Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболизм циклического гуанозин-3',5'-монофосфата в растительной клетке. Связь с процессами внутриклеточной сигнализации

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм циклического гуанозин-3',5'-монофосфата в растительной клетке. Связь с процессами внутриклеточной сигнализации"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ГНУ «ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ»

УДК 577.344

ДУБОВ СКАЯ Людмила Вячеславовна

МЕТАБОЛИЗМ ЦИКЛИЧЕСКОГО ГУАНОЗИН-З ¿'-МОНОФОСФАТА В РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКЕ. СВЯЗЬ С ПРОЦЕССАМИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск-2004

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии клетки ГНУ «Институт фотобиологии HAH Беларуси»

Научный руководитель - доктор биологических наук, академик HAH

Беларуси, профессор

ВОЛОТОВСКИЙ ИГОРЬ ДМИТРИЕВИЧ (ГНУ «Институт фотобиологии HAH Беларуси», лаборатория молекулярной биологии клетки)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

КРИЦКИЙ МИХАИЛ СЕРГЕЕВИЧ (Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, лаборатория эволюционной биохимии)

доктор биологических наук ШЛЛЫГО НИКОЛАЙ ВЛАДИМИРОВИЧ (ГНУ «Институт фотобиологии HAH Беларуси», лаборатория биофизики и биохимии растительной клетки)

Оппонирующая организация - Белорусский государственный университет

Защита состоится «21» июня 2004 года в 14°° часов на заседании Совета по защите диссертации (Д 01.37.01) в Институте фотобиологии HAH Беларуси по адресу: 220072, Минск, ул. Академическая, 27. Телефон ученого секретаря -284-28-88, факс 284-23-59, e-mail: ipb@biobel.bas-net.by

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии HAH Беларуси

Автореферат разослан « {(/» 2004 года

Ученый секретарь

Совета по защите диссертаций,

кандидат биологических наук, доцент

Л.Ф. Кабашникова

бшез

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертации

Хорошо известно, что в роли вторичного медиатора в регуляции метаболиз-животных организмов выступает циклический гуанозин-3',5'-монофосфат (цГМФ). Недавно были получены косвенные свидетельства участия цикломоно-нуклеотида в ряде важных регуляторных процессов в высших растениях, базирующиеся на функциональных ответах клетки. Однако в настоящее время трудно оценить физиологическую значимость многих ответов растений на действие цГМФ, поскольку внутриклеточная концентрация цГМФ пока достоверно не оценена, механизм его действия не изучен, а вопрос о функционировании системы метаболизма цГМФ не разрешен.

Известно, что в поддержании эндогенного уровня цГМФ в животной клетке принимают участие ферменты его анаболизма и катаболизма - гуанилатцшслаза (ГЦ) и фосфодиэстераза (ФДЭ) соответственно. К сожалению, о содержании, локализации и функционировании данных ферментов в растительной клетке информации мало. Имеются лишь отдельные работы, в которых определена удельная активность ГЦ и ФДЭ в растениях. Более того, в отличие от животных, растительные гены, кодирующие ГЦ и ФДЭ, пока не расшифрованы и не клонированы. Данные о физиологической роли ферментов метаболизма цГМФ в растительной клетке и их возможном участии в процессах сигнальной трансдукции в растениях также отсутствуют, а механизм действия гуанозинцикломононуклеотида на молекулярном уровне совершенно не изучен. Следовательно, представлялось важным исследовать систему метаболизма цГМФ в растительной клетке и ее участие в таких процессах сигнальной трансдукции в высших растениях, как передача светового и фи-тогормонального сигналов.

Связь работы с научными программами

Диссертационная работа выполнялась в рамках Государственной программы фундаментальных исследований по теме «Циклические мононуклеотиды - вторичные медиаторы процессов внутриклеточной сигнализации в растениях» № ГР 20015172 (2001-2005 гг.) и гранта Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований по теме «Метаболизм цГМФ в растительной клетке» № ГР 2022723 (2002-2004 гг.).

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы является характеристика системы метаболизма цГМФ в проростках овса, а именно, определение кинетических параметров ферментов синтеза и распада цГМФ - ГЦ и ФДЭ соответственно, установление возможного модулирующего действия фитохромной и фитогормональной регуляторных систем на активность этих ферментов, а также оценка связывающей активности цГМФ структурными компонентами субклеточных фракций.

Поставленная цель включает решение следующих задач:

- Оценить эндогенную концентрацию цГМФ в тканях растений и его возможное участие в трансдукции внешних сигналов. __

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА , С. Петербург I 800 уР К_|

2004-4 11255

ма

- Изучить локализацию в клетке и основные характеристики ферментов метаболизма цГМФ.

- Исследовать влияние G-белков и системы Са2+/кальмодулин на активность ГЦ и ФДЭ.

- Выяснить возможность регуляции ферментов обмена цГМФ светом и фи-тогормонами.

- Оценить связывание цГМФ растительными клеточными компонентами и исследовать различные субклеточные фракции на присутствие цГМФ-связывающих центров.

Объект и предмет исследования

В качестве основного объекта исследования выступали первичные листья проростков овса (Avena sativa L.), а также листья ячменя (Hordeum vulgare L.), пшеницы (Triticum aestivum L.) и табака (Nicotiana plwnbaginifoliä). В работе использовали экстракты растительной ткани, протопласты и изолированные фракции растительных клеток. Предметом исследования в данной работе было изучение системы метаболизма цГМФ в растениях и ее участия в процессах трансформации внешних сигналов в растительной клетке.

Гипотеза

Выдвигается предположение о том, что в растительной клетке функционирует система цГМФ, сходная с системой, охарактеризованой в клетках животных и совершенно не исследованная в растительной клетке. Предполагается, что механизмы синтеза и деградации цГМФ в растениях и животных одинаковы, поэтому в растениях также должны быть представлены гуанилатциклазная, цГМФ-гидролизующая фосфодиэстеразная и цГМФ-связывающая активность. Система метаболизма цГМФ, вероятно, играет в высших растениях ключевую роль в передаче, по крайней мере, световых и фитогормональных сигналов.

Методология и методы проведенного исследования

В работе использовались седиментационный, хроматографический и элек-трофоретический методы разделения биологических компонентов и радиоизотопный, радиоиммунологический и спектрофотометрический методы анализа.

Научная новизна полученных результатов

Работа является первым исследованием роли света и фитогормонов в регуляции активности ферментов метаболизма цГМФ в высших растениях. Полученные результаты подтверждают возможность применения к клеткам проростков овса цикломононуклеотидной концепции реализации биологического действия данных стимулов, подразумевающей участие цГМФ в качестве вторичного посредника.

