Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическая модель для скрининга биологически активных веществ, способных стимулировать морфогенез мембранных дисков наружного сегмента фоторецепторных клеток

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Биологическая модель для скрининга биологически активных веществ, способных стимулировать морфогенез мембранных дисков наружного сегмента фоторецепторных клеток"

РГб о

2 3 MAP 1994

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗБИТИЯ им. Н К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 591. 573. 3. 018.2: 577.15/19

ПОПЖЙСКАЯ Валентина Антониновяа

БИОЛОГИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ СКРИНИНГА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, СПОСОБНЫХ СТИМУЛИРОВАТЬ МОРФОГЕНЕЗ МЕМБРАННЫХ ДИСКОВ НАРУЖНОГО СЕГМЕНТА «ОТОРЩВДОРИЫХ КЛЕТОК

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

Автореферат

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Мэеква - 1994

Работа выполнена в Лаборатории клеточной диф^ренцировки Института биологии развития им. К К. Кольцова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

О. Г. СТРОЕВА

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ■ профессор В. Я БРОДСКИЙ кандидат биологических наук Г. Г. ЗИАНГИРОВА

Ведущая организация - Московский Государственный Универсишт им. М. Е Ломоносова

Защита диссертации состоится " СЛпрги^ 1994 г. в и Л часов на заседании специализированного совета Д. 002.85.01 при Институте биологии развития им. Е К. Кольцова РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, д. 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н К. Кольцова РАН по адресу: г. Москва, ул. Вавилова, д. 26

Автореферат разослан I а а/>77А 1994 г.

Ученый "секретарь специадизтованного совета, кандидат биологических наук

Е. Ы. Протопопова

I. ВВЕДЕНИЕ.

Роль фундаментальных наук в раскрытии этиологии наследственных болезней исключительно велика. Одним из таких • заболеваний, на борьбу с которыми объединяются усилия исследователей и . врачей, является пигментный ретинит (ПР), открытый в середине прошлого века Это название охватывает сборную группу глазных заболеваний, объединенных общей симптоматикой. Как правило, заболевание обнаруживается после двадцатилетнего возраста и проявляется в нарушении темновой адаптации, сужении поля эренйя, исчезновении электроретинограммы и часто кончается слепотой. Есть формы этого заболевания, поражающие зрение уже в детстве. Слепота наступает по причине разрушения фоторецепторного слоя сетчатки. Первыми постепенно погибают палочки - фоторецепторы сумеречного зрения, у человека обильные в периферических зонах глазного дна; отсюда название - периферическая дистрофия сетчатки. Ш способу наследования и продолжительности латентной фазы ПР подразделяется на три основные формы - аутосомно доминантную, ауто-сомно рецессивную и связанную с Х-хромосомой; каждая из них может включать множество подгрупп. 'Распространенность ПР в человеческой популяции по усредненным данным приближается к соотношению 1 на 3500-5000 человек с повышением встречаемости в регионах, где нередки близкородственные браки (Marmor et al. , 1983).

Начальные процессы в развитии ПР у человека неизвестны, так как для морфологических и биохимических исследований сетчатка таких больных становится доступной только после их смерти. Большую роль в интенсификации данного направления исследований сыграло открытие и разведение лабораторных животных с.разными формами наследственной дегенерации сетчатки, по конечному результату сходных с ПР (LaVail, 1981; Farber,- 1988). Несмотря на прогресс молекулярно-генетических знаний в этой области ПР остается неизлечимым заболеванием. Изучение ПР вылилось в одну из наиболее актуальных областей исследований в офтальмологии. Их цель -решить проблему этиологии ПР на уровне процессов, протекающих в течение латентной фазы болезни. Венцом таких поисков, как считается, должно стать создание лекарств на научной основе после того как будут идентифицированы метаболические пути, кодируемые^ генами, мутация которых приводит к развитию ПР.

Но пока ученые ведут исследования, все еще очень далекие от счастливого завершения, мнохество людей, страдающих ИТ, н^уклон-

но .приближаются к слепоте» теряя по одним расчетам 4-SZ, по другим 15-17% оставшегося поля зрения в год (Massof, Finkelstein, 1987). Это оправдывает поиск лечебных средств, не дожидаясь полного раскрытия этиологии всех форм ПР. В настоящее время исследования идут по трем направлениям: (1) Поиск лекарственных препаратов для фенотипической коррекции процессов, ведущих к гибели фоторецепторных клеток. Для ориентации в этом вопросе оказались полезными два наблюдения: а) после начала деструктивных процессов в сетчатке потеря периферического зрения осуществляется с одинаковой скоростью в сравнимые отрезки времени в разных типах ПР (Massof, Finkelstein, 1987), и 0) при некоторых формах наследственной дегенерации сетчатки гибели палочек предшествует замедление роста их наружных сегментов за счет какого-то дефекта в формировании мембранных дисков наружных сегментов палочек (МД НСП) (LaVai1, 1981). Эти факты позволяли надеяться на некую общность процессов на последней стадии болезни при разных формах ПР и на возможность влиять на ход болезни путем стимуляции морфогенеза МД НСП (Massof, Finkelstein, 1S87).

На этом пути недавно были получены впечатляющие достижения. Однократная инъекция в стекловидное тело фактора роста фиброб-ластов (bFGF) в дозе 1 мг оказалась достаточной для предотвращения дегенерации фоторецепторных клеток у крыс RCS с наследственной дистрофией сетчатки (Faktorovich et al. , 1990). Но это пока неприменимо к человеку так как bF6F является митогеном, и возможны непредсказуемые побочные эффекты типа стимуляции вазопро-лиферации в сетчатке (Вок, 1993). Кроме того нет научных доказательств того, что этиология наследственной дегенерации у крыс RCS и у человека с той или иной формой ПР одинакова. В отечественных клиниках с 1971 г. для лечения ПР применяется препарат ЭНКАД, который в среднем в ЗОХ случаев задерживает наступление слепоты (Кацнельсон и др., 1986), однако механизм его действия неизвестен. Для успешного развития этого направления помимо всего прочего важно иметь адекватные модели, для тестирования искомой активгчгги среди лекарственных средств, и для изучения механизма их действия. В силу случайности мутаций ни одна из форм наследственной дегенерации сетчатки у животных не тождественна известным формам ПР у человека, и поэтому до полного раскрытия

