Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фитохром-зависимая транслокация ионов кальция в мембранных структурах протопластов овса

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фитохром-зависимая транслокация ионов кальция в мембранных структурах протопластов овса"

г л

ой

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

СОКОЛОВСКИЙ Сергей Геннадьевич

ФИТОХРОМ — ЗАВИСИМАЯ ТРАНСЛОКАЦИЯ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В МЕМБРАННЫХ СТРУКТУРАХ ПРОТОПЛАСТОВ ОВСА

03.00.02 — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссергации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск — 1093

Работа выполнена в' Институте фотобиологии АКБ, Минск

Научный руководитель: член-корр. АНБ, профессор ВОЛОТОВСЮШ it. Д.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук КРИЦЮШ И. С.

кандидат химических наук ЛАГКО В.Н.

Ведущая организация: Институт физиологии растений РАК

Зашита состоится 1993 р. в /У часов ia заседании специализированного совета Д 006.ОК.01 по защите докторских диссертаций по специальности "биофизика" при Институте фотобиологии АНБ по адресу: 220733, г.Минск, ул. Ф.Скорины, 27.

С диссертацией мо&го познакомиться ь библиотеке Института фотобиолигии АНБ.

Автрореферат разослан t-*^" Cß-jt ^ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета ¿¿Г-*4"" ' Л.М.Шейко

Институте фотобиологии Академии Наук Беларуси

го _/ (ßti^t Л.М.Е

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Возможное участие ионов кальция в реализации фитохроыного сигнала в растительной клетке уже дастаточно давно привлекает внимание исследователей. Известно, что такие фитохром-зависимые эффекты, как набухание протопластов злаковых, переориентация хлоропластов у зелйной водоросли мужоции, прорастание семян е"сших растений и спор папоротников, деполяризация наружной мембраны водоросли нителлп, никтинастические движения листиков у акации не происходят при отсутствии в среде ионов кальция [Tretyn c-t al., 19911.

К моменту выполнения данной работы был накоплен некоторый феноменологический материал, но полной картины трансдукции хотя он "быстрых" (с 10-ти минутной лаг-фазой) Са2+-зависимых фитохромных аффектов не существовало. В частности была показана, в ответ на облучение К-светом, активация транспорта Са2+ через плазмалемму растительной клетки CDryere, Welsen-seel, ¡979; Hale, Roux, 1980; Das, Ворогу, 1985] и усиление степени фосфорилирования белков еЭ мембран [Romero et al., 1991,ab]. Эти данные указывают на то, что К-облучение способно изменять цитоплазматическую концентрацию Са2+, а также модулировать Са2+-зависише внутриклеточные процессы, протекающие с уч ястием систем метаболизма ttNi и G-белков. Вмосте с тем конкретные механизмы фитохром-индуцированного переноса Саг+ через плазматическую мембрану и природа К-зависимого увеличения [Са2+1 в цитоплазме растительной клетки изучены не были.

Сказанное выше и определило цели и задачи исследования.

Цел'}, и ьадачи исследования. Основная цель данной работы состояла в изучении возможной регуляции фитохромом активности Са -транспортирующих систем плазмалеммы и влияния К-, ДК-сОлучения на [Са2+}ц этиолированных протопластов овса. В связи с втим били поставленны следующие задачи:

1. Исследовать кинетику транспорта Саг+ через плазматическую мембрану протогыгастов этиолированких проростков овса (Лиегш еаМ"а. Ь).

2. Изучить влияние красного, дальнего красного света и их чередования на процессы накопления и выброса ионов кальция протопластами.

Щсвести скрининг Са2+-транспортирующих систем плазматической меморани, ответственных за фитохром-зависимое накопление этого иона.

4. Исследовать действие К-, ДК-света на динамику цитоплазма-тической концентрации ионов кальция и оценить участие в этом процессе кальциевых депо протопласта.

5. Изучить влияние К-, ДК-оолучения на (^осфоинозитидный метаболизм растительной клетки.

