форм 1 мкМ фура 2 в буферном растворе (ЮОмМ КС1, 25 нИ ХЕПЕС рЦ 7,0). Пунктирные линии показывают спектр фура 2, введенного в цктозоль ПП гороха методом "кислого встраивания" (в) и спектр аутофлуоресценцни контрольных ПП, ненагруженных зондом (г). Шкала прибора при записи спектров виг на 1,5-2 порядка бо. se чувствительна, чоп при записи спектров а и б (за счет разницы концентраций зонда).

(Б) а - ПП нагружены фура 2; б - контрольные ПП (ненагружены зондом). Добавки: тритон Х-100 0,05%, ЭГТА '4мМ, трис 40мМ (рН >

8.2). Из данных рисунка [Ca

1 = 198 нН. Пояснения в тексте. Jc

Однозначным доказательством внутриклеточной локализации зонда

ножет служить быстрый рост флуоресценции после изменения проницае-

2 +

мости плазналемны под действием Са -нонофоров или детергентов в 2+

Са -содержащей среде, когда весь внутриклеточный зонд переходит в 2+

комплекс с Са . этот прием лежит в основе калибровки сигнала в единицах концентрации Са [Tsien et al., ' 1982]. Пример подобной процедуры показан на рис.2. В ответ на добавку тритона X -100 быстро увеличивается только флуоресценция суспензии ПП, нагруженных зондом. Последующее падение флуоресценции под действием ЭГТА-

„ 2+

трис также стандартно для флуоресцентных Са - индикаторов.*

2+

Численные значения [Са ]с, полученные наки с помощью методики "кислого встраивания" фура 2 составляют для ПП из суспензионной культуры корнеплода сахарной свеклы 653 ± 160 нН (п = 4), для ПП из мезофилла гороха индикатор фура 2 дает значения 217 ± 60 нМ (п »5), а индо 1 - 170 ± 39 нМ (п = 18). Некоторый разброс величин связан с'нестабильностью значений К^ фура' 2 (см. далее), а порядок величин совпадает с полученными для других растительных объектов

[Gilroy et al., 1986,1987, Felle 1988, Miller, Sanders 1987 etc.].

2+

В ходе зкспериментов мы наблюдали вытекание Са -индикаторов из клеток, что, по-видимому, является общей.проблемой для целого ряда животных и растительных объектов [Steinberg et al., 1987, Oakes et al., 1988, Karaki 1989, McDonough, Button 1989].

Технические трудности, связанные с утечкой зонда, могли бы Ьыть преодолены с помощью специальной компьютерной программы, способной вычленять информативные изменения флуоресценции внутриклеточного индикатора. Не имея такой программы, ны вынуждены ограничивать время записи каждой пробы 12-15 минутами, то есть периодом, когда скорость утечки линейна.

Ряд других факторов также вносят искажения в опытные данные к * 2+

особенно в количественные оценки [Са Jc. Присутствие неучитываемой доли зонда в наружном растворе выражается в завышении рассчи-2+

танных значений [Са ] . Константы диссоциации конплекса краситель 2+

* Са зависят от микровязкости среды [Konishi et al., 1988], могут реагировать на различные неспецифические воздействия [Owen 1989], резкие скачки рН [Lattanzio 1990]. В последнее вреня появились сообщения об опосредованном неким неспецифическин анионным

переносчиком однонаправленном транспорте молекул различных флуо-

«

реСцентных красителей, в том число фура 2, в вакуоль [Oparka

1991], а также о возможном распределении зондов в другие компарт-

Hetrrbit ядро [Karaki 1989, Oparka 1991], эндоплазматический ретику-

лун [Bush et al., 1989].

Приводимые исследователями в настоящее время численные значе-2+

вив [Са ] и количественные оценки ее изненений должны расснатр"-

ватьсл с учетом указанных замечаний. Можно надеяться, что по мере

2+

совершенствования техники измерений свободного клеточ ого Са станет возможным точный учет всех необходимых поправок для любой экспериментальной системы, » наши данные тогда могут подвергнуться известной коррекции.

