Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изолированный фрагмент мембраны НСП как модель фоторецепторной клетки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изолированный фрагмент мембраны НСП как модель фоторецепторной клетки"

ттсетпкзд жлпт^'я ттл таггктгх дэдитачтш п зпстеттаттгдлнш рккгтетп

на ггоавах рукошгсч

ХвяиЯт-зядэ ('ятар ЧЛтгптл OT.ni

УЛК 577.352.465

РЙОЩШ>АВДЩ 5РАГ?5ЯКг |явмврдрч НГЛ

как |эдлшп> яютда геортгощ клгосл

03.00.02 - "Биофияиуа"

диссзртшжи на еотдокатпее учввой степени кащшлага «йчятвд - натенатгтчеаких наук

ШТИНО - ХЗЗЗ

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН Научный руководитель:

доктор биологических наук Колесников С.С.

Официальные оппоненты:

доктор физико—математических наук, проф. Берестовский Г.Н.

кандидат биологических наук, в.н.с. Каламкаров Г.Р.

Ведущая организация - Филиал Института биорганической химии им.М.М. Шемякина

Защита состоится

1992 г

•в Ц

час. на

заседании СпециализированйЬго совета Д. 200.22.01 Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН по адресу: 14-2292 г.Пущино-на-Оке Московской области

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Автореферат разослан " " Цо-Д 0

1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

П.А. Нелипович

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

отуальность проблеыы. Традиционно информацию о процессах ютотрансдукции давали исследования целых фоторецепторных клеток-лектрофизиологические методы, либо биохимические эксперименты, в оторых in vitro изучались светозависимые реакхщи. В последнем лучае полученные данные легко интерпретировать, при етом, однако, сследуется далеко не нативная система. Соответственно, вопрос о ом, в какой степени результаты полученные in vitro, отображают роцессы происходящие in vivo всегда остается открытым. Достаточно расноречивой в этом отношении является эволюция данных о скорости ТФ-азной активности траясдуцина.

При изучении фотоответов целых фоторецепторных клеток сследовагель имеет дело с целостной системой. Это несомненное остоинство электрофизиологических методов, однако, однозначная нтерпрегация полученных данных в етом случае весьма атруднительна. Достаточно вспомнить,.что после того, как в 1972 егинс на основании электрофизиологических экспериментов формулировал свою знаменитую "Са2+- гипотезу" (Hagins,1972), этребовалось примерно 15 лет для того, чтобы выяснить истинную эль Са2+ в возбуждении фоторецепторов. Оказалось, что медиатором акте фоторецепции является цГМФ (Fesenlco et al., 1985), а Са /щественным образом определяет процессы адаптации (Yau et L. ,1990).

Изложенное позволяет прийти к заключению, что методический эдход, сочетающий в себе достоинства влектрофязиологических и «химических методов, в токе время, в значительной степени пленный их недостатков, может обеспечить заметный прогресс в зследовании процессов возбуждения фоторецепторных клеток.

Электрофизиологические данные (Kolesnikov et al.,1987) и шные электронной микроскопии (Roof,Heuser,1982) свидетельствуют том, что петчи мембран НСП могут содержать фрагменты ¡торецепторных дисков. В этом случае, по крайней мере, в ¡которых пвтчах должны функционировать основные ферменты >тотрансдукционного каскада, которые локализовании в дисках ->допсин, трансдуцин и фосфодаэстераза. Следовательно, Ьлированный фрагмент мембраны НСП, в принципе, способен отвечать г свет. Прямым доказательством этого являются эксперименты Эртеля írtel, 1990), наблюдавший 'фотоответы ineide-out фрагментов мбраны НСП.

Итак, изолированные фрагменты мембраны НСП при определенных ловиях способны отвечать на . свет аналогично целым

фоторецепторным• клеткам и, следовательно, сохраняя функционирующий каскад фототрансдукции за исключение водорастворимых компонент. Последние, очевидно, определяют лиш детали фотоответов, поскольку последние наблюдаются ив и отсутствии. Таким образом, исследования фотоответов изолированны фрагментов мембраны НСП могут оказаться тем подходом, которы сочетает достоинства електрофизиологических и биохимически методов.

Цель в задачи исследования. Целью настоящей работы являлос изучение изолированных фрагментов мембраны НСП как сложной систем и, прежде всего, исследование закономерностей фотоответо фрагментов.

Научная новизна в практическая ценность работы. Установлено) чт изолированные фрагменты плазматической мембраны НСП способк отвечать на свет ингибированием цГМФ-зависимой проводимости Показано, что в присутствии АТФ механические воздействия, а так к DgO могут приводить к необратимому подавлению цГМФ-зависимо: проводимости. Установлено, что Р-актин способен при определенны условиях модифицировать цПЮ-зависимую проводимость. Получении результаты свидетельствуют о том, что изолированные фрагмент?! являются удобной модельной системой для изучения механизме управления проницаемостью наружной мембраны НСП и процесса: фототранодукции.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовании 3 статьи ¿апробация. Основные положения диссертации докладывались на V1 симпозиуме "Механизмы сенсорной рецепции" (Москва,1992). Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзор; литературы, двух глав с описанием собственно экспериментальны: данных и их обсуждением, заключения, выводов, приложения < описанием использовывпгихся методов и материалов, а также списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 111 стр. i содержит 22 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕИШШЕ РАБОТЫ