Научная новизна работы. В ходе работы установление, что этиолированные протопласта овса обладают значительной способностью к аккумуляции ионизированного кальция даже при столь низкой его концентрации в ср^де, как Ю-6 !.!. При этом, наблюдается достоверное различие' в накоплении этого иона К-оОлуч&нними и темновыми клетками. Подобное различие было обнаружено и в кинетических опытах по накоплению и выбросу Са2*" протопластами. Обратимость К-индуцированного накопления и выброса Са2+ дальним красным светом говорит о модуляции этих процессов фитохромом. В аккумуляции этого иона принимает участие Ма*УСаг+-янтипорт плазмалеммы растительной клетки. При

ч5м, било установлено, что Ыа+/Са2+-о0мен активируется К-облучетшем, но не функционирует в этиолированных клетках. Кнгибиторннй анализ так не показал модуляцию фитохромом активности Саг+-насоса, но не Са2*/Н+-обменника наружной мембраны протопластов. Влияние хромопротеида на состояние Са2+-каналов плазмалеммы выражалось в увеличении чувствительности их к верапамилу.•

Флуоресцентное зондирование протопластов с ■ помощью кеиня-2 показало, что К- и ДК-облучение вызывало как синхронные, незатухающие, так и асинхронные, затухающие осцилляции ССаг+] в цитоплазме, возникновение первых эависило от концентрации протопластов в суспензии (и имело место при концентрациях на ниже, чем 5*105 клеток в мл). Эти

ш

светозависимые колебания ССа ] возникают после выброса иона из ЭПР или(и) вакуоли, но не из митохондрий. В то время как ьнешний кальций лишь модулирует параметры осцилляций. Фитохром-завйсимая активация синтеза ФИФг, указывает на возможность сопрязкенмя, по крайней мере, К-опосредованных осцилляций ССаг+]ц с /Ш-метаболизмом в протопластах овса.

Практическое значение работы. Полученные результаты представляют интерес для специалистов, работающих в области биофизики Фотобиолитических процессов и физиологии растений, а так же, могут быть использованы в соответствующих курсах лекция для студентов биологических специальностей. Ряд результатов, приведенных в диссертационной работе, вошЭл в монографию И.Д.Болотовекого "Фитохром - регуляторный фоторецептор растений".

Апробация работы. Результаты диссерта! энной работы были доложены и обсуждены на IV Советско-Западно Германском

симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Москва, 1991), Советско-Японском симпозиуме "Зеленение" (Пущино, 1991), VIH" конгрессе FESPP (Антверпен, 1992), II конференции IUBMB "Биохимия клеточных мембран" (Еари, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

ООъДм диссертационной работы. Диссертационная . работа состой-" из введения, обзора литературы, разделов: метериалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, заключение и выводы. Список цитируемой литературы включает G отечественных и 156 зарубежных источников. Работа изложена на iGO страницах машинописного текста, включая 1 таблицу и 39 рисунков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объект и методы исслэдованая.

Исходным материалом для получения протопластов служил первичный лист птиолированных проростков овса (Avena sativa, L.). Р^хп-опластк выделялись из растительной ткани с помощью Ферментативной обработки, с последующей их очисткой от мембранных структур флотацией на градиенте между 0.5 М сахарозы + 0.1 М маннита и 0.5 М гшнита CChae et al., 1990). Подсчёт протопластов проводился по стандартной методике с использованием камеры Горяева. Осмотическая интактность протопластов определялась с помощью дифференциального красителя - метиленового синего (0.3 мМ) и составляла, как' правило, 80£ от общего количества клеток.

Fi качестве стандартной среды инкубации использовался

буферный раствор следующего состава (в мМ): 500 маннита, 2 МеС12, 0.1 ЭГТА, 20 Три с-),! ЕС (рН 7.0). Все этапы выделения протопластов и эксперименты проводились при комнатной температуре и слабом зеленом свете (лампа накаливания 15 Вт, стеклянный фильтр с максимумом пропускания в области 470-^5 км).

Накопление кальция протопластами запускали внесением в стандартную среду, содержащую СаС12 (5 мкКи 45Са2*/мл) в требуемой концентрации, суспензии клеток (5><103 клеток на пробу) и останавливали добавлением в пробирку 5 мл промывочного буфера (содержащего в мМ: 160 КС1, 2 И£С12> 1 ЭДТА, 5 Трис (рН 7.0)), охлажденного .до 0°С. Затем реакционную суспензию наносили на стекловолоконные Фильтры (вР/Р, Иа^п). Осадки на фильтрах промывали таким же количеством промывочного буфера. Фильтры Еысуиивали и помещали во флаконы, содержащие по 5 мл сцинтилляционного коктейля следующего состава: 0.2 мМ РОРОР и 30 мМ РГО в толуоле. Удельную радиоактивность проб измеряли на ишдкостно-'йцинтилляцяотом счБтчике Цагк-ПГ (Нидерланды).

Выброс ионов кальция инициировали внесением обогащенной 45Са2+ суспензии протопластов в Сескальциевую. стандартную среду. Обогащение проводилось инкубацией клеток в среде, содержащей 200 мкМ СаС12 <5 мкКи 45Са2+/мл) при 22°С в течение 20 минут. Остановку реакции (промывочный буфер содержал вместо 1 мМ ЭЯГА 5 мМ С"012) и измерение радиоактш чости образцов проводились как и в случае накопления кальция.