В связи с этим в дальнейшем мы концентрировали свое внинание скорее на качественной стороне явлений. Наблюдав: te нами изменения достаточно адекватно отражают реальный ход процессов внутри клетки, а допускаемая ошибка измерений являет-я постоянной величиной.

Специфичность регистрируемых изменений флуоресцентного сигнала определялась в проверочных экспериментах для каждой .серии опытов. Возможность кеспецифического влияния применяемых реагентов также контролировалась.

Наглядным г убедительным подтверждением применимости метода 2+

"кислой загрузки " Са -индикаторов фура 2 и к\що 1 в цитозоль протопластов из мезофилла гороха служат полученные нами результаты, описанные в следующих разделах. [Са2*1_ и рН_

¿====±с==£=с 2+

В наших опытах выявление связи между изменениями рНси [Са )с

открыло путь для изучения механизмов, создающих основу статиро-

2+

вания и регулирования [Са Jc.

Применение слабых проникающих кислот и оснований является стандартным приемом для искусственно индуцированного зскисления или защелачивания цитозоля.

Закисление. Снижение рНс у ПП гороха вызывали внесением в среду измерений (рН 6,0) 15 мН слабой неметаболизируемой изомаслп-ной кислоты (рК = 4,84), данные приведены î.a рис.3. Первоначальное быстрое падение рНс на 0,3 единицы рк (ДрН = 0,32±0,01? п=3), зарегистрированное по изменениям ÛA4g5_490 рН-чувствительного индикатора карбоксифлуоресцеина, встроенного в цитозоль ПП, сопровожпа-лось постепенной релаксацией до исходного уровня, равного 7,0±0,1, п=3 (Рис. 3, кривая б); что связано с активацией прогонного транспорта [Трофимова, МолоткоЬский 1988, Kurkdjian, Guern 1989]. Для кальция после более чем 2-кратйого увеличения его концентрации в цитозоле (Д[Са2+]с = 218±90 нМ, п=3) наблюдалась тен-

денцня к восстановлению начального уровня (Рис. 3, кривая а). Вид-

2+

но, что изменения [Са ]с ■ рнс почта параллельны во времени в начинаются сразу же после добавления нзобутирата к ПП. Их амплитуда укладывается в порядок величин, полученных другими исследователями [Felle 1988].

2+

Отметим, что сродство зондов к Са не меняется при колебаниях. pH в пределах 6,7-7,1 [Hason, "Grinstein 1990, Lattanzio 1990]. + 2+

Взаимосвязь II n Ca в клетке может осуществляться как через физико-химические механизмы (вытеснение кальция протоном из мест t-ro связывания в цитозоле при закислении), так н благодаря изменениям транспорта ионов через ллазналемму и внутриклеточные мембраны. В частности, вакуолярный pH-градиент, сформированный протонной

2+ +

помпой, может служить движущей силой для Са /Н -обмена через то-

нопласт, и снижение pH вызывает уменьшение ДрН на тонопласте, что

2 +

приводит к выбросу части вакуолярного Са в цитозоль.

ИЗОВУТМРЛТ

500

100

7.0

рнс

2 МИН

Рис.3 Кинетика изменений рН и [Са2+] под действием нзобутирата

2 +

а - изменения [Са ] регистрировали в протопластах гороха с

помощью встроенного зонда фура 2; б - о смещении рНс судили по изменениям ЛЛ465_490 локализованного в цитозоле карбоксифлуорвсцеина. Стрелкой указано внесение 15 нМ нзобутирата. рН среды 6,0.

NII4CI " 15 7

i «-«M* <

2

lt. красный

3 ^^

7-2

pHc

7.0

7.1

P»c

6.9

u

2 M"H

2+

Рис. 1 Кинотика изменений [Са '] при заболачивании цитоплазмати-ческого (А) и вануолярного (Б) компартментов

1.3 - ПП нагружены фура 2;

2.4 - ПП нагружены карбоксифпуоресцеинон.

