Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование взаимодействия полностью транс-ретиналя с компонентами фоторецепторной мембраны и ретиналь-переносящими белками

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование взаимодействия полностью транс-ретиналя с компонентами фоторецепторной мембраны и ретиналь-переносящими белками"

На правах рукописи

Аболтин Павел Валерьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОЛНОСТЬЮ ТРАНС-РЕТИНАЛЯ С КОМПОНЕНТАМИ ФОТОРЕЦЕПТОРНОЙ МЕМБРАНЫ И РЕТИНАЛЬ-ПЕРЕНОСЯЩИМИ БЕЛКАМИ

03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 0 ЯНВ ¿014

Москва, 2013

005544599

005544599

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Научные доктор биологических наук Каламкаров Григорий

руководители: Рафаэлевич, заведующий лабораторией нейрохимии

Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук.

доктор химических наук Левин Петр Петрович, ведущий научный сотрудник лаборатории физико-химических основ регуляции биологических систем Федерального государственого бюджетного учреждения науки Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Официальные доктор физико-математических наук, профессор, Твердислов оппоненты: Всеволод Александрович, заведующий кафедрой биофизики Физического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

доктор биологических наук Тимошин Александр Анатольевич, старший научный сотрудник лаборатории физико-химических методов исследования НИИ экспериментальной кардиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский Кардиологический Научно-производственный комплекс» Министерства Здравоохранения Российской федерации.

Ведущая Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

организация: Институт «Международный томографический центр» Сибирского отделения Российской академии наук.

Защита состоится «19» февраля 2014 года в 13.30 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук по адресу. 119334, Москва, ул. Косыгина д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук.

Автореферат разослан « /$ » января 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, / Мы

/ Л.И. Мазалецкая кандидат химических наук у

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Основная функция глаза - световосприятие и преобразование светового кванта в различимый сенсорный сигнал. Зрительный аппарат развивался для выполнения именно этой функции и максимально для нее приспособлен. Для восприятия света в широком диапазоне освещенностей сформировалось много как клеточно-молекулярных, так и физических механизмов адаптации органа зрения к тому диапазону освещенностей, в котором происходит функционирование того или иного вида животных. Однако, кроме того, что свет является носителем сенсорного сигнала, он может выступать и как физиологически опасный фактор. Причиной этого является то, что, взаимодействуя с различными светопоглощающими веществами -хромофорами - квант света может инициировать образование активных форм кислорода (АФК), которые, в свою очередь, могут оказывать повреждающее действие на молекулярные и клеточные структуры глаза, такие, как хрусталик, роговица и сетчатка [Островский М.А., 1982]. Хотя сам факт, что пребывание экспериментальных животных в условиях высоких освещенностей приводит как к снижению зрительных функций, так и к заметным морфологическим изменениям, известен давнорЭе1те11е М.,1977; Островский М.А., 1982], особую актуальность эта проблема получила в последнее время, когда было установлено, что в сетчатке при относительно высокой освещенности развивается апоптоз. Поскольку сетчатка является постмитотической нервной тканью и не восстанавливается при гибели клеток, развитие апоптоза на протяжении всей жизни может иметь прямое отношение как к старению сетчатки, так и к развитию старческих патологий.

В сетчатке не так много хромофоров, и поиск хромофоров, ответственных за развитие апоптоза, а также механизмов светоиндуцированной генерации свободных радикалов имеет первостепенное значение как в фундаментальном, так и в прикладном смысле.

Одним из потенциальных хромофоров - генераторов свободных радикалов - является свободный полностью тряис-ретиналь (ATR) [Delmelle М., 1978; Островский М.А., 1982]. Ретиналь в 11 -цис конфигурации является хромофорной группой светочувствительного белка родопсина, который находится в фоторецепторной клетке в очень высокой концентрации (3-4 ммоль/л). При освещении он переходит в полностью транс-форму и диссоциирует, находясь в фоторецепторной мембране в полностью трансформе. Действительно, известно, что ATR способен при освещении генерировать как синглетный кислород, так и супероксид анион-радикал с относительно высоким квантовым выходом (0.001). Однако, высвобождаясь из белка, ATR восстанавливается в ретинол ферментом ретинолдегидрогеназой (РДГ), причем активность РДГ настолько высока, что in vivo свободный ретиналь не обнаруживается в сетчатке даже при распаде 90% родопсина при очень сильной освещенности. Ретинол же, в отличие от ретиналя, не является сенсибилизатором, способным генерировать свободные радикалы. В стабильном состоянии ретиналь в обеих изомерных формах в сетчатке встречается только в связанном с ретиналь-переносящими белками состоянии. В связи с этим важным представляется вопрос о том, является ли ATR фотосенсибилизатором, будучи связанным с ретиналь-переносящими белками. Накапливаясь при высокой освещенности внутри фоторецепторного диска, ATR формирует Шиффовы основании с аминогруппами белков и липидов, которые не являются фототоксичными. Однако, некоторое его количество может оставаться и в свободном виде.

Цель диссертационной работы

Цель диссертационной работы заключалась в исследовании фотосенсибилизирующих свойств ретиналя в связанном с ретиналь-переносящими белками состоянии, а также в оценке возможных концентраций свободного ретиналя в фоторецепторной мембране в том случае, когда он по

каким-либо причинам не восстанавливается в ретинол, и оценке квантовых выходов фотоповреждения белков свободным АТЯ.

Основные задачи исследования

Определить, какие активные формы кислорода образуются при освещении АТЯ в растворе и в состоянии, связанном с ретиналь-связывающими белками.

Методом спиновой ловушки определить изменение квантового выхода генерации АФК при связывании АТЯ с ретиналь-связывающими белками.

Определить характеристики возбужденного триплетного состояния АТЯ методом лазерного импульсного фотолиза.

Исследовать кинетические характеристики тушения триплетного состояния ретиналя молекулярным кислородом в различных средах - водных растворах, липосомах, в состоянии, связанном с альбумином и специфическим ретиналь-переносящим белком из межфоторецепторного матрикса.

Определить соотношение между «связанным» (образовавшем Шиффовы основания) и свободным АТЯ в фоторецепторном диске при полном обесцвечивании родопсина.

Научная новизна

Установлено, что эффективность генерации АФК снижается при связывании АТЯ с альбумином и ретиналь-переносящим белком. Показано, что при эквимолярном соотношении альбумина и АТЯ эффективность уменьшается в четыре раза.

Впервые изучены кинетические параметры тушения триплетного состояния ретиналя молекулярным кислородом в водных растворах, липосомах и в состоянии, связанном с ретиналь-связывающими белками. Установлено, что скорость процесса тушения возбужденного триплетного состояния кислородом при связывании АТЯ с альбумином уменьшается в 8 раза, а в случае МРПБ -примерно в 50 раз.