(¿атери&Ш И ыетоды. Эксперименты были выполнены с использование! метода patch - olamp (Hamill et al, 1981). Объектом исследование являлись лягушки XENOPUS IAEYIS. Актин выделялся по метод (Spudioh,Watt,1971) из икроножных мышц лягушки RANA TEMPORARIA Как правило, использовался раствор следующего состава (мМ): 10< NaCl;0,2 СаС12; 1 HgCl2; 10 HEPES;pH 7.4 (НЕ-рингер). В некоторы: вкспериментах использовался раствор (мМ): 100 ЫаС1;0,1 T3GTA; О,' ШЛА 10 HEPES; рН 7.4 (OR-рингер).

I. Фотоответы изолированных фрагментов мембраны НСП

Феноменология действия цГХФ. На рис.1 представлена упрощенная сема экспериментов, в которых исследовалась цГМФ-активируемая юводимость изолированных фрагментов НСП.

В отсутствии цГМФ в тестовом растворе проводимость системы тектрод-фрагмент мембраны (далее просто пэтч) была невелика. Если ¡утрикле точная сторона петча омывалась раствором, содержащим цГМФ концентрации 10_5-10-4, М, то его проводимость возрастала от ¡скольких раз до двух порядков. Действие цГМФ было обратимым, |блюдалось в отсутствии нуклеозидтрифосфатов и многократно ^производилось на одном и том же фрагменте. Представленные ¡иные свидетельствуют о том, что на плазматической мембране НСП акционируют ионные каналы, активируемые цГМФ.

ЬГМШ Г и

1-

гж Г 250лСи . 20с ,

Рис.1 а - Упрощенная схема експериментов. б- цГМФ-индуцируемое увеличение проводимости 1Пз1с1е-оиЛ фрагмента мембраны НСП.

Изолированный фраглет. НСП как сложная систем. Изолирование эгменты биологических мембран получаемые и исследуемые методом Ьс11 - о1атр, обычно рассматриваются как простая система, держащая лишь ионные каналы. В то же время, ясно,, что клировэнный фрагмент может содержать мембранносвязанные эуктуры, наличие которых может в значительной степени эдопределять свойства фрагмента. Данные электронной микроскопии ю1,Неивег,1982) свидетельствуют о том, что при получении >лированныХ фрагментов мембраны НСП велика вероятность вместе с ¡зматической мембраной оторвать фрагменты мембран дисков, датрофизиологические исследования свидетельствуют о том, что в гаторых пвтчах функционирует фосфодиестераза (ФДЭ) (Ко1евп1ко7 а1.,1987). Об этом говорит тог факт, что при умеренных пдентрациях цГМФ проводимость таких пвтчей зависит от

концентрации ингибитора ФДЭ - изобутилметилксантина (ИВМК). Ря фактов свидетельствуют о том, что и другие ферменты каскад фототрансдукции (в основном локализованные на мембране дисков также функционируют в пэтче. Поэтому вполне разумно было ожидать что в при определенных условиях изолированные фрагменты мембран НСП будут отвечать на свет аналогично целой фоторецепторно: клетке, что в действительности и имело место в ряде экспериментов Фотоответ фрагментов лелбраны НСП в общей сложности на удалось получить 52 темно-адаптированных Inside - out фрагменте мембраны НСП, 39 из которых отвечали на аппликацию цГМФ ил 8ВгцШФ обратимым увеличением проводимости. В 11 случаях из 18 присутствии 50 мкМ ГТФ освещение фрагментов приводило ингибированию цГМФ- индуцированной проводимости. На рис.2 показан' изменение цГМФ- индуцированной проводимости inside - out фрагмент, мембраны НСП при освещении препарата вспышками света различно: интенсивности. Отметим, что в отсутствии ГТФ фотоответы » наблюдались. Аппликация 100 мкМ АТФ незначительно меняла фаз, возрастания фототока и ускоряла его восстановление более, чем на порядок.

мин 20 3D

0 г-

10

1

ГТФ цГМФ

ГТФ-

пА

-6

jjJ

11 г I

t L

цГТФ

Рис.2 Фотоответы изо лированного фрагмент мембраны НСП.С цито-плазмат-ой стороны: 50 мкМ ГТФ;Вспышки: 50 мс; 103; 6*103; 15*103 фотонов/мкм2

АТФ-зависимая

светочувствительность

цГМФ

аналогично целой фоторецепторной клетк< родопсина К в пэтче приводит к активацк

индуцируемого тока легко мокет быть обьяснена, если предположить что изолированные фрагменты мембраны НСП содержат главные фермент] каскада фототрансдукции - родопсин, трансдущш и фосфодиэстеразу Действительно, фотоизомеризация

б-белка, который в свою очередь активирует фосфодиэстеразу (ФДЭ) Последнее приводит к смещению равновесия иеаду гидролизом : диффузией цГМФ в сторону гидролиза и, тем самым, к сиияенк концентрации цГЫФ в приыеыбранном слое и уменьшению проводимости.

