Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция белком 26КД и ионами СФ2+ активности фосфодиэстеразы и светозависимой проводимости мембраны фоторецепторной клетки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Регуляция белком 26КД и ионами СФ2+ активности фосфодиэстеразы и светозависимой проводимости мембраны фоторецепторной клетки"

РГ6

МобкЬвСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

7 ? :;лп ^соо_

на правах рукописи

Никонов Сергей Станиславович

УДК 577.352.465

РЕГУЛЯЦИЯ БЕЛКОМ 26КД И ИОНАМИ СА2+ АКТИВНОСТИ «ШЩИЭСТЕРАЗЫ И СВЕТОЗАВИСИМОИ ПРОВОДИМОСТИ МЕМБРАНЫ ФОТОРЕЦЕПТОРНОИ КЛЕТКИ

03.00.02 - "Биофизика"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фязико-математиче ских . наук .

Москва 1993

Работе выполнена в Жституте биофизики клетки РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Фесенко Е.Е. кандидат физико-математических наук Любарский А.Л.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Грибакин Ф.Г. кандидат физико-математических наук Александров A.A.

Ведущая организация: Институт химической физики РАН

Защита состоитоя "/5" С1/1/1 РЛА. 1993 г. в часов на заседании специализированного совета К 063.91.10 при Московском физико-техническом институте (141700, г. Долгопрудный Московской обл., Институтский пер., 10).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института. I

Автореферат разослан " & " ¿1 /З/тгО. 1993 г.

Ученый "секретарь совета,

кандидат физико математических наук

Киреев В.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблем.

Согласно классической циклонуклеотидной гипотезе фототрансдукции в фоторецепторах позвоночных (ФР) поглощение кванта света зрительным пигментом приводит, при посредничестве G-белка трансдуцина, к активации фосфодиэстеразы (ФДЭ). Однако вопрос о том, определяется ли падение проводимости плазматической мембраны клетки при генерации фотоответа только гидролизом ФДЭ-зсй циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) - агошста светозависш.ых каналов (Fesenko et al. 1985) - до сих пор остается одним из наиболее острых в фоторецепции. Действительно, если концентрация свободного цГМФ в НСП составляет единицы микромолей (йобарсшгЯ и Фесешсо, 1987, Yau and Nakatany, 1985b) и K^ для ФДЭ <» 500 мкМ (Barkdol et al, 1988), расчетная гашетика падения концентрации цГМФ оказывается много медлешее кинетики развития переднего фронта фотоответа. Не в пользу гипотезы свидетельствуют и данные о регистрации фотоответов от целых клеток и изолированных фрагментов мембран при замене ЦГМ5 на его слабо гидролизуемый аналог 8Вг-цГ?,й (Zimmerman et al, 1985; Pugh et all, 1986). В то so время сравнительно недавно появились сообщения о быстром падении внутриклеточной концентрации цГМФ в интактных НСП в ответ ка освещение (Cohen and Blazynski, 1988).

В рамках циклонуклеотидной гипотезы предполагалось также, что светозависимые каналы осуществляют однозначную связь между концентрацией цГМФ в цитоплазме и проводимостью мембраны. Одна!» открытие широкого спектра веществ-модуляторов цГМФ-зависиыой проводимости (Tanaka et al, 1989; Filatov et al, 1989) показывает, что такой однозначности in vivo может и- не существовать. Кроме того, сравнительно недавно нами были получены данные, согласно которым цГМФ-зависимые каналы1 обладают свойством "адаптации" к цГМФ и их проводимость определяется1 не только концентрацией циклического нуклеотидв, но и предисторией взаимодействия с ним. Указанная неоднозначность свидетельствует о существовании в функционирующем ФР более тонкой, чем известная на настоящий момент, системы регуляции. Если ето действительно так, то представляется вероятным, что подобная регуляция' могла бы играть определенную роль, по крайней мере, в сравнительно медленных процессах световой адаптации.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось исследование, в условиях, близким к in vivo, (1) механизмов регуляции скорости гидролиза цГМФ; (2) путей регуляции проводимости мембраны НСП, -непосредственно не связанных с изменением концентрации циклонуклеотида.

Новизна и научная ценность работы.

В работе впервые зарегистрирована сильная активация примембранной ФДЭ Са-связывающим белком из НСП с молекулярной массой 26кД. Показано, что в системе, близкой к нативной, скорости гидролиза обычного и 8Вг-цГМФ могут отличаться менее чем на порядок, значительно меньше, чем в биохимических экспериментах tn Vitro. Полученные результаты могут в значительной мере устранить упомянутые выше противоречия современной теории фототрансдукции, связанные с предполагаемым участием ФДЭ в генерации переднего фронта фотоответа.

Также впервые показано, что при определенных условиях ионы кальция могут существенным образом влиять на цГМФ-зависимую проводимость мембраны НСП, причем данный эффект не связан о изменением концентрации циклонуклеотида. Исследована связь еффекта кальция с кинетическими характеристиками реакции фрагмента мембраны на аппликацию ЦГМ5. Показано Са-зависимое ингибирование белком 26кД цГМФ-зависимой проводимости. Установлено, что падение проводимости фрагмента в ответ на аппликацию препарата трансдуцина не опосредуется активацией примембранной ФДЭ. Исследовано влияния неокиоторфина, нейропептида из мозга гибернирующих животных, на ЦГМФ-зависимую проводимость. Возможная интерпретация полученных результатов заключается в предположении о существовании путей световой адаптации ФР, непосредственно не связанных, в отличие от ныне известных, с изменением концентрации ЦГМФ.