Показано, что при связывании с фосфолипидными липосомами или фоторецепторными мембранами АТЯ локализуется на поверхности, а не внутри липидного бислоя. Определены константы связывания ретиналя с аминогруппами липидов в фоторецепторных мембранах. Установлено, что в фоторецепторных мембранах при нативном соотношении АТЯ и родопсина 70% АТЯ связывается с аминогруппами компонентов фоторецепторных мембран, и только 30% находится в свободном состоянии.

Научная и практическая ценность работы

Результаты диссертации имеют фундаментальное значение для понимания механизмов фотоповреждения сетчатки глаза и разработки средств защиты от него.

Основные положения, выносимые на защиту

Связывание АТЯ с ретиналь-переносящими белками. Эффект экранирования АТЯ ретиналь-переносящими белками, приводящий к уменьшению квантового выхода активных форм кислорода.

Кинетические характеристики процесса тушения возбужденного триплетного состояния АТЯ молекулярным кислородом в различных средах. Уменьшение константы скорости реакции тушения триплетного состояния АТЯ молекулярным кислородом при связывании АТЯ с альбумином и межфоторецепторным ретиналь-переносящим белком (МРПБ).

Соотношение свободного и связанного с аминогруппами АТЯ при полном обесцвечивании родопсина в фоторецепторной мембране.

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены на следующих всероссийских и международных конференциях:

Аболтин, П.В. Протекторное действие ретиналь-связывающих белков при генерации активных форм кислорода ретиналем. / П. В. Аболтин, Т. Ф. Шевченко, П. П. Левин, Г. Р. Капамкаров И Международная научная

конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем». - Сборник статей. - Минск, Беларусь. 2010,2325 июня. - С. 23-25;

Аболтин, П. В. Фотоиндуцированная генерация активных форм кислорода производными и конъюгатами ретиналя / П. В. Аболтин, Т. Ф. Шевченко, П. П. Левин, К. Б. Шумаев, Г. Р. Каламкаров // Всероссийская конференция с международным участием «Спектроскопия и томография электронного парамагнитного резонанса в химии и биологии». - Москва 2011,6-10 октября. -С. 107;

Аболтин, П.В. Ретинапь-белковые взаимодействия как фактор, предотвращающий фототоксическое действие ретиналя в сетчатке глаза. / Аболтин П.В., Шевченко Т.Ф., Левин П.П., Шумаев К.Б, Каламкаров Г.Р. // У1 Съезд Российского фотобиологического общества. - Материалы съезда. - Пос. Шепси 2011, 15-22 сентября. С. 79.

Каламкаров, Г. Р. Ретинапь-белковые взаимодействия как фактор, предотвращающий окислительный и нитрозитивный стресс в сетчатке глаза / Г. Р. Каламкаров, П. В. Аболтин, Т. Ф. Шевченко, П. П. Левин, Т. С. Константинова, А. Е. Бугрова, К. Б. Шумаев // Седьмая научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». - Материалы конференции. -Смоленск 2011,14-18 сентября. - С. 112-113.

Аболтин, П.В. Фотоиндуцированная генерация активных форм кислорода производными и конъюгатами ретиналя / П. В. Аболтин, Т. Ф. Шевченко, П. П. Левин, К. Б. Шумаев, Г. Р. Каламкаров // Съезд биофизиков. - Материалы докладов. - Нижний Новгород 2012, 20-26 августа. - Симпозиум II. С.8.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 5 тезисов докладов, опубликованных по материалам конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения и выводов. Общий объем работы - 85 страниц и включает 1 таблицу, 21 рисунок и список литературы из 149 наименований.

Основное содержание работы

В главе 1 - Обзор литературы - анализируются современные представления о фотоиндуцированных процессах в сетчатке глаза позвоночных. Рассмотрены молекулярные механизмы фотохимических повреждений, происходящих вследствие генерации свободных радикалов хромофорами сетчатки и пигментного эпителия.

В главе 2 - Материалы и методы - описаны методы выделения и очистки белков и фоторецепторных мембран из тканей глаза, методы получения липосом, определения АФК с использованием спиновых ловушек (ЭПР) и импульсного лазерного фотолиза для исследования спектрально-кинетических характеристик ретиналя.

В главе 3 - Результаты и обсуждение - приведены результаты исследования влияния связывания ATR с липидами и ретиналь-связывающими белками на его способность генерировать свободные радикалы.

3.1 Исследование ретиналь-белковых взаимодействий методом спиновой

ловушки

Для регистрации активных форм кислорода применялся метод спиновой ловушки, в качестве которой использовался ДЕПМПО (5-диэтоксифосфорил-5-метил-1-пирролин-Ы-оксид).

Приведенные в данной главе эксперименты проводили в модельной системе, где в качестве ретиналь-связывающего белка использовали бычий сывороточный альбумин (BSA), который, как и МРПБ, находится в фоторецепторном матриксе и, вероятно, также может участвовать в транспорте ретиноидов. Кроме того, использование продажного препарата BSA существенно облегчало решение поставленных задач, поскольку выделить из

глаз крупного рогатого скота достаточное для таких экспериментов количество МРПБ невозможно.

На рисунке 1 представлены спектры ЭПР аддуктов спиновой ловушки ДЕПМПО со свободными радикалами кислорода, возникающими при освещении (Хм,«= 375 нм) АТЯ в 10% водном растворе этанола. Спектр представлен характерной для аддуктов ДЕПМПО сверхтонкой структурой, состоящей из 8 компонент (рис. I, спектр 4). Для того, чтобы выявить, какие свободные радикалы кислорода могут привести к появлению такого спектра, моделировались базисные спектры аддуктов спиновой ловушки ОЕРМРО с супероксид-анион радикалом и гидроксильным радикалом (рис.1, спектры 1, 2,

Рис. I Спектры ЭПР авдуктов 13ЕРМРО.

1 - спектр аддукта гидроксильного радикала;

2 - спектр аддуктов, возникающий в ферментативной реакции ксшггин-ксантиноксидаза;

3 - разностный спектр, соответствующий сигналу ЭПР спинового аддукта супероксида;

4 - спектр аддуктов ДЕПМПО в >мо н. О среде, содержавшей АТИ, после

облучения светом.

Генерацию гидроксильного радикала проводили в системе Ре^/НгО:, т. с. в реакции Фентона:

Ее*1 + Н20,-►Ре*1 + ОН" + ОН" (I).