Для оценки влияния фитохромной системы растительной клетки на процессы накопления и выброса Са2+ протопласта предварительно облучали К- (1 мш., 55 утоЬл""2), ДК-светом (3 мин., 25 цггю1-м~2) либо их чередованием (К/ДК). Для этого

использовались лампа накаливания (25 Вт) и интерференционные светофильтр« с Лтах пропускания - 667 и 730 нм, соответственно.

Сменку включения радиоактивной мотки в мембранные фосфолипиды протопластов (5*105 кл/мл) осуществляли с помощью 15 мМ КН2Р04 (200 мкКи 32Р/мл, 60 минут инкубации) в стандартной среде, либо с помощью 0.25 мМ АТФ (50 мкКи ГГ-32РШФ/мл, 30 минут инкубации). В случае [у-32Р]ЛТФ) метку вводили с помощью предварительной нитрогенной кавитации протопластов (давление 20 кгс/см2, при 0°С в течение 20 мин.). .Выделение фракции кислых фосфолипидов проюдилось по методу Ирвина [1гу1п е1 а1., 1984]. Их хроматографическое разделение осуществлялось на пластинах К1е1зе]^е1 СО нанесением 100 мкл экстракта фосфолипидов. После радиоавтографическоя идентификации фракций пятна фосфолипидов соскабливали и определяли удельную радиоактивность образцов как и в случае 45Са2+-исследований. Влияние фитохромкой системы на метаболизм фосфоиноэитидов протопластов оценивалось при предварительном облучении суспензию клеток К-, ДК-светом в течение 5 минут.

Измерения цитоплазматической концентрации Са2+ проводились с помощью Саг+-ч.увствительного флуоресцентного зонда -квин-2 (его мембранпроницаемого аналога, квин-2АМ) СТв1еп е1 а1., 1982аЫ. Для этого 3 мл суспензии клеток (3*106 кл/мл) инкубировались с красителем (конечная концентрация 25 мкМ) в стандартной среде (без ЭГГА) при 20"с в течение БО-гбО мил при постоянном перемешивании [С1те et а1., 1990], после чего краситель дважды отмывали центрифугированием в стандартной среде (без ЭГГА). Измерения интенсивности флуоресценции проводили на ■ лазерном спектрофлуориметре (Ин-т биофизики

клетки РАН, г.Пущино). Свет возбуждения флуоресценции генерировался азотным лазером (Х=339 нм), а излучение регистрировалось при Х=495 нм. Облучение суспензии протопластов К-, ДК-светом осуществлялось через стекловолоконгаШ световод с помощью выше указанных светофильтров и лампы накаливания (100 Вт).

Концентрация ионизированного кальция в растворе, рассчитывалась по алгоритму для металло-:юнного Ca2+-Mg2+-3I1A буфера [Fabiato, Fablato, 1979]. В расчбтах использовались константе, заимствованные из работы [Chljsen et al., 1984J.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

О i

Влияние К-. ДК-сБета на транспорт Са через плазмалемму протопласта. Отдельные сведения о способности К-света модулировать транспорт Саг+ через наружную мембрану растительнойклетки был;; известны ещЭ до начала выполнения настоящей работы [Dryere, tfeisenseel, 1979; Hale, Roitx, 1580; Das. Sopory, 19S5], но эти.данные противоречили друг другу в оценка направленности фитохром-нндуцированных потоков кальция через мембрану клетки. В связи с этим представлялось важный исследовать кинетжу накопления и выброса иона протопластами и влияние на наО К-облученйя, а так ко фотообратимость этих процессов ДК-сб9т0!«. Оказалось, что накопление Саг+ темповыми протопластами описывается кривой, которая выходит на плато почти сразу Ев после внесения суспензии клеток в среду инкубации. При этом, у предварительно облученных красным светом протопластов проявляется Солее выра энная способность аккумулировать этот ион, в отличии от темнового контроля

Содержим« Со**, X

О 10 20 50 «О

Рис.1. Кинетика накопления (А) и выброса (Б) ионов кальция темновыми (1) и К-облучённшда (2) протопластами в стандартной среде инкубации. За 100% принято накопление (Л) (относительное содержание, Б) Са Т-обраэцэми за 70 ГО") мин. .