этиологии болезни каждого типа не может служить вполне адекватной моделью для ПР. Таким образом проблема разработки "независимых" биологических моделей для испытания активности средств, предлагаемых в качестве лечебных при наследственных дегенерациях сетчатки, является составной частью в развитии этого направления. (2) Трансплантация клеток или тканей, взятых от генотипи-чески нормальных индивидуумов, взамен однотипных тканей, наследственно пораженных или разрушенных дегенерацией в глазах реципиентов, представляет второе направление в попытках лечения наследственных дегенераций сетчатки. Такие операции оказались успешными при пересадке клеток здорового пигментного эпителия взамен больного у конгенных. линейных крыс RCS в предотвращении развития дегенерации фоторецепгорных клеток у мутантных животных (Li, Turner, 1988; Gaur et al., 1992). Однако на человеке такие операции пока невозможны- в силу неизбежной гистонесовместимости между донором и реципиентом. Метод рекомбинантной ДНК для преодоления гистонесовместимости в принципе мог бы быть применим для создания универсальных донорских клеток. Теоретически представи-мы и другие подходы,. но все они в практическом плане остаются пока проблематичными (Вок, 1993). (3) Подобно тому, как клетки и ' ткани пересаживаются от донора к хозяину, могут быть получены и трансгенные индивидуумы, Успешные примеры тому дали опыты на гомозиготных мутантных мышах, несущих гены rd и rds, с наследственной дегенерацией сетчатки. В результате трансгенных экспериментов, осуществленных на 1-дневных зародышах, родились животные с излеченной сетчаткой (Вок, 1993). Обсуждаются и другие подходы к генной терапии пораженных мутацией тканей, например, использование в культуре вирусного векторного переноса генов в больные клетки из здоровых с последующей их трансплантацией в глаза пациентов (Вок,. 1993). Каждый из трех предлагаемых путей лечения ПР имеет положительные примеры на животных, но ни один из них, за исключением препарата ЭНКАД, пока в своем сегодняшнем виде не может быть применен к человеку. Следовательно, каждый из них остается открытым полем для дальнейших исследований.

Цель работы. Первоначальной целью работы было выяснение воп-, роса о клеточной системе в глазу, первично затрагиваемой ЗННА-1 Дом, желательно с раскрытием явления на цитологическом уровне.

После того, как в данной работе было показано на мугантных и ге-нотипически нормальных крысах, что ЭНКАД стимулирует морфогенез МЛ НСП, возникла задача обосновать биологическую модель, пригодную для поиска и количественной оценки активности препаратов для лечения ПР и на ее основе провести тестирование ряда препаратов в поисках такой активности.

Актуальность задачи. Поиск и оценка лекарств для лечения ПР, является актуальной задаче., для клинической офтальмологии.

Новизна работы. Епервые экспериментально с использованием электронной микроскопии доказано, что препарат ЭНКАД, применяемый в клинике для лечения ПР, стимулирует морфогенез наружных сегментов палочек. Впервые разработана биологическая модель, с помощью которой возможен поиск и количественная оценка биологической активности веществ в отношении стимуляции морфогенеза наружных сегментов палочек. Впервые показано, что пара-аминобен-зойная кислота является активным препаратом в стимуляции морфогенеза наружных сегментов фоторецепторных клеток.

Практическая значимость. Результаты работы могут быть использованы в офтальмологической клинике в создании курса лекарственной терапии для ряда глазных заболеваний, в том числе некоторых форм ПР. Разработанная биологическая модель может быть использована в поиске новых лечебных препаратов с морфогенетической активностью, а также для выявления активных фракций из сложных препаратов растительного и животного происхождения того же назначения.

Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на III Всесоюзн. конференции по актуальным вопросам детской офтальмологии (Суздаль, 1989), на заседаниях Ученого совета НИИ глазных болезней им. Гедьмгольца МЗ РФ (Москва, 1989, 1991), на семинаре НИЛ биомодедей РАМН (Отрадное, 1992) и на заседании Отдела эмбриологии МБР им. Н. К.Кольцова РАН (Москва, 1994).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 166 стр. т* состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Материал и метод, Результаты исследований, Обсуждение, Выводы. Список литературы состоит из 273 наименований. Работа содержит 21 микрофотографий, схем и график, а также 25 таблиц.

Публикации. Ш теме диссертации опубликовано 9 работ.

МАТЕРИАЛ И ЦЕТОД.

В качестве объекта исследования были использованы мутантные крысы Campbell с наследственной дегенерацией сетчатки, несущие тот же мутантный ген, что и крысы RCS, генотипически нормальные серые крысы (СК) и мутантные мыши rd с наследственной дегенерацией сетчатки. Крысы Campbell- розовоглазые, бледно-капюшонные животные, гомозиготные по наследственной регинальной дистрофии сетчатки, были переданы нам проф. Р. Н. Эгингоф (Институт эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова РАН, С. -Петербург) в 1982 году. В настоящее время крысы Campbell разводятся в виварии ИБР АН СССР на' основе инбредного скрещивания и содержатся в ре-жида циклического света (12 ч света - 12 ч темноты). Серые крысы СК, потомки диких пасюков, с 1952 года разводятся в виварии Института биологии развития-им ER Кольцова РАН на основе посемейного скрещивания и также содержатся в режиме циклического света. Беременные самки серых мутантных мышей линии CBA/J были получены из Научно-исследовательской лаборатории экспериментальных биологических моделей АМН. СССР и сраау использованы е экспериментах. Во всех исследованиях как при изученкг нормального развития,.так и в экспериментах, использовали животных с точной датой рождения. День рождения крыс и мышей обозначали как постнатальный нулевой день (ГЮ), Животных проживших 24 часа, считали односуточ-ными (Ш), проживших 48 часов - двухсуточными (П2) и т.д. Возраст животных, использованных в разных опытах, указан в соответствующих разделах главы "Результаты исследования". Новорожденных 'животных умерщвляли декапитацией, а взрослых усыпляли эфиром, и глаза обрабатывали для электронной микроскопии.

Для электронно-микроскопического исследования животных умерщвляли через 1 час после начала светового периода Глазные яблоки фиксировали в 2% глютаровом альдегиде на фосфатном буфере рН 7.4. Затем глаз разрезали по лимбу. От склеральной части глаза по окружности отрезали полоску периферии шириной 1-2 мм. Оставшуюся центральную часть склерального отдела глаза разрезали на 10-12 секторов по радиусам сходящимся у головки зрительного^ нерва, и держали в глютаровом альдегиде до 2-3 час. Затем после промывания в 0.2 Ч растворе сахарозы на том же буфере, фиксиро-

вали 1 час в 1% растворе четырехокиси осмия. После обезвоживания в спиртах кусочки заднего сектора глаза заключали в смолу ERL 4206 или аралдит, ориентируя таким образом, чтобы все срезы содержали участки сетчатки, прилегающие к головке зрительного нерва. Ультратонкие поперечные срезы, содержащие пигментный эпителий и наружные слои сетчатки контрастировали 3% уранилацетатом и нитратом свинца по Рейнольдсу. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB Ultratoine Л1, испрльзуя стеклянные ножи. Срезы просматривали на электронном микроскопе Tesla BS-500 и фотографировали на JEM СХ II.

КЪрфометрию поперечных ульгратонких срезов наружных слоев сетчатки для количественной оценки интенсивности морфогенеза НСП у всех трех линий животных проводили на экране электронного микроскопа Tesla BS-500. Метод морфометрии в применении к объекту данного исследования был разработан в ходе работы и будет представлен в разделе "Результаты исследований".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ЭНКАД- Препарат ЭНКАД (фукс и др. , 1971), представляющий собой смесь рибонуклеотидов - результат ферментативного гидролиза дрожжевой РНК, был предложен для лечения ПР. Клиническое применение этого препарата выявило контингент больных с ПР (около ЗОХ), у которых оказались возможными даже при давности процесса в 10-15 лет временное восстановление или улучшение зрение либо задержка прогрессирования болезни, иногда с длительным эффектом при повторных курсах инъекций ЭНКАДа (Фукс и др., 1971; Трутнева и др., 1972; Трутнева и др. , 1973; Авцын и др., 1977; Кацнельсон' и др., 1978; Кацнельсон и др., 1982; 5укс и др., 1985; Кацнельсон и др., 1986). Согласно представлениям этой группы исследователей ПР развивается вследствие нарушения нуклеотидного обмена. Они рассматривали лечебный эффект ЭНКАДа как заместительную терапию. Однако если заместительное действие ЭНКАДа затрагивает только метаболизм, терапевтический эффект должен быть кратковременным, а он сохранялся месяцами. Это, заставляло предполагать возможность закрепления эффекта на каком-то структурно-функциональном уровне. Необходимо было найти, какие клетки сетчатки первично реагируют на действие ЭНКАДа, что требовало адекватной

лабораторной модели.