Супероксидный радикал (О/") продуцировался ферментативно в системе, содержавшей ксантин и ксантиноксидазу. Реакционная среда содержала I ммоль/л ксантина и 0.2 сд'мл ксаитиноксидазы. В случае этой ферментативной реакции регистрируемый спектр ЭПР является суперпояицией спектров аддуктов ДЕПМПО с О/ и гидроксильным радикалом (рисунок 1, спектр 2), поэтому для получения спектра, наиболее близкого сигналу ЭПР спинового

*— а™ 1

01ШТОООИ

аддукта ДЕПМПО/ООН (аддукт с супероксидом), рассматривался разностный спектр (рис. 1, спектр 3): 100% спектра 2 - 12,5% спектра 1. С помощью полученных спектров аддуктов супероксид анион-радикала и гидроксильного радикала с ДЕПМПО производилось разложение экспериментального спектра на компоненты. Было выяснено, что больший вклад в зарегистрированный сигнал вносили сигналы адпуктов спиновой ловушки с супероксидом (на рис 1, спектр 4 - компоненты сверхтонкой структуры, отмеченные кружками). Как показано на рисунке, вклад адцукта(ов) других свободных радикалов в спектр 4 сравнительно невелик.

Таким образом, было показано, что спектр ЭПР, зарегистрированный при облучении системы, содержавшей АТЛ и ДЕПМПО, представляет собой суперпозицию следующих компонент: -80% супероксид-анион радикала, ~15% гидроксильного радикала и -5% радикала неизвестной природы.

В наших экспериментах нельзя исключить образование свободных радикалов, являющихся производными АТЛ. Например, может образоваться анион-радикал АТЛ:

АТЯ* + е"-> АТЯ'" (2)

а также катион-радикал молекулы АТЛ в результате одноэлектронного окисления молекулярным кислородом в реакции:

АТЯ* + 02 -> АТЛ' + + О/ ~ (3).

Образование супероксид-анион радикала возможно также в следующих реакциях:

АТК*~ + 02 АТЫ + 02*" (4),

АТЛ* -> 3АТЛ (5),

3АТК + 302 'АТЛ+ *02 (6),

*02 + е"-> 02" ~ (7),

где 3АТЛ - триплетное состояние АТЛ, 'АТЛ - синглетное (основное) состояние АТЛ. Прямо оценить квантовый выход образования свободных

радикалов кислорода не представляется возможным, однако можно рассчитать относительную скорость их образования и, соответственно, относительный квантовый выход образования свободных радикалов по величине максимальной скорости нарастания интегральной интенсивности сигнала ЭПР при освещении. Интегральную интенсивность приближенно оценивали, пользуясь выражением S™ = 1макс(ДНмакс)2, где S™ - площадь под кривой поглощения, 1макс - интенсивность линии, ДНмакс - ширина линии. В качестве 1макс мы рассматривали амплитуду третьей компоненты зарегистрированных сигналов ЭПР, так как именно эта компонента максимально совпадает с сигналом, соответствующим спиновому аддукту супероксид-анион радикала, вносящему основной вклад. Таким образом минимизируется вклад свободных радикалов, являющихся производными ATR. Кинетика образования АФК представлена на рис. 2. Оценивалась относительная скорость образования АФК при освещении для ATR, А2Е и ATR в присутствии BSA.

Относительные величины квантовых выходов генерации АФК представлены на рисункеЗ.

Квантовый выход для А2Е в полтора раза выше, чем для ATR. Этот факт хорошо согласуется с данными других авторов. Квантовый выход генерации АФК ATR значительно снижался при связывании BSA с ретиналем. Причем, эта величина оказалась пропорциональной относительной концентрации BSA.

Рис. 2 Зависимость амплитуды низкополевой компоненты спектра ЭПР аддукта DEPMPO, возникающего при освещении:

1) А2Е,

2) ATR,

3) ATR в присутствии эквичолярного количества BSA,

4) ATR в присутствии 4-кратного избытка BSA

Рис. 3 Относительная величина квантового выхода генерации АФК при освещении растворов А2Е, ATR и ATR в комплексе с BSA в разных концентрациях.

3.2 Исследование спектрально-кинетических характеристик триплетною

состояния АТЯ

Во второй части работы методом лазерного импульсного фотолиза исследовалось взаимодействие АТк как с альбумином, так и с МРПБ. В разделе ставились те же задачи, «по и в предыдущем - изучить влияние связывания АТК с ретииаль-связываюшими белками на скорость тушения возбужденного триплетного состояния молекулярным кислородом. Тушение возбужденного состояния кислородом является одним из путей образования радикальных форм кислорода, хотя и не единственным. Донором электрона в сложной биологической системе может выступать практически любая группа с

соответствующими донорными свойствами, например, ароматические аминокислотные остатки, сульфгидрильные группы или сам ретиналь, который при этом может окисляться. В модельной системе, в которой находится только ретиналь в водно-спиртовом растворе, донором электрона является, скорее всего, сам ретиналь, что показано и в литературе. Таким образом, несмотря на различие экспериментальных подходов (ЭПР и импульсный фотолиз), в разделах ставились, по существу, сходные задачи. Кроме того, и это крайне важно с биологической точки зрения, при использовании импульсного фотолиза удалось исследовать взаимодействие ATR не только с BSA, но и с МРПБ - именно того белка, который и осуществляет транспорт ретиналя и ретинола в нативной фоторецепторной клетке.

3.2.1 Спектрально-кинетические характеристики 3ATR в растворах

Исследовалось поведение ATR в метанольном растворе, водном растворе с небольшой добавкой метанола, в суспензии липосом, в водных растворах альбумина и водных растворах МРПБ.

Импульсное фотовозбуждение (1 не, 337 нм) растворов ATR приводит за время лазерной вспышки к образованию триплетного состояния 3ATR, характеризующегося известным спектром поглощения с Хтах около 470 нм (рис. 4, спектр 1).

Кинетика гибели 3ATR как в обескислороженном, так и в воздушнонасыщенном метанольном растворе подчиняется закону первого порядка. Соответствующие константы скорости (кт и кт°), а также рассчитанная из этих значений константа скорости тушения 3ATR молекулярным кислородом (kq) приведены в таблице 1.

При лазерном фотолизе ATR в метаноле (МеОН), помимо относительно короткоживущего триплет-триплетного поглощения, наблюдается также слабое долгоживущее наведенное поглощение с максимумом при X™ax < 400 нм (рис. 4, спектр 2). Выход этого промежуточного продукта не зависит от присутствия кислорода в растворе, что свидетельствует о том, что он образуется из

синглстного электронно-возбужденного состояния и, по литературным данным,

он представляет собой изомер или радикал рстиналя.

Рис. 4. Дифференциальные спектры поглощения промежуточных продуктов, полученные при лазерном фотолизе метанольных растворов АТЯ (5х 10'5 моль/л) через 0.5 (1) и 100 (2) мкс.