кривая накопления достигает плато лишь к 10 минуте инкубации (рис.1,А). На втом же рисунке представлена кинетика выброса Са2+ (рис.1,Б). Наблюдается практически прямопропорциональная зависимость выброса иона ■ темновнми образцами. Наоборот, в

. Содержание Со", X _

Накопление Со*. X

г4

Г+1

Рис.2. Влияние К- и ДК-облучшия на накопление (А, 20 мин) и выброс (Б, 1 мин) Са этиолированными протопластами овса в стандартной среде инкубации, т - темповой контроль (100%).

случае К-облучбнных протопластов клетки активно освобождаются

от кальция в течение первых минут инкубации, а после 5-ой минуты содержание иона в них выходит на стационарный уровень, превосходящий по величине [Саг+] темпового контроля. Рисунок 2 демонстрирует влияние К-, ДК-света на аккумуляцию и выброс ионизированного кальция протопластами. Наблюдаемае активация этих процессов K-облучением и подаапение ДК-светом указывает на регуляцию фитохромом проницаемости плазматической мембраны к ионам кальция. Следовательно, противоположные по . своему результату процессы накопления и выброса Са2+ находятся под контролем активной формы фитохрома <РДК)-

Ингкбиторный анализ эффективности аккумуляции Ca2* протопластами. В плазматической мембране растительной клетки установление существование, по йрайней мере, трЗх Са2+-транс-портирующих систем: Са2+/Н+-обменника [DuPont et al., 1990; Kasal, Muto, 1990], Саа+-каналов [Hetherlngton et al., 19923, Са2+-АТФазы CBrlskln, 1950; Kasal, Muto, 1991]. Кроме них в

Таблица 1. Схема анализа участия Ca2 ^-транспортирующих систем плазматической мембраны растительной клетки в накоплении ионов кальция протопластами овса.

Ca2 -транспортирующие системы плаз-малеммы Условия инкубации

Верапа-мил 10 мкИ На3704 100 мкМ NaCl 50 мН pH 6. 0

Са2+-канг ч. - + ¡f +

Са2+-насос + - + +

Са2+/Н+-обменник + + + -

Са2+/На*-огменник + + - -

плазматической мембране'растительной клетки возможно присутст-

вив и Ма*/Са2+-обмешшка, который обнаружен в плазмалемме клетки животных организмов СВауегс1огГ/ег еХ. а1., 19В5; Такиш а1., 1985]. С помощью избирательного ингибирования выше перечисленных Са2+~транспортирувдих структур плазмалемш протопласта создавались оптимальные условия для функционирования каждой из них в отдельности (таб.1).

При изучении влияния величины рН внешней среды на аккумуляцию Са2+ темповыми и К-облучЭнными протопластами было установлено, что последние более активно накапливали ионы кальция в кислой области рН (от 5.0 до 7.0) в отличии от первых (рис.3,А). В щелочном же диапазоне значений рН '7.25-7.5) аккумуляция Саг+ теиновыми протопластами достигала

* Б

Ижспмии, Се1', X

Нодолом Со**, X СЗ? СЭк сам

Г»

Рис.3. Влияние рН среда на накопление (А) Са2* темповыми (1)„и К-облучбнными (2) протопластами; аккумуляцию (Б) Са-темновыми (Т), К- и ДК-облучйшшми протопластами в стандартной среда инкубации, содержащей в мМ: О.1 Ыа.ТО,, 50 НаС1, 0.01 верапамила, время инкубации 20

^ 4 о.

мин. За 100$ принят уровень накопления Са' при рН 7.0. (А) и 6.5 (Б).

г+

Т-образцами

уровня К-оОлучбшшх клеток, благодаря возникавшему градиенту рН на плазмалемме (рН цитоплазмы 7.0-7.2 [Трофимова, 1992]), который обеспечивает накопление иона по механизму

Са2+/Н+-обмена СКазз1, Ми1;о, 1990]. Иными словами, исчезало влияние К-света. При оптимальных условиях для функционирования Саг+/Н+-обметшка (состав среды см. в таб.1) фитохромная регуляция его активности не наблюдалась (рис.3,Б).

На рисунках 4,АБ представлены зависимости накопления и выброса Са2+ протопластами от концентрации Ма+ в среде. Как вкшю из рисунков эффективность аккумуляции и выброса ионов

Рис.4. Зависимость накопления (А, 20 мин) и выброса (Б, 1 мин)

Са2+ темнотами (1) и К-облучбнными (2) протопластами от концентрации МаС1 и стандартной среде инкубации. За 100% принято накопление (А) и относительное содержание

(Б) Са2+ в Т-образцая при (НаС13 - 100 мМ.