Исходя из того, что в зрелой сетчатке, единственным лабильным морфогенетическим процессом является обновление НСП за счет непрерывно образующихся новых Щ, мы предположили, что ЭНКАД, вводимый в организм пациентов, может влиять именно на этот процесс, интенсифицируя его. В качестве объекта исследований для этой цели были взяты крысята Campbell в возрасте первых полутора недель после рождения, когда ретинальные реснички преобразуются в НСП и процесс еще не осложнен вторичными патологическими явлениями на морфологическом уровне. Так как первые признаки улучшения зрения при применении ЭНКАДа в клинике отмечаются на 6-8 дни после начала Курса лечения, то чтобы обнаружить, какая клеточная система первой реагирует на это действие, мы фиксировали животных в разных опытах на П7 или на IB после 6-8 дневного курса соответственно при однократных ежедневных инъекциях ЭНКАДа, начиная с т. Если за лечебный эффэкт ЭНКАДа ответственна предполагаемая интенсификация морфогенеза НСП, то можно было ожидать найти более интенсивное преобразование ресничек в НСП в опыте по сравнению с контролем. .Этот раздел работы распадается на 4 подраздела.

Сравнительное электронно-микроскопичеоте исследование ' развития наружных сегментов фоторецепторных клеток у крыс Campbell и СК. У крыс Campbell патогенез сетчатки начинается после открытия век и выражается в замедлении роста НСП (Yates et al. , 1974). Для того чтобы выяснить, не затрагивает ли мутация самые ранние процессы формирования НСП, было проведено электронномикроскопичес-'кое исследование преобразования первичных ретинальных ресничек в ВЗП у мутантных крыс CaiipbelГ с. наследственной дистрофией сетчатки в сравнении с генотипически нормальными крысами СК в период между рождением и открытием век.

Первые немногочисленные реснички еще незначительных размеров обнаруживаются уже у новорожденных животных, как и у крыс Вистар (Galbavy, Olson,- 1979). На этой стадии апикальные поверхности внутренних сегментов палочек и пигментного эпителия ппотно прилегают друг к другу, при этом апикальные отростки последнего расположены параллельно плоскости соприкосновения обеих структур! глаза. В местах, противолежащих образующимся первччннм реслич-

наружный сегмент палочки

Рис. I. Схема, нлдюстрмруюимя этапы развития НСП крысы (Ре ИоЬмШ. 1960)

кам, на поверхности пигментного эпителия возникают глубокие ци-гоплаа магические впячивания, в которые первичные реснички плотно входят как пшата в ножны; индивидуальность цитоплазматических мембран сетчатки и РПЭ при этом сохраняется. В зоне впячивания в пигментном эпителии отсутствую® апикальные отростки и пиноцитоз-ные пузырьки, многочисленные в приникающих зонах апикальной поверхности клеток пигментного эпителия. Насколько нам известно, этот этап взаимодействия первичной реснички и пигментного эпителия описан впервые.

По мере увеличения и дифференцировки ресничек их контакт такого рода с пигментным эпителием прерывается и растущие реснички располагаются длинной осью параллельно поверхности сетчатки, -будучи зажатыми между сетчаткой и пигментным эпителием. Начиная с П 7, когда образуется межфоторецепторное пространство, возникает расширение цитоплазмы на апикальном конце реснички, которое подвергается изменениям, знаменующем их преобразование в МД НСП в соответствии со схемой Де Робертиса (1960) (Рис. 1). Нам не удалось встретить МД в ресничках 3-суточних крыс. В сетчатке 5-суточных животных из обеих линий крыс реснички, содержащие ВД, встречаются редко. Величина и ориентация возникающих МД сильно варьирует. В сетчатке крыс в возрасте П 5-П 9 встречаются все стад"-* развития ресничек, включая саше ранние, что свидетельствует о том, что первичные.реснички образуются в сетчатке' не одновременно, а порционно. Реснички, претерпевающие преобразование в НСП, встречаются в виде очагов, разделенных участками апикальной поверхности сетчатки, свободной от ВД. Благодаря низ-

кой плотности формирующихся БСП на изучаемых стадиях только часть из них ориентирована вертикально по отношению к пигментному эпителию, остальные располагаются под разным углом наклона по отношению друг к другу и пигментному эпителию. Часто МД одной реснички плотно, прилегают к ВД другой, так что в очагах образующихся МД не всегда можно очертить границы индивидуальных HCIL В сетчатке на П 9 уже можно встретить полностью сформированные НСП с правильной поперечной ориентацией ВД. К моменту открытия век сетчатка обеих' линий крыс имеет сформированные КСП, плотно прилегающие друг к другу и ориентированные перпендикулярно к пигментному эпителию". Согласно данным электронной Микроскопии о времени возникновения первичных ресничек и характере их преобразования в ГОП в течение первых двух недель после рождения .нами, не было найдено визуальных различий между крысами Campbell и СК. Электронно-микроскопическое исследование действия препарата ЗН-КАД на ШП у крыс Campbell. ЭНКАД в ампулах был получен нами из Отдела патологии сетчатки НИИ глазных болезней им. Гельмгольца. Животным подопытной группы один раз в сутки, утром вводили подкожно 0.1 мл 3.5 % ЗНКАДа, а животным контрольной группы. 0.1 мл 0,9 X NaCl. На П 7 или на П 9 животны умерщвляли путем декапи-тации, глаза фиксировали и затем обрабатывали для электронно-микроскопического исследования.

В первом опыте в контроль и опыт крысята были взяты из разных . пометов. При просмотре ультратонких поперечных срезов на П7 и П9 визуально была, заметна большая разница между опытом и контролем, указывающая на интенсивную стимуляцию морфогенеза НСП в 'опыте. У. животных подопытной группы на ГГ7 небольшое межфоторе-цепторное пространство было занято срезанными продольно.наружными сегментами фоторецепторов и их многочисленными фрагментами с образующимися МД, располагающимися в различных плоскостях.

У животных контрольной группы отдельные ВД НСП и их фрагменты встречались редко и занимали небольшую плошадь межфоторе-цепторного пространства. Эти яркие отличия между опытом и контролем, тем не менее, вызвали у нас сомнения в достоверности вывода о стимулирующем.действии,ЗНКАДа, так как выбор срезов дл^; .'просмотра, естественно, мог быть случайным. Кроме того могли быть различия, между опытом к контролем .вследстзье неоднородности

животных из разных пометов. Для точного вывода была необходима количественная оценка полученного эффекта.