Таблица I Константы скорости гибели триплетиого состояния полностью т/кшс-ретииаля в различных обескислороженных (кт) и воздушнонасыщснных (кт®) средах и константа скорости его тушения молекулярным кислородом (1ц).

Среда ктх10\ с'1 ктв*10\ с" к<,*10у, л моль'1 с'1

Липосомы* 0.90 14 4.6*

HjO" 1.7 4.7 1.1'

МРПБС 6.0* 6.4*

BSAC 6 Г 8.5' 0.62J

МеОН 0.70 110 5.0

ФРМС 0.89 13 4.3"

"0.15 моль/л К-Р буфер, рН 7.4, содержащий 8*10"' моль/л фосфатидилхолина и 1% метанола по объему.

b 0.15 моль/л К-Р буфер, рН 7.4, содержащий 1% метанола по объему. е 0.14 миль/я NaCI, 0.05 моль/и |рис-НС1, рН 7.4, содержащий 10'5 моль/л белка и 1% метанола по объему.

d Рассчитана, исходя из концентрации кислорода в воздушнонасышенной воде, равной 2.8x10"4 моль/л.

' Для быстрой компоненты кинетики гибели 'ATR (kTf). Рассчитана, исходя из концентрации кислорода в воздушнонасыщенном МеОН, равной 2.2*10"' моль/л.

3.2.2 Спектрально-кинетические характеристики JATK в липосомах

Квантовый выход 'ATR суспензии липосом из фосфатидилхолина (л-ФХ) (8*10'5 моль/л ФХ) примерно в 5 раз ниже, чем в растворах метанола Значение констант в 100% метаноле и водной суспензии л-ФХ существенно выше, чем в водном растворе, где концентрация спирта не превышала 1%.

0.0}

0.0!

О 0

<» »О !М

Длина волны, ни

Такие значения kq типичны для процесса тушения триплетных состояний органических молекул, обладающих умеренными электронно-донорными свойствами, кислородом в полярных растворителях. Процесс в этом случае может осуществляться по двум каналам: путем переноса энергии с образованием синглетнош кислорода (в синглетном комплексе встречи, спин-статистический фактор 1/9) и за счет спиновой конверсии в триплетном комплексе с переносом заряда (спин-статистический фактор 1/3). Реализация такого механизма приводит к тому, что выход синглетного кислорода при тушении 3ATR, близкий к 100% в неполярных растворителях, существенно уменьшается при переходе к полярным растворителям. Однако высокое значение kq в липосомах обусловлено, по-видимому, не только наличием двух каналов процесса, но также высокой концентрацией 02 в липидном бислое (выше, чем в водном объеме) и его высокой латеральной подвижностью. При лазерном фотолизе ATR в л-ФХ наблюдается также заметное долгоживущее наведенное поглощение в области 400-500 нм, природа которого обсуждалась выше.

3.2.3 Спектрально-кинетические характеристики триплетного состояния ATR в белковых растворах

При фотолизе ATR в водных растворах BSA и МРПБ (Хтах около 460 нм) наблюдается триплетное состояние 3ATR с квантовым выходом примерно в 2 раза ниже, чем в л-ФХ. При этом в присутствии белков происходит, с одной стороны ускорение, а с другой стороны - замедление гибели 3ATR в обескислороженных растворах. Аппроксимация кинетических кривых по двухэкспоненциальному закону дает «быструю» и «медленную» компоненты приблизительно с одинаковыми вкладами и различающимися в 10 раз константами скорости (константы скорости «быстрой» компоненты кт приведены в таблице 1) (рис. 5, кривые 1).

При переходе к воздушнонасыщенным растворам наблюдается ускорение «быстрой» компоненты и возрастание ее вклада до 70 и 80% для МРПБ и BSA,

соответственно (константы скорости «быстрой» компоненты кт°, а также соответствующие значения констант скорости тушения этих !АТЯ молекулярным кислородом 1ц приведены в таблице I) (рис. 5, кривые 2). Константа скорости гибели «медленной» компоненты практически не изменяется. Таким образом, как в концентрированных, так и в разбавленных белковых растворах наблюдается экранирование 'АТИ по отношению к молекулярному кислороду.

Рис. 5. Кинетика гибели промежуточных продуктов, поглощающих при Х.а460 нм, полученная при лазерном фотолизе обескислороженных (1) и воздушнонасышенных (2) водных (0.15 моль^л К-Р буфер. рН 7.4) растворов АТЛ( 1.5* 10" моль/л) в присутствии 3.5*10'' моль/л ФХ.

На экспериментальные кривые наложены кривые, полученные при аппроксимации по одноэкспоненциальному закону с незначительной постоянной составляющей.

Существенное экранирование ретиналя от молекулярного кислорода при его связывании с белками необходимо учитывать при рассмотрении окислительных процессов в биосистемах. Так, то, что ретиналь в зрительной клетке и в пигментном эпителии постоянно находится в состоянии, связанном с ретиналь-переносяшими белками, может быть важным протекторным фактором, предотвращающим образование критических концентраций активных форм кислорода.

При фотолизе АТЯ в водных белковых растворах, помимо триплетного состояния, также наблюдается образование незначительного количества более долгоживущих промежуточных продуктов (около 10% по поглощению при 460 нм относительно поглощения 'АТЛ), характеризующихся полосой поглощения с максимумом около 400 нм и имеющих, по-видимому, радикальную природу.

Введение в белковые растворы липосом приводит к резкому ускорению гибели 'АТ1* в воздушионасыщемных растворах. Кинетика гибели 'АТЛ подчиняется одноэкспоненциальному закону с константой скорости, близкой к значению к/ в л-ФХ. Однако в обескислороженных растворах кинетика гибели !АТ1* остается деухэкспоненциальной. По мере увеличения концеитраиии ФХ «быстрая» компонента замедляется (рис. 6), а ее вклад возрастает.

Рис.6

Зависимость

константы

скорости гибели

«быстрой»

компоненты

'АТКв

растворах МРПБ (I) и БСА (2) (10"' моль/л) от

О 2 4 фХ, имоль/л ^°"ЦеН7РаЦИИ

ФХ.

Константа скорости «медленной» компоненты при этом практически не изменяется. Таким образом. АТЯ остается локализованным в белках. Только при большой концентрации липидов (> 5 ммоль/л) кинетика гибели 'аТЯ совпачает с кинетикой гибели 'аТИ в л-ФХ.

В целом, можно сделать вывод о том, что ретиналь при наличии в системе ретиналь-переносящих белков (как альбумина, так и специфического МРПБ из фоторецепторного матрикса) всегда будет переходить из липидного бнелоя в карманы белка. Это, в свою очередь, значительно снижает вероятность образования под действием света активных форм кислорода и, таким образом, оказывает значительное протекторное действие, защищающее клеточные компоненты от вредного действия света.