кальция К-облучРшмми клетками резко меняется в области концентраций На* 2+5 мН. Наоборот, у теиновых протопластов либо нет никаких изменений в содержании Са2+ (выброс, рис.4,б), либо нр^лядостся постепенный рост накопления иона (рис.4,Л). Таким образом, К-индуцированный транспорт ионов кальция через плазмалемму модулируется величиной концентрации наружного На+, чт-1 предполагает участие в регулируемом фитохромом транспорте, Са2+ На+/Саг -обменника. Это

I

подтверждается результатами экспериментов по избирательному

ингиОирошнию всех Са2^-транспортирующих систем плазматической мембраны, кроме На+/Саг+-антипортера (рис,5). В этих условиях зарегистрирована более высокая Саг+-аккумулирующая способность (на 20%) К-облучённых протопластов, чем темнового контроля. Уровень накопления Са2 + темновнми и ДК-облучйнным протопластами практически совпадал, что свидетельствует о возмоаной, модуляции активности На^/Са^-обменника фитохромом. Вторым фактом в пользу вывода о фитохромной регуляции На+/Са2+-антипорта является исчезновение эффекта К-облучения

Рис.5. Влияние КС1 и NaCl на накопления Са темповыми (Т), К- и ДК-оолучйншши протопластами в стандартной среде, содержащей в мм: 0.1 fia^V0<( 0.01 ве-

J 4

шпамила, при рНб.О. За ЮОЖ принят уровень накопления Са2 е темповыми метками в присутствии 50 Mil К01 (20 мин).

на аккумуляцию этого иона при внесении в среду инкубации МаСЛ (50 мМ).

В литературе существует ряд косвенных указаний на участке ¡сальциевых каналов в фитохром-регулируемых физиологических

V

процессах, например, К-индуцированное набухание протопластов пшеницы, подавляемое ингибиторами кальциевых каналов - верапа-милом и La3+ [Tretyn et al., 1991 J. В настоящей работе была предпринята попытка выяснения участия Са2+-каналов в К-индуцировашюй аккумуляции Са2+ протопластами овса (рис.6,А). При подавлении всех других транспортных систем илазмалеммы кроме Са2,"-каналов (см. таб.1) степень накопления

Накопление Со X

Г*

гЬ

гЬ

гЬ

Са2* . как тешюшми, так и К- и ДК-облу-'гннш/.и клетками практически не меняется. Внесение та в среду инкубации верапамила (Ю мкМ) приюдит к незначительному уменьшению степени аккумуляции ионов кальция темповыми и ДК-облучбнными клетками (Ю-Нб!!) и резкому падению е5 величины для К-облучбн-ных протопластов (на 40:5), т.е., фитохромная система клетки увеличивает чувствительность Саг+-каналов к действию верапамила, но не стимулирует накопление Саг+ но канальному механизму.

Данные, представленные на рисунке 6, Б, отражают роль Са2+-насос.а плззмалеммы в фитохром-зависимом накоплении ионов кальция протопластами. Как видно из этого рисунка, при оптимальных для функционирования Са2,-АТФээы условиях красный свет вызывает резкое снижение (на 63%) Са2+-аккумулирующей способности протопластов по сравнению с темновым контрэлем.

Накоплена Си' *. К

г!

□ I СП* ЕЯ«

Я

л

У- > Й

т

I

Накопление Са**, X

ь

С=) г СЗ к КЗ як

верагизмил

Рис.в. апняние-верапамила (А) и Иаэ'»'04 (Б) па аккумуляцию Саг +

темповыми (Т), К- и ДК-облучбнними протопластами в стандартной среде, содержащей в чМ: А - 50 МаС1, 0.1 МаэУОл, 0.01 верапамила, рН 6.0;

Б - 0.01 верапамила, 50 ЫаС1, 0.1 Ма^'О^, рН 6.0. За

100% принята величина накопления Са клетками в среде без ингибитора (20 мин).

темношми

Допрлнительное внесете в среду инкубации ортованадата натрия (100 мкМ) приводило к нивелированию К-эффекта. В случае темновых и ДК-оОлучбнных образцов этот ингибитор АТФаз не оказывал практически никакого влияния на процесс аккумуляции Саг* клетками. Учитывал отрицательный (уменьшение урогня накопления) Бклад Саг+-насоса в фитохром-опосредованное накопление этого иона протопластами, моено сделать вывод о его активации фоторецептором скорее при выбросе Саг+ из клетки, чем при аккумуляции его.

Таким образом, проведенный айализ показывает, что фитохром активирует Ни+/Саг+-оОменник и Саг+-насос, ко не Саг+/Н+-обкенник и Саг+-каналы.