Показано, что в клетках проростков овса присутствует функционально активная система метаболизма цГМФ. Установлена ее функциональная связь с фо-томорфогенетическими рецепторами высших растений. Активность ферментов обмена цГМФ в проростках овса и, следовательно, концентрация цГМФ, модулируются красным и синим светом, адресованным фитохрому и криптохрому соответственно. Показана обратимая регуляция активности ГЦ и цГМФ-

гидролизугощей ФДЭ этиолированных проростков при освещении их красным / дальним красным светом, поглощаемым фитохромом. Получены также данные, свидетельствующие об участии указанных ферментов в процессах фитогормо-нальной регуляции. Показано участие О-белков и системы Са2+/кальмодулин в регуляции синтеза и деградации цГМФ в растениях.

Совершенно новыми являются данные о цГМФ-связывакнцей активности в растительных субклеточных фракциях. В клетках проростков овса обнаружены центры специфического связывания цГМФ белковой природы, сродство которых к цикломононуклеотиду контролируется Са2+, кальмодулином, гуанозинтрифосфа-том (ГТФ) и светом, по всей видимости, с участием фитохрома.

Практическая значимость полученных результатов

Полученные данные расширяют существующие представления о процессах трансформации внешних сигналов в растительной клетке, в частности, о транс-дукции фитохромного и фитогормонального сигналов. Результаты диссертационной работы имеют практическое значение и являются важными для понимания и дальнейшего изучения механизмов фотоморфогенеза как основы онтогенеза высших растений. Биохимические параметры системы метаболизма цГМФ могут быть использованы как тест на функциональное состояние растительной клетки. Полученные результаты могут быть использованы в курсах лекций по биофизике, фотобиологии, биохимии и физиологии растений. Кроме того, полученная информация о молекулярных механизмах трансдукции в растениях таких модулирующих сигналов, как, например, биологически активные соединения, фитогормоны и свет, могут использоваться при разработке приемов оптимизации процессов роста и регуляции развития растений, в частности, такой практически важной сельскохозяйственной культуры, как овес.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. В клетках проростков овса присутствует функционально активная система метаболизма цГМФ, представленная мембрано-связанной ГЦ, растворимой цГМФ-гидролизующей ФДЭ и центрами специфического связывания цГМФ.

2. Ферменты метаболизма цГМФ участвуют в процессах световой и фи-тогормональной регуляции в проростках овса и находятся под контролем фитохрома и криптохрома при участии О-белков и системы Са2+/ кальмодулин.

3. В субклеточных фракциях проростков овса представлены центры специфического связывания цГМФ белковой природы, сродство которых к цикломононуклеотиду контролируется Са2+, кальмодулином, ГТФ и светом с участием фитохрома.

Личный вклад соискателя

Экспериментальный материал получен автором самостоятельно. Выбор методов исследований, условий экспериментов, интерпретация результатов и анализ полученных данных проведены при решающем участии автора.

Апробация результатов диссертации

Основные результаты работы были представлены на Международном симпозиуме «Внутриклеточная сигнализация в растительных и животных системах»

(Минск, 2000 г.), TV съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков: Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем (Минск, 2000 г.), Международном симпозиуме «Внутриклеточная сигнализация в растительных и животных системах» (Киев, 2001 г.), Шестой международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» (Москва,

2001 г.), школе-семинаре для молодых ученых Федерации Европейских биохимических обществ (ФЕБО) «Химические зонды в биологии» (Спецес, Греция, 2002 г.), Форуме для молодых ученых ФЕБО (Стамбул, Турция, 2002 г.), Пятом съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск,

2002 г.), школе-семинаре «Клеточная сигнализация», организованной Международной организацией клеточных исследований и Европейской молекулярно-биологической организацией (Шанхай, Китай, 2002 г.), школе-семинаре для молодых ученых ФЕБО «Технология рекомбинантных ДНК и экспрессия белков» (Бухарест, Румыния, 2003 г.), Втором немецко-белорусском симпозиуме «Формирование и функционирование фотосинтетического аппарата» (Эгсдорф, Германия,

2003 г.), Республиканской конференции молодых ученых Национальной академии наук Беларуси «Молодежь в науке» (Минск, 2003 г.).

Опубликованность результатов

По теме диссертации опубликовано 5 статей в научных журналах и 11 тезисов докладов. Общее количество опубликованных страниц - 39.

Структура и объем диссертации

Диссертация содержит оглавление, перечень условных обозначений, введение, общую характеристику работы, основную часть, представленную 6-тъю главами, заключение и список использованной литературы, включающий 378 источников. Работа изложена на 194 страницах машинописного текста, содержит 50 рисунков и 8 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Основным объектом исследования служили первичные листья проростков овса (Avena sativa L., сорт Асилак).

Субклеточные фракции получали методом дифференциального центрифугирования (Финдлей и др., 1990). Плазматические мембраны (ПМ) выделяли из грубой микросомальной фракции согласно методу разделения в двухфазной полимерной системе, разработанному Larsson с соавторами (1987), с некоторыми модификациями. Все манипуляции с растительным материалом проводили при температуре 4° С. Для выделения протопластов из зеленых проростков овса разрезание на кусочки проростки инкубировали в смеси целлюлолитических ферментов, отмывали от энзиматической среды и центрифугировали в ступенчатом градиенте сахарозы при 200xg, 10 мин. Фракцию очищенных протопластов отбирали на границе раздела фаз в концентрации 4,5x106 кл/мл.

Для перевода фитохрома в активную (Фду) и неактивную (Ф„) формы проростки и образцы гомогенатов растительной ткани облучали красным (КС, 667 нм) или дальним красным (ДКС, 730 нм) светом (20 Вт/м2). Образцы облучали также синим светом (454 нм, 0,05 Вт/м2). Интенсивность света измерялась при помощи фотометра РМА 2140 (Solar Light Company, США).

Радиоиммунологическое определение количества цГМФ проводили с помощью набора реактивов РИО-([1251]-цГМФ), разработанного в Институте биоорганической химии НАН Беларуси (Минск). Минимальное содержание цГМФ, измеряемое с помощью набора, составляло 0,05 нмоль/л.

Активность гуаиилашиклазы определяли по скорости образования цГМФ из Мп2+-ГТФ в реакционной смеси, состоящей из 175 мМ Трис-HCl буфера (рН 7,9), содержащего 100 мМ МпС12) 20 мМ теофиллина, 1 мМ ГТФ и 0,06 мг белкового препарата в общем объеме 0,25 мл (Garbers, Gray, 1974). Реакцию запускали внесением белкового препарата и останавливали добавлением 0,25 мл 0,2 M раствора уксуснокислого цинка. К исследуемому образцу добавляли 0,25 мл 0,2 M Na2C03, раствор замораживали, размораживали и центрифугировали. Количество образовавшегося цГМФ в полученном супернатанте измеряли при помощи метода радиоиммунологического определения количества цГМФ.

Определение активности ФДЭ проводили радиометрическим способом по скорости образования меченого гуанозина в реакционной смеси, состоящей из 40 мМ MES буфера (рН 5,5), содержащего [8-3Н]цГМФ (0,1 мкКи), З'-нуклеотидазу (2х10'2 ед.), 5'-нуклеотидазу (1,Зх10"3 ед.), 3,75 мМ р-меркапгоэтанол, 0,35 мМ цГМФ и 0,5 мг белкового препарата в общем объеме 0,2 мл (Chiatante е.а., 1990). Реакцию запускали внесением белкового препарата и останавливали iiyj ем пропускания смеси через колонку, содержащую анионо-обменную смолу Dowex 1X8. Колонку промывали охлажденным 40 мМ MES (рН 5,5), собирали элюат и измеряли радиоактивность полученных образцов. Активность фермента выражали в на-номолях гуанозина, образующегося в результате двух последовательных реакций.