3.2.4 Образование Шиффовых основании АТ1* к липосомах

Концентрация родопсина в фоторецепторной клетке составляет 3-4 ммоль/л, и поэтому формально при интенсивном освещении, приводящем к полному обесцвечиванию родопсина в фоторецепторной клетке могло бы

0 2 4 ф.\, имоль/л

образовываться до 4 ммоль'л АТЯ. Под обесцвечиванием в биологической литературе понимается изменение окраски родопсина = 500 нм) при освещении, приводящем к распаду родопсина на белок и АТЯ (Х«»,ся380 нм). Ясно, что при такой огромной концентрации, несмотря на невысокий квантовый выход генерации АФК, АТЯ оказывал бы катастрофическое повреждающее действие. В нативной клетке этого не происходит из-за высокой активности ретинолдегидрогеназы - фермента, катализирующего переход АТЯ в полностью /лрл«с--рстинол. Если бы этого не происходило, высокая химическая активность ретиналя приводила бы к образованию Шиффовых оснований с аминогруппами, которые в избытке находятся в клетке. Именно высокая активность фермента является причиной того, что даже при очень высоких освещенностях значительные количества ретиналя не удается обнаружить в фоторецепторной клетке. Однако восстановление ретиналя в ретинол происходит в цитоплазме клетки, а высвобождается ретиналь во внутридисковос пространство, откуда транспортируется в цитоплазму. Во внутридисковом пространстве АТЯ образует Шиффовы основания с аминогруппами, прежде всего, с аминогруппами ФЭА, концентрация которого в фоторецепторе оставляет 10 ммоль/л. Как известно, Шиффовы основания АТ11 не образуют триплетного состояния и поэтому не являются активными генераторами АФК. В связи с эти мы поставили задачу определить, какая часть АТЯ во внутридисковом пространстве образует Шиффовы основания и не обладает фототоксическими свойствами. Поскольку Шиффовы основания не образуют триплетов, по концентрации возбужденного триплетного состояния можно определить константы равновесия Шиффовых оснований как в липосомах из ФЭА (в таблице I - липосомы), так и в натнвиых. содержащих родопсин, фоторецепторных мембранах (ФРМ). В данной серии экспериментов к суспензии л-ФХ добавляли суспензию липосом из ФЭА. Введение в раствор ФЭА приводит к уменьшению наблюдаемого выхода 'АТ1*, но не влияет на кинетику его гибели. ФЭА образует Шиффово основание с АН*. которое не обладает карбонильной группой, обеспечивающей эффективное спин-

орбитальное взаимодействие в первом синглетном электронно-возбужденном состоянии и, соответственно, не образует триплетное состояние при прямом фотолизе. Таким образом, наблюдаемый относительный выход 'АТЯ может служить мерой доли АТЯ, находящейся в виде Шиффова основания (ШО). Соответствующая концентрационная зависимость (рис. 7) указывает на существование равновесия (7):

АТ1* + ФЭА ШО (7).

Рис.7 Зависимость интенсивности оптического поглощения 3АТЯ при 470 нм. зарегистрированная через 20 не после лазерного импульса в присутствии л-ФХ (4х 10й моль/л ФХ) от концентрации ФЭА в системе.

Зависимость на рисунке 7 хорошо описывается соответствующим выражением:

|*ЛТНи, = |'АТИИ1 + К|ФЭА|) (8),

где ['аТЗДмь наблюдаемая начальная концентрация 'аТЯ в присутствии ФЭА, ['АТЯ)о ~ начальная концентрация 3АТЯ, наблюдавшаяся в отсутствие ФЭА. а К - 8,0 (мольная доля)"1 - константа равновесия (7).

Выражение (8) получается при соответствующем решении кинетической схемы (7) при условии [АТЯ) « [ФЭА), которое хорошо выполняется в данных экспериментальных условиях.

3.2.5 Образование Шнффовых оснований АТН в ФРМ

В следующей серии экспериментов использовали суспензию ФРМ. выделенных из зрительных клеток и засвеченных до полного распада комплекса опенна с 11-цнс-ретиналсм. Фотолиз такого образца приводит к образованию 'АТЯ, спектрально-кинетические характеристики которого

Мольная доля Ф')Л

практически полностью совпадают с аналогичными параметрами в л-ФХ (рис. 8. спектр 2; табл. 1).

Однако квантовый выход 3АТЛ в ФРМ составляет только 30% от соответствующего выхода, получающегося при фотолизе АТЯ, добавленного в раствор л-ФХ в эквимолярном количестве. Таким образом, на основании полученных данных по равновесию (7) можно сделать вывод, что 70% образующегося при полном обесцвечивании родопсина АТЯ образует Шиффовы основания и не генерирует АФК.

Важно отметить, что определить константы равновесия АТЛ и аминогрупп (Шиффовых оснований) можно по сдвигу максимума поглощения, однако, в нативной фоторецепторной мембране, содержащей родопсин, это сделать невозможно из-за наличия долгоживущих продуктов фотолиза родопсина, максимум поглощения которых отличается от АТЯ из-за его локализации в «белковых карманах» родопсина. Поэтому можно полагать, что определение равновесия по квантовому выходу 3АТЛ является более адекватным методом.

400 450 500 550 600 Длина волны, им

Рис. 8 Дифференциальные спектры поглощения промежуточных продуктов, полученные при лазерном фотолизе воздушнонасышенных растворов АТЛ (10 5 моль/л)

1) в присутствии ФХ-липосом (4 *10"' моль/л) через 0.02 мке

3) то же через 5мкс

2) в системе с ФРМ через 0.02 мке

4) то же через 5 мке

Выводы

1. С использованием метода спиновой ловушки показано, что связывание полностью шранс-ретиналя с альбумином приводит к значительному снижению относительного квантового выхода фотогенерации супероксид анион-радикала.

2. Методом наносекундного лазерного фотолиза изучена кинетика гибели возбужденного триплетного состояния АТЛ в воде, в водных растворах липосом и ретиналь-связывающих белков, а также в фоторецепторных мембранах. Установлена природа мест локализации АТЯ.

3. В белках обнаружено как минимум два места локализации АТИ., которые существенно (до 2 порядков) различаются по степени экранирования триплетного состояния АТЯ от молекулярного кислорода.

4. В результате прямых кинетических измерений установлено, что константа скорости тушения возбужденного триплетного состояния АТЯ молекулярным кислородом при его связывании с альбумином и ретиналь-переносящим белком уменьшается в 10 и 50 раз, соответственно.