Влияние К-, ДК-облучбния на цитоплааматическую концентрацию ионов кальция. Существуют экспериментальные данные, указывающие lia цитоплазматическую локализацию фитохрсыа в клетке (до 9036) [Pratt, 19863, но при етом некоторая часть белка способна ассоциироваться с внутриклеточными оргаиеллами [Serlln, Roux, 1986; Roux, 19873. Поэтому, есть все основания предполагать возможность влияния фитохрома на Caz+ проницаемость мскбран клеточных оргакелл, что и побудило нас к-изучению действия К-, ДК-облучения на цитоплазматическую концентрацию кальция в протопласте. Опыты, проведенные с помощью флуоресцентного зондирования, показали что К-облучение суспензии клеток в кальций содержащей среде (2 мМ) вызывало спустя 8*10 с синусоидальные синхронные колебания ССа2+.ц, амплитуда и частота которых варьировала в диапазоне 51+150 нИ и с 0.017+0.05 с-1, соответственно. Выключение К-света сопровождалось прекращением кальциевых осцилляция с 5т7-секундной

лаг-фазой (рис.?,А). ДК-облученне вызывало аналогичный по величинам амплитуды (4СН-80 нМ) и частоты (0.025-Ю.05 с"1) осцилляции ССа2+1ц в протопласте. В кальций- дефицитной среде инкубации (il0"6 U) К- и ДК-свет также индуцировали в клетке Са2+ осцилляции (рис.7,Б). В данной случае, в отличии от кальций-содеркащей среды, колебания [Са2+]ц характеризовались невысокой амплитудой (=11 нМ) и высокой частотой (=<3.13 с-1), на фоне более низкой (120 нМ) [Са2+] в цитоплазме. Учитывая, что фотоиндуцированные осцилляции возникают и в практически бескальциевой среде, можно полагать, что их причиной является выброс Са2+ из внутриклеточных депо, а вход иона извне

Со

к Вьщ.ДК ЦаК Ььвд.

I II III

£ МИН

К ÎMM.AK fetK*. К M*-

.I ! ! M . I

Рис.7. Влияние К-, ДК-облучения на интенсивность флуоресценции комплекса квин-2/Сяг+ в цитоплазме, протопласта в среде инкубации, содервсащей в мУ: 600 маннита, 2 MgClz,

20 HEPES (рН 7.0), 6*105 КЛ/МЛ. А - 2х10-3 M СаС1„. Б - «Ю-6 U Са2+.

модулирует параметры колебаний ССа2+Зц. Как видно из рисунка 7, ответы всех клеток суспензии синхронизированы, в ином случае регистрируемый сигнал представлял собой суммарный

"шум", т.е., возможно межклеточное взаимодействие, синхронизирующее ответа протопластов на действие облучения. Как известно, критическим фактором для межклеточной сигнализации

[Са").. пч

РЫКА

к !

cea, | . ¿-¡л^

|Са" )„ пМ

II |

ICs"j, г,Ы

—'«¿ÍBi

T

tai" L гм

еыкл.

Рис.8. Зависимость характера проявления К-, ДК-индуцированных

Са2+ осцилляция в цитоплазме протопласта от конценттция клеток в среде инкубации (состав среда г-м.

рис.7). А - Ю4 кл/мл, В - 2*104 кл/мл, С - 2хЮ5

кл/мл, О - 5*Ю6 кл/мл.

является расстояние между клетками [Меуег, 1991; Oslpchuk,

Cahalan, 19923. На основании этого, нами были проведеА эксперимент!! по индукции К-, ДК-светом Са2) осцилляция при различных концентрациях клеток в среде (104, 2*104, 2х105, БхЮ5 в мл; рис.8, А, В, С, D). Из представленного рисунка видно, что, в случае концентраций ниже 5х105 кл/мл (рис.8. А, В, С) К- и ДК-сбут Еызнвал низкочастотные (0.00Э±0.0009 с-1), самозатухашие колебания [Са2+Зц, которые нэ косили синхронного характера. В силу этого, можно предположить, что концентрация 5хЮ5 кл/мл (рис.8,D), а, следовательно, и расстояние =100 ик.ч между клетками являются достаточными для синхрони- ■ зации фотоиндуцированних Са2+ осцилляция [Кеуег, 1991; 0з1р-chiik, Catalan, 19923.