Стрелки указывают на внесение 20мМ NH^Cl (А) и ЮОмкМ нейтрального красного (Б), pu среды 7,0. *

Защелачивание. Хлористый аммоний (рК. = 9.22) способен повышать рНс благодаря быстрому вхождению ГШ^ в цитозоль и последующей. его ассоциации с Н+. Добавление к суспензии протопластов 20 мМ при рН среды 7,0 вызывало устойчивое зашелачивание цитозоЛя на 0,2 единицы рН (ДрН = 0,2±0,02; п=3), (рис. 4А, кривая 2); в

то же время из нерения с помощью фура 2 обычно не показывала, значи-

2 +

тельных колебаний уровня (Са ] (Рис. 4А, кривая 1).

Краситель нейтральный красный, являющийся слабым осковаккек

(PK » 6,7), распределяется в более кислый вакуолярный компартмент и даже в небольших концентрациях способен повышать pH вакуоли, не оказывая существенного пействия на pH. [Felle 1988]. Нами отмечено

2 -г ■

слабое увеличение [Са ]с в ответ на добавление 100 ккМ нейтрального красного к ПП, суспендированным в среде pH 7,0 (Рис. 4Б, кривая 3). Цитоплазнатический pH изменялся незначительно (Рис.4Б, кривая 4). в объяснении этого любопытного факта мы согласны с мнением

?+ +

о возможном участии Са /Н -антипортера тонопласта в осуществлении 2+

связи Са и pH вакуолярного кокпартмента [Felle 1988].

2 +

• Пероятно, повышение [Са )_ может обеспечиваться вакуолярный 2+

пулом Са , на что указывают данные по защелачиванию вакуоли нейтральный красным.

Известно, что изменения рНс, вызываемые физиологически активным* веществами типа ИУК [Felle 1988], светом [Miller,. Sanders 1987] или стрессом [Drummond et al., 1986] сопоставимы по амплитуде с искусствено индуцированными смещениями рНс [Kurkdjian, Guern 1989]. Это позволяет полагать, что целый ряд процессов, реализуемых через модуляции рНс, должен вовлекать и механизмы, регулирующие [Са2+] .

2+

Статирование [Са ]

Данные, представленные в предыдущем разделе, в частности,

2+

тенденция к восстановлению исходного уровня [Са ]с после возмущающих воздействий (Рис.3, кривая а), свидетельствуют о ток, что

2 +

уровень Са в ПП гороха достаточно строго контролируется внутриклеточными системами. Поэтому следующей задачей, наших исследований

2+

стало подтверждение существования элементов Са -статирующей системы в ПП гороха.

Ингибиторы лТФаз. Для большого количества животных клеток твердо установлено, что повышение Са2+ в среде вызывает увеличение [0а2+]с [Carafoli 1987]. В наших экспериментах скачкообразное 100-

краткое увеличение внеклеточной концентрации Са от 0,01-0,02 мМ

2 +

до 1-2 иН. сопровождалось медленным росток [Са ]с (Рис.5, контроль). ПП, прединкубированные в течение 10-15 нинут с ингибиторами АТФаз, в значительной степени утрачивали способность поддерживать уровень [Са2+]с при повышении [Ca2+]Q (Рис.5), причем сходный характер ответов наблюдался для всех использованных ингибиторов, независимо от их специфичности. Концентрации ингибиторов подбирали, основываясь на литературных данных. На изолированных препаратах мембран показано, что эрктрозин Б в низкой концентрации специфи-

+ ДЭС

+ ОрТОВАНДДАТ

+ //-ЭМ + эритрозни Б

контроль

2 НИН

... 2+.

Рис.5 Влияние внеклеточного кальция на [Са ]

на фоне ингибиторов АТФаз

Протопласты, нагруженные индо 1, суспендировали в номинально бес-2 +

кальциевой среде ((Са ] < 20 мкМ). Все пробы кроме контрольном прединкубированы с ингибитораки:

5 мкМ эритрозин Б; 200 мкМ Л-этилмалеимид; 1 мМ ортоваиадат; 100 мкМ ДЭС.