Морфометрический метод для количественной оценки стимулирующего действия препарата ЗНКАД. Для количественной оценки площади, занимаемой ВД НСП в межфоторецепторном пространстве сетчатки новорожденных крыс, понадобилась специальная разработка морфометрического подхода, адекватного для данной системы. Этот, подход был разработан при большой • консультативной помощи профессора С. Б. Степанова и сотрудницы нашей лаборатории И. Г. Пановой, которым, пользуюсь случаем выразить большую благодарность.

Морфомегрию очагов мембраногенеза проводили на экране электронного микроскопа Теэ1а В5-500 (ЧССР) при увеличении 14 ОООх, анализируя поперечные ультратонкие срезы, сделанные с блоков, содержащих сетчатку и пигментный эпителий из центральной зокы глазного дна При данном увеличении диаметр поля на экране электронного микроскопа примерно соответствует ширине апикальной части внутреннего сегмента фоторецептора (1,6 мкм) на поперечных срезах. За очаг мембраногенеза принимали единичные ЫД или их скопления в поле зрения, расположенные в межфоторецепторном пространстве между апикальными микровиллами пигментного эпителия и апикальной поверхностью внутренних сегментов. Оценку морфогенеза наружных сегментов проводили по 4-бальной системе, отражающей категории условной площади поля зрения, занимаемой дисками (М): -отсутствие МД в поле зрения - "категория 0" - М=0; -ЫД занимают около 1/3 поля зрения или меньше - "категория 1" - М-1/3; -МД занимают 1/2 поля зрения - "категория 2" - М-1/2; и -МД занимают 2/3 поля зрения й более - "категория 3"- Ы=2/3.

Данные морфометрии срезов располагали в таблицы и обрабатывали статистически. Первичные данные о числе полей каждого типа, -полученные с экрана электронного микроскопа записывали в столбики в карте "А", затем для каждого из вертикальных рядов подсчитывали число категорий О, 1, 2 , 3 и заносили результаты в карту "Б", распложенную строго под картой "А." Далее суммировали каждую из категорий по горизонтали и полную сумму каждой из категорий полученных со срезов с одного блока записывали в карту "В".

Затем суммировали значения из карт "К', полученные со всех изученных в опыте блоков и после этого подсчитывали процент встречаемости каждой категории (И) по отношению к общему числу

- .11 -

Карта "А" (данные морфометрии на экране электронного микроскопа, выраженные в условных категориях)

ООООО 01000 00001 00000

00000 00000 00000 00000

00000 00000 10000 00000

0000100021 0 2001 0 1000

00000 0 1000 0 0000 01000

00000 11000 00002 00000

0000010010 00000 3000С

0 0 0 0 0 0 0 2 1 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0

0 2 0 0 0 ,0 0 0 0 0 .0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

00 0 0 0 .0 0 0 0 0 11001 30000

Карта "Б"( число категорий в каждом из вертикальных столбиков)

Категория

0 • Ю 9 10.10 9 8 7 9 7 9 8 6 9 9 6 8 3 10 10 10

1 00 0 0123021 21013 02 000

2 01000 0 0110 01001 ООООО

3 00 0 00 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 20 ООО

Карта "В" (полная сумма кажд.ой из категорий полученная с каждого отдельного блока)

0-17Г

1 18

2 5

3 3

просчитанных полей. Результаты подсчетов площади, занимаемой МЛ, заносились в стандартную таблицу ( для примера Таблица 1). В этой жа таблице отражалась условная площадь каждой категории, занимаемая дисками (М). После умножения процентной доли встречаемости каждой категории (Ю на величину условной плошади (КО получали пяошадь, занимаемую МД для каждой категории поля зрения. Сумма этих произведений отражает относительную долю площади (Э), занимаемую МД в центральной зоне сетчатки. Стимулирующий эффект исс^ ледуемого препарата на морфогенез МД НСП оценивал!.* отношением

Р-5оп-5к .1002, ~5к—

- 12 -Таблица N 1.

Морфе метрические показатели стимулирующего эффекта ЭНКАДа

. (у крыс Campbell в возрасте 7 и 9 сут в опыте N 01)

Кате Встреча- Условная Суммарная R= Son-5k

Серия гория емость площадь площадь

поля катего- занимаемая занимаемая • SK

рий (N) дисками дисками 7.

(Ю (NxM) %

0 92. 8

Конт- 1 5. б '/3 1.9

роль 2 1.0 1/2 0.5

7 сут 3 0.6 2/3 0.4

SK = 2. 8

R - 600Z

0 56.6

1 20.9 1/3 6.9

Опыт 2 13.8 1/2 • 6.9

7 сут 3 8.7 2/3 5.8

Son = 19.6

0 30.3

Конт- 1 32.3 1/3 10.8

роль 2 18.7 1/2 9.4

9 сут 3 18.8 2/3 12.5

Sk = 32.7

R =38. 97.

0 8.9

1 32.1 1/3 10.7

Опыт 2 28.3 1/2 14.2

9 сут 3 30.7 2/3 20.5

Son = 45.4

где 5оп-площадь, занимаемая ЫД в опыте, и Зк- в контроле.

Используя выработанные критерии для количественной оценки площади, занимаемой формирующимися Щ НСП в дифференцирующейся сетчатке крыс, были сделаны соответствующие предварительные измерения, которые показали, что: 1) нет достоверных различий между двумя глазами одного животного, что позволяет использовать по одному глазу от каждой крысы; 2) так как выше была обнаружена значительная неоднородность распределения очагов- образования ЫД НС с пределах дифференцирующейся сетчатки, для получения достоверных результатов необходимо брать не менее 3-х точек (3 блоков) из центральной зоны глазного дна каждого глаза; 3) исполь-

зование 200 полей зрения на каждую точку (блок) является оптимально достаточным, так как дальнейшее увеличение материала не приводит к изменению средней величины и его стандартного отклонения. В каждом эксперименте использовали по 3 крысы в опыте и по 3 в контроле. Каждый эксперимент, таким образом, был охарактеризован путем просмотра по 1800 полей зрения в подопытной группе и по 1800 полей зрения контроле. Количественная оценка действия препарата ЗНКАД на сетчатку новорожденных иугавтных крыс Campbell и генотнпическн нормальных крыс СК. Используя выработанную морфометрическую оценку материала, были количественно охарактеризованы результаты первого опыта'по действию ЗНКАДа на сетчатку новорожденных крыс Campbell, где опыт и контроль были поставлены на животных из разных пометов. В этой серии опытов стимулирующий эффект был очень высоким - R= 600 % на П 7 и 392 на П 9. (Таблица 1). Далее была проверена активность ЭНКАДа, где крысята для каждого отдельного эксперимента, в опыте и контроле были взяты из одного помета. В двух опытах такого рода при использовании одной и той же партии ЗНКАДа стимулирующий эффект препарата характеризовался величинами R=12% на П 7 и R=2,2Z на П 9 в одном опыте и R=20% на П 7 в другом. Бри сравнении эффективности препарата одной и той же заводской партии на крысах из одного помета видно, что оценка результатов на П 7 является более информативной, чем на П 9. Это можно объяснить тем, что у последних в контроле площадь межфото-рецепторного•пространства, занятая МД, уже достаточно велика в силу естественно идущего процесса дифференцировки сетчатки, и прибавка МД НСП как результат стимуляции может быть оценена только по, категории~ 3. В двух следующих опытах было проверено действие ЭНКАДа из двух других фабричных партий. Результат оказался отрицательным и даже угнетающим R=-40,8% и R=-25,92, что позволило сделать вывод о неоднородности по качеству разных партий ЭНКАДа. Такой, вывод, небезразличный для использования ЭНКАДа в клинике, поставил предел.работы с этим препаратом в наших исследованиях, в частности, возможности построения дозозашеимой. кривой. Тем не менее, полученные результаты дали количественное • обоснование того, что клеточной системой, на которглр воздействует ЭНКАД при парентеральном введении, являются фоторецепториые клетки. Так как в сетчатке крыс подавляющее число фотореиептор-

них.клеток представлено палочками, то можно сделать вывод о том, что ЭНКАД влияет на палочки, а цитологическим проявлением этого влияния является интенсификация морфогенеза ЫД НСП.