Реакцию связывания [3Н]дГМФ проводили в 0,5 мл смеси, состоящей из 20 мМ Трис-HCl буфера (рН 7,0), содержащего 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ, 2 мМ теофиллин, 10"8-10"7 M [3Н]цГМФ (396 ТБк/моль) и 0,3 мг белка [Gil-man, 1970]. Связывание останавливали перенесением инкубационной смеси с мембранными фракциями на стекловолоконный фильтр GF/F, с цитозолем - на нитро-целлюлозный фильтр В А 85. Промытые и высушенные фильтры помещали в жидкий сцинтилляционный коктейль и измеряли радиоактивность образцов. Все данные были скорректированы на неспецифическое связывание.

Для очистки пГМФ-связываюших белков методом аффинной хроматографии экстракт растворимых белков, содержащий 4,5 мг общего белка, наносили на колонку, заполненную 8-(2-аминоэтил)тиогуанозин-3',5'-цикломонофосфат-агарозой. После промывания колонки связанные белки элюировали 50 мМ глице-рофосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 20 мМ ЭДТА, 15 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 5 мМ NaF и 10 мМ цГМФ, при 4°С в течение 15 часов. Элюированные белки осаждали в 10 объемах охлажденного на льду ацетона, содержащего 10%

(вес/объем) трихлоруксусную кислоту и 0,07% (вес/вес) Р-меркаптоэтанол, и высушивали па воздухе. Фракции анализировали с использованием 10% SDS-гель-электрофореза (Laemmli, 1970). Белки после электрофореза окрашивали серебром (Shevchenko е.а., 1996).

Основные результаты и их обсуждение

Внутриклеточное содержание цГМФ в проростках овса Avena sativa L.

Вопрос о физиологической роли цГМФ в высших растениях пока находится на стадии исследования. Одним из спорных моментов является тот факт, что измеряемая концентрация цГМФ в тканях высших растений существенно ниже, чем в животных системах. Является ли она достаточной для выполнения цикломононук-леотидом медиаторной роли? Для осуществления медиаторной функции цГМФ необходимо выполнение нескольких критериев: 1) цГМФ должен присутствовать в растительной клетке в достаточном количестве; 2) концентрация цГМФ должна изменяться в ответ на стимул, который вызывает биологический эффект; 3) в клетке должны присутствовать ферменты анаболизма и катаболизма цГМФ, а также «мишени» действия цГМФ. Поэтому первоначальной задачей данного исследования явилась оценка эндогенного содержания цикломононуклеотида в растительной ткани.

Рис. 1 дает представление об эндогенном содержании цГМФ в тканях листьев зеленых и этиолированных проростков овса разного возраста. Данные рисунка свидетельствуют о том, что содержание цГМФ в проростках овса находится в обратной зависимости от их возраста: в 2-дневных растениях содержание цГМФ

Рис. 1. Зависимость содержания цГМФ в экстрактах ткани зеленых (1) и этиолированных (2) проростков овса Avena sativa от возраста растения.

Оказалось также, что содержание цГМФ в проростках овса определяется световыми условиями выращивания растений. В ткани этиолированных проростков оно ниже, чем в ткани зеленых растений. Этиоляция зеленых растений (перенос в темноту на 24 часа) приводит к падению содержания цГМФ в ткани практически до значений, свойственных этиолированным растениям. Таким образом, можно считать, что процессы синтеза и распада цГМФ в клетке находятся под

контролем света. Установлено, что эндогенная концентрация цГМФ в проростках овса составляет 2,3-5,3 пмоль цГМФ/г ткани, а внутриклеточная концентрация цГМФ, измеренная с использованием суспензии очищенных протопластов овса, -0,269±0,01 фемтомоль цГМФ на одну клетку.

Активность гуанилатциклазы в проростках овса Avena sativa L.

В табл. 1 представлены данные измерений активности ГЦ в различных субклеточных фракциях, полученных из 5-дневных проростков овса. Хотя ферментативная активность была обпаружена во всех субклеточных фракциях, опыты показали, что наибольшая гуанилатциклазная активность регистрировалась во фракции плазматических мембран (ПМ). Следовательно, можно предположить, что в клетках проростков овса ГЦ содержится преимущественно в мембрано-связанной форме.

Таблица 1

Активность ГЦ (пмоль / мг белка-мин) в различных субклеточных фракциях 5-

дневных про ростков овса Avena sativa L.

активность гуаьшжтциклаЗв!, "" пмоль/мтбелка-мин -* "'г>

ФРАКЦИЯ ЗЕЛЕНЫЕ ; ПРОРОСТКИ ЭТИОЛИРОВАННЫЕ ПРОРОСТКИ'

Грубый гомогенат Осадок 1500g Грубая митохондриальная фракция Грубая микросомальная фракция Плазматические мембраны Цигозоль 1,85±0,10 1,42±0,05 1,29±0,02 1,73±0,06 3,34±0,02 0,75±0,08 0,84±0,03 1,05±0,10 1,11±0Д2 1,28±0,08 1,78±0,03 0,56±0,05

Примечание. Активность ГЦ измеряли при температуре 25иС, рН среды инкубации, равном 7,9, концентрации ГТФ 1 мМ и содержании бежа в пробе 0,06 мг, время инкубации -10 минут.

Начальная скорость реакции, фактически отражающая активность ГЦ во фракции ПМ при оптимальных условиях инкубации, равна 3,3 пмоль/мг белка-мин. Значения кажущихся Кт и Ут для подобранных экспериментальных условий составили: Кт=4,2 мМ и Уш=15,1 пмоль/мг белка-мин, что сравнимо с аналогичными параметрами ГЦ в гомогенатах ткани легких, печени, почек и мозга животных. Активность ГТД практически полностью подавлялась гуанилатциклазным ингибитором ЬУ 83583 в микросомальной (на 97%) и в цитозольной (на 84%) фракциях. Активность ГЦ снижалась под действием ГДФРБ, который ингибирует О-белки в животных тканях, и увеличивалась под действием активаторов в-белков - ГТФуБ и ЫаГ. Следовательно, активность мембрано-связанной ГЦ контролируется в-белками. Значительное активирующее влияние на активность ГЦ оказывал

Са2+-связывающий белок кальмодулин. Отдельно добавленный в среду инкубации Са2+ снижал активность ГЦ на 29%. Обнаружено, что добавление к гомогенатам ткани проростков овса нитропруссида натрия вызывало существенное увеличение активности ГЦ (в 19 раз), что свидетельствует об участии оксида азота в регуляции синтеза цГМФ в клетках проростков овса.

