Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие физических факторов - видимого света и ионизирующей радиации - на сетчатку глаза

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Действие физических факторов - видимого света и ионизирующей радиации - на сетчатку глаза"

На правах рукописи

□□34У7513

Логинова Марина Юрьевна

действие физических факторов видимого света и ионизирующей радиации— на сетчатку глаза

03.00.02-Биофизика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 СЕН 21

Москва 2009

003477519

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, академик,

Островский Михаил Аркадьевич (ИБХФ РАН)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Каламкаров Григорий Рафаэлевич (ИБХФ РАН)

доктор биологических наук, профессор Пелевина Ирина Ивановна (ИХФ РАН)

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем РАН

Защита состоится « 28 » октября 2009 г. в 11.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.039.01 в Институте биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН по адресу: 117977, Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. Н.Н.Семенова РАН

Автореферат разослан 2009

года

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 002.039.01 кандидат химических наук

М.А.Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Глаз, являясь периферическим органом восприятия световых раздражений, подвергается воздействию разнообразных физических и химических факторов внешней среды. По-крайней мере три физических фактора представляют для структур глаза существенную опасность - слишком яркий видимый свет, ультрафиолет и ионизирующая радиация. Показано, что видимый свет может стать причиной нарушения зрительных функций и дегенерации фоторецепторных клеток сетчатки и клеток ретинального пигментного эпителия как у экспериментальных животных, так и у человека. Согласно многолетним эпидемиологическим исследованиям, свет оказывает усугубляющее действие при развитии такого тяжелого и распространенного заболевания сетчатки как возрастная макулярная дегенерация. Что касается ионизирующей радиации, то, согласно последним отчетам NASA, глаз, наряду с кожей, является самым дозоаккумулирующим органом.

Механизмы как свето-, так и радиационно-индуцированного повреждения сетчатки остаются в значительной мере невыясненными. Их выяснение является исключительно важной задачей для биофизики, радиобиологии, молекулярной физиологии и патологии зрения. Понимание механизмов патогенеза дегенеративных заболеваний сетчатки является ключевой и нерешенной проблемой современной экспериментальной и клинической офтальмологии. Изучение механизмов действия различных видов ионизирующего излучения на сетчатку глаза принципиально важно как для оценки рисков постлучевых осложнений, возникающих при лучевой терапии глаза и мозга, так и вполне реальной опасности, возникающей в ходе длительных космических полётов. В последнем случае речь идёт об опасности повреждающего действия тяжёлых заряженных частиц галактического происхождения вне магнитосферы Земли. При этом клинически значимый повреждающий эффект на сетчатку может возникнуть не сразу, а спустя месяцы и даже годы.

Одним из основных источников потенциальной опасности свето-индуцироваиного повреждения сетчатки является полностью-/и/»£шс-ретиналь, представляющий собой конечный продукт нормального процесса фотолиза родопсина. Как показано совсем недавно, именно полностью-т^акс-ретиналь может быть одной из важных причин патогенеза или ускорения развития дегенеративных изменений в сетчатке (Maeda et al., 2009)

В механизмах радиационно-индуцированного повреждения сетчатки остается невыясненной роль и пути апоптоза отдельных типов клеток в развитии последующих патологических изменений. Не описаны характер повреждений и механизмы репарации ДНК в клетках сетчатки. Не выяснена роль повреждений ДНК в индукции апоптотической гибели нейронов сетчатки, не исследована связь между остаточными (неотрепарированными) повреждениями ДНК и последующим развитием нейродегенеративных изменений в клетках как сетчатки, так и мозга. Сетчатку как «часть мозга,

помещённую в глаз» (Ramón у Cajal, 1901) правомерно рассматривать как модель и объект для изучения действия радиации, в первую очередь тяжёлых заряженных частиц, на центральную нервную систему.

Цель диссертационной работы заключалась, с одной стороны, в выяснении фототоксических свойств конъюгатов полностью-яг/аднс-ретиналя в модели in vitro, имитирующей избыточное присутствие поппостыо-транс-ретиналя в фоторецепторных мембранах наружных сегментов палочек сетчатки, а с другой стороны, в исследовании морфологических и цитогенетических изменений в клетках сетчатки мышей после воздействия ионизирующего излучения in vivo.

Основные задачи исследования

1. Исследовать спектральные и фотофизические свойства конъюгатов нолностыо-от/зд/лг-ре пшаля с компонентами фоторецепторных мембран.

2. Исследовать in vitro фототоксичное действие полностью-/и/аднс- ретиналя и его конъюгатов с компонентами фоторецепторных мембран, оценивая (1) фотоокисление липидов фоторецепторных мембран, и (2) изменение скорости регенерации родопсина после его обесцвечивания.

3. Выявить и описать ранние морфологические изменения сетчатки после действия у-излучения и ускоренных протонов в высокой дозе (14 Гр).

4. Охарактеризовать поврежденность генома и активность репаративной системы зрелой сетчатки после действия у-излучения и ускоренных протонов в указанной дозе.

5. Оценить изменение уровня экспрессии белка р53, регулирующего ответ ряда клеточных систем и активирующегося в ответ на повреждение генома после действия ионизирующего излучения.