Публикации.

Непосредственно по теме диссертации опубликованы четыре печатные работы (две статьи и тезисы), две статьи находятся в печати. Рассматриваемые вопросы освещались также, в той или иной степени, более чем в 10 печатных работах автора.

Апробация.

Основные положения диссертации докладывались на семинарах лаборатории биофизики рецепции ИБК РАН; на 15-й конференции молодых ученых МФТИ, Москва, 1990 г.; на 2-м Советско-испанском

симпозиуме по физико-химической биологии "Биологические мембраны: Структура и функции", Киев, 1990 г.; на 4-м Советско-германском симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы", Москва, 1991 г.

Струщ/ра диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (Гл.1), описания материалов и методов исследования (Гл.2), изложения полученных рельтатов и их обсуждения (Гл.З), заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

ОСНОВНОЕ СОДБРХАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Patch, clamp эксперимент.

Все электрофизиологические експерименты проводились методом "patoh-olamp" (см. Сакман и Неер, ,1987). Метод заключается в регистрации ионных токов через изолироанные фрагменты мембран при фиксированном мембранном потенциале. Использовалась конфигурация Inside-out (Hamil et al, 1981), в которой цитоплазматическая сторона фрагмента доступна действию содержащихся в залитом в рабочую ячейку растворе исследуемых агентов. В данной работе фрагмент мембраны фоторецептора использовался в качестве модельной системы, достаточно полно отражающей процессы, протекающие в клетке "in vivo" (Koeolapov et al, 1992). Поскольку в условиях, близких к физиологическим, одиночные цГМФ-зависимые каналы зарегистрированы быть не могут, измерялись интегральные токи и вычислялась интегральная проводимость фрагментов.

Эксперименты проводились на фрагментах плазматической мембраны НСП шпорцевых лягушек Xenopus laevie и Xenopua bareolie.

Все експерименты проводились на свету.

Растворы и реагенты.

В работе использовались: устойчивый к гидролизу ФДЭ-зой аналог цГМФ 8-Бром-цГМФ, цГМФ и Нерев фирмы Boehringer (Герм.); изо-бутнлметилксантин (ИБМК), [втилен-бис(окси-этапеннитрило)] тетра-ацетатная кислота (ЭГТА) фирмы Sigma (США); остальные реактизы отечественного производства квалификации не ниже "ч.д.а." без дополнительной очистки; физиологический раствор следующего состава (mía)i NaCl-100; КС1-10; Mg0l-1; CaClg-0,1; Hepes-10, pH 7.4

В работе использовался частично очищенный белок 26кД,

выделенный буфером низкой ионной силы по методике, изложенной в статье Kawamura and Murakami, 1991. Также использовался рекомбшшнтный белок 2бкД, полученный Ь лаборатории прсф. /.бдуллаева, ИБХ РАН (Kutuaov et al, 1991; Кутузов и др., 1992).

Трансдуцин выделялся по методике, изложенной в статье Krapivinsky et al, 1989.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Регуляция активности фосфодиэстераэы белком 26кД.

Фосфодиэстеразная активность фраглетов лелбраны НСП.

Изолированные фрагменты мембраны НСП способны к генерации фотоответа (Ксво1ароу е1; а1, 1592), что свидетельствует о наличии на них елементов каскада фототраисдукции. Т.о., при отрыве фрагмента на свету можно было бы ожидать сохранения на нем активной ФДЭ в состоянии, близком к нативному.

Действительно, на некоторых фрагментах нами наблюдалось медленное пэдение*проводимости вслед за быстрым ее увеличением в ответ на аппликацию цГМФ (рис. 1 А, Р). Восстановление проводимости в присутствии ингибитора ФДЭ ИБМК (рис. 1 Б) свидетельствует о том, что наблюдавшиеся аффекты обусловлены именно гидролизом циклонуклеотида. Эффект сохранялся при многочисленных аппликациях цГМФ, как правило, на протяжение всего времени жизни фрагмента, что может быть связано с потерей кнгибиторной 7~субъединицы фермента.

Рис.1. Гидролиз цГМФ и 8Вг~цГМВ гфииеыбранной ФДЭ-эой. Отмечены точки, в которых производилась смена физилогических. растворов: А. Р аппликация 100 мкМ гдГМФ; В - аппликация 10 мкМ 8Вг-цГМФ: Б -аппликация 100 мкМ цГМФ при 1 мМ ИБМК; С, Е - аппликация исходного физиологического раствора.

1М К« ЭМ «« Г Г

Время после отрыва фрагмента, с

В"

Эффект наблюдался также и при замене обычного цГМФ на

8Вг-цГМФ (рис. 1 В). Считая, что начальная скорость падения проводимости фрагмента сразу после смены раствора в ячейке будет определяется главным образом скоростью гидролиза циклонуклеотида ФДЭ-зой, можно оценить различие в скорости гидролиза обычного -и 8Вг-цГМФ. Оказалось, что гидролиз последнего протекает примерно на . порядок медленнее. В то же время в биохимических экспериментах In Vitro эта разница составляла как минимум два порядка (Barkdol et al, 1988). Т. о., в системе, близкой к нативной, может иметь место достаточно эффективный гидролиз 8Вг-цГМФ.

Активация фосфодиэстеразы белкол 26кД.