На рис. 2 представлены данные активности ГЦ в гомогенате ткани листьев зеленых и этиолированных проростков овса Avena sativa L. разного возраста. Результаты свидетельствуют о том, что активность данного фермента определяется световыми условиями выращивания растений. В ткани зеленых проростков она выше, чем в ткани этиолированных. К тому же во всех субклеточных фракциях, выделенных из этиолированных проростков, активность ГЦ была более низкой, чем во фракциях, выделенных из зеленых растений (см. табл. 1). Таким образом, можно считать, что анаболизм цГМФ в клетках листьев овса контролируется светом.

г S

W *

ra f¡5 " §

ю

б S ± 3"

i fe 5 §

< X

100

50-

Рис. 2. Зависимость активности ГЦ в гомогенате ткани зеленых (1) и этиолированных (2) проростков овса Avena sativa от возраста проростка.

2 3 4 5 6 7 Возраст растения, дни

Установлено, что активность фермента в проростках овса находится в обратной зависимости от их возраста. В 2-дневных растениях активность ГЦ была выше, чем в 6-дневных (см. рис. 2). Этим обстоятельством можно объяснить более высокое содержапие цГМФ в ткани зеленых проростков по сравнению с этиолированными растениями и его падение с возрастом проростков, что было показано нами ранее (см. рис. 1).

цГМФ-гидролизукицая фосфодиэстеразная активность в проростках овса A vena sativa L.

В таблице 2 представлены данные измерений активности цГМФ-гидролизующей ФДЭ в различных субклеточных фракциях, полученных из 5-дневных проростков овса. Ферментативная активность была обнаружена во всех субклеточных фракциях, однако опьггы показали, что наибольшей фосфодиэсте-разной активностью обладает растворимая цитозольная фракция. Следовательно, можно предположить, что в клетках проростков овса цГМФ-гидролизующая ФДЭ содержится преимущественно в растворимой форме.

Таблица 2

Активность цГМФ-гидролизующей ФДЭ (нмоль / мг белка-мин) в различных суб_клеточных фракциях 5-дневных проростков овса Avena sativa L. _

АКТИВНОСТЬ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ,

нмоль / мг белка-мин

ФРАКЦИЯ „ ЗЕЛЕНЫЕ ЭТИОЛИРОВАННЫЕ

ПРОРОСТКИ ПРОРОСТКИ

Грубый гомогенат 1,06±0,03 1,24±0,02

Осадок 1500g 0,47±0,05 0,71+0,10

Грубая митохоцдриальная

фракция 0,25±0,02 0,57±0,01

1 рубая мшсросомальная фрак-

ция 0,52±0,06 0,53±0,08

Плазматические мембраны 0,96+0,09 0,99±0,06

Цитозоль 1,57±0,18 2,22±0,15

Примечание. Активность ФДЭ цГМФ измеряли при температуре 30°С, рН среды 5,5, концентрации цГМФ 0,35 мМ и содержании белка в пробе 0,5 мг, время инкубации - 40 минут.

Оказалось, что начальная скорость реакции, характеризующая активность ФДЭ в цитозоле, при оптимальных условиях инкубации равна 1,57 нмоль/мг белка мин. Í рафически определенные значения кажущихся Кш и Vm составили для ФДЭ: Кш=0,1 мМ и Vm=0,26 нмоль/мг белка-мин, что хорошо согласуется с уже известными данными других авторов по изучению ФДЭ в высших растениях и сходные с характеристиками ФДЭ в клетках позвоночных.

Зарегистрированная в субклеточных фракциях клеток проростков овса цГМФ-гидролизующая ФДЭ ингибировалась в значительной степени мегштксан-тинами. Было обнаружено некоторое стимулирующее влияние на фосфодиэсте-разную активность кальмодулина. Ионы кальция активировали ФДЭ на 26%. Это означает, что ФДЭ, функционирующая в клетках листьев овса, взаимодействует с системой Са2+/кальмодулин. Добавление к образцам ГТФу8 и NaF сопровождалось снижением фосфодиэстеразной активности. Добавление же ГДФрБ приводило к обратному эффекту. Эти данные дают основание заключить, что регуляция ФДЭ осуществляется, возможно, с участием ГТФ-связывающих белков, но она носит негативный характер.

Рис. 3 дает представление об активности ФДЭ цГМФ в гомогенате ткани листьев зеленых и этиолированных проростков овса Avena sativa L. разного возраста. Данный рисунок свидетельствует о том, что активность фермента в проростках овса находится в прямой линейной зависимости от их возраста: в 6-дневных растениях регистрируется более высокая активность ФДЭ, чем в 2-диевных проростках. Оказалось также, что активность фермента в проростках овса определяется световыми условиями выращивания растений. В ткани этиолированных проростков она выше, чем в ткани зеленых (рис. 3).

л а. '

Ь Р

о Б z т m s

I!

о

•е-

§ ^

i * i g

é 5

— Ю

Рис. 3. Зависимость активности цГМФ-гидролизующей ФДЭ в гомогенате ткани зеленых (1) и этиолированных (2) проростков овса Avena sativa от возраста растения.

Возраст растения, дни

Кроме того, было установлено, что во всех субклеточных фракциях, выделенных из зеленых проростков, активность ФДЭ была более низкой, чем во фракциях, выделенных из этиолированных растений (см. табл. 2). Этим обстоятельством можно объяснить более высокое содержание цГМФ в ткани зеленых проростков по сравнению с этиолированными и его падение с возрастом проростков, что было показано ранее (см. рис. 1). Таким образом, можно считать, что процесс гидролиза цГМФ в клетке находится под контролем света.

Фоторегуляция метаболизма цГМФ в проростках овса

Свет является одним из ключевых факторов, контролирующих функционирование растительного организма. В настоящее время хорошо известна роль рецептора красного/дальнего красного света (КС/ДКС) фитохрома в качестве важного сигнального посредника. Важным доказательством участия фитохрома в фоторегуляции является эффект обратимости КС/ДКС-освещения. Поэтому, для ответа на вопрос, входит ли цГМФ в прямую цепь трансдукции фитохромного эффекта, логично исследовать влияние КС/ДКС-облучения на метаболизм цГМФ в растительной ткани. Также представляет интерес изучение влияния синего света, что позволит получить свидетельство о возможном участии системы метаболизма цГМФ также и в трансдукции криптохромного сигнала.

При облучении 5-дневных этиолированных проростков овса было обнаружено влияние КС и КС/ДКС на эндогенное содержание цГМФ. Как следует из рис. 4, КС вызывает значительный рост концентрации цГМФ, ДКС-облучение не оказывает на нее никакого влияния, а ДКС, использованный сразу же после КС, подавляет стимулирующий эффект.

2 s

L_ X

Ф Ig á а о

ai 5

о

41

321-

• •*>

II

i

Рис. 4. Содержание цГМФ в экстрактах ткани 5-дневных этиолированных проростков Avena sativa (1) И влияние на него КС-облучения (20 Вт/м2, 5 минут) (2), ДКС-облучения (20 Вт/м2, 5 минут) (3), КС/ДКС-облучения (4) и синего света (0,05 Вт/м2,5 минут) (5).