Действие препарата ЭНКАД на сетчатку новорожденных крыс СК было изучено в трех экспериментах. В первом из них стимулирующий эффект ЭНКАДа на П 7 составил R=-43,8%, что совпадает с отрицательным действием ЭНКАДа этой партии ( N2) на крыс Campbell.. Во втором эксперименте, при вр-цении крысятам ЭНКАДа из хорошей проверенной партии N3 стимулирующий зффект был R=64,3X на П 7. При тестировании ЭНКАДа из четвертой партии стимулирующий эффект был низким (R-6,2Z). На Campbell при тестировании ЭНКАДа этой же партии было получено угнетающее дгЯствие. Таким образом ЭНКАД действует и на морфогенез ВД НСП генотипически нормальных крыс СК в случае использования эффективной партии препарата.

Шжно рассмотреть несколько возможных причин разнообразия этих результатов; 1) модель не адекватна для поставленной задачи и не может дать стандартного ответа; 2) различия в интенсивности стимулирующего эффекта могли быть обусловлены тем, что. в первом опыте на крысах Campbell крысята в контроле и опыте принадлежали разным пометам; это подразумевает возможность, что в разных пометах крысята рождаются с разной степенью зрелости сетчатки; 3) разные партии ЭНКАДа неравноценны по своей биологической активности. На эти вопросы мы попытаемся ответить в конце всего исследования после тестирования других препаратов и накопления более обширных данных по состоянию глаз животных, использованных в качестве контроля во всех сериях опытов. Результаты этой части работы открыли возможность проверки эффективности воздействия на изучаемый процесе других веществ, применяемых в клинике. Испытание действия других препаратов. Тауфон (Моск. ПХФО им. Семашко), танукс и АТФ (Дарница), полученные нами из МНИЛ глазных болезней им. Гельмгольца, применяются в клинике при различных патологиях глаза, но неэффективны при периферических дистрофиях сетчатки. В трех разных опытах крысам Campbell в возрасте П 1-П 6 ел. дневно утром подкожно вводили однократно по 0,2 мл 4Z р-ра гауфона или по 0,1 мл препарата танукс, или АТФ по 0,2 мл' ежесуточно дважды - утром и вечером. Результаты регистрировали на П 7. Все три препарата не оказали стимулирующего действия на

морфогенез МЛ НСП: )?=■ - 17,5% для тауфона, И» - 22,17. для танук-са и 1?= - 12,8% для АТФ.

Испытание биологической активности ара -аиипобенаойной кислоты (ПЛБК) в стшуляцни ЛЛ НСП. Уникальная способность ПАБК к фенотипической активации признаков была открыта нашим соотечественником генетиком И. А. Рапопортом (1948, 1992) в конце 30-х годов на дрозофиле. Позже И. А. Рапопорту с сотрудниками (1989) удалось показать на многочисленных объектах, что стимулируются активность ПАБК в отношении полезных признаков у растений и животных весьма многообразна. -В случае дистрофий сетчатки типа ПР, можно было надеяться с помощью ПАБК, фенотипического активатора широкого действия, выявить какое-либо из звеньев в цепи нарушений, вызванных мутацией, которое окажется чувствительным к стимулирующему действию этого препарата Испытание ПАБК в интересующей нас сфере, оказалось реальным только после того, как была разработана биологическая модель при работе с препаратом ЭНКАД. ПАБК была испытана по той же схеме, по которой был тестирован ЭННАД. Первоначально мы остановились на том диапазоне концентраций раствора ПАБК, которые были наиболее эффективны в опытах на растениях (Рапопорт, 1989).

Исследование действия ПАБК на крыс СакрЬеП. Крысам линии ГапрЬеП на стадии П 1 -П 6 под кожу живота ежедневно вводили ПАБК на физиологическом растворе в разных опытах в дозе 5x10~</, 5x10~ , 6x10-3 , 7,5x10, 9хю" • и 2х10~2 мг на 1 г веса тела из расчета 0,02 мл/г тйким образом, что крысенок весом в 5 г получал однократно 0,1 мл раствора По мере роста животных объем ежедневно вводимого раствора увеличивался и достигал максимума в 0.3 мл. Инъекции ПАБК делали в течение б дней и результат фиксировали на П 7. В опытах с подкожной инъекцией ^Н-ПАБК было доказано, что ПАБК обнаруживается в печени, крови и в сетчатке с максимумом накопления через 3 часа после введения (Строева и др. 1992). В контроле крысятам из того же помета вводили такие же объемы физиологического раствора. Анализ данных по всем сериям опытов, проведенный по стандартной схеме, показал, что ПАБК в широком диапазоне доз проявляет себя как активный, стимулятор морфогенеза ЫД НСП в период преобразования примитивных ресничек в наружные сегменты фоторецепторных. клеток с дозозависимым эф-

Рис. 2 . Дозозааисимый эф&кт ПАЕК в стимуляции морфогенеза наружных сегментов фоторецепторных щеток у крыс СагрЬеП с наследственной дегенерацией сетчатки.

фектом (Рис. 2). Стимулируквдая активность самой низкой из тестируемых доа ПАБК (5x10 мг/г) оказалась на уровне таковой хороших партий ЗНКАДа (53=22% и 20%. соответственно). Дозы ПАБК. 7,5х10~3 -9x10"3 мг/г обладают наибольшей активностью с ¡воспроизводимым результатом в повторных опытах (Я-77, 88, .90 и 81%). При дальнейшем увеличении дозы (2x10 мг/г) стимулирующая- активность ПАБК резко падала (Рис.2). Это падение не было связано с, каким либо повреждающим действием ПАБК на клетки сетчатки. Об этом позволяет судить как визуальные наб^дения ультраст~уктуры клеток сетчатки на большом материале в данной работе, так и специальная проверка действия ПАБК на глазах кролика, где на порядок более высокая концентрация при ежедневном введении под конъюктиву в течение месяца не оказала никакого повреждающего действия ни на одну из структур глаза При введении ПАБК через сутки (на П 2, П 4 и П б) в дозе 7,5x10 не было стимулирующего эффекта на морфогенез МД нсп.

Исследование действия ПАБК на крыс С К. При введении ПАБК в дозе 7,5х10~3 крысам СК с П 1 до П б с фиксацией на П 7 обнаружен стимулирующий эффект того же порядка, что и на крысах Campbell (R=92,5%) . Это свидетельствует в пользу того,; что ПАБК может оказывать регулирующее влияние на нормальный морфогенез НСП, a также, что генотипически нормальные крысы могут быть использованы в качестве модели для поиска активных вешеств в стимуляции морфогенеза НСП.