Из приведению: результатов следует, что и 1С-, и ДК-свет ьызннзкт концентрационные осцилляции цитоплазматического Саг+ в протопластах овса. Поскольку. ФотооОратимость К-еффоктов ДК-светом не наблюдалась, мои го думать, что Са2+ осцилляции вызываются очень низкими концентрациями активной формы фитохромэ, образующимися даже при действии ДК-облучения на растительную клетку CLissimore, Quail, 19S83, или обусловлены взаимодействием фмтохрока и фоторецептора нефитохромной природы [Nlshlzakl, 19923.

Ингибиторный анализ Са2"*" ссцилляций в цитоплазме протопластов. Для определения природы депо, кз которого выходят ион;; кальция, участвующие в осцилляциях использовались: олчгоминин и ротенон - ингибиторы активности митсдаэндрий, этилизопропиламилорид (ЕКФА) - ингибитор WaVn+-o6Mei:HHK8 плазмчтнчпекой мембраны, Na;)VOjl - олокатор транспортных А'ГРаз, в том числе и Ca2t-nacocoB тонопласта, плазмалеммы и мембран

ЭПР и 2,5-дитерт-бутил 1,4-бензогидрохинон (гиВШ) - вдзывает мобилизацию Са21" из ЭПР (эффектор Са2+-насоса ЭПР). Рисунок 9 демонстрирует нечувствительность К-индуцированных Са2* осцилляция к внесению в Са2 ^-содержащую среду (2 мЦ СаС12) олигомицина и ротенона (2 икг/мл). Добавлений же гиВН!} (60 ыкМ) приводит к заметному снижению концентрации цитоплазмати-ческого Са2+ (на 100 нУ), и нарушению ритма Сай+ осцилляций, который восстанавливается спустя 1.5 ьшнути. Внесение в среду инкубации ортованадата натрия (100 мкМ), на фоне ДК-индуцированных Са2* осцилляций, спустя 5 минут необратимо подавляло способность протопласта к фотоиндуцировацным колеба-

[Са% пм к

®С0г | 1иВНО

. EifA ДО*.

\ I |4К '

ftotenone OilooroycSn

г min

Рис.9. Влияние различных ингибиторов на фотоиндуцирсшшше

осцилляции Са21 в цитоплазме протопласта овса. Среда инкубации (состав см. в подписи к рис.?) содержит 2 мУ

СаС1,. Концентрация клеток в суспензии - 5*10ъ в ил.

ниям [Са2+.(ц. Вероятнее всего ортованадат, связываясь с каталитическими суО'чздиницами Саг+-АТРаэ плазмале;.:ш, тоноплас-а и ЭПР, ингкбирует их, результатом чего является нарушение механизма осцилляций в целом. Влияние ингибиторов (кроме ЕИФА) ни проявление К-индуцированных Са2+ осцилляций в цитоплазме протопластов при дефиците Са2+ (^ 10~б И) в среде инкубации

било таким не, как и при избытке иона. Единственное отличЙе заключалось в отсутствии необратимости действия ортованадата на светозависимые колебания ССа2+] .

Таким образом, фотоиндуцированные Са2+ осцилляции обусловленны выбросом иона из ЭПР и, возможно, вакуоли (эффект гиВТО), а не из митохондрий. Кроме этого, в реализации колебаний ГСа2+]ц задействованы Са2+-насосы прежде всего мембран ЭПР, а также тонопласта и плазмалеммы протопласта.

Сопряяение Са2+ осцилляция с метаболизмом полифосфо-инозитидов в растительной клетка. Последние исследования в области фитохромного контроля метаболизма полифосфоинозлтидов проводились либо In vitro на гомогенатах листьев, либо ln vivo, при регистрации косвенных эффектов (набухания протопластов; [Tretyn et al., 19911. Поэтому, для приближения экспериментов к условиям In vivo, метка вводилась инкубацией суспензии темноЕых протопластов с натриевой или калиевой солью фосфорной кислоты (200 мкКи/мл). При этом, практически вся

Синтез fH4>,. %

Т Рис.10. Влияние К—, "Л ДК-облучения на степень,,» включения эгР ([у-Э2Р]К2НР04,' 200

мкКи/мл, в течение 1 ч.) в ШФ

протопластов

(5*105 кл/мл). За 100Ж принята степень включения метки в необлучбнные клетки. Т - темновой контроль.