Недавно было установлено, что белок с молекулярным весом 26кД, содержащийся в препаратах НСП, является кальций-зависимым регулятором активности гуанилатциклазы (ГЦ) (Lambreoht and Kooh, 1991; Dizhoor et al,1991). В рамках общепринятой циклонуклеотидной схемы ему приписывается, в етой связи, участие в процессе инактивации каскада фототрансдукции. Одновременно появились указания на то, что белок с тем же молекулярным весом может регулировать активность ФДЭ (Kawamura and Murakami, 1991). С учетом етих данных представляется целесообразным изучение влияния белка 26кД на ключевые звенья цепи фототрансдукции. Нами установлено, что, во-первых, белок 26кД вызывает активацию примембранной ФДЭ, во-вторых ингибирует цГМФ-зависимую проводимость независимо от изменения активности ФДЭ (см. раздел "Новые пути модуляции свето-зависимой проводимости..."). Ниже приводятся результаты исследования влияния белка 26кД на активность ФДЭ.

Для изучения влияния белка 26кД на примембранную ФДЭ выбирались фрагменты, на которых изначально присутствовала фосфодиэстеразная активность (рис. 2 А). Аппликация белка 26кД в концентрации 1 мкМ совместно с ЦП® (рис. 2 В) приводила к значительному увеличению скорости гидролиза цГМФ ФДЭ-зой. То, что наблюдавшиеся эффекты обусловлены именно дополнительной активацией примембранной ФДЭ следует из факта восстановления проводимости фрагмента в присутствии ИБМК (рис. 2 D). Максимальная активация ФДЭ достигалась через несколько минут после аппликации белка 26кД (рис. 2 С), что, вероятно, связано с сорбцией на мембране. Медленная сорбция белка 26кД сильно затрудняет количественное описание феномена. Определенные затруднения представлял' и тот факт, что наблюдавшиеся после

аппликации белка изменения проводимости фрагмента являлись суммой двух эффектов - активации ФДЭ и ингибирования цГМФ-зависимых каналов. По нашим оценкам, проведенным с учетом сделанных выше замечаний, в присутствии белка, 26кД скорость гидролиза цГМФ примембранной ФДЭ-зой возрастала на 1 - 2 порядка, полумаксимальный эффект соответствует концентрации белка 26кД в сотни наномолей (усреднение результатов серий экспериментов на 4 фрагментах).

Рис.2. Активация ФДЭ белком 26кД. Отмечены точки, в которых производилась . смена физилогических растворов: А, С, Е -аппликация • 100 мкМ цГМФ; В - аппликация 100 мкМ цГМФ совместно с 1 мкМ белка 2бкД; D - аппликация 100 мкМ цГМФ при 1 мМ ИБМК. Справа показана зависимость проводимости фрагмента от кон,центрации цГМФ, мкМ,

! снятая при 1 мМ ИБМК.

Эффект активации ФДЭ исчезает после многократных аппликаций цГМФ и отмывок раствором Риягера, при сохраняющейся исходной активности ФДЭ. С нашей точки зрения это может указывать на то, что активация ФДЭ белком происходит при посредничестве некоего внутриклеточного агента, медленно диссоциирующего с мембраны. Именно отсутствием такого кофактора • может объясняться наблюдавшаяся ранее (Kawamura and Murakami, 1991) слабая активация ФДЭ белком 26кД (всего на 50# при 1 мкМ свободного кальция).

К сожалению, нам не удалось достоверно ответить на вопрос о влиянии ионов кальция на процесс активации ФДЭ. В контрольных экспериментах (до аппликации белка 2бкД) мы наблюдали незначительное увеличение скорости гидролиза цГМФ при уменьшении концентрации кальция от 0.1 мМ до 10 нМ. Примерно такое же по порядку величины увеличение скорости гидролиза наблюдалось и при аппликации белка 26кД в низком кальции по сравнению с аппликацией в высоком кальции. Однако не исключено, что результаты контрольных экспериментов объясняются сохранением на мембране некоторого количества белка 26кД после отрыва фрагмента, активность которого и регулировалась кальцием.

Активация ФДЭ вызывалась и частично очищенным препаратом

нативного белка 26кД, и рекомбинантным (Kutuzov et al, 1991; Кутузов и др., 1992) белком 26кД. Эффективность действия рекомбинантного белка 26кД отсекает возможность экспериментальных артефактов.

Если фрагмент изначально не проявлял фосфодиэстеразную активность, аппликация белка 26кД не приводила к ее появлению. Некоторое падение цГМФ-зависимой проводимости, обусловленное, возможно, гидролизом цГМФ, на таких фрагментах иногда наблюдалось лишь в присутствии 26кД совместно с ГТФ (рис. 3 Е) (в контрольных експериментах ГТФ сам по себе несколько увеличивал проводимость фрагмента, что и видно на рис. 3, D). В пользу предположения о том, что этот эффект связан с активацией ФДЭ, свидетельствует отмена его в присутствии ИБМК (рис. 3, G). Как известно, ГТФ необходим для активации ФДЭ трансдуцином. Т.о. не исключено, что траксдуцин и ГТФ могут оказаться теми самыми предполагаемыми посредники/и между белком 26кД и ФДЭ, однако етот вопрос нуждается в дальнейших исследованиях.