2+

Са вносили в среду до конечной концентрации 1 мМ.

2 мин

, 2+ Рис.б Влияние верапаиила и нифедипина на поступление Са

а цитозоль

Все пробы кроме контрольной прединкубирооаны со 100 мкМ ДЭС. 1 мМ верапанила или 100 нМ нифедипина вносили на фоне 100 им ДЭС. Стрелкой указан момент внесения в номинально бескальциевую среду 1 нН Са2+.

чески инактивирует Са -АТФазу плазмалеимы, на ингнбируя активность Н -АГФазы [Rasi-Caldogno et al.,1989], тогда как прочив ингибиторы не отличаются -акой избирательностью и способны подавлять АТФ-зависикый транспорт ионов на различных клеточных мембранах [Sanders, Slayman 1989, Evans et al., 1991]. 11ы надеялись, что использованный набор ингибиторов позволит подойти к оценке вклада

разных АТФ -зависимых систем, пряно или опосредованно участвующих 2+

в поддержании Са -гомеостаза; но сложность работы на такой экспериментальной системе как целые протопласты я несовершенство методику. измерений затрудняет уверенную интерпретацию полученных данных.

По-видимому, выключение работы АТФаз (в первую очередь И -АТФазы плазмалеимы) лишает клетку основного источника энергии для

2+

транспорта ионов и соотвотствонно для поддержания Са гомеостаза.

Нельзя отбросить вероятность прямого отключения дТФ-зависимых пу-

2+ • тей регулирования [Са ] на то"опласте и мембранах эндоплазмати-

ческого ретикулума. Эффект эритрозииа Б указывает на возможность

2+ '2 + участия Са -АТФазы плазкалеммы в статировании [Са ] .

2+

Блокатсры Са -каналов, как известно из физиологии животных,

-5+----2+

увеличение [Са ] может быть следствием либо выхода Са . из внутриклеточных компартментов в цктозоль, либо поступления из внешней среды [Berridge 1987]. Для растений описаны системы, способные

обеспечить оба эти механизма [Poovaiah, Keddy 1907]. В наших экс-2+

периментах рост [Са ] на фоне ингибиторов АТФаз непосредственно

2+

связан с увеличением [Са ] (Рис. 5,6). Па рис. б видно, что внесение 1 кИ варапамила или 100 нМ нифедипйна - известных блокаторов Са2+-каналов - предотвращает подъем [Са2+]с на фоне возросшего Са2+ среды и инактивированных ингибитором АТФаз . Работая на целых ПП,

невозможно точно оцепить вклад внутриклеточных компартнентов в 2+

сумкарный рост [Са 1 , В то же время эффект верапамила й нифеди-

с 2+

пика указывает, что в данной постановке эксперимента рост [Са ]с

2 +

обусловлен поступлением Са из внешней среды и, вероятно, вход

2+

осуществляется через Са каналы плазмалеимы. Для клеток харовых

водорослей охарактеризована контролируемая трансмембранной раз-

2+

ностью электропотенциалов Са -проводимость плазкалеммы и тоноп-ласта: деполяризация мембран приводит к открыванию каналов [Берес-

товский и др., 1987]. Возможно, на рис, 6 отражены последствия

+

деполяризации плазмалеимы, вызванной инактивациеи Н -помпы. _[Са___] при тепловом стрессе

В соответствии с первоначально поставленной целью и согласно

логике работы, на следующем этапе исследований мы стремились оце-

„ 2+

пять роль и долю участия свободного цитозольного Са в развитии реакций клетки на физиологический стимул.

Были опробованы многочисленные варианты воздействий! обработка протопластов фитогормонами в рост-активирующих концентрациях; освещение краснын/дальним красный или запускающим фотосинтез белым светом; воздействие проникающин (Die 8:0) и непроникающин (DiC 18:

1) аналогами диацилглицеряна; обработка микромолярными концентра-4-

циями АТФ . Ли одно из этих воздействий на отразилось на регист-2 +

рируемом уровне [Са ]с< что в каждом случае можно объяснить как экспериментально обусловленными, так и объективными причинами. К успешному результату привели исследования стрессового действия повышенной температуры.