В двух специальных опытах на крысах Campbell было проверено комбинированное действие ПАБК в дозах 7,5x10 и 5x10 иг/т, вводимой утром, и препарата ЭНКАД (0,1 мл 3,5%-ного раствора) с хорошей активностью, который вводили вечером, начиная со стадии П1. После ежедневных инъекций в течение 6 дней .тавотных забивали на П7 и глаза обрабатывали по принятой схеме. Совместное применение ПАБК и ЗНКАДа действовало угнетающе в обоих опытах (R=-21% и -11%), что, вероятно, свидетельствует о разном механизме их действия.

Количественная оценка естественной вариабельности развития НСП у мутантных крыс Campbell, и у генотиническл нормальных крыс СК на основании анализа морфометрических данных по контрольный животяш всех серий опытов.

Сравнение контролей Campbell и СК. Были проанализированы контро-ли из 9 предшествующих опытов, выполненных на Campbell. Количественный материал был оснозан на- использовании 91 блока для П 7 и 14 блоков для П 9 у крыс Campbell и 30 блоков на П 7 и 4 блока на П 9 у крыс СК. Число блоков принято за п при суммировании результатов и оценке достоверности различий между показателями для крыс Campbell и СК.

У 7-суточных крыс Campbell площадь, занимаемая МД, составляет 13,6%, а у СК только около 7,0% от просмотренной площади в центральной зоне сетчатки вокруг головки зрительного нерва У Campbell не только более интенсивно по сравнению с СК идет процесс образования МД (более высокие значения категорий 1,2 и 3), но также имеет место более плотное расположение очагов морфогенеза Щ по отношению друг к другу, о чем свидетельствует меньшая величина категории 0 (63„0*2,4% у Campbell против 80,1*2,1% у СК). К 9-му дню после рождения эти межлинейные различия исчезаю!'

и ЫД занимают около,35% площади центральной сетчатки, не различаясь у Campbell и СК, Найденное ускорение дифференцировки НСП на промежуточной стадии развития сетчатки у Campbell может быть отражением отклонений от нормы за счет несбалансированности каких-то регуляторных механизмов у мутантных крыс, но также может означать и возможные межлинёйные различия.

Сравнение контролей Campbell из разных пометов. Необходимо было узнать, с одинаковой ли интенсивностью осуществляется процесс преобразования ретинальных ресничек в НСП в период между рождением и открытием век у крысят иа разных пометов и в пределах одного помета. Для получения ответа на первый вопрос мы проанализировали количественные данные из 15 экспериментов, используя контроля для оценки интересующего нас признака в популяции крыс СагфЬеП на П 7. Значения Sk, каждое из которых отражает среднюю величину суммарной площади мелфторецепторного пространства, , занятого МД НСП в центральной зоне глазного дна у трех контрольных животных из одного помета,были расположены в виде вариационного ряда (Таблица 2).

Этот ряд однозначно дает ответ на поставленный Вопрос, а именно, - в разных пометах интенсивность морфогенеза ШП в центральной зоне сетчатки различна. При таких различиях в значении Sk в разных пометах использование в одном эксперименте животных для опыта и контроля иа разных пометов заведомо даст заниженные или завышенные результаты в оценке активности тестируемых препа-. ратов.

Таблица 2

No Значение

опыта Sk %

01 • 2,7

03 2,8

7 5,9

18 6,6

22 10,2

2 11,2

8 13,6

16 14,1

20 14,1

4 35,7

.12 16,9

6 18,1

14 18,7

9 19,2

10 24,5

Взвешенное

среднее для Sk

13,0-1,7 Z.

п-15

Рассмотрим в свете этих данных три серии опы.ов, в которых препарат ЭНКАД оказал стимулирующее влияние, В эксперименте (N 01) животные для контроля и опыта были взяты из разных пометов. Сверяясь с-Таблицей 2, видим, что в этом опыте Sk характеризуется наименьшей величиной вариационного ряда (Sk=2,7) при значении Son=19,7%, R=60O,OX. В двух других экспериментах (N 6 и N 9), где животные для контроля и опыта были взяты из одного, помета, Sk тяготеет к наибольшим-значениям в приведенном вариационном ряду, и стимулирующий эффект был значительно ниже С R=12,8% и 20,3%), чем в эксперименте N 01. Но при оценке последнего по усредненному контролю (Sk=13,0-1,7; Таблица 2) получается величина не трехзначная, а того же порядка (R=51,5%), что и в экспериментах N б и N 9, хотя мы не знаем, каково было бы значение R, если бы подопытные и контрольные животные принадлежали к одному помету. Эти данные количественно обосновывают вывод о необходимости использования для контроля и опыта животных из одного помета в каждом отдельном эксперименте, поставленном с целью оценки биологической активности препарата по отношению к стимуляции морфогенеза МД HCEL

Сравнение контролей Campbell в пределах одного помета. Для ответа на вопрос о том, насколько однородны значения Sk в пределах одного помета, были использованы данные по экспериментам N 7, N 16 и N 10 из Таблицы 2.

Таблица 3.

N опыта 7, 16 10

г N животного 1 2 3 1 2 3 1 2 л О

Значение Sk % 2,8 2,3 12,4 17,0 13,5 11,8 27,4 23Д 23,1

Приведенные в Таблице 3 значения 5к для отдельных животных в пределах каждого эксперимента, количественно обосновывают вывод о том, что в пределах помета от одной самки крысята характеризуются относительно , однородными значениями Бк, хотя значения по отдельным животным из разных пометов могут совпадать. Эти результаты количественно обосновывают необходимость использования не менее 3 крысят в контроле и опыте соответственно. Критическая оценка предлагаемой биологической модели для скрининга препаратов, обладающих активностью в стимуляции . морфогенеза МД НСП.

Анализ всего фактического материала позволяет критически оценить достоинства разработанной биологической модели для скрининга препаратов, обладающих активностью в стимуляции морфогенеза Щ НСП, взяв за основу вопросы, сформированные в конце раздела, посвященного ЭНКАДу. Бея совокупность полученных результатов позволяет заключить, что разработанная модель адекватна поставленной задаче. Этот ответ базируется как на том, что ряд препа-. ратов, таких как АТФ, танукс и тауфон, неэффективных в клинике, при ПР, не оказывает стимулирующего действия на интересующий нас процесс на модели, так и на четком, воспроизводимом, дозосависи-мом положительном действии ПАБК Определенность результатов, полученных в опытах с ПАБК, подтверждает предварительный вывод о нестандартности отдельных фабричных партий препарата ЭНКАД и является своего рода приглашением биохимикам осуществить очистку комплексного препарата ЭНКАД, выделив из него активные фракции с помощою предлагаемой нами модели. Вместе с тем, эта определенность позволяет склониться в пользу специфичности действия препаратов ЭНКАД и ПАБК, хотя окончательный вывод может быть сделан лишь после того, как точный механизм их действия будет найден на молекулярном уровне.