Рис.3. Предполагаемая активация ФДЭ в присутствии белка 26кД

и ГТФ. Отмечены точки, в которых производилась смена физилоги-ческих растворов: А, С, F - аппликация мкМ цГМФ; В аппликация 100 цГМФ совместно с 1 белка 26кД; D аппликация 100 цГТаФ совместно с 1 ___ ___ _ __ _ __ГТФ; Е - аппликация

Время после отрыва Фрагмента, с ¿Of «^ЖдТг

1 мМ ГТФ; G - аппликация 100 мкМ цГМФ совместно с 1 мкМ белка 26кД и 1 мМ ГТФ в присутствии 1 мМ ИБМК; Н - аппликация исходного физиологического раствора.

Какова же вероятная функциональная роль эффекта активации ФДЭ белком 26кД? Согласно данным биохимических экспериментов In vitro, гидролиз цГМФ хорошо описывается уравнением Михаэлиса-Метен, при этом Vmax * 1000 молекул цГМФ в секунду, Km 500 мкМ (Liebman and Pugh, 1982; Barkdol et al, 1988). Тогда при 1 мкМ свободного цГМФ (как то следует из сравнения цГМФ- и светозависимой проводимостей (Любарский и Фесенко, 1987)) скорость гидролиза составит несколько молекул циклонуклеотида в секунду. Если фотовозбужденный родопсин

ч ч

I.» * I

О

Я

о " Я •■«

о и Р.

И "

л ш с * • 9 9 t

I 11 II М.1 1 1 ■

■лГ-

1 об

мкМ мкМ

мкМ Ш

(Р*) активирует 500 молекул трансдуцина (Т) за 500 мс (Vuong et al, 1984), одна молекула Т активирует одну молекулу ФДЭ за 1 мо (Cobbs and Pugh, 1937), то за время генерации фотоответа (около 100 мо) гидролизуется « 10 молекул цГМФ на молекулу Р*. В то же время ето должно приводить к закрытию не менее 100 каналов плазматической мембраны НСП (Любарский и Фесенко, 1987). Несоответствие становится еще более очевидным, если учесть, что проводимость светозависимого канала, скорее всего, регулируется тремя молекулами циклонуклеотида (Funiian and Tanaka, 1989). Согласно экспериментальным данным (Cohen and Blazynski, 1988) в интактном ФР гидролизуется 2,8 * 10^ молекул цГМФ на 480 молекул Р* за 56 мс, что соответствует ы 10400 молекул цГМФ на молекулу Р* за 100 мс.

Узким местом рассмотренной схемы фототрансдукции являются низкий уровень свободного цГМФ и высокая Km для ФДЭ, при этих условиях фермент использовался бы клеткой менее чем на 1S5 своей "мощности". Однако in VÍV0 активность фосфодиестеразы может оказаться значительно выше благодаря влиянию белка 2бкД.

При низком уровне свободного ЦГМФ представляется более оправданным механизм увеличения скорости гидролиза цГМФ за счет уменьшения Кщ ФДЭ, чем за счет роста максимальной скорости гидролиза циклонуклеотида ферментом. Это предположение хорошо согласуется с данными биохимических экспериментов in vitro (Kawamura and Murakami, 1991), согласно которым белок 26кД несколько увеличивает эффективность активации ФДЭ, не влияя на максимальную скорость гидролиза. Наряду с вышеизложенными аргументами, отсутствие заметной кальций-зависимости этого феномена в наших экспериментах предполагает возможность участия белок 26кД-зависимой активации ФДЭ в акте генерации переднего фронта фотоответа.

Нам представляется удивительным тот фарт, что белок 26кД может одновременно являться кальций-зависимым регулятором активности ГЦ и сильным активатором ФДЭ - ферментов противоположного действия. С этой точки зрения, закономерным является вопрос идентичности рековерина (Dizhoor et al,1991) и С-модулина (Kawamura and Murakami, 1991 ), тем более, что электрофоретически белок 26кД наблюдался, как правило, в виде двух близких, но хорошо различимых полос.

Новые пути модуляции свето-зависимой проводимости*.!, их возможная роль в процессе световой адаптации фоторецептора.

Регуляция ионами кальция медленной фззн цгМФ-зависимоя проводимости фрагментаТ

После обнаружения непосредственной активации светозависимых

каналов НСП циклическим гуанозинмонофосфатом интерес к кальцию кок

к возможному регулятору их проводимости значительно упал, хотя -в

2+

ряде работ и сообщалось о модулирующем действии ионов Са на индуцированную цГМФ проводимость фрагмента, в пределах 205? ■(Любарский и Фесенко, 1987). Сообщая о существовании двух различных форм ответов фрагментов на аппликацию цГМФ - медленной и быстрой фаз, возможно обусловленных эффектом "адаптации" канала к цГМФ, мы предполагали, что таким образом мокет функционировать альтернативный, непосредственно не связанный с изменениями концентрации кальция и, следовательно, активностей ФДЭ и ГЦ, механизм световой адаптации. Однако результаты дальнейших исследований показали, что проводимость тленно таких фрагментов оказывается наиболее чувствительной к изменениям концентрации кальция.

Недленкые изленениа цГНФ-зависилой проводилост изолированных фраглетод фсторецепторной желбраны.