На культивируемых клетках животных было показано, что вызван-

2+ 2+ ное действием Са -ионофоров искусственное повышение [Са ] индуцирует синтез некоторых белков теплового шока при нормальной температуре [V)u et al., 1981, Resendes et al., 1985]. Для растений такие работы неизвестны.

В предварительных опытах мы выбирали режимы тепловых воздействий, которые с одной стороны не ограничили бы применимость метода 2+

регистрации [Са ]с, а с другой - оказывали бы явное действие на протопласты. Были сняты температурные кривые, отражающие зависимость повреждения клеток от температуры и длительности прогрева (результаты не приведены). Опираясь на полученные данные, выбрали условия для дальнейших экспериментов! 39°С 5 мин для протопластов гороха; 43°С 5 мин для протопластов сахарной свеклы; 52°С 20 • мин для клеток сахарной свеклы.

При суспендировании протопластов в среде, нагретой до темпе-

2 +

ратуры теплового стресса, сразу же начинается быстрый рост [Са ] ,

тродолжающийся все время наблюдений (рис.7, кривая 1). Значения 2+

Са ] возрастают при этой с исходного уровня 170 - 39 нМ в сред-

шк в 4 раза за первые 3-4 минуты, достигая 6Q0-700 и более нМ.

Очевидно, доказательствами обусловленности роста флуоресцен- ,

2+

яи именно специфическими взаимодействиями зонда с Са могут слу-ять результаты, отраженные на рисунке 7 (кривые 4 и 5). В пробе с ротопластами, ненагруженными зондом, при перенесении их в нагретую эеду (см."Методику") не наблюдали никаких колебаний флуоресцент-э.го сигнала (кривая 5). В то же время, у протопластов,внутрикле-

точно нагруженных индо 1, в отсутствие тепловых воздействий флуоресценция сохранялась постоянной (кривая 4). .

500

150

2*

С»

- С»2*

контроль

I- 59°С

<-39*С

+■ верапгмнл 1«»39*С

{2а*С

2 мин

ПП без мни ("39 "С

.2 + ,

Рис.7 Кинетика изменений [Са ] в протопластах из

мезофилла гороха при тепловом стрессе

.2+

В протопласты гороха встроен флуоресцентный Са -зонд индо 1; . + Са2+, t=390C - среда измерений содержит 1мМ СаС12; - Са24", t=390C - среда без Са2*, с добавкой 50 мкМ БАПТА-Вг2; верапанил, и=39°С - ПП предиикубированы с 1мМ верапанила, среда

содержит 1кК саС^; контроль, ъ=23°С - ПП не подвергали действию повышенной температуры;

"П без зонда, 1=39°С - контроль на неспецифические изменения, не связанные с флуоресценцией зонда: ПП не нагружены индо 1

Стрелкой указан начальная момент действия температуры для всех кри' вых, кроме контрольной.

Сходные закономерности зафиксированы и для протопластов са харной свеклы (не показано).

Вызванный действием повышенной температуры быстрый рос

2+

[Са ] существенно замедлялся при истощении вне- и внутриклеточнъ

пулов Са

с помощью соответственно 10-50 мкМ высокоаффинного хе

латора БАПТА-Br. (рис.7, кривая 2) или комбинации 5-10 mi "I БАП-2 +

ТА-Br, с 2,5 ним Са -ионофора иономицина (предобработка 5 мин).

2+ „ 2 + Блокирование транспорта Са по верапаиил-чувствительиым Са -ка-

2 +

налам также проявлялось s замедлении скорости роста [Са ]с, вь;з-

ванного увеличением температуры (рис.7, кривая 3).