На рис. 4 также отражено влияние синего света на содержание цГМФ в ткани проростков овса. Облучение синим светом приводит к росту содержания цГМФ, что свидетельствует также и о возможном участии цГМФ в трансдукции криптохромного сигнала. Увеличение концентрации цГМФ в ткани при освещении этиолированных проростков КС предполагает активацию ГЦ или ингибирова-ние ФДЭ светом.

Эксперименты по влиянию КС на эндогенное содержание цГМФ, проведенные в присутствии ингибитора ФДЭ теофшшша, указывают на тот факт, что действие света на уровень цГМФ реализовалось, в основном, через ГЦ, а не ФДЭ.

Из рис. 5 видпо, что КС вызывает значительное увеличение активности ГЦ (в 4 раза), а ДКС, использованный сразу же после КС «снимает» стимулирующий эффект, что не происходит, если вместо ДКС используется темнота. Было обнаружено, что и синий свет вызывает активацию ГЦ в клетках проростков овса. Эти данные указывают на то, что в основе фоторегуляции активности ГЦ проростков овса лежит ее взаимодействие не только с фитохромной, но и с криптохромной системой.

-£ 2

л h

¡i

< I

Я 2

A

Рис. 5. Влияние КС-облучения (20 Вт/м2, 10 минут) (2), ДКС-облучения (20 Вт/м2, 10 минут) (3), КС/ДКС-облучения (4) и синего света (0,05 Вт/м2, 5 минут) (5) на активность Щ в гомогена-те ткани 5-дневных этиолированных проростков овса Avena sativa (!)•

Следовательно, полученные данные свидетельствуют о том, что фотоконтроль содержания цГМФ в растительной клетке действительно связан с фотомодуляцией активности ГЦ. Было обнаружено, что ионы кальция ингибировали и активность ГЦ и увеличение гуанилатциклазной активности под действием красного света, чго соответствует теории негативной регуляции между Са2+- и цГМФ-зависимыми сигнальными цепями фитохромной трансдукции.

Однако, как следует из рис. 6, КС вызывает также увеличение активности ФДЭ, ДКС-облучение практически не оказывает влияния, а ДКС, использованный сразу же после КС, подавляет стимулирующий эффект, чего не наблюдается, если вместо ДКС используется темнота. Синий свет также вызывал активацию ФДЭ. Следовательно, фотоконтроль содержания цГМФ в растительной клетке связан также с фотомодуляцией активности ФДЭ. Однако, по сравнению с ГЦ, активность ФДЭ является значительно менее чувствительной к действию света. В то время как ГЦ активируется красным и синим светом в несколько раз, активность ФДЭ увеличивается только на 14-16%, и равновесие между синтезом и распадом цГМФ на фоне света сдвинуто в сторону синтеза: при облучении этиолированных проростков овса наблюдается значительное увеличение эндогенного содержания

цГМФ (см. рис. 1). Таким образом, фотомодуляция активности ФДЭ является, вероятно, вторичной по отношению к модуляции светом активности ГЦ. Возможно, процесс активации ФДЭ светом и, следовательно, гидролиз цГМФ, является отдельной ветвью регуляторной цепи, запускаемой фоторецептором, и служит как механизм обратной регуляции, снижающий концентрацию сигнальной молекулы до предстимуляционного уровня.

Рис. 6. Влияние КС-облучения (20 Вт/м2, 20 минут) (2), ДКС-облучения (20 Вт/м2, 20 минут) (3), КС/ДКС-облучения (4) и синего света (0,05 Вт/м2, 20 минут) на активность ФДЭ цГМФ в гомогенате ткани 5-дневных этиолированных проростков овса Avena sativa (1).

Фитогормональная регуляция метаболизма цГМФ в проростках овса

Важную роль в процессе роста и развития растений играют такие регуляторы их роста как фитогормоны. Поэтому задачей данного исследования было изучение действия таких разных по своему физиологическому эффекту фитогормо-нов, как индолил-3-уксусная кислота (ИУК), 1-нафтилуксусная кислота (НУК), гибберелловая кислота (ГАз), абсцизовая кислота (АБК) и 24-эпибрассинолид (ЭБР), на метаболизм цГМФ в ткани проростков овса Avena sativa L. Было обнаружено значительное увеличение содержания цГМФ под действием всех фитогор-монов в концентрации 10"®М. По степени влияния на концентрацию цГМФ гормоны распределились следующим образом: АБК>ИУК>НУК>ГА3>ЭБР (табл. 3).

Таблица 3

Влияние LY 83583 на стимулируемое фитогормонами содержание цГМФ в гомо-_генате ткани 5-дневных зеленых проростков Avena sativa L._

/ Содержание цГМФ, пмоль/мг белка

ФИТОГОРМОН КОНТРОЛЬ -LY 83583 +LY 83583

ИУК 0,52±0,01 1,66±0,04 1,13*0,02

НУК 0,52±0,01 1,51±0,05 1,27±0,05

ГАз 0,47±0,02 1,46±0,03 1,25±0,04

АБК 0,47±0,02 2,05±0,06 1,20±0,03

ЭБР 0,47±0,02 1,19±0,05 0,73±0,01

. <я -5

£ & л

X - 4 ш

§1

I §

=5 -cl-=- ю

<|Е

Примечание. В качестве контроля использовали образец в отсутствии фитогормо-на. Инкубация проводилась с ИУК в течение 30 сек, НУК - 3 мин, ГАз, АБК и ЭБР - 10 мин при концентрации гормонов 10"8М.

В присутствии ЬУ 83583 в среде инкубации наблюдалось подавление фито-

гормон-индуцируемого роста уровня цГМФ. Полученные результаты являются косвенным доказательством того, что в тканях проростков овса мишенью фитогормонов является фермент синтеза цГМФ - ГЦ. Для проверки этого предположения проводили эксперименты по изучению влияния ИУК, НУК, ГА3, АБК и ЭБР непосредственно на удельную активность ГЦ в гомогенатах ткани проростков овса. Оказалось, что все вышеперечисленные соединения вызывали существенное увеличение активности ГЦ. Таким образом, действие изученных фитогормонов на содержание цГМФ в растительной клетке, действительно, реализуется посредством модуляции активности Щ.

Исследование влияния фитогормонов ИУК, НУК, ГА3, АБК и ЭБР на активность цГМФ-гидролизующей ФДЭ в гомогенате ткани зеленых проростков Avena sativa показало, что активность фермента снижается под действием ИУК, ИУК и АБК, в то время как ГАз и ЭБР не оказывали влияния на фосфодиэстеразную активность. Таким образом, хотя ауксины и реализуют свое активирующее действие на уровень цГМФ в клетках проростков овса, в основном, через стимуляцию гуанилатциклазной активности (в 2-4 раза), они также подавляют и фосфодиэстеразную активность (на 20-40%). В то время как ГА3 и АБК проявляли одинаково направленный активирующий характер влияния на активность ГЦ в клетках проростков овса, действие на активность ФДЭ оказывала только АБК, но не ГАз. Возможно, в этом проявляется их антагонизм действия на систему цГМФ в проростках овса. Скорее всего, благодаря тому, что ИУК, НУК и АБК увеличивают активность ГЦ и снижают активность ФДЭ, под их влиянием концентрация цГМФ в клетках растет более эффективно. Действие же таких фитогормонов, как ГА3 и ЭБР, на содержание цГМФ реализуется только через стимуляцию активности ГЦ, а не ингибирование ФДЭ.