-ь

2 овса

К/ск

радиоактивность распределялось мезду фосфатидилиноэит 4.5-бифосфатом (<М5>г) и мажорнымп фосфолипидами мембраны:

фосфатидилхолином, фосфатидилсерином, фосфатидилэтанолаиинок, а включение 32Р в фосфатидилинозит (ФИ) и фосфатидилииозит 5-монофосфат (ФИФ) было следовым. Предварительное К-облучВнние протопластов приводит к усилению синтеза ФИФ2 на ЗЭЖ (рис.10). ДК-евет, наоборот, частично подавляет етот процесс. К такому же аффекту приводит ДК-облучение, проведенноо сразу Ее после К-освещения. И, наконец, .чередование облучения в следующем порядке: ДК/К, сопровождается активацией синтеза.ФИФ на 1БЖ. Таким образом, свэт, приводящий к образованию активной Рдк-форш фитохрома, стимулирует синтез фосфатидиллнознтди-фосфата, что является отражением активации его гидролиза на ИФЧ и ДТ [Роо\'а1аП, ИесШу, 1987]. Иояшо, поэтому, предполагать, что реализация, по крайней мере, К-индуцирован-ных осцилляции [Са2+]ц в растительной клетке сопряжена, в определённой степью, с активацией фосфоиноэитвдного цикла.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И БЬЭОДЫ

1. Установлена кинетика транспорта ионов кальция через пдазматкчэскую неыбрану втиолироваших протопластов овса и влияние на кэб красного света.

2. Г.'ока^ано, что накопление и выброс Са2+ • протопластами контролируются фитохромчоЯ системой растительной клетки.

3. Впервые обнаруа^н светозависимый Ма+/Саг+-обмен через плазматическую мембрану протопласта овса.

4. ПроЕедбн с- "чшинг возможных механизмов трансмемОрашк.ш . переноса ионов кальция, показавший зависимость активности

На+/Са2+-обменника и Са2+-АТФазы плазматической мембраны протопластов от состояния фитохрома в клетке.

5. Впервые установлено, что облучение этиолированных протопластов красным и дальнекрасным светом вызывает осцилляции цитоплазматнчэской концентрации ионов кальция, синхронность которых зависит от концентрации клеток в среде.

Триггерам осцилляция ССаг+3 является выброс Са2+ из внутриклеточных кальциевых дело, а не поступление иона в клетку извне. Присутствие Са2+ во внешней среде модулирует параметры осцилляции.

7. Анализ с использованием ингибиторов показал, что Ca2f осцилляции обусловлены выходом Са2+ из ЭПР и вакуоли, но не из митохондрий.

3, Для протопластов этиолированных проростков овса впервые показана активация красным и ингибировяние дальним красным светом синтеза ФИФ .

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Sokolovsky S.G., Volotovskl I.D.' Phytochrome-dependent Ionic permeability of the plasm membrane of plant protoplasts //Abst. of IV Sovlet-FRG Symp. "Receptors and Ion channels", Moscow. 1991. P. 38.

2. Соколовский С.Г., Ховратович в. И., Волотовский И.Д. Влияние фитохрома на транслокацию ионов кальция через' мембрану протопластов этиолированных проростков овса //Докл. АН БССР. 1Э91. Т.XXXV, »12. С.1134-1136.

3. Volotovskl I.D., Sokolovskl S.G., Khovratovlch V.I. Influences of reel Illumination on Са2' p*?Tmeablllty of the i>las-ma membrane of the oat protoplasts //Abstr. of 8th Congress of l'EPPl', Antwerpen. 1992. P.21.

4. Соколовский С.Г., Никифоров В. Л., Зинченко В. П., Волотовский И. Д. Кальциевые осцилляции в цитоплазме протопластов, индуцированные красным и дальнекрасным светом //Докл. РАН. 1992. Т. 327. «¡3. С. 409-412.

5. Volotovskl I.D., Sokolovsky S.G. Possible role oi phyto-chrome In Caz+ translocation across oat protoplast plasma membrane //Photosynthetlca. 1992. Vol.26, N4. P.541-549.

6. volotovskl I.D., Sokolovsky S.G., Nlkllorov E.L., Zlnchenko V.P. Calcium oscillations In plant cytoplasm Induced by red and far-red light Irradiation //J. Photochem. Photoblol. 1993.

7. Ховратович В.И., Соколовский С.Г., 11'ейко Л.II., Волотовский И. Д. О-влиянии красного' света на метаболизм фосфоинозитидов в мембранах растительной клетки //Физиол. Раст. 1993.

8. Volotovskl I.D., Sokolovsky S.G,, Nlklforov E.L., Zlnchenko V.P. Llgnt-lnuuced Ca2+ oscillations In cytoplasm of oat protoplasts //Abat. of 2nd IUBHB Conference "Biochemistry of Cell Membranes'*, Barl. 1993.

Подписано г. печати AO. 00 93 г. Формат 6GxB41/16 Усл. печ. л. iTii£JiiiK 400 зкаБесплатно.Заказ КПП Госэкоиолшланд Республики Беларусь.