5. По выходу 3АТЯ определены константы равновесия обратимого процесса связывания АТЯ с аминогруппами (образование Шиффовых оснований) компонентов фоторецепторной мембраны. Показано, что при полном обесцвечивании родопсина 70% АТИ. образуют Шиффовы основания с аминогруппами и не генерируют АФК.

Список публикаций по теме работы:

1. Левин, П.П. Исследование кинетики тушения триплетного состояния полностью-транс-ретинапя кислородом в водных растворах альбумина и липосом методом лазерного фотолиза / П.П. Левин, П.В. Аболтин, Т.Ф. Шевченко, Г.Р. Каламкаров. // Химия высоких энергий. - 2010. - Т.44. - №6. - С. 555-559.

2. Левин, П.П. Исследование спектрально-кинетических характеристик триплетного состояния полностью транс-ретиналя в водных растворах ретиналь-связывающих белков и липосом методом лазерного фотолиза. / П.П.

Левин, П.В. Аболтин, Т.С. Константинова, Т.Ф. Шевченко, Г.Р. Каламкаров. // Химия высоких энергий. - 2013. - Т.47. - № 3. - С. 1-4.

3. Аболтин, П.В. Фотоиндуцированная генерация активных форм кислорода производными и конъюгатами ретиналя / П.В. Аболтин, Т.Ф. Шевченко, К.Б. Шумаев, Г.Р. Каламкаров. // Биофизика. - 2013. - Т. 58. - вып. 2. -С. 246-251.

4. Аболтин, П.В. Протекторное действие ретинапь-связывающих белков при генерации активных форм кислорода ретиналем. / П. В. Аболтин, Т. Ф. Шевченко, П. П. Левин, Г. Р. Каламкаров // Международная научная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем». - Сборник статей. - Минск, Беларусь. 2010, 2325 июня. - С. 23-25.

5. Аболтин, П. В. Фотоиндуцированная генерация активных форм кислорода производными и конъюгатами ретиналя / П. В. Аболтин, Т. Ф. Шевченко, П. П. Левин, К. Б. Шумаев, Г. Р. Каламкаров // Всероссийская конференция с международным участием «Спектроскопия и томография электронного парамагнитного резонанса в химии и биологии». - Москва 2011, 6-10 октября.-С. 107.

6. Каламкаров, Г. Р. Ретиналь-белковые взаимодействия как фактор, предотвращающий окислительный и нитрозитивный стресс в сетчатке глаза / Г. Р. Каламкаров, П. В. Аболтин, Т. Ф. Шевченко, П. П. Левин, Т. С. Константинова, А. Е. Бугрова, К. Б. Шумаев // Седьмая научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». - Материалы конференции. -Смоленск 2011, 14-18 сентября. - С. 112-113.

7. Аболтин, П.В. Ретиналь-белковые взаимодействия как фактор, предотвращающий фототоксическое действие ретиналя в сетчатке глаза. / Аболтин П.В., Шевченко Т.Ф., Левин П.П., Шумаев К.Б, Каламкаров Г.Р. // У1 Съезд Российского фотобиологического общества. - Материалы съезда. - Пос. Шепси 2011, 15-22 сентября. С. 79.

8. Аболтин, П.В. Фотоиндуцированная генерация активных форм кислорода производными и конъюгатами ретиналя / П. В. Аболтин, Т. Ф. Шевченко, П. П. Левин, К. Б. Шумаев, Г. Р. Капамкаров // Съезд биофизиков. -Материалы докладов. - Нижний Новгород 2012, 20-26 августа. - Симпозиум II. С.8.

Подписано в печать: 16.01.14

Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 173 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинский проспект, д.2 (495) 978-66-63, www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аболтин, Павел Валерьевич, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н.М. ЭМАНУЭЛЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201-1оо976

АБОЛТИН Павел Валерьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОЛНОСТЬЮ Г/МЯС-РЕТИНАЛЯ С КОМПОНЕНТАМИ ФОТОРЕЦЕПТОРНОЙ МЕМБРАНЫ И РЕТИНАЛЬ-ПЕРЕНОСЯЩИМИ БЕЛКАМИ

03.01.02 - биофизика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук Г.Р. Каламкаров доктор химических наук П.П. Левин

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................8

1.1 Строение глаза позвоночных..................................................8

1.1.1 Сетчатка позвоночных..................................................10

1.1.2 Пигментный эпителий.................................................. 11

1.1.3 Межфоторецепторный матрикс...................................... 13

1.1.4 Фоторецепторные клетки и фоторецепторные мембраны.... 14

1.2 Фотоиндуцированные процессы в сетчатке и ПЭ.......................16

1.2.1 Фотолиз родопсина.......................................................16

1.2.2 Ретиноидный цикл.......................................................17

1.3 Повреждения элементов зрительной системы,

вызываемые светом.........................................................20

1.3.1 Фототермические повреждения.......................................20

1.3.2 Фотохимические повреждения....................................... 21

1.4 Молекулярные механизмы фотохимического повреждения.........23

1.4.1 Фотоиндуцированная генерация свободных радикалов......24

1.4.2 Фотосенсибилизирующие свойства хромофоров

сетчатки и ПЭ................................................................ 29

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................... 33

2.1. ЭПР спектроскопия.............................................................33

2.2 Лазерный импульсный фотолиз............................................. 35

2.3 Приготовление липосом........................................................ 37

2.4 Приготовление ФРМ из наружных сегментов палочек сетчатки

глаз быка........................................................................... 38

2. 5 Выделение и очистка межфоторецепторного

ретиналь-связывающего белка..........................................39

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.......................................41

3.1 Исследование ретиналь-белковых взаимодействий методом

спиновой ловушки...............................................................41

3.2 Исследование спектрально-кинетических характеристик

триплетного состояния АТИ.................................................49

3.2.1 Спектрально-кинетические характеристики 3АТЫ.