Анализ, представленный в предыдущем разделе, подтвердил наличие гетерогенности пометов от разных самок по динамике. преобразования рэтинальных ресничек в НСП в течение первых полутора недель после рождения, что диктует необходимость использования крысят в контрольной и подопытной группах в каждом,отдельном эксперименте непременно из одного помета. Также необходимо использовать в каждом отдельном эксперименте не менее трех животных в подопытной и трех животных в контрольной группах, поскольку нес-

мотря на относительную однородность степени диффер^чцированности сетчатки у животных в пределах одного помета встречаются отдельные выскакивающие точки. Пренебрежение этим правилом при использовании предлагаемой биологической модели чревато получением искаженных результатов.

Итак, при изучении стимулирующего действия препарата ЭНКАД была обоснована биологическая модель, позволившая показать место приложения в . сетчатке его действия и способность этой модели различать активные и неактивные партии препарата Работа с ПАБК раскрыла другие возможности модели, такие, как дозометрическая оценка препарата, способность тоь.л различать эффективность близких доз (например, 6x10 и 7,5х 10 мг/г ПАБК) и изучение влияния на наружные сегменты фоторецепторных клеток совместного применения нескольких препаратов. Модель, несмотря на ее трудоемкость, может быть использована для выявления активных фракций сложных препаратов животного или растительного происхождения, например таких, как ЭНКАД. Трудоемкость модели может быть отнесена к ее недостаткам, преодоление которых возможно при использовании чувствительного биохимического метода для.количественного определения родопсина взамен электронной микроскопии. Однако необходимость просмотра большого материала в каждом опыте, может быть расценена и как ее достоинство, ибо позволяет убедиться визуально на большом числе ультратонких срезов, оказывает или не оказывает тестируемое вещество повреждающее действие на структурные элементы сетчатки.

Патогенез сетчатки в иутаятяоЯ линия швей CBЛ/J с наследственной дегенерзцяеИ сетчатки (Ы/гс1). Используя ПАБК по схеме, ранее разработанной на крысах, мы решили проверить, возможно ли задержать развитие патологии сетчатки у мышей этой линии. При изучении контроля мы обратили внимание на ряд деталей в этом процессе, которые ранее отмечена не были (Са1еу е1 а1. , 1972). Было проведено исследование развития сетчатки у мышей СВА^ в раннем постнатальном периоде в сопоставлении по стадиям сетчатки СВА/К1 (литературные данные) и СВАЛ1 (собственные наблюдения), с комбинированным использованием световой и электронной микроскопии для более полной характеристики мугантной. линии CBA/J и на этом фоне затем оцененивали результат применения ПАБК.

, - 22 -

Для электронно-микроскопического исследования развития сетчатки использовали животных в возрасте П 2, П 5, П 7, П 10, П 12, П 15 и П 21 и взрослых 3-4 месячных животных (по 1-3 животных на стадию). Объем использованного материала по мышам определялся числом беременных самок, имевшихся в нашем распоряжении.

,В двух пометах половине мышат, начиьая с П 1, вводили пара- аминобензойную кислоту (ПАЕК) на физиологическом растворе в дозе 7,5x10 3 мг на 1 г массы тела из расчета 0,02 мл/г (опыт), , и другим мышатам из того же помета вводили физиологический раствор того же объема (контроль). В первом помете глаза были зафиксированы на П 10 по 1 глазу от каждой особи (1 опыт и 1 контроль) и на П 15 (1 опыт и 2 контроля) ., а во втором помете, зафиксированном на П 12, было обработано по 3 мышонка в опыте и по 3 в контроле. Ыорфометрия на экране электронного микроскопа проводилась по методу описанному выше. На нескольких срезах с трех разных блоков от каждого из трех глаз (в опыте и контроле), зафиксированных на П 12, на экране электронного микроскопа при увеличении бОООх определяли состояние внутренних .сегментов фото-рецепторных клеток. Было вычислено процентное отношение внутренних сегментов с деструктивными изменениями от общего числа просчитанных сегментов (1354 в контроле и 1549 в опыте).

В отличие от СВА/К1, у которых отставание развития сетчатки от нормы начинается на П 7, у СВА/Д развитие сетчатки продолжается вплоть до П 12. Дегенеративные изменения в сетчатке мышей СВА^ начинаются с появления пйкнотических ядер в наружном ядерном слое на П 10 (около 0,22) и разрушения митохондрий в некоторых внутренних сегментах. В это время в субретинальном пространстве появляются макрофаги мезодермального происхождения. Толшина слоев сетчатки у СВА/Л на П 12 заметно не изменяется по сравнению с П 10, но значительно увеличивается.число некротических ядер (6-72) и интенсифицируется дегенерация внутренних сегментов - 352 характеризовались разрушенными митохондриями и 6-72 элект-ронноплотной деградирующей цитоплазмой. При этом НСП продолжают увеличиваться в длину, а клетки пигментного эпителия осуществляют нормальный фагоцитоз сброшенных пачек ВД НСП и на П 10 и на П 12. Однако на П 15 наружные слои сетчатки у СВА/] оказываются уже полностью разрушенными, и по общей картине деградации сет-

- 23 -

чатки не отличаются от СВА/К1.

Ежедневные инъекции ПАБК между П 1 и П 9, не уменьшили числа внутренних сегментов, подвергающихся деградации и не предотвратили гибели наружных слоев сетчатки. Таким образом у мышей линии С-ВА/], несущих мутантный ген г<1, дегенеративные процессы первоначально не затрагивают развития НСП, а протекают в более глубоких отделах фоторецепторных клеток, что и приводит к их обвальной гибели. Действие ПАБК не предотвращает наступление этих дегенеративных изменений..

ОБСУВДШШЕ

Первым научным достижением работы является доказательство того, что при парэнтеральном введении в организм ЭНКАД влияет на фоторецепторные клетки сетчатки, стимулируя морфогенез МД НСЕ Таким образом, впервые показано, на какую клеточную систему в сетчатке и как влияет этот препарат. Это открытие на ультраструктурном уровне позволяет объяснить механизм стимулирующего действия ЭНКАДа при периферических дистрофиях сетчатки у человека. В настоящее время мы не знаем, каким образом эти факты могут быть увязаны с метаболической теорией, выдвинутой биохимиками совместно с клиницистами (фукс и др. , 1985) о действии-ЭНКАДа на нуклеиновый метаболизм организма. Однако, в дальнейшем при выделении очищенных активных фракций из препарата ЗНКАД, этот вопрос может стать предметом продуктивного изучения и перевести ЭНКАД в разряд лекарств, отвечающих мировым стандартам.

Данные по характеристике и апробации биологической модели для скрининга препаратов, обладающих активностью в стимуляции роста ЫД НСП, представляют собой основной научный результат диссертационной работы. Эта модель открывает возможности для решения тех задач в отношении ЭНКАДа (и любых других препаратов), которые были сформулированы выше.

Третье важное достижение работы составляет открытие того, что ПАБК оказалась активным препаратом в стимуляции МД НСП. Учитывая безвредность этого препарата, простое химическое строение, доступность для дешевого синтеза и полифункциональность его биологической активности, сделанное открытие позволяет выйти на создание лекарственной формы препарата и внедрение его в меди-

цинскую практику. Эти же свойства ПАЕК допускают дальнейшие исследования его участия в различных биологических процессах, в том числе в морфогенезе НСП, на молекулярном уровне.