цГМФ-связывающаи активность в проростках овса Avena sativa L.

В попытке объяснить ранние молекулярные события, связанные с проявлением биологической активности циклического ГМФ, было изучено связывание цикломононуклеотида структурными компонентами растительной клетки. Наивысшей активностью обладала растворимая цитозольная фракция (табл. 4). Кроме того, было установлено, что связывание зависит от световых условий выращивания растений. Субклеточные фракции, выделенные из зеленых проростков, обладали более низкой связывающей активностью, чем фракции, выделенные из этиолированных растений. Сродство [3Н]цГМФ к центрам связывания определялось из зависимостей Скетчарда для связывания [3Н]цГМФ в цитозолъной фракции и фракции плазматических мембран зеленых и этиолированных растений. Все зависимости характеризовались изломом, свидетельствующим о неоднородности центров связывания - существовании центров высокого и низкого сродства. В табл. 5 представлены значения констант диссоциации K¡) и количества обнаруженных центров. Было показано, что ионы Са2+ в присутствии кальмодулина и без него активируют связывание цГМФ и в зеленых и в этиолированных проростках, что свидетельствует о том, что структуры, ответственные за связывание Са2+ (Са-насос) и кальмодулин (специфические центры), взаимодействуют с центрами связывания

цГМФ, что подтверждает предположение о том, что цГМФ действует при взаимодействии с другим вторичным медиатором - Са2+. Следует отметить, что ГТФ, ГТФ ув и Кар оказывали ингибиругощее действие на связывание циклического мононуклеотида, что может быть связано с активацией гуанозинтрифосфатом ФДЭ, либо с тем, что в ПМ устанавливается взаимодействие между в-белком и центрами сродства к цГМФ.

Таблица 4

Специфическое связывание [3Н]цГМФ различными субклеточньши фракциями _проростков овса Avena sativa L. (пмоль / мг белка)_

• СПЕЦИФИЧЕСКОЕ СВЯЗЫВАНИЕ

[3Н]цГМФ, пмоль / мг белка * '

ФРАКЦИЯ ЗЕЛЕНЫЕ ЭТИОЛИРОВАННЫЕ

ПРОРОСТКИ ПРОРОСТКИ

Грубый гомогенат 0,ЗОЮ,06 0,80+0,12

Осадок 1500g 0,07±0,01 3,00+0,32

Грубая митохондриальная

фракция 0,08±0,01 4,11 ±0,16

Грубая микросомальная фрак-

ция 0,05±0,02 1,66+0,08

Плазматические мембраны 0,25+0,01 3,80+0,15

Цдюзоль 4,57±0,26 8,00±0,18

Примечание. Связывание [ Н]цГМФ проводили в присутствии теофиллина (2 мМ) в течение 60 мин при 20°С, рН 7,0 и содержании белка в пробе 0,3 мг.

Таблица 5

Параметры специфического связывания [3Н]цГМФ в цитозоле и плазматических мембранах клеток проростков Avena sativa L., рассчитанные из за_ _ _висимостей Скетчарда_

ПРОРОСТКИ ЦЕНТРЫ НИЗКОГО СРОДСТВА ЦЕНТРЫ ВЫСОКОГО СРОДСТВА

Kd, нМ Количество центров (пмоль / мг белка) Kd, нМ Количество центров (пмоль / мг белка)

Зеленые Цито-золь 252,9±14,3 4,6±0,3 5,6+0,3 1,4±0,3

ПМ 473,8±10,2 7,5±0,5 1,6±0,3 0,3±0,1

Этиолированные Цито-золь 688,7+17,5 11,2±0,5 6,0±0,2 5,3+0,1

ПМ 240,1±15,5 54,5±0,3 44,9±0,2 20,7±0,3

Исследовалось влияние КС/ДКС-облучения на связывание ['ЩцГМФ в проростках овса. Было обнаружено активирующее влияние КС на цГМФ-связывающую активность в гомогенате ткани и КС/ДКС-обратимость эффекта. Влияние синего света обнаружено не было. Следовательно, данное связывание контролируется светом, по всей видимости, с участием фитохрома.

Поскольку наиболее высокая цГМФ-связывающая активность регистриро-. валась в растворимой цитозольной фракции и центры специфического связывания цГМФ имели белковую природу, была предпринята попытка охарактеризовать цГМФ-связывающие белки в цитозоле клеток. Выделение растворимых цГМФ-t| связывающих белков из цитозоля клеток Avena sativa проводили методом аффинной хроматографии с использованием 8-(2-аминоэтил)тиогуанозин-3',5'-цикломонофосфат-агарозы. С помощью SDS-гель-электрофореза было охарактеризовано десять элюировапных белков (рис. 7, полоса 5). Среди них следует выделить белки с молекулярной массой 15 и 18 кДа, 30-40 кДа, а также белки массой 53, 58 и 72 кДа. В контрольном образце, в котором очистка белков проводилась после предварительной инкубации растительного экстракта с 10 мМ цГМФ, цГМФ-связывающие белки не обнаруживались (рис. 7, полоса 4), что свидетельствует о специфическом взаимодействии центров связывания с цГМФ.

116,0 кДа— 66,2 кДа—

45,0 к Да— 35,0 кДа-*

25,0 кДа—

18,4 кДа—► 14,4 кДа-»

-72 кДа

ш

-35»Д»

-««Да

-18кДа -15кДа

Рис. 7. Электрофореграмма цГМФ-связывающих белков цитозоля клеток 5-дневных зеленых проростков овса, очищенных с использованием аффинной хроматографии, в 10% полиактиламидном геле в присутствии додецилсулъфата натрия. 1 - маркерные белки; 2 - общие белки грубого гомогената; 3 - общие белки цитозоля; 4 - цитозольная фракция, элюированная 10 мМ цГМФ при предварительной инкубации белков цитозоля с 10 мМ цГМФ перед хроматографией (неспецифическое связывание); 5 - цитозольная фракция, элюированная 10 мМ цГМФ (общее связывание). Слева указано положение на треке маркерных белков.