Саяачувстдгтелъноапь ЗБгцГПФ-тВуциробсвшой проводшости. ] ряде экспериментов в качестве агониста использовался 8ВгцГМФ, в 11

из которых свет эффективно ингибировал 8ВгцГМФ- индуцированный ток (рис.3). Как и в случае цГМФ, ингибирование тока имело место только в присутствии ГТФ. АТФ значительно ускорял восстановление 8ВгцГМФ-индуцированного тока и уменьшал амплитуду фотоответов (рис.4).

! о

2юН вЕг-цПИ

а

1 С

I f

а Ь

[ Г I

с d е

2ккМ 8Bi--uIW5

I

Время/юга

— O.IiA) АТФ —

t Время/шш

Рис.3 Фотответы inside out пвтча НСП'в присутствии 2 мкМ вВгцГМФ С цитоплаз.сторороны: 50 мкМ ГТФ;100 мкМ АТФ Вспышки- 50мс;а- 0,75* 103;Ъ-12,7*103;с-42,1# 103;d-55,1*103;e-74,5*

о 2

10 ; фотонов/мкм

Рис.4- АТФ зависимое восстановление 8ВгцГМФ индуцированного тока inside-out пэтча НСП

з

Вспышка-50 мс;12*10 ;

о

фотонов/мкм .С цитопл. стороны:50мкМ ГТФ потенциал на мембр:-20мВ

Согласно данным Эртеля (Ertel,1990), в inside-out фрагментах мембраны НСП фоторецептора функционирует гуанилатциклаза. В силу втого наличие в перфузирушцем растворе ГТФ может приводить к тому, что петч содер'лит определенное количество цГМФ, синтезированного de novo. Поетому вполне допустимо, что свет ингибирует не вВгцГМФ-индуцируемую проводимость, а проводимость, активированную синтезированным цГМФ. Однако, ГТФ в отсутствии цГМФ не вызывает увеличения проводимости фрагментов в темноте и, соответственно, не лндуцирует их фоточувствительности. Таким образом, количество синтезированного цГМФ в описываемых условиях пренебрежимо мало, [(обавление 8ВгцГМФ, в принципе, ничего не меняет, так как сонстанта ингибирования ФДЗ этим агонистом порядка 1 мМ (Barkdol it al.,1988). Следовательно, возможное увеличение проводимости фрагмента (на фоне 8ВгцГМФ-индуцированной проводимости) за счет шнтеза цГМФ весьма незначительно и не мо1»ет объяснить большие амплитуды фототоков в присутствии 8ВгцГМФ.

С другой стороны, 8ВгцГМФ не является абсолютно устойчивым к

гидролизу фосфодиэстеразой. Во всяком случае, именно неполной резистентностью 8ВгцГМФ обычно объясняется подавление светом тока, индуцированного инъекцией нуклеотида в целую фоторецепторную клетку (Macleish. et al.,1984). Согласно Баркдоллу (Barkdoll et al.,1988), скорость гидролиза цГМФ примерно на 2 порядка выше таковой для БВгдГМФ, поэтому естественно было ожидать, что фоточувствительность изолированных фрагментов НСП в присутствии 8ВгцГМФ будет существенно ниже чем в присутствии цГМФ. В некоторых экспериментах на темно-адаптированных фрагментах мембраны НСП 40 мкМ цГМФ и 2 мкМ 8ВгцГМФ индуцировали ток приблизительно одинаковой величины (рис.5А), что свидетельствовало о низком темновом уровне активности ФДЭ. В этих случаях удобно проводить сопоставление фоточувствительности фрагментов, которая может быть оценена непосредственно по амплитуде фотоответов. Оказалось, что фоточувствительность Inside-out фрагментов НСП в присутствии цГМФ действительно больше чем в присутствии 8ВгцГМФ, но не более чем на порядок (рис.5А). Это обстоятельство наводило на мысль, что неполная резистентность 8ВгцГМФ к гидролизу хотя качественно и позволяет объяснить подавление светом 8ВгцГМФ-индуцируемого тока, однако, в количественном отношении такая интерпретация вряд ли проходит. Чтобы внести ясность в данный вопрос, мы провели специальную серию экспериментов, суть которых состоит в следующем.

Используя конкурентный ингибитор ФДЭ - изобутилметилксантин (ИБМК) (Baehr.et al.,1979) можно уменьшить скорость гидролиза цГМФ и сделать ее равной скорости гидролиза 8ВгцГШ>. Если при этом подобрать концентрации агонистов пропорционально их EC5Q, то цГМФ + ИБМК и 8ВгцГМФ должны быть эквивалентны. Это качественное рассуждение можно обосновать более,строго.