в растворах.................................................................... 50

3.2.2 Спектрально-кинетические характеристики триплетного состояния АТ1* в липосомах...........................52

3.2.3 Спектрально-кинетические характеристики триплетного состояния АТК в белковых растворах................................ 53

3.2.4 АТЫ в водных растворах белков в присутствии ФХ........... 58

3.2.5 Образование Шиффовых оснований АТИ

в фоторецепторной мембране............................................ 60

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................65

ВЫВОДЫ....................................................................................69

СПИСОК

СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................70

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................71

ВВЕДЕНИЕ

Основная функция глаза - световосприятие и преобразование светового кванта в различимый сенсорный сигнал. Зрительный аппарат развивался для выполнения именно этой функции и максимально для нее приспособлен. Для восприятия света в широком диапазоне освещенностей сформировалось много как клеточно-молекулярных, так и физических механизмов адаптации органа зрения к тому диапазону освещенностей, в котором происходит функционирование того или иного вида животных. Однако, кроме того, что свет является носителем сенсорного сигнала, он может выступать и как физиологически опасный фактор. Причиной этого является то, что, взаимодействуя с различными светопоглощающими веществами - хромофорами - квант света может инициировать образование активных форм кислорода, которые, в свою очередь, могут оказывать повреждающее действие на молекулярные и клеточные структуры глаза, такие, как хрусталик, роговица и сетчатка [Островский М.А., 1982]. Хотя сам факт, что пребывание экспериментальных животных в условиях высоких освещенностей приводит как к снижению зрительных функций, так и к заметным морфологическим изменениям, известен давно, особую актуальность эта проблема получила в последнее время, когда было установлено, что в сетчатке при относительно высокой освещенности развивается апоптоз. Поскольку сетчатка является постмитотической нервной тканью и не восстанавливается при гибели клеток, то развитие апоптоза на протяжении всей жизни может иметь прямое отношение как к старению сетчатки, так и к развитию возрастных патологий зрения.

В сетчатке не так много видов фотосенсибилизаторов, и поиск хромофоров, ответственных за развитие апоптоза, а также механизмов светоиндуцированной генерации свободных радикалов имеет первостепенное значение как в фундаментальном, так и в прикладном смысле.

Одним из потенциальных хромофоров - генераторов свободных радикалов -является свободный полностью транс-ретиналь (АТ11) [Ое1те11е М., 1978; Островский М.А., 1982]. Ретиналь в 11 -цис конфигурации является хромофорной группой светочувствительного белка родопсина, который находится в фоторецепторной клетке в очень высокой концентрации (3-4 ммоль/л). При освещении он переходит в полностью транс-форму и диссоциирует, находясь в фоторецепторной мембране в полностью транс-форме. Действительно, известно, что АТЯ способен при освещении генерировать как синглетный кислород, так и супероксид анион-радикал с относительно высоким квантовым выходом (0.001). Однако, высвобождаясь из белка, АТЯ восстанавливается в ретинол ферментом ретинолдегидрогеназой (РДГ). Ретинол же, в отличие от ретиналя, не является сенсибилизатором, способным генерировать свободные радикалы. В стабильном состоянии ретиналь в обеих изомерных формах в сетчатке встречается только в связанном с ретиналь-переносящими белками состоянии. В связи с этим важным представляется вопрос о том, является ли АТЯ фотосенсибилизатором, будучи связанным с ретиналь-переносящими белками. Накапливаясь при высокой освещенности внутри фоторецепторного диска, АТЯ формирует Шиффовы основании с аминогруппами белков и липидов, которые не являются фототоксичными. Однако, некоторое его количество может оставаться и в свободном виде.

Цель диссертационной работы заключалась в исследовании фотосенсибилизирующих свойств ретиналя в связанном с ретиналь-переносящими белками состоянии, а также в оценке возможных концентраций свободного ретиналя в фоторецепторной мембране в том случае, когда он по каким-либо причинам не восстанавливается в ретинол, и оценке квантовых выходов фотоповреждения белков свободным АТЯ.

Основные задачи исследования: определить, какие формы активного кислорода (АФК) образуются при освещении АТЯ в растворе и в состоянии, связанном с ретиналь-связывающими белками.

Методом спиновой ловушки определить изменение квантового выхода генерации АФК при связывании АТЯ с ретиналь-связывающими белками.

Определить характеристики возбужденного триплетного состояния АТИ. методом лазерного импульсного фотолиза.

Исследовать кинетические характеристики тушения возбужденного триплетного состояния ретиналя молекулярным кислородом в различных средах -водных растворах, липосомах, в состоянии, связанном с альбумином и специфическим ретиналь-переносящим белком из межфоторецепторного матрикса.

Определить соотношение между связанным (образующим Шиффовы основания) и свободным АТЯ в фоторецепторном диске при полном обесцвечивании родопсина.

Научная новизна: Впервые установлено, что эффективность генерации АФК снижается при связывании АТЯ с альбумином. Установлено, что при эквимолярном соотношении альбумина и АТЯ эффективность уменьшается в четыре раза.

Впервые изучены кинетические параметры тушения триплетного состояния ретиналя молекулярным кислородом в водных растворах, липосомах и в состоянии, связанном с ретиналь-связывающими белками. Показано, что скорость процесса тушения возбужденного триплетного состояния кислородом при связывании АТЯ с альбумином уменьшается в 8 раза, а в случае МРПБ -примерно в 50 раз.

Показано, что при связывании с фосфолипидными липосомами или фоторецепторными мембранами АТЯ локализуется на поверхности, а не внутри

липидного бислоя. Определены константы связывания ретиналя с аминогруппами липидов в фоторецепторных мембранах.

Установлено, что в фоторецепторных мембранах при нативном соотношении АТЯ и родопсина 70% АТЯ связывается с аминогруппами компонентов фоторецепторных мембран, и только 30% находится в свободном состоянии.

Научная и практическая ценность работы: результаты диссертации имеют фундаментальное значение для понимания механизмов фотоповреждения сетчатки глаза и разработки средств защиты от него.

Основные положения, выносимые на защиту: Связывание АТИ. с ретиналь-переносящими белками. Эффект экранирования АТЯ ретиналь-переносящими белками, приводящий к уменьшению квантового выхода активных форм кислорода.

Кинетические характеристики процесса тушения возбужденного триплетного состояния АТЯ молекулярным кислородом в различных средах.

Уменьшение константы скорости реакции тушения триплетного состояния АТЫ молекулярным кислородом при связывании АТЯ с альбумином и межфоторецепторным ретиналь-переносящим белком.

Соотношение свободного и связанного с аминогруппами АТ11 при полном обесцвечивании родопсина в фоторецепторной мембране.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Строение глаза позвоночных

Структуры глаза устроены так, чтобы фокусировать свет в центральную область сетчатки. Часть света, попадающего в глаз, рассеивается глазными структурами, расположенными между передней частью глаза и сетчаткой, и это определяется оптическими свойствами глазных тканей. С точки зрения повреждающего действия эта отраженная часть света относительно падающего пучка столь мала, что ею можно пренебречь. Интенсивность света, падающего на сетчатку, зависит от диаметра зрачка, регулирующего величину светового потока, окрашенности радужной оболочки, оптических характеристик хрусталика [Algvere P.V. et al. 1993; Ambach W. et al.1994; Guerry III D. et al. 1956; Jordan D.R. 1974; Sliney D.H. 2002].

Внутренние структуры, предшествующие сетчатке на пути света, поглощают часть падающего света [Boettner Е. A. et al. 1962; Sliney D. H., 2002]. На рисунке 1 схематично показано прохождение света через структуры глаза.