Аппликация цГМФ к свежеизолированным "inside-out" фрагментам плазматической мембраны в <* 20% опытов вызывала двухфазное увеличение проводимости. Скорость быстрой фазы определялось временем смешивания в экспериментальной ячейке (1 - 2 с), а медленная фаза развивалась за времена порядка десятков секунд. Форма ответа Фрагментов, проявлявших двухфазную реакцию на первую апплггкацню цГМ5, на последующи аппликации зависела от предасторж фрагмента, при этом суммарная амплитуда эффекта не изменялась. Так, после кратковременной отмывки от цГМФ (ы 10 сек), наблюдалось только бистра;! фчза; после длительной выдержки фрагмента С';з цтслоиуклеотпдо (200 - 300 сек) происходило полное восстэновдонко медленней фаз»; п промежуточных случаях медленная 'Газ-'j восстанавливалась частично. Медлешшя фаза, как правило, пропадал?, после нсс1-.олыш7 отмывок от ЦГМФ, что может бить связано с потерей каким-то легко диссоциирующих компонент мембраны Ср.

Быстрое падение проводимости фрагмента при отмывке и быстрос ее восстановлен"!:-:) при аппликации цГМФ после кратковременной

отмывки, а также отсутствие скачков проводимости при повторных аппликациях цГМФ или перемещениях электрода в ячейке во время развития медленной фазы, указывают на то, что наблюдавшиеся еффекты не являются артефактом, 'связанным, напрймер, с плохим леремешиванием в ячейке или затрудненной диффузией к поверхности фрагмента. Далее везде при обсуждении медленных эффектов изменения цГМФ-зависиыой проводимости принимались во внимание только фрагменты, прошедшие аналогичный контроль.

- Влияние ионов кальция на проводилостъ светозависилъа: кашиов.

Нами неоднократно наблюдалась неглубокая модуляция кальцием цГМ^-зависимой проводимости. Как правило, снижение концентрации кальция приводило к небольшому, быстрому, обратимому увеличению проводимости фрагмента. Реже наблюдались противоположные еффекты. Долгое время не удавалось установить хорошей корреляции между эффектом кальция и характеристиками фрагмента. Некоторые закономерности стали проясняться только при исследовании феномена генерации медленной фазы цГМФ-зависимой проводимости.

Оказалось (результаты серий вксчершентов на б фрагментах), что снижение концентрации кальция со 100 мкМ до Ю'мкМ приводит к падению проводимости фрагментов, проявлявших двухфазную реакцию на аппликацию цГМФ (рис. 4 В, I). Кинетика эффекта хорошо соответствует кинетике генерации медленной фазы " 'сек.),

а глубина ингибирования - ыакошальной возможной (т.е. той, которая могла бы наблюдаться после достаточно длительной выдержки фрагмента без цГМФ) амплитуде медленной фазы. Снижение концентрации кальция приводило к увеличению скорости, но не глубины ингибирования. Восстановление концентрации кальция вызывало рост проводимости фрагмента, схожий с процессом развития медленной фазы. При етом, как правило, полного восстановления проводимости не происходило (рис. 4 Ю, Н). Если фрагмент переставал проявлять е$фект медленной фазы (рис. 4, ¡1, Ь), пропадали и описанные еффекты кальция. Такое поведение фрагмента, скорее всего, связано с отмывкой каких-то примембранных структур, опосредующих влияние кальция. После исчезновения медленной фазы наблюдалась обычная реакция фрагмента - незначительное увеличение проводимости - на снижение концентрации кальция (рис. 4, М).

Изменения мембранного потенциала при развитии эффекта кальция не превышали 1 мВ. Эта величина слишком мала, чтобы вызвать наблюдавшиеся более чем 5055-е изменения проводимости (Любарский и

Время посла отрыва фрагмента, с

Фесенко, 1987).

Проводимость фрагмента не восстанавливалась в присутствии ИБМК (рис. 4 0, Е), аналогичные аффекты кальция регистрировались также и при использовании вместо цГМФ его слабо гидролизуемого аналога 8Вг-цГМФ. Эти результаты показывают, что наблюдавшиеся еффекты не связаны с изменением скорости гидролиза ЦГМФ.

Рис.4. Влияние

изменений концентрации свободного кальция на ц1Ш-зависш.1ую проводимость. Отмечены точки, в которых производилась смена физилогических растворов: А, Б, Р, Н, J, Ъ - аппликация 100 мкМ цГМФ при концентрации свободного кальция 100 мкМ; В, I, и -аппликация 100 мкМ цГМФ при концентрации свободного кальция 10"£ мкМ; С, Е аппликация 100 мкМ цГМФ при 1 мМ ИБМК и 10 или 100 мкМ свободного кальция соответственно; С, К, N - аппликация исходного физиологического раствора, концентрации свободного кальция 100 мкМ.

Маловероятно также, что эти еффекты опосредуются белком 26кД. Более подробно этот вопрос рассмотрен в следующем разделе.

Т.о. участие кальция в регуляции проводимости плазматической мембраны фоторецептора может и не ограничиваться контролем только лишь уровня цГМФ посредством известного механизма Са-зависиыоЛ отрицательной обратной связи. При наличии достаточно большой по величине медленной фазы (для некоторых фрагментах она представляла большую часть Проводимости, до 10055) существенную роль могли бы играть описанные выше эффекты. В целом, влияние кальция на проводимость фрагмента будет определяться соотношением минимальной амплитуды быстрой и максимальной возможной амплитуды медленной фаз проводимости. При етом, в силу противоположного влияния на них кальция, могут наблюдатся еффекты обоих знаков.

Интегральная проводимость мембраны, регистрируемая в наших экспериментах, определяется проводимостью одиночного канала и вероятностью нахождения его в открытом состоянии. Ранее нами было высказано предположение о существовании цГМФ-зависимых каналов (или некоторой популяции этих каналов) в нескольких формах, различающихся по проводимости в открытом состоянии. Тогда феномен

медленной фазы мог Си явиться следствием управляемых цГШ> переходов между этими формами (после связывания цШФ канал переходит в форму с большей проводимостью).