На рисунке 5 представлены результаты одного из экспериментов, выполненных по обсуждавшейся выше схеме. Если

фотоответыобусловлены лишь процессами - диффузия агониста, его гидролиз и взаимодействие с цШФ-акгиаируемыми каналами - то на основании приведенных выше рассуждений следует ожидать, что поведение системы в присутствии 2 мкМ вВгцГМФ будет идентична таковому в присутствии 40 мкМ цГМФ + 1 мМ ИБМХ. В эксперименте оказалось, что своства Inside-out фрагментов мембраны НСП в данных условиях совершенно неэквивалентны. Как видно из рис.бВ. аппликация 40 мкМ цГМФ + 1 мМ ИБМК индуцируют ток, который по величине примерно на два порядка превышает ток, индуцированный 2 мкМ 8ВгцГМФ, соответственно, существенно отличаются и амплитуды фотоответов.Необходимо обметить,что фоточувствительность цГЫФ-за-висимого тока остается большей чем у тока.индуцированного ЭВгцГМФ.

_ 2ыкЫ евг-цп»

40 шМ цП».

Вреыя/шн

40hxU цГМ»

IiM ШК

Рис.5 Фотоответы пэт-чей в присутствии 2 мкМ 8ВгцГМФ;40 мкМ цГМФ(А);

или 40 мкМ цГМФ + 1 мМ ИБМК(В) Вспышки света как на рис.3.С цито-плазматической стороны: 50 мкМ ГТФ;100 мкМ АТФ; мембранный потенциал: - 20 мВ

с •-----

3 < I I Г I

Следует подчеркнуть, что смещение равновесия диффузия -гидролиз, приводящее к изменении приыембранной концентрации агониста, может быть так же обусловлено изменением условий циффузии. Например, структурные изменения в пвтче, индуцированные воздействием света, способны изменить эффективную длину диффузии молекул цГМФ. Даже при постояной скорости гидролиза это может привести к изменению концентрации агониста внутри петча. С точки зрения рассматриваемой схемы, 2 мкМ 8ВгцГМФ и 40 мкМ цГМФ +■ 1 мМ ИБМК также должны быть приблизительно эквивалентны.

Итак, выше мы предположили, что лишь три процесса - диффузия агониста, его гидролиз и активация соответствующих каналов -определяют все особенности поведения пэтчей в темноте и на свету. Проведенный анализ показал, что в этом случае 40 мкМ цГМФ + 1 мМ ИБМК и 2 мкМ 8ВгцГМФ должны быть еквивалентны с точки зрения электрических характеристик изолированных фрагментов НСП. Приведенные выше данные ясно демонстрируют, что это не так. Следовательно, существует еще какой-то процесс, не учтенный в приведенной схеме, который в значительной степени определяет свойства темноадаптированных фрагментов и вносит заметный вклад в формирование их ответов.

В принципе, существует еще одна возможность в рамках системы родопсин - трансдуцин - фосфодиэстераза - цГМФ- активируемые каналы объяснить описанные выше эксперименты. Как известно из литературных данных, G-белки, которые передают возбуждение самым разным эффекторным системам, могут регулировать активность ионных каналов - K+,Na+,Ca2+ каналы (Yatani et al.,1987а; Yatani et al.,1987b; Cantiello et al.,1989; Yatani et al.,1990; Kirsh et al.,1988; Hamilton et al.,1991; Cerione,1991). В то же время, по данным Крапивинского с коллегами (Krapivinsky et el.,1989) а-субьединица трансдуцина в присутствии ГТФ[7Б] ингибирует 8ВгцГМФ-

индуцируемую проводимость мембраны НСП. Поэтому, если а-субьединица в ответ на свет может выходить из мембраны диска в раствор, а затем диффундировать к плазматической мембране и блокировать цГМФ- активируемые каналы,то гидролиз цГМФ не нужен для обеспечения фоточувствительности изолированных inside - out фрагментов мембраны НСП.

Такое объяснение, однако, встречает ряд трудностей. Прежде всего отметим, что по данным Венетт (Ildefonse,Bennett, 1991) CL-субьединица не влияет на активность реконструированных ЦГМФ-активируемых каналов. Кроме того, не ясно, выходит ли ТдГТФ в раствор при освещении фогорецептора (bieb/nan et al.,1987 ' ; Mumby et al.,1990; Taylor,1990; Uhl et al.,1990), но даже если ето происходит, рассматриваемый механизм не удовлетворяет колличественным оценкам. Действительно, фотовозбукденный родопсин активирует порядка 500 транодуцинов (Stryer,1986). Общее число цГМФ- активируемых каналов в фоторецепторной клетке оценивается в 0,5-1*10б каналов. В нормальных условиях в темноте открыто 5% каналов. Общепринятая интерпретация этого факта состоит в том, что концентрация свободного цГМФ составляет около 1 мкМ в то время как 50 % каналов открыто при 20 мкМ цГМФ- Обесцвечивание одной молекулы зрительного пигмента приводит к закрыванию 3 % открытых каналов (см.для обзора Любарский,Фесенко,1987). Если предположить, что при поглощении одного фотона все (порядка 500) ТаГТФ становятся цитоплазматическим меосендаером (Chabre,1987; Chabre,Detterry,1989), то а- субьединицы трансдуцина должны будут взаимодействовать с 0,5-1*10® каналами. Это означает, ' что одна молекула ТдГТФ должна контролировать примерно 103 цГМФ-активируемых каналов. Ясно, что в этой ситуации при прямом взаимодействии ТаГТФ с каналами активность последних ингибировать невозможно. Даже, если предположить, что а- субьединицы трансдуцина каким-то образом производят отбор цГМФ- активируемых каналов по состояниям и взаимодействуют лишь с открытыми (т.е. связавшими цГМФ) каналами, то и в этом случае 500 Т^ГТФ должны ингибировать 1500 каналов. Если учесть, что изолированный фрагмент НСП - открытая система, то очевидно, что в случае фрагмента ситуация еще более трудна для объяснения фоточувствительности через блокирование каналов ТаГТФ.