16

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. В клетках проростков овса обнаружена функционально активная система метаболизма цГМФ. Наивысшая активность ГЦ зарегистрирована в плазматических мембранах и составляет 3,34 пмоль / мг белка-мин, а ФДЭ - в цитозоле и составляет 1,57 нмоль / мг белка-мин. Кинетические параметры активности ферментов обмена цГМФ в проростках овса близки к характеристикам соответствующих ферментов в тканях животных [4, 5,14]. ,

2. Концентрация цГМФ в проростках Avena sativa составляет 2,3-5,3 пмоль цГМФ / г ткани, что согласуется с предполагаемым участием цГМФ в процессах внутриклеточной сигнализации в растительной клетке. Содержание цГМФ } в проростках овса зависит от их возраста, что проявляется в снижении активности

ГЦ и увеличении активности ФДЭ с возрастом растения. Активность ферментов метаболизма цГМФ зависит от световых условий выращивания растений и характеризуется более высоким содержанием цГМФ в ткани зеленых проростков по сравнению с этиолированными растениями [1,6,14].

3. Установлена функциональная связь фотоморфогенетических рецепторов высших растений с ферментами обмена цГМФ. Активность ферментов обмена цГМФ и концентрация цикломононуклеотида контролируются красным (Х=667 нм) и синим (Я,=454 нм) светом, адресованным фитохрому и криптохрому соответственно. Равновесие между синтезом и распадом цГМФ на фоне освещения красным и синим светом сдвинуто в сторону синтеза, следовательно, фоторецепторы контролируют активность анаболического звена метаболизма цГМФ [1, 4, 5, 6, 7, 12,13,15,16].

4. цГМФ принимает участие в реализации действия фитогормонов на проростки овса. Действие таких фитогормонов, как ИУК, НУК, ГА3, АБК и ЭБР на содержание цГМФ осуществляемся, в основном, через стимуляцию активности ГЦ [3,9,10].

5. В субклеточных фракциях проростков овса представлены белки, выступающие в роли центров специфического связывания цГМФ, сродство которых к цикломононуклеотиду контролируется Са2+, кальмодулином и ГТФ. Связывание характеризуется насыщаемостью, обратимостью, специфичностью, сродством ли-ганда к центру и контролируется светом с участием фоторецепторного бежа фи-тохрома \2, 8].

6. цГМФ и ферменты его метаболизма являются основными элементами молекулярного кросстока между сигнальными каскадами. Проведенный эффек-торный анализ свидетельствует об участии G-белков, системы Са24 / кальмодулин и оксида азота в регуляции метаболизма цГМФ в проростках овса [ 11 ].

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Дубовская Л.В., Молчан О.В., Волотовский И.Д. Фоторегуляция эндогенного содержания цГМФ в проростках овса // Физиология растений. - 2001. - Т. 48. -С. 1-4.

2. Дубовская Л.В., Молчан О.В., Волотовский И.Д. цГМФ-связывающая активность в проростках A vena sativa // Физиология растений. - 2002. - Т. 49. - С. 216-220.

3. Молчан О.В., Дубовская Л.В., Волотовский И.Д. Фитогормональная регуляция уровня цГМФ и цАМФ в проростках овса (Avena sativa L.) // Весщ' HAH Беларуси. Сер. бит. навук. - 2003. - №. 1. - С. 47-50.

4. Дубовская Л.В., Молчан О.В., Волотовский И.Д. цГМФ-гидролизующая фос-фодиэстеразная активность в зеленых и этиолированных проростках овса: влияние красного света, адресованного фитохрому // Becni HAH Беларуси. Сер. б!ял. навук. - 2003. - №.4. - С. 100-104.

5. Volotovski I.D., Dubovskaya L.V., Molchan O.V. Photoreceptor phytochrome regulates the cGMP synthesis in Avena sativa L. cells // Bulg. J. Plant Physiol. - 2003. -Vol. 29.-P. 3-12.

6. Дубовская Л.В., Молчан O.B., Волотовский И,Д. Содержание циклического гуанозин 3 ',5'-монофосфата (цГМФ) в проростках Avena sativa L. и его участие в трансдукции фитохромного сигнала // Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем: Тез. докл. IV Съезда Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков, Минск, 28-30 июня 2000 г. / Белго-суниверситет. - Минск, 2000. - С. 55.

7. Dubovskaya L.V., Molchan O.V., Volotovski I.D. Influence of light on guanosine 3',5'-cyclic monophosphate content in Avena sativa L. // Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems: Abstract Book of International Symposium, Minsk, Belarus, September 24-26,2000. - Minsk, 2000. - P. 46.

8. Dubovskaya L.V., Molchan O.V. The binding of guanosine 3',5'-cyclic monophosphate to protein fractions in homogenate of Avena sativa L, I I Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems: Abstract Book of International Symposium, Minsk, Belarus, September 24-26,2000. - Minsk, 2000. - P. 45.

9. Dubovskaya L.V., Molchan O.V., Volotovski I.D. Influence of phytohormones on cyclic guanosine 3'^'-monophosphate content in Avena sativa L. // Abstract Book of International Symposium on Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems, Kyiv, Ukraine, September 9-14,2001. - Kyiv, 2001. - P. 57.

Ш.Дубовская Л.В., Молчан O.B., Волотовский И.Д. Гормональная регуляция эндогенного содержания цГМФ в проростках Avena sativa L. // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях: Тез. докл. Шестой международной конференции, Москва, 26-28 июня 2001 г. - Москва, 2001. - С. 26.

11. Dubovskaya L.V., Molchan O.V., Volotovski I.D. Cyclic GMP is a second messenger of signal transduction processes in oat plant cells // Chemical Probes in Biology: Poster Abstracts of NATO/FEBS Advanced Study Institute, Island of Spetses, Greece, August 18-30,2002. - Island of Spetses, 2002. - P. 27.

12.Dubovskaya L.V., Molchan O.V., Volotovski I.D. The role of light spectral quality and dose in modulation of oat cGMP intracellular concentration // Abstract Book of FEBS Forum for Young Scientists, Istanbul, Turkey, October 18-20, 2002. - Istanbul, 2002. - P. 63.

13.Dubovskaya L.V., Molchan O.V., Volotovski I.D. The role of light spectral quality and dose in modulation of oat cGMP intracellular concentration // Eur. J. Biochem. -2002. - Vol. 269 (suppl. 1). - P. 55.

14.Дубовская JI.B., Молчан O.B. Активность ферментов метаболизма цГМФ в зеленых и этиолированных листьях овса // Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: Материалы докл. Международной научной конференции, Пятого съезда Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков, Минск, 22-24 октября 2002 г. / Ин-т фотобиологии НАЛ Беларуси. - Минск, 2002. - С. Т-35.

15.Dubovskaya L.V., Molchan O.V., Volotovski ID. cGMP, a factor of biosynthesis of plant pigments and photosynthetic proteins, is under control of phytochrome // Abstracts of 2nd German-Belarus Symposium "Development and Function of the Photosynthetic Apparatus", Egsdorf, Germany, October 8-11,2003. - Egsdorf, 2003. - P. 9.

16.Дубовская Л.В., Молчан O.B. Регуляция синтеза цГМФ фоторецептором фито-хромом в клетках A vena sativa L. // Сборник трудов молодых ученых Национальной академии наук Беларуси. Отделение аграрных наук. Отделение биологических паук. Отделение медицинских наук. - Минск: ИООО «Право и экономика», 2003. - Т. П. - С. 268.