Маловероятно, что в течение всего времени развития медленной фаз и (сотни секунд) канал связан с цГМФ - соответствующая энергия связи оказывается слитком большой. Если предполагаеше перехода и происходят ь действительности, то они должны иметь многоступенчатый характер. Так как изменения проводимости канала обычно связаны со значительными структурными перестройками, представляется вероятным также, что в присутствии цГМФ увеличивается не проводимость, а вероятность нахождения одиночного канала б открытом состоянии.

Приведенные выше экспериментальные данные показывают, что наряду с цГМФ эти переходы могут управляются ионами кальция. Это не противоречит и предположению об участие таких процессов в механизме световой адаптации цГМФ-зависимого канала. Действительно, в темноте повышенная концентрация Са11 и цГМФ способствовали бы увеличению проводимости мембраны, что соответствует сдвигу кривой зависимости проводимость-концентрация влево. Т.к. концентрация свободного цГМФ в НСП меньше Кт, ето привело бы одновременно и к росту чувствительности фоторецептора. Падение концентрации и" цГМФ при освещении вызывало бы

уменьшение проводимости и чувствительности.

Ингибирование цГМФ-зависимой проводимости белком 26кД.

Еде раз в существовании неоднозначной зависимости между проводимостью плазматической мембраны фоторецептора и концентрацией цГМФ мы убедились, исследуя влияние белка 26кД на активность примембранной ФДЭ. Как оказалось, падение проводимости фрагмента в присутствш: белка 26кД обусловлено только

увеличением скорости гидролиза цГМФ, но и ингибировашем проводимости светозависимых каналов. Однако вклад второго ефректа ь суммарное изменение проводимости был значительно меньше вклада первого. Поэтому ингибирование цГМФ-зависимой проводимости белком 26кД главным образом исследовалось на фрагментах, не проявлявши.-: <]осфодпс'стерозной активности.

Аппликация к таким фрагментам белка 2(>цЦ совмести» с цГ'.'Т> приводила к быстрому (менее чем за 1 сек.) обратимому подавлению

цГМФ-зависимой проводимости (рис. 5, В). Эффект наблюдался на 11 из 12 исследованных фрагментов. Ингибирование становилось заметнш при концентрации 26кД « 0,5 мкМ. Максимальный эффект наблюдался при 1 мкМ белка и ЮмкМ свободного кальция (см. ниже) и составлял около 25% от величины проводимости фрагмента. В доступном ном интервале концентраций (до 1,5 мкМ) обычно наблюдалось 5 - 20%-в ингибирование, насыщения эффекта не наблюдалось. Концентраций тотального 26кД в НСП 30 мкМ, т.о. глубина ингибирования 1п VI 1)0 может оказаться значительно больше наблюдавшейся в наши* экспериментах.

Рис.5. Ингибирование цГМФ-зависииой проводимости белкой 2БкД. Отмечены точки,в которых производилась смена физилоги-ческих растворов: А, Б - аппликация 100 мкМ цГМФ; В - аппликация 100 мкМ цГМФ совместно с 1 мкМ белка 26кД; С - 8ППЛИК8ЦИЯ 100 мкМ цГМФ совместно с 1 мкМ белка 26кД при 1 мМ ИБМК.

Время посла отрыва фрагмента, с

Контрольные експерименты с белком БСА показали, что заметнее неспецифическое влияние проявляется при концентрациях БСА порядка сотен микромолей, что более чем на два порядка превышает действующую концентрацию белка 26кД.

Изменения эквивалентного мембранного потенциала при аппликации белка' не превышали 5 - 6 мВ, соответствующие и:-ченения проводимости должны были бы бить < 5%. Т.о. представляется маловероятным, что наблюдавшиеся ооьяснить сдвигом .мембранного лотенциала и вольт-амперной характеристики фрагмента.

На то, что эффект ингибирования не может быть вызван активацией ФДЭ, указывают следующие факты: во первых, величина эффекта не уменьшалась при использовании вместо цГМФ его слабогидролизуемого аналога 8ВгцГМФ; во вторых, проводимость фрагмента не восстанавливалась ИБМК (рис. 5 С; рис. б С); и, в третьих, ингибирование наблюдалось как на фрагментах с явно выраженной фосфодиэстеразной активностью, так и на фрагментах,

еффзкты можно нелинейностью

где таковая не наблюдалась.

Ингибирование, во всяком случае на фрагментах с медленной фазой проводимости, зависело' от концентрации ионов кальция -глубина падения проводимости при'1 мкМ кальция была в несколько раз больше, чем при 100 мкМ при той же концентрации белка (рис. 6 В, Е). Т. о. описанная выше регуляции проводимости таких фрагментов ионами кальция могла оказаться опосредованной белком 26кД. Чтобы проверить ето предположение, во время развития еффекта ингибирования медленной фазы (рис. 6 Б) проводилась аппликация белка 26кД также при низкой концентрации кальция (рис. 6 Е). Это приводило к быстрому скачку проводимости фрагмента, после которого продолжалось ее медленное падение. Скорость медленных изменений несколько возрастала в присутствии 26кД, что, вероятно, связано с уменьшением концентрации свободного кальция в результате связывания его белком. Обратимость еффекта ингибирования белком при низкой концентрации кальция (рис. 6 С) была несколько меньше, чем при высокой (рис. 6 Р), однако после отмывки физиологическим раствором проводимость полностью восстанавливалась (рис. 6 I). В тех случаях, когда аппликация белка проводилась после того, как еффект ингибирования медленной фазы достигал насыщения, это не приводило к изменениям проводимости фрагмента. Т.о. не исключено, что кальций и белок 26кД воздействуют на один и тот же пул каналов, однако, в силу существенных различий в кинетике эффектов, представляется вероятным предположение об их независимом действии.