Таким образом, проведенный выше анализ показывает, что фоточувствительность 8ВгцШФ- индуцированного тока трудно объяснить, если рассматривать лишь традиционные элементы фототрансдукционного каскада. Вероятно, следует признать, что существует еще какой-то неизвестный механизм, контролирующий

активность цГМФ- зависимых каналов. Этот гипотетический механизм должен аятипирояаяьст светом через G- белок, так как. фоточувствительность 8ВгцГМФ- индуцированного тока наблюдается только в присутствии ГТФ. Отметим так же, что рассмотренное предположение позволяет рационально объяснить действие ТдГТФ на 8ВгцГМФ- индуцируемую приводимость, в то время как прямое действие G- белка на цГМФ-активируемые каналы отсутствует. Ниже будут описаны эксперименты, в которых предпринята попытка выяснить молекулярную базу предполагаемого механизма.

2. Роль актина в функционировании цШВ-активируеиых каналов

Данные, изложенные в "Предыдущем разделе свидетельствуют о том, что фотоответы изолированных фрагментов мембраны НСП в присутствии 8ВгцГМФ невозможно корректно интерпретировать, если считать, что в петче функционирует лишь цГМФ-каскад с извесными из литературы характеристиками. В принципе, наблюдаемые закономерности можно объяснить, если предположить, что свойства цГМФ-каскада в петче отличаются от таковых ln vivo. Например, можно предположить, что гидролиз цГМФ в петче не описывается Михаелевской кинетикой и тогда многие аргументы, изложенные выше будут неправомерны.

Однако, существуют некоторые экспериментальные факты,, которые невозможно игнорировать. В частности, примерно ЗОЯ петчей не отвечают на аппликацию цГМФ или 8ВгцГМФ. Согласно контрольным экспериментам, цитоплазматическая сторона мембраны большинства подобных пэтчей доступна для агониста, так как амфотерицин, добавленный в перфузирующий раствор, индуцирует типичную катионную проводимость и, следовательно, встраивается в мембрану. Таким образом, ЦГМФ мембраны достигает, но G-каналы не активирует. Учитывая, что G-каналы распределены равномерно по поверхности НСП с плотностью 102-103 на 1 мкм-2 (Yau, Nakatani, 1985) существование "молчащих" пэтчей невозможно объяснить отсутствием G-каналов. Скорее всего, активность G-каналов действительно контролируется не только сорбцией цГМФ.

Этот вывод вполне согласуется с данными, полученными при исследовании фотоответов пэтчей и послужил стимулом к поиску гипотетического механизма управления G-каналами. Прежде всего обращает на себя внимание тот факт, что белок, формирующий в мембране НСП цГМФ-зависимый канал, выделяется совместно с белком 240 кДа ,а это свидетельствует об их сильной ассоциации в мембране. Белок-240 кДа был идентифицирован как спектриноподобный

белок ( Moldey et al.,1990). Последнее означает, что G-канал в мембране НСП может быть ассоциирован с актиновым цитоскелетом.

Необходимо подчеркнуть - многие рецепторные и транспорные мембранные белки ассоцированны с белками, образующие клеточный цитоскелет (Stossel et al.,1985; Cantiello et al.,1989). Обычно этот факт интерпретируется с точки зрения структурной организации мембраны. Однако, недавно было показано, что активность ионных каналов может регулироваться актиновыми' микрофиламентами (Cantiello et al.,1991) и , следовательно, цитоскелет способен играть определенную роль в регуляции ионного тронспорта.

Учитывая изложенное, мы предположили, что активность G-каналов в НСП может коррелировать с состоянием актиновых микрофиламентов, с которыми каналы взаимодействуют через актин-связывающий белок - спектрин. Данная точки зрения подкреплялась также тем обстоятельством, что актин идентифицирован во всем НСП (Vaugh.an,Fisher,1987; Luoian et al.,1987). Имелись также указания на то, что модификация цитоскелета в фоторецепторах может влиять на процессы трансдукции (Ребрик,Каламкаров,1989).