Таким образом, ни БАПТА-Вг„, ни верапаиил, ни истощение внут-2+

рнклеточных пулов Са не снимают обнаруженного эффекта температуры полностью, но в силу трудностей технического порядка (см. [Бия-

шева, Нолотковский 1991]) в наших опытах но представлялось

„ 2 +

возможным оценить поступление вне- и внутриклеточного Са в цито-

золь строго количественно.

В контрольных опытах показано, что применяемые реагенты не

являются тушителями флуоресценции и не взаимодействуют с зондом,

поэтому полученные данные позволяют утверждать, ч-о фиксируемые

„ 2 +

изменения флуоресценции отражают процесс взаимодеиствия Са с зондом, локализованным в цитозоле, то есть являются специфичными и значимыми.

Из литературы известно, что при повреждающих воз де51ств::ях на-« 2+

рушается Са -гомеостаз, поддерживаемым в нормальных условиях клеточными системами транспорта и компартментации;, это приводит к не-

2+

регулируемому росту [Са ] я тесно связано с цитотоксическими

эффектами [Orrenius et al., 1989; Perotti et al., 1990]. 2+

Влияиие [Са 1рна клетки при тепловом стрессе. Для прочерк»

предположения о возможном токсическом действии на клетки высоких 2+

концентраций Са , возникающих в результате высокоамплитудного-,„ 2 + ,

роста [Са ] при тепловом стрессе, подвергали воздеиствяю темпе-:

ратуры клетки суспензионной культуры сахарной свеклы, инкубиройан-

ные при физиологической (1,25 мМ), высокой (15 мМ) и близкой к ну-

2 +

левой (3 мИ ЭГТА на фоне 1,25 мМ СаС12, рН 7,2) концентрациях С а в среде. Определяя жизнеспособность клеток по исключению красителя Эванс голубой, показали (см.рис.8), что через 2 часа после теплового стресса (52°С, 20 мин) жизнеспособность сохраняется у 75-80%

2+

клеток, если среда содержит 1,25 нИ Са , как и при культияирова-

2 +

нии суспензии. В присутствии 15 мИ Са неокрашенными остаются

2 +

лишь 60-70 % клеток, тогда как уменьшение доступного Са в среде

при помощи ЭГТА восстанавливает терлоустойчявость клеток до уровня

физиологического "стандарта".

Хотя к клеточной смерти могут приводить процессы, не 2 +

зависящие от Са , в последнее время обнаружены цитотоксическиэ

/

Л

V? 100

л"

н во

О

о

«о со

О

и

о

с ■«0

и

о

п го

я

«

0

Рис.8 Влияние

[Са2Ч

на теплоустойчивость клеток суспензионной

о,

культуры сахарной свеклы к высокой температуре (52 С, 20мин). % жизнеспособных клеток опредвляли через 2 часа после прогрева

А

контроль, t

В - высокая [Са

23 С; Б - нормальная [Са ] в среде (1,25 мМ); 2+ 2+ ¿-г, ------- ,с ..„_ ^ среда без Са'' (3 нМ ЭГТА).

]0, равная 15 мМ;

механизмы, активируемые именно продолжительным повышением уровня 2 +

внутриклеточного Са . К ним относятся нарушения работы цитоскеле-та и неконтролируемая активация Са^+-стинулируемых фернентов катаболизма (фосфолипаз, протеаз и эндонуклеаз) [0ггеп1ив ей а!., 1989].

Кроме того, существенное и/или продолжительное повышение

2+

[Са ] аышэ уровня, считающегося нормальным (порядка десятков или

сотен может привести к нарушению существующих олектростатичес-

2+

ких взаимодействий, необратимому связыванию Са с фосфатными, карбоксильными а другими группами клеточных белков и ферментов, изменению их конформации, блокированию энергетического метаболизма и невозможности регулирования в целок.