Полученные результаты показали, что как ЭНКАД, так и ПАБК, работают не только на мутантных, но и на генотипически нормальных крысах. Стало быть они способны вмешиваться в действие каких-то регуляторных факторов, • работающих в период преобразования ресничек в НСП и связанных с приобретением плазматической мембраной свойства сократимости в нормальном онтогенезе. Такая локализация их активности облегчает дальнейщий поиск механизма действия этих веществ на морфогенез ВД НСП.

Следует подчеркнуть, что полученные в настоящей работе результаты на крысах Campbell с помощью ЭНКАДа и ПАБК не есть лечение мутантных животных. Эти данные имеют самостоятельное значение и могут быть рассмотрены в качестве обоснования нового объективного метода для скрининга терапевтических средств, способных принести облегчение состояния больных и вызвать задержку развития слепоты при.тех формах пигментного резинита, при которых дегенерация сетчатки начинается с нарушения роста и обновления НСП. "Лечение" же различных животных на более поздних стадиях онтогенеза представляет предмет самостоятельных исследований.

Сравнение мутантных крыс Campbell и мышей rd/rd по морфологическим картинам развития патологии сетчатки и по реакции на действие ПАБК дало экспериментальное подтверждение важного тезиса о невозможности найти универсальное терапевтическое средство для всех форм ПР, подчеркивая значение ЭНКАДа и ПАБК для тех форм, при которых поражен аппарат морфогенеза МД НСП, т. е. затронуты процессы роста и обновления НСП. Этот вывод, по-видимому, опровергает предположение (Massof, Finkelsteii* 1987) о том, что может иметь место некая общность процессов, приводящих к гибели фоторецепторных клеток на заключительной фазе болезни при разных формах ПР. Он позволяет также скорректировать критическое отношение ряда клиницистов к препарату ЭНКАД, которому ставится в упрек его эффективность в терапии ПР только в ограниченном числе случаев (в среднем около 30% пациентов среди получавших это лечение). Скорее в настоящее время это обстоятельство должно быть записано в положительный актив этого препарата, так как

позволяет убрать из его характеристики оскорбительный ярлык первоначально ожидаемой панацеи от всех бед и пристальнее искать специфичность его лечебного эффекта в идутальмологии.

Задачей дальнейших исследований является выяснение вопроса об обратимых и необратимых метаболических и структурных нарушениях в зоне морфогенеза НСП и возможности их коррекции на фено-тшическом уровне с помощью биологически активных веществ. Можно предполагать, что разные вещества такого рода, не обязательно должны затрагивать одно и то же метаболическое звено в этом процессе. Понимание механизма их действия будет зависеть от знания не только природы этих веществ, но и цитомолекулярных механизмов морфогенеза НСП, которые еще до конца не раскрыты.

выводи.

1. В электронномикросколических исследованиях впервые выявлена клеточная система в сетчатке, на которую влияет препарат ЭН-КАД, применяемый в офтальмологических клиниках для лечения периферических дистрофий сетчатки. Показано, что ЭНКАД при парентеральном введении мутантным крысам Campbell и генотипически нормальным крысам СК стимулирует морфогенез мембранных дисков наружных сегментов папочек,, что на морфологическом уровне позволяет объяснить лечебный эффект этого препарата в клинике.

2. Впервые создана и апробирована биологическая модель для выявления и количественной оценки препаратов, обладающих активностью в стимуляции морфогенеза мембранных дисков наружного сегмента палочек» Использование этой модели открывает возможность поисков новых лекарственных препаратов для лечения ПР и выделения и очистки с этой же целью активных фракций из сложных препаратов растительного и животного происхождения типа препарата ЭНКАД.

3. С помощью созданной модели выявлена высокая биологическая активность пара-аминобензойной кислоты в отношении стимуляции морфогенеза мембранных дисков наружного сегмента палочек, обоснован дозозависимый эффект ее избирательного специфического действия и безвредность для тканей глаза.

4. На созданной биологической модели показана неэффективность в отношении стимуляции морфогенеза мембранных дисков наружного

сегмента палочек таких применяемых в клинике препаратов как АТФ, танукс и тауфон.

5. При сравнении животных мутантных линий крыс СатрЬеП и мышей гс1/гс1 по морфологическим (ультраструктурным) признакам патогенеза сетчатки и по реакции на действие ПАБК получено экспериментальное подтверждение принципиально важного тезиса о невозможности выделения универсального лечебного средства для всех форм пигментного ретинита. Это подчеркивает значение ЭНКАЦа и ПАБК для тех форм дистрофии сетчатки, при которых поражен аппарат морфогенеза мембранных дисков наружного сегмента палочек.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Поплинская Е А., Хорошилова-Мае лова И. И , Строева О. Г. , Панова И. Г. Электронно-микроскопическое и морфометрическое исследование действия препарата ЭНКАД н~ фоторецепторные клетки у крыс с наследственной дистрофией сетчатки. Тезисы докл. Ill Все-союзн. конференции по актуальным вопросам детской офтальмологии. Суздаль 23-24 января 1989. Москва, 1989, С. 141.

2. Строева О. Г., Поплинская В. А. , Хорошилова-Маслова И. П. , Рапопорт И. А. Стимуляция образования мембранных дисков наружных сегментов фоторецепторных клеток' у крыс с помощью пара-аминобен-зойной кислоты. 1990, ДАН СССР, 314, N 2, 483-487.

3. Строева О. Г., Хорошилова-Маслора И. П. , Поплинская Е А., Панова И. Г. Способ оценки биологической активности препаратов . из комплекса нуклеотидов. Авторское сидетельство SU 1597665А1 от 7.10.1990. Бюл. N 37.

4. Поплинская В. А. , Строева 0. Г. Электронно-микроскопическое и морфометрическое исследование развития наружных сегментов фоторецепторных клеток у мутантных крыс Campbell с наследственной дистрофией сетчатки. Известия АН СССР, сер.биол, 1990, N 1. С. 5-14.

5. Строева 0. Г. , Поплинская Е А., Хорошилова-Мае лова И. П. , Панова И. Г. Электронно-микроскопическое и морфометрическое исследование действия препарата ЭНКАД на фоторецепторные клетки сетчатки у крыс Campbell с наследственной дистрофией сетчатки. 1990, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, N 5, 504-506.

6. Строева 0. Г. , Ершов А. Е , Поплинская В. А. , Панова И. Г. Межорганное распределение меченой тритием пара-аминобензойной кислоты в организме крысы после подкожной инъекции. Известия РАН, сер. биол., 1992, N 3, С. 447-450.

7. Поплинская R А., Строева О. Г., Семенов X X. Электронно-микроскопическое исследование развития и патогенеза сетчатки у мутантных мышей CBA/J с наследственной дегенерацией сетчатки. Известия РАН, сер.биол., 1992, N 6, С. 915-924.

8. Поплинская Е А. , Строева О. Г. , Семенов X X - Сравнительное исследование развития и патогенеза сетчатки у мутантных мышей СБА/J и CBA/Ki с наследственной дегенерацией сетчатки. Ланимало-гия, 1993, Т. 1, N 1, стр. 13-16.

9. Строева О. Г., Поплинская В. А. , Ворошилова-Мае лова И. П., Рапопорт И. А. Способ стимуляции морфогенеза наружных сегментов фоторецепторных клеток сетчатки. Заявка на изобретение N 4460966/14(111446) on 15.07.1988.