Сформулированную выше идею проще всего было бы проверить воздействуя цитостатиками на актиновый цитоскелет и регистрируявозможные изменения' в характеристиках цГМФ-активируемой проводимости. Однако, ряд обстоятельств делал такой подход неприемлемым. Прежде всего необходимо отметить, что механизм действия цитостатиков сводится к сдвигу равновесия мономер-полимер в сторону мономеров (Фултон,1987). Поэтому аппликация цитостатиков приводит к деполимеризации цитоскелетных структур. Если обрабатывать клетку цитостатиками и затем получать inside - out фрагменты, то потребуется значительное количество экспериментов для обеспечения статистической значимости результатов. Однако, в нашем случае обработка фоторецепторов цитохалазином приводила к тому, что вероятность получения гигаомных контактов падала более чем на порядок. Это обстоятельство делало обсуждаемый подход совершенно неэффективным. С другой сторрны, обработка изолированных фрагментов цитохалазином не приводила к значимым изменениям в свойствах петча. По всей видимости, отрыв фрагмента мембраны переводит его цитоскелетные структуры в условия, когда может происходить его деполимеризация, что в какой-то мере эквивалентно действию цитостатика.

2.1 Механочувствительностъ G- каналов.

Другим подходом к выявлению возможной роли примембранных

структур в функционировании каналов может быть изучение механочувствительности пвтчей. Действительно, если состояние цитоскелета каким-то образом определяет активность в-каналов, то один из способов выявить это - исследование пэтчей. при различных механических возмущениях.

Эксперименты показали, что О-проводимоеть незначительно варьирует при изменении давления в пипетке. Слабо зависели от величины и знака давления концентрационные зависимости проводимости от концентрации агониста. Наблюдаемые эффекты давления вполне ■ можно объяснить вариабельностью площади поверхности петча, через которую происходит транспорт ионов.

В то же время, оказалось, что в физиологических концентрациях (0.5-2'мМ) АТФ существенно увеличивает чувствительность цГМФ-зависимой проводимости к механическим воздействиям. В целом, феноменология действия давления на З-ггроводкмость в присутствии АТФ весьма разнообразна и ее полное описание выходит за рамки данной работы. Однако, с точки зрения сформулированной выше задачи, существенно следующее. Наиболее выраженные изменения в свойствах пэтчах, давление вызывало в тех экспериментах, когда оно менялось / от отрицательных значений до положительных и обратно (реверс). В этих случаях даже небольшие по величине вариации давлением (±10 см Ь^О) приводили к существенным количественным и качественным изменениям в характеристиках С-проводимостк. Так, на рис.б представлены концентрационные зависимости О-проводимости при-различных давлениях в пипетке. Как видно из рисунка, переход к положительным давлениям качественно мало что'. меняет в характере зависимости проводимости от концентрации агониста. Однако, после реверса, характер кривой драматически меняется - она становится бифазной. По всей видимости, часть 0-каналов переходят в состояние

I

с гораздо большим сродством к цГМФ.

Характерной особенностью эффектов давления на С- проводимость в присутствии АТФ является их необратимость. Более . точно, при переходе к положительным и последующем возврате к отрицательным значениям давления, более чем в 50%' случаев наблюдалось необрати-мое подавление цГМФ-зависимой проводимости фрагмента (рис.7). Многократное прохождение по шкале давлений от отрицательных к положительным значениям и обратно может приводить к полному ингибированию 0- проводимости. Следует подчеркнуть, что во многих экспериментах глубина модуляции 0- проводимости (в присутствии АТФ), при изменении давления, достигала 5-10 раз. Столь значительные количественные и качественные (рис.6 и 7) изменения проводимости трудно объяснить вариацией эффективной

0.75

. 0.50

0.25

0.00

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

я 2 0,4*1 лт*

-10

-5

ДАВШИЕ/Я Н20

10

:Рис.6 Влияние давления Л см Н^О) на концентра-"адионную зависимость. '(Г) -б; (а) +б; (О) - б ,С цитоплазма т. стороны:

мМ АТФ;0,5 мМ ИБМК; по обе стор.мембраны: ГШ- рингер

Рис.7 Зависимость нормированной С- проводимости от давления (см. Н^О)

'1- без АТФ, (7)-реверс 2-0.4 мМ АТФ.(□)-реверс С цигоплазмат. стороны: 50 мкМ цгаф;0,5 мМ ИВМК. По обе стороны мембраны: ЫЕ- рингер

площади поверхности изолированного фрагмента мембраны НСП. К тому же не ясно, каким образом изменение площади может быть связано с фактом присутствия АТФ в пвгче.

Следует подчеркнуть, что даже в случае широко исследуемых Имеханочувствительных каналов различных клеток нет ясности в молекулярных механизмах их механочувствительности (МоггуЕ,1990), тем более это справедливо в нашем случае. Несомнено одно, без существенных структурных изменений в петче вряд ли возможны необратимые и столь зачителыше гго величине эффекты давления на в-проводимость.

2.2 Влияние актива на С- проводимость

Описанные выше эксперименты позволяют прийти к важному выводу - структурный фактор может играть существенную роль в активности в-каналов мембраны НСП фоторецепторной клетки. Исходно предполагалось, что таким фактором может быть взаимодействие й-каналов с вктиновыми микрофиламентами. В связи с етим мы

попытались выяснить, не приведет ли к модификации свойств пэтча непосредственная аппликация актина.

"Молчащие* фрагленш. В тех случаях, когда inside - out фрагменты характеризовались высоким уровнем G-проводимости со стандартными характеристиками, инкубация пэтча в препарате актина не приводила к заметным изменениям электрических параметров изолированного фрагмента мембраны НСП. С другой стороны, если высокий уровень G-проводимости означает "нормальное"' состояние актиновых филаментов, то скорее всего актин и не должен модифицировать мембрану и следует ожидать, что эффекты актина могут проявиться в пэтчах с подавленной G-проводимостью.