Рис.6. Са-зависиыость ингибирования цГМФ-зависимой проводимости белком

2ькД. Отмечены точки, в которых производилась смена физилоги-ческих растворов: А, С, I - аппликация 100 мкМ ЦГМФ при концентрации свободного кальция 100 мкМ; Б - аппликация 100 мкМ цГМФ совместно с 1 мкМ белка 26кД; В, Р -аппликация 100 мкМ _г цГМФ при концентрации

свободного кальция ЮмкМ; Е - аппликация 100 мкМ цГМФ совместно с 1 мкМ белка 26кД при концентрации свободного кальция 10"амкМ; 0 -аппликация 100 мкМ цГМФ при 1 мМ ИЕМК и ¡С'мкМ свободного кальция; Н, J - аппликация исходного физиологического раствора, концентрации свободного кальция 100 мкМ,

М |*Ю 1М |Мв 1 МО им

Время после отрыва фрагмента, с

Зависимость активности белка от концентрации ионов кальция и корреляция наблюдавшихся случаев ингибирования с наличием медленной фазы проводимости фрагмента предполагают возможное участие такого рода эффектов в процессах адаптации ФР.

О механизме ингибирования цГМФ-зависимой проводимости фрагментов плазматической мембраны Н1Л1 трансдуцином.

В 1988 году Дэвис с соавторами впервые высказали предположение о том, что активированный трансдуцин способен ингибировать проводимость ионных каналов плазматической мембраны 'ФР (Davis et al, 1988). Годом позже в лаборатории биофизики рецепции ИБФ АН СССР было экспериментально показано ингибирующее действие препаратов трансдуцина на цГМФ-зависимую проводимость (полумаксимальный эффект при концентрации белка 1 - 3 мкМ) (Krapivinsky et al, 1989). По результатам этих экспериментов была предложена гипотеза, согласно которой генерация переднего фронта фотоответа может быть связана не только с гидролизом цГМФ, но также с ингибированием проводимости светозависимых каналов а субъединицей трансдуцина, переходящей с мембраны в цитоплазму ФР.

Однако такая интерпретация вызвала серьезные возражения со стороны ряда исследователей (Detwiller et al, 1990). Суть их заключалась в том, что наблюдавшиеся эффекты могут быть обусловлены активацией примембранной ФДЭ трансдуцином. Действительно, при отрыве фрагмента на нем возможно сохранение ФДЭ, использование вместо цГМФ его слабо гидролизу-емого аналога 8Вг-цГМФ, как в обсуждаемых экспериментах, не может полностью исключить возможные артефакты. Достаточно хорошим контролем явилось бы сравнение влияния трансдуцина на активированные цГМФ каналы в отсутствии и при наличии ИБМК.

Такие эксперименты были нами поставлены. Оказалось, что ИБМК не устраняет эффект трансдуцина и практически не сказывается на его развитии (рис. 7 В, С). ФДЭ-ая активность фрагмента сохраняется при многочисленных аппликациях цГМФ, в то же время отмывка трансдуцина раствором с исходной концентрацией цГМФ приводила, как правило, к полному восстановлению проводимости (рис. 7 D). Эти факты, а также отсутствие заметной разницы в развитии еффекта трансдуцина при замене цГМФ на 8Вг-цШФ убедительно свидетельствуют в пользу предположения о TOMt что

ингибирование препаратом трансдуцина проводимости непосредственно не связано с изменением скорости циклонуклеотида.

фрагмента гидролиза

Рис.7. Ингибирование цГМФ-зависиыой проводимости трансдуцинои. Отмечены точки, в которых производилась смена физиологических растворов: А. Б, аппликация 100 мкМ цГМФ; В - аппликация 100 мкМ цГМФ совместно с 1 мкМ трансдуцина; С - аппликация 100 мкМ цГМФ совместно с 1 мкМ трансдуцина при 1 мМ ИБМК, Е - аппликация исходного физиологического раствора.

Исследуя эффекты трансдуцина, мы обратили внимание на то, что проявление еффекта ингибирования хорошо коррелирует с наличием медленной фазы цГМФ-зависимой проводимости фрагмента (рис. 7, А). При втом максимальная глубина и кинетика ингибирования достаточно хорошо соответствуют амплитуде медленной фазы и кинетике ее развития. На фрагментах, проявлявших только быструю фазу проводимости, ингибирования, как правило, не наблюдалось. В результате представляется достаточно оправданным предположение об участии описанных эффектов в процессах световой адаптации ФР.

Время после отрыва фрагмента,

Влияние неокиоторфина на цШФ-зависимую проводимость.

При исследовании влияния неокиоторфина, нейропептида из мозга гибернирующих животных, на цГМФ-зависимую проводимость наблюдались еффекты трех типов: (1) полное ингибирование; (2) отсутствие еффекта; (3) частичное ингибирование с насыщением, т.е. увеличение концентрации пептида не приводило к увеличению глубины ингибирования. Эти результаты также свидетельствуют в пользу предположения о существовании субпопуляций цГМФ-зависимых каналов в фоторецепторной мембране, различающихся, в данном случае, по чувствительности к неокиоторфину.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Настоящая работа посвящена исследованию путей регуляции проводимости плазматической мембраны ФР позвоночных и условно может быть разделена на две самостоятельные части.