Наблюдаемый нами высокоамплитудный и вследствие этого, веро-

2+

ятно, неконтролируемый рост [Са ]с может вызвать токсические реакции и явиться причиной гибели клетки [0ггеп1из et а1., 1989]. Учитывая, что .и намеренно выбирали температуры, близкие к критическим, можно считать, что результаты, приведенные на рис.7, подтверждают это предположение. Наши результаты не вступают в противоречие с представлениями о протектирукэдвм, стабилизирующем действии 2+

Са на биологические объекты, предохраняющем их от повреждений во время стресса [Вгэаоп 1989].

2 +

По-видимому, в физиологических границах существования [Са ]

в клетках тонко регулируется н ее изменения могут быть сигнальными. Но в пограничных условиях под действием стрессовых факторов обвспвчивающеэ жизнедеятельность гомеостатярованиэ нарушается или даже становится невозможным.

ВЫВОДЫ

1. Кодифицированный и усовершенствованный метод измерения

2+

уровня свободного Са в цитозоле растительных протопластов с

помощью флуоресцентных хелаторов фура 2 и индо 1 позволяет вести

спектрофлуормнетрячесыие измерения в суспензии протопластов, кор-

2+

ректно оценивать изменения [Ca 1 и следить за ними в кинетике.

2+

2. Цитозольные концентрации Са , определенные с помощью указанного метода, составляют! в протопластах из суспонзионной культуры корнеплода сахарной свеклы 653 i 160 нМ, п = 4 (фура 2); в протопластах из незофилла листа гороха 217 ± 60 нМ, п = 5 (фура 2) и 170 ± 39 нМ, п - 18 (индо 1).

3. В цитозоле растительных протопластов существует тесная

2+

связь между концентрациями Са и н . Искусственное закисление

2+

цитозоля приводит к росту [Са ] . Защелачивание вакуолярного ком-

2+

партнента также сопровождается повышением [Са ] . Эти факты ука-

2+•

зывают на возможность модулирования [Са Jc путем коррекции протонного транспорта через граничные нембраны, приводящей к изменениям pH цитозоля или вакуоли. ,

4. В растительных протопластах функционирует сложно органи-

2 +

зованная многокомпонентная система Са -стата, элементами которой 2 +

могут быть Са -каналы плазмалеммы, блокируемые верапамилом и ни-федипинон, и АТФ-потребляющие механизмы транспорта через плазматическую мембрану (Са^+-АТФаза, Н+-АТФаза), а также, возможно, Са2+/ Н+ антипорт на тонопласте.

245. Изменения уровня свободного Са в цитозоле возникают как

„ 2+

временное нарушение Са -статирующих механизмов, причем источника-2+

ми повышения [Са ] могут служить как внеклеточная среда, так и

внутриклеточные конпартиенты, в первую очередь вакуоль. ,

2 +

6. Нарушение координированной работы Са статирующих механизмов ножет быть одной из причин повреждающего действия высокой

температуры при cTpecces неконтролируемый рост цитозолъной кон- 2+ , цеитрации Са , вероятно, приводит к необратимым изменениям мета-

болизма клеткк и вызывает ее гибель.

- 24 - I

I

Список работ, опубликованных по материалам диссертации'

2+ 1

1. А.э.Бияшева. определение Са в цитозоле растительных

клеток с помощь» флуоресцентных индикаторов.-IV Всесоюзная ■ конференция колодых ученых по физиологии растительной клетки: Тез. докл. - Минск, 1990, с.163.

2. Бияшева А.Э.,Молотковский Ю.Г. Измерение концентрации ци-

2+ "

тозольного Са в протопластах с помощью флуоресцентного индикатора фура 2.- Физиология растений, 1990, т.37, вып.З, с.602-608.

2+

3. Бияшева А.Э..Молотковский Ю.Г. Исследование Са -етатвру-ющих механизмов в протопластах мезофилла гороха с помощью фура 2 ■ индо 1.- Физиология растений, 1991, т.38, вып-2, с.262-272.

4. Бияшева А.Э., Молотковский Ю.Г., Мамонов Л.К. Повышение

2+

уровня свободного Са в цитозоле растительных протопластов в от-

2+

вет на тепловой стресс: связь с Са -гомеостазои.- Физиология^растений, 1992 (в печати).