РЭЗЮМЕ

Дубо^ская Людмша Вячаславауна

МетабалЬм цыюпчнага гуаназш-3',5'-монафасфата у раслшнай клетцы. Су-вязь з працэсам1 Унутрыклетачнай сй-налЬацьп

Ключавыя словы: метабал1зм цГМФ, гуаншатцыклаза, фосфадыэстэраза, цГМФ-звязвагочая актыунасць, фггахром, крыптахром, фпвгармоны, юны кальцыю, G-бялю, красток, Avena sativa L.

Мэта работы - характарысшка схстэмы метабал1зму цГМФ у праростках ауса, а шенна вымярэнне актыунасги ферментау сштэзу i распаду цГМФ, гу-аншатцыклазы i фосфадыэстэразы цГМФ адпаведна, вызначэнне магчымага маду-люючага дзеяння фшхромнай i фггагарманальнай рэгуляторных ыстэм на актыунасць гэтых ферментау, а таксама ацэнка звязваючай актыунасщ цГМФ структурным! кампанентам! субклетачных фракцый.

Паказана, што f клетках праросткау ауса прысутшчае функцыянальна акты уная сктэма метабал^зму цГМФ. Установлена яе функцыянальная сувязь з фо-таморфагенетьгчньтп рэцэптарам1 вьшэйшых раслш. Актыунасць ферментау аб-мену цГМФ у праростках а^са i канцэнтрацыя цГМФ мадулююцца чырвоным i cíhím святлом, адрасаваным фгёахрому i крьштахрому адпаведна. Установлена, што вызначаныя фермепты ^дзельтчаюць у працэсах ф1 гагарманальнай рэгуля-цьп. Паказаны удзел G-бялко^ i скггэмы С а2' /кальмаду лш у рэгуляцш метабал^зму цГМФ. цГМФ i ферменты яго абмену з'яуляюцца ключавым1 элементам! малеку-лярнага крастока памЬк сггнальным! каскадам! f раслшах.

3ycÍM новым! з'яуляюцца даныя аб цГМФ-звязваючай акты^насш У раслшных субклетачных фракциях. У клетках праросткау ауса выяулены цэнтры спецыф!чнага звязвання цГМФ бялковай прыроды, роднасць яих да цыкламонануклеашду кантралюецца Са2+, кальмадулшам, ГТФ i святлом, як ввдаць, з удзелам фггахрому.

Bi»xÍMÍ4HbM параметры астэмы метабал1зму цГМФ могуць быць выкарыстаны як тэст на функцыянальны стан раслшнай клетю. Вьшш могуць вьткарыстоувацца пры распрацо^цы прыёмау алтьвшзацьп працэсау росту i рэгуляцьп разв^щхя сельскагаспадарчых культур.

РЕЗЮМЕ

Дубовская Людмила Вячеславовна

Метаболизм циклического гуанозин-3 ',5 '-монофосфата в растительной клетке. Связь с процессами внутриклеточной сигнализации

Ключевые слова: метаболизм цГМФ, гуанилатциклаза, фосфодиэстераза, цГМФ-связывающая активность, фитохром, криптохром, фитогормоны, ионы кальция, G-белки, кроссток, Avena sativa L.

Цель работы - характеристика системы метаболизма цГМФ в проростках овса, а именно измерение активности ферментов синтеза и распада цГМФ, гуани-латциклазы и фосфодиэстеразы цГМФ соответсгвенно, установление возможного модулирующего действия фитохромной и фитогормональной регуляторных систем на активность этих ферментов, а также опенка связывающей активности цГМФ структурными компонентами субклеточных фракций.

Показано, что в клетках проростков овса присутствует функционально активная система метаболизма цГМФ. Установлена ее функциональная связь с фо-томорфогенетическими рецепторами высших растений. Активность ферментов обмена цГ'МФ в проростках овса и концентрация цГ'МФ модулируются красным и синим светом, адресованным фитохрому и кршгшхрому соответственно. Установлено, что указанные ферменты участвуют в процессах фитогормональной регуляции. Показано участие G-белков и системы Са2+/кальмодулия в регуляции метаболизма цГМФ. цГМФ и ферменты его обмена являются ключевыми элементами молекулярного кросстока между сигнальными каскадами в растениях.

Совершенно новыми являются данные о цГМФ-связывающей активности в растительных субклеточных фракциях. В клетках проростков овса обнаружены центры специфического связывания цГМФ белковой природы, сродство которых к щшхомононуклеотиду контролируется Са2+, кальмодулином, ГТФ и светом, по всей видимости, с участием фитохрома.

Биохимические параметры системы метаболизма цГМФ могут быть применены как тест на функциональное состояние растительной клетки. Результаты могут использоваться при разработке приемов оптимизации процессов роста и регуляции развития сельскохозяйственных культур.

SUMMARY

Dubovskaya Lyudmila V.

Metabolism of cyclic guanosine 3',5'-monophosphate in plant cell: the involvement in intracellular signaling processes

Key words: cGMP metabolism, guanylate cyclase, phosphodiesterase, cGMP-binding, phytochrome, ciyptochrome, phytohormones, calcium ions, G-proteins, crosstalk, Avena sativa L.

The aim of the work is to characterize a metabolic system of cGMP in oat seedlings, that is to measure the activities of the enzymes of synthesis and degradation of cGMP, guanylyl cyclase and cGMP-phosphodiesterase correspondingly, to establish a possible modulating action of phytochrome and phytohormones on the activities of these enzymes, and also to estimate the cGMP-binding activity of structural components of subcellular fractions.

The iunctionally active cGMP metabolic system was found in the cells of oat seedlings. Its functional interaction with photomorphogenic receptors in higher plants was established. In oat seedlings red and far red light absorbed by phytochrome and chryptochrome, correspondingly, modulate the activity of cGMP turnover enzymes and concentration of cGMP. The involvement of the given enzymes in phytohormone regulation was also established. The role of G-proteins and Ca2+ / calmodulin system in regulation of cGMP metabolism was shown. cGMP and the enzymes of its turnover appeared to be the key components of molecular crosstalk between signaling cascades in plants.

Completely new data on cGMP-binding activity in plant subcellular fractions were obtained. In the cells of oat seedlings specific binding proteins with the affinity for cGMP to be under control of Ca2+, calmodulin, GTP and light via probable involvement of phytochrome were found.

Biochemical parameters of cGMP metabolic enzymes can serve as a test for functional state of a plant cell. The results can be used for development of techniques of optimizing the processes of growth and regulatory development of agricultural crops.

Подписано в печать 13.05.2004. Формат 60x84 1/16. Тираж 100 экз. Зак. № 523.

Отпечатано с готового оригинала-макета заказчика в Республиканском унитарном предприятии «Издательский центр Белорусского государственного университета». Лицензия на полиграфическую деятельность № 02330/0056850 от 30 04.2004 220030, Минск, ул. Красноармейская, 6.

I

! !

f >

i

i

! I í

i

к

РНБ Русский фонд

2004-4 11255