В первой'части исследовались механизмы регуляции, связанные 'С изменением концентрации агониста свего-зависимых кеналов цГМФ. Наблюдавшиеся в высоко нативной системе, каковой является изолированный фрагмент плазматической мембраны НСП, эффективный гидролиз 8Вг-цГМФ и сильная активация ФДЭ белком 26кД свидетельствуют в пользу предположения о генерация переднего фронта фотоогвета преимущественно в результате гидролиза цГМФ ФДЭ-зой.

Вторая половина работы посвящена исследованию альтернативных, не связанных с изменением концентрации цГМФ, путей регуляции проводимости мембраны НСП. Исследовалась взаимосвязь между кинетическими закономерностями реакции фрагментов на аппликацию цГМФ и регуляцией их проводимости ионами кальция. Показано, что снижение концентрации кальция приводит к обратимому ингибированию проводимости фрагментов, проявляющих двухфазную реакцию на аппликацию цГМФ. Глубина ингибирования соответствует максимальной возможной амплитуде медленной фазы. Также исследовано Са-зависимое ингибиро-вание проводимости фрагментов белком 26кД и связь етого эффекта с указанной выше регуляторной ролью кальция. Исследован механизм о ингибирования препаратами трансдуцина. Обнаруженные эффекты могут означать существование неизвестного до сих пор механизма световой адаптации ФР, реализуемого через "адаптацию" самого сьетозависи-мого канала. Го, что в мембране фоторецепторв возможно . существование различных субпопульций цГМФ-зввисимых Качалов подтверждают и результаты исследования влияния нэйропбптида из мозга гибернирукшдх адвопшх неокиоторфина на проводимость фрагментов.

вывода.

1. Показано, что аппликация Са-связывающего белка 26кД из НСП в концентрации * 1 мкМ к фрагментам, изначально проявлявшим фосфодиэстеразную активность, приводит к значительному (более чем на порядок) увеличению скорости гидролиза цГМФ. Эффект, вероятно, опосредуется неким внутриклеточным агентом. Т.о. может быть устранено одно из основных противоречий современной теории

фототрансдукции - противоречие между высокой скоростью генерации фотоответа и низкой расчетной.скоростью гидролиза ФДЭ-зой цГМФ.

2. Установлено, что скорость гидролиза 8Вг-цГМФ в системе, близкой к нативной, может не более чем на" порядок отличаться от скорости гидролиза цГМФ.

3. Показано, что для фрагментов, проявляющих двухфазную реакцию на аппликацию цГМФ, снижение концентрации кальция со 100 мкМ до ЮмкМ приводит к обратимому ингибированию проводимости на глубину, соответствующую максимальной возможной амплитуде медленной фазы.

4. Установлено Са-зависимое ингибирование цГМФ-зависимой проводимости фрагмента белком 26кД в концентрации °< 1 мкМ.

5. В силу существенных различий в кинетике аффектов, указанных в п. 3 и п. 4, представляется вероятным предположение об их независимости.

6. Показано, что ингибирование проводимости фрагмента препаратами трансдуцина, а также все аффекты, перечисленные в п. 3 и п. 4, не овязаны с изменением скорости гидролиза цГМФ ФДЭ-зой.

7. Продемонстрирована корреляция частоты проявления эффектов пл. 3, 4, 6с наличием медленной фазы проводимости. На этом основании представляется вероятным предположение об их опосредованности.

8. Предложена гипотеза, в рамках которой адаптация ФР обусловлена не только регуляцией активностей ФДЭ и ГЦ, но также другим процессом - "адаптацией" самого светозависимого канала.

9. Исследовано влияние неокиоторфина на проводимость фрагментов мембраны ФР. Полученные данные указывают на возможность существования различных субпопуляций цГМФ-зависимых каналов.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1.Никонов G.G., Филатов Г.Н., Любарский А.Л., Маринов B.C., Кокоз Ю.М..Алексеев А.Е. Влияние на проводимость цГМФ-зависимых каналов пеларгонидина, ротенона и нейропептидов из мозга гиберниру-гацих животных. Труды XV конференции молодых ученых МФТИ, 1990.

2.Kokoz Y.M., Filatov. G.N., Nikonov S.S., Lyubareky A.L., Alekseev A.E., Mikhaleva I.I., Svieryaev V.l., Fesenko E.E., Ivanov V.T. -A new peptide regulator of oell membrane oationio oonductanee. Abstracts of second Soviet-Spanish symposium on physioal ohemioal biology, Kiev, 1990.

3.Piiatov,Q.N., LyubarskyTA.L., Nikonov.S.S., Kooharjan R.A., and Fesenko, E.E. (1991) On heterogeneity of the oGMP-aotivated channels of the retinal rod. Abstr. Soviet-German Symposium "Receptors and Ionio Channels", Mcsoow, 1991.

4.N:'.konov,S.S., Filatov,G.N., and Fesenko,- È.E. (1993) On the Activation of Phoephodiesterase by a 26 kD Protein. FEBS LETT., v. 316, N 1, pp.34-36. ,

МФГИ Z2.OZ.9iz. ¿'Ы

rwp. ¿CO Э-^.