Исходя из данной логики специально исследовались inside - out фрагменты мембраны НСП, которые не реагировали на аппликацию цГМФ. При втом специально убеждались в том, что отсутствие реакции пэтча на аппликацию агониста не обусловлено функционированием ФДЭ. Для этого цГМФ апплицировался на фоне 0.5-1.5 мМ ИБМК.

I - баи

2-50 urU ЦП!» + 1,5 1« Bat

3 - 50 ut qmt после imu

4 - ОТШВ

3

I.í

2

1,5 I- * Рис.8 Восстановление в-

проводимости молчащего фрагмента мембраны НСП аппликацией актина, по обе стороны мембраны: ГО- рингер

Оказалось, что в отсутствии цГМФ инкубация пэтча в препарате актина не приводит к заметному изменению проводимости. Однако, если после 10-20 минутной инкубации добавить в перфузирующий раствор цГМФ, то во всех случаях (п=7) наблюдалось обратимое увеличение проводимости. При этом, цГМФ-активируемая проводимость "оживленных" пэтчей, по своим свойствам была идентичной обычной проводимости. В частности, зависимость проводимости от концентрации цГМФ имела стандартную форму и характеризовалась

(рис.8). Следует то

препарат актина не восстанавливал й- проводимость.

Таким образом, инкубация в актине восстанавливает чувствительность "молчащих" пэтчей к цГМФ. Данное явление наблюдается в условиях, когда актин должен находиться в Р-форме. Следовательно, состояние актиновых мнкрофиламентов каким-то образом определяет активность в- каналов. Если белок - 240 кДа,

коэффициентом Хилла: 1,6- 2,0 и ЕС_ - 10-30 мкМ

2+ 2+

отметить, что если в инкубационной смеси отсутствуют, Са ,Iig

ассоцированный о О-каналом (Мо1йеу et а1.,1990), действительно относится к семейству спектрика, то, скорее всего, Р-актин взаимодействует непосредственно с комплексом О-канал-белок 240 кДа.

2.3 Действие 0Р0 на (г-проводимость

Нами было Ц-проводимость.

установлено, При ©том

что степень

в20

необратимомо подавляет

[ характер подавления 2+ Н+

й-проводимости инкубацией в 1)~0 сильно зависели от Са и Щ;

пл ох

Эффект 1>г0 в присутствии Саг+ и . в присутствии Саг+,%2+ замена 1^0 =» Бг0 » приводила к необратимому

подавлению й- проводимости пэтчей на 40-60%. Действие Б20 приводит не только к уменьшению 0-проводимости, но и сопровоздается некоторым изменением характера концентрационных зависимостей. Инкубация пэтчей в актине восстанавливала

С-проводимость, ингибированную В^О, как по величине гак и по характеру концентрационных зависимостей

Эффект 0 0 б отсутствии Са'

•2+ и

В отсутствии Са'

2+

0.5 0.4 0.1 0.2

Рис.9 Влияние замены Й^О В20 1^0 на в- проводимость. А.; 1 - контр-я концентрационная зависимость;

2- после инкубации в 1>20 В; 1- зависимость в Ю20; 2 - в Н^О после В20;

3- конц-я зависимость восстан-я актином-Н^О.По обе стороны мембраны: Ой- рингер

%2+эффекты 1>г 0 были еще более драматичными. В эксперименте, результаты которого представлены на рис.9 замена 1^0 =* Ь^О =» 1^0 приводит к необратимому подавлению в- проводимости - в 15 раз (в среднем 11— 2 раза) (рис.9А). Кроме того, 1>г0 вызывало существенное изменение характера концентрационных зависимостей (рис.9В). Собственно в 1>20 зависимость проводимости от концентрации цГМФ принимала колоколообразный вид (рис.9В,

кривая-1). При обратном переходе в Н^О проводимость еще более подавлялась, зависимость от концентрации агониста становилась монотонной (рис.ЭВ, кривая- 2), но не линеаризировалась з

координатах Хилла.

Последующая инкубация фрагмента в актине частично восстанавливала й-проводимость, что сопровождалось и восстановлением характера концентрационной зависимости (рис.9В, кривая- 3).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выше были рассмотрении основные результаты настоящей работы, которую условно можно разбить на две самостоятельные части.

Прежде всего, было показано, что изолированный фрагмент мембраны НСП способен отвечать на свет и, следовательно, содержит основные элементы фототрансдукционного каскада. Структурная организация фрагмента, видимо, близка к организации НСП, в то же время, его свойства можно исследовать в строго контролируемых условия. В связи с этим изолированный фрагмент может оказаться весьма эффективной модельной системой для изучения процессов фототрансдукции.