295-400 nm

>400 nm

<295 nm

Рис. 1. Прохождение ультрафиолетового и видимого света через структуры глаза человека [А. Я. \Vielgus & а!., 2012].

Роговица предотвращает попадание на сетчатку ультрафиолетового (УФ) излучения с длиной волны менее 295 нм. [Boettner Е.А. 1962]. Хрусталик задерживает большую часть УФ между 300 и 400 нм, а хрусталик с катарактой -еще больше [Boettner Е.А., 1962; van Norren D.V., 1974]. В результате на сетчатку взрослого человека может попасть только видимый свет с длиной волны выше 390 нм и менее 1% «ближнего» ультрафиолета [Sliney D.H., 2002; Sliney D.H. 2001]. Пропускающая способность структур глаза зависит от вида животного, возраста, и с возрастом может меняться.

Наибольшее количество света, падающего на сетчатку, поглощается в слое ПЭ [Birngruber R, et al., 1985]. Наиболее восприимчивы к видимому свету содержащиеся в ПЭ эллипсоидальные органеллы диаметром 1 мкм - меланосомы [Schrärmeyer U. et al., 1999], в которых содержится черный пигмент меланин. Так, в глазу человека именно благодаря меланину клетки ПЭ поглощают около 60% падающего света, достигшего сетчатки [Hammond B.R. et al., 2000], и в этом состоит одна из основных защитных функций ПЭ. Однако меланин с возрастом под действием света обесцвечивается, и его защитная роль снижается [Hu D. N. et al., 2008]. Таким образом, первичными внешними факторами, которые могут вызвать фотоповреждение, можно считать интенсивность и длину волны полученного тканями глаза человека света, а также возраст человека [Roberts J. Е., 2001]. Известно, что можно получить повреждение сетчатки, если смотреть на солнечный свет, отражаемый снегом или долго смотреть на солнечный диск во время затмения [Sliney D. 2005; Coroneo М. Т. 1990]. Такое изменение окружающей среды, как истончение защитного озонового слоя приводит к увеличению доли ультрафиолетового излучения [Norval М., 2007] и увеличивает вероятность фотоповреждения. Кроме того, глаз может получить повреждения от искусственных источников освещения, испускающих ультрафиолетовый свет [Klein R.S., 2009]. Накапливающиеся повреждения могут возникать в условиях менее интенсивного освещения, но в течение более длительного воздействия или в случае связанного с возрастом снижения антиоксидантной защиты [Samiec P. S. et al., 1998; Vandewoude М. F. et al., 1987].

1.1.1 Сетчатка позвоночных

Сетчатка позвоночных выстилает внутреннюю поверхность задней стенки глаза и состоит из трех слоев нервных клеток, разделенных двумя слоями синапсов, образованных аксонами и дендритами этих клеток. Светочувствительные рецепторы - палочки и колбочки - расположены на задней поверхности сетчатки. Своими наружными сегментами, которые и осуществляют восприятие света, они обращены в сторону пигментного эпителия. Контакт между клетками пигментного эпителия и фоторецепторами достаточно слабый, что может привести к отслойке сетчатки — опасному заболеванию глаз. Отслойка сетчатки приводит к нарушению зрения не только вследствие ее смещения с места оптического фокусирования изображения, но и вследствие дегенерации рецепторов из-за нарушения контакта с пигментным эпителием, что приводит к серьезнейшему нарушению метаболизма самих рецепторов. Метаболические нарушения усугубляются тем, что нарушается доставка питательных веществ из капилляров сосудистой оболочки глаза, а сам слой фоторецепторов капилляров не содержит.

Слой клеток, следующий за рецепторным, содержит нейроны трех типов: биполярные, горизонтальные и амакриновые клетки. Биполярные клетки связаны с синаптическими окончаниями рецепторов, и многие из них передают сигналы непосредственно ганглиозным клеткам. Горизонтальные клетки соединяют рецепторы и биполярные клетки сравнительно длинными связями, идущими параллельно слоям сетчатки. Аналогично горизонтальным, амакриновые клетки связывают биполярные клетки с ганглиозными. Слой нейронов на передней стороне сетчатки содержит ганглиозные клетки, аксоны которых проходят по поверхности сетчатки и собираются у слепого пятна, образуя зрительный нерв. Схема строения сетчатки представлена на рисунке 2.

пигментный_£

эпителий

амакриновые клетки

ганглиозиые клетки

нервное волокно

Рис. 2. Строение сетчатки глаза.

1.1.2 Пигментный эпителий

Пигментный эпителий представлен клетками гексагональной формы, содержащими пигментные гранулы (меланин), придающие этому слою черный цвет. На внутренней поверхности этих клеток расположены отростки (микровиллы), окружающие наружные концы фоторецепторов и проникающие вглубь на 5-10 мкм длины наружных сегментов [Bok, D. 1993], оптически изолируя их друг от друга. Существуют два вида микровилл: короткие - для фагоцитоза отработанных дисков наружных сегментов фоторецепторов, длинные - для максимально эффективного транспорта необходимых веществ в субретинальное npocTpaHCTBo[Young R.W., 1974; Young R.W., 1969; Marshall J. et al., 1971]. Такие микровиллы значительно увеличивают площадь контакта клеток пигментного эпителия с фоторецепторами, способствуя тем самым высокому уровню метаболизма за счет возрастания интенсивности доставки питательных веществ сетчатке из хориокапиллярного слоя сосудистой оболочки и выведения из сетчатки продуктов метаболизма [Strauss О., 2005].

На одну клетку пигментного эпителия приходится 10-20 фоторецепторов. Всего в пигментном эпителии сетчатки человека насчитывают около 4-6 млн. клеток. На стороне, обращенной к сетчатке, клетки ПЭ содержат меланосомы,

которые экранируют от света более глубокие слои, где располагаются митохондрии и ядро.

Клетки в эпителиальном слое скрепляются плотными клеточными контактами. Плотные контакты выполняют две функции: барьеров для диффузии мембранных белков между апикальной и базолатеральной поверхностями (апикальная сторона обращена внутрь глаза к фоторецепторным клеткам, базолатеральная - к сосудистой оболочке) и скрепления соседних клеток вместе так, чтобы транспортированные молекулы не могли продиффундировать назад через межклеточные промежутки. Перенос метаболитов происходит только через цитоплазму клетки активным путем.

Со стороны склеры пигментный эпителий отделяется от сосудистой оболочки мембраной Бруха, входящей в состав гематоофтальмического барьера. ПЭ обеспечивает поступление из кровяного русла питательных веществ и витамина А, являющегося предшественником ретиналя, в фоторецепторные клетки. Превращения ретиноидов в ПЭ и доставка их в сетчатку способствует нормальному протеканию фототранс