Исследование фотоответов изолированных фрагментов мембраны НСП позволило прийти к следуидему заключению. В качественном отношении закономерности фотоответов можно вполне объяснить, если считать, что только три процесса лежат в основе наблюдаемой феноменологии - диффузия агониста в пэтч, его гидролиз и взаимодействие с цГМФ-акгивируемыми каналами. Однако, способность фрагментов отвечать на свет в присутствии 8ВгцГМФ - аналога цГМФ, резистентного к гидролизу,- и анализ данных свидетельствуют о том, что три процесса, указанные выше, не могут объяснить все закономерности фотоответов. На основании этого было сделано заключение, что в НСП, вероятно, функционирует еще некий светозависимый механизм, контролирующий активность цГМФ- зависимых каналов и несвязанный с гидролизом ЦГМФ.

Вторая половина работы посвящена попыткам выявить молекулярные основы этого гипотетического механизма. Ряд фактов свидетельствовали о том, что актиновый цитоскелет может играть определенную роль в функционировании ионных каналов. В частности, в пользу подобной точки зрения свидетельствовали данные работы (Сап-Ые11о et а1.,1991), в соответствии с которой короткие филаменты Р-актина (но не длинные и не С-актин) могут активировать №а+-каналы эпителиальных клеток. В специальных экспериментах выяснилось, что при определенных условиях Р-актин действительно влияет на свойства пэтча. В принципе,можно предположить, что актин связывается с актиновыми филаментами, сохранившимися в пэтче и с мембраной. Так или иначе, имеется "принципиальная возможность, того, что часть экзогенного актина перейдет в мембраносвязанную форму и

- 16 - .

модифицирует свойства мембраны. Важно другое, если бы действие актина носило неспецифический характер, то оно проявлялось бы вне зависимости от свойств G-проводимости. Однако, эффекты актина были наиболее выраженны в тех условиях, когда G-проводимость теряла свои стандартные характеристики, которые восстанавливались аппликацией актина. По нашему мнению, это означает, что имет место специфическое взаимодействие G-каналов и актиновых микрофиламентов.

Изложенные факты позволяют предположить следующее. Характер взаимодействия G-каналов с актиновыш иикрофилаыентаии в НСП определяет свойства G-проводиыости. Изменение состояния филаыентов является фактором регуляции активности G-каналов и ыовет, следовательно, использоваться в процессах фототрансдукции.

В настоящий момент имеется слишком мало экспериментальных данных, чтобы достаточно глубоко обсуждать справедливость данной гипотезы. Тем не менее, на ее основе можно дать рациональное объяснение нескольким экспериментальным фактам. Например, фотоответам пэтчей в присутствии негидролизуемого аналога цГМФ-8ВгцГМФ, объяснить почему G-белок ингибировал G-проводимость изолированных фрагментов мембраны НСП (Krapivinsky et al.,1989) и не действовал в реконструированной системе (Ildefonse, Bennet, 1990). В любом случае только дальнейшие эксперименты подтвердят или опровергнут истинность предложенной гипотезы.

ВЫВОДЫ

1- Показано, что изолированные фрагменты плазматической мембраны НСП способны отвечать на свет и являются удобной модельной системой для изучения процессов фототрансдукции.

2- Исследовании закономерности фотоответов изолированных фрагмен-тов НСП. Полученные данные свидетельствуют о том, что активность цГМФ-зависимых каналов, возмояшо, регулируется без изменения концентрации агониста.

3- Показано, что в присутствии АТФ механические воздействия могут приводить к необратимому подавлению цГМФ-зависимой проводимости. Полученные данные свидетельствуют о существовании структурного фактора, контролирующего активность цГМФ-зависимых каналов.

4- Показано, что примерно 30$ изолированных фрагментов не отвечают на аппликацию цГМФ. Одной из причин существования подобных "молчащих" фрагментов могут быть механические возмущения, возникающие при отрыве фрагмента мембраны от целой клетки.

5- Установлено, что инкубация изолированных фрагментов мембраны

НСП в D20 приводит к необратимому подавлению цГМФ-зависимой проводимости.

б- Показано, что F-актин способен восстанавливать цГМФ-зависимую проводимость, ингибированную действием DgO и индуцировать ее у "мочащих" фрагментов. На основании этих фактов и литературных данных выдвинуто предположение, что цГМФ-активируемы'е . каналы ассоцированны в нативной мембране . НСП с актиновыми микрофиламентами. Состояние микрофиламентов и характер их взаимодействия с каналами являются фактором, определяющим активность цГМФ-зависимых каналов.

По материалам диссертации опубликовании следующие работы:

1 - А.В.Косолапов, М.Ч.Халифа-заде, С.С.Колесников Фотоответы изолированных фрагментов мембраны НСП. "Сенсорные системы", 1992, т.б, N 3, стр.55-57

2- М.Ч.Халифа-заде, С.С.Колесников Механочувствительность цГМФ- активируемой проводимости НСП. "Сенсорные системы", 1992, т.6, N 4, стр.22-24

3- A.V.Kosolapov, M.Ch.Khalifa-zacLe, S.S.Kolesrikov Photosentivity of 8BrcGMP- induceid conductance In ROS- excised pathes. PEBS LETT.,1992, v.305, p.174-17S

26.10.92 г. Зак.5176Р Тир.85 экэ. Уч.-изд.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПКЦ РАН