Научная новизна

Впервые детально описаны спектральные и фотофизические свойства конъюгатов полностью-от^очс-ретиналя, образующихся в модельной системе in vitro в ходе длительной инкубации фоторецепторных мембран с избытком ретиналя при 37°С. Методом пикосекундной лазерной флуорометрии исследованы кинетики затухания флуоресценции полностью-ш/эанс-ретиналя и его конъюгатов, определены центры свечения и их реальные времена жизни. Установлено образование, по меньшей мере, трех флуорофоров с характерными временами жизни возбужденного состояния - 48, 208 и 900 пс. Впервые установлено фототоксическое действие конъюгатов ретиналя на липиды фоторецепторной мембраны in vitro- при облучении видимым светом (400-700 нм) в мембранах накапливаются продукты перекисного окисления липидов. Показано снижение скорости регенерации родопсина in vitro после облучения видимым светом (400-700 нм) в присутствии конъюгатов ретиналя.

Впервые для определения поврежденное™ ДНК в клетках сетчатки применен метод ДНК-комет, позволяющий определять однонитевые и двунитевые разрывы ДНК. Установлено, что после облучения животных как у-

4

лучами, так и ускоренными протонами в дозе 14 Гр в ДНК клеток сетчатки образуется значительное количество одно- и двунитевых разрывов, которые почти полностью удаляются к 6-12 часов. Обнаружено, что спустя 24-48 часов после облучения в сетчатке снова встречаются клетки (10%) с поврежденной ДНК. Впервые показано увеличение количества белка р53 в сетчатке половозрелых мышей после действия ионизирующей радиации. Установлено, что массового апоптоза в терминально-дифференцированной ткани сетчатки в первую неделю после воздействия ИИ в дозе 14 Гр не наблюдается.

Научная и практическая ценность работы

Результаты диссертации имеют фундаментальное значение для понимания механизмов липофусциногенеза и патогенеза сетчатки/ ретинального пигментного эпителия, связанных с избыточным накоплением полностью-м/юнс-ретиналя в фоторецепторных мембранах, образованием его конъюгатов с компонентами мембраны и, как следствие, фотоиндуцированным перекисным окислением липидов. Описанные флуоресцентные характеристики конъюгатов ретиналя представляют несомненный практический интерес для дальнейшего усовершенствования метода аутофлуоресцентной диагностики глазного дна при дегенеративных заболеваниях сетчатки.

Результаты данной работы имеют большую значимость для понимания механизмов развития радиационно-индуцированного патогенеза сетчатки и расширяют представления о биологических последствиях воздействия ионизирующего излучения на зрелую сетчатку.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Связывание полностью-от/занс-рстиналя с компонентами фоторецепторной мембраны приводит к образованию нескольких флуорофоров с различными максимумами поглощения при 355, 335/440, 335/460 и флуоресценции при 480,480/550 и 480/550 им, соответственно.

2. Реальные времена жизни возбужденного состояния конъюгатов полностыо-т/гакс-ретиналя с компонентами фоторецепторной мембраны выше, чем у полностью-7и/?анс-ретиналя, и составляют 48, 208 и 900 пс.

3. Скорость регенерации родопсина, находящего в окружении конъюгатов полностью-7н/?анс-ретиналя с компонентами фоторецепторной мембраны, резко падает после обесцвечивания светом в диапазоне 400-700 нм.

4. Облучение светом в диапазоне 400-700 нм фоторецепторных мембран, содержащих конъюгаты полностью-от^анс-ретиналя, индуцирует перекисное окисление липидов.

5. Облучение половозрелых мышей в дозе 14 Гр способствует появлению одно- и двунитевых разрывов в ДНК их сетчатки, которые устраняются в течение 12 часов после облучения. Спустя 24ч и далее в течение 7 суток после облучения среди нормальных клеток с неповрежденной ДНК снова встречается до 10% клеток с поврежденной ДНК.

6. Облучение приводит к увеличению количества белка р53, повышенный уровень которого сохраняется в течение длительного времени после облучения.

7. Облучение не приводит к резким морфологическим изменениям в сетчатке в течение первой недели после воздействия.

Апробация диссертации и публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 4 статьях; докладывались и обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах.

Итог. конф. «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2004, 2007,

2008); VI и VIII междунар. молод, конф. «ИБХФ РАН - ВУЗы» "Биохимическая физика" (Москва, 2006, 2008); XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (2007, Москва); VII «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов», посвященная дню космонавтики и приуроченная к 45-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН (Москва, 2008); V съезд Российского фотобиологического съезда (Пущино, 2008); 30-я сессия программно-консультативного комитета по физике конденсированных сред (ОИЯИ, Дубна,

2009);

Личный вклад соискателя. Все изложенные в диссертации новые результаты получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Постановка задач, интерпретация полученных результатов и формулировка выводов исследования осуществлялись совместно с научным руководителем и другими соавторами публикаций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 175 страницах, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение результатов), выводов и списка литературы, включающего 188 источников. Диссертация иллюстрирована 59 рисунками и 9 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Обзор литературы разбит на 2 части, посвященные фото- и радиационно-индуцировапным изменениям в сетчатке. В первой части литературного обзора анализируется возможность участия полностью-транс-ретиналя в свето-индуцированной патологии сетчатки, описываются условия, при которых в наружных сегментах палочек сетчатки может происходить накопление фототоксичного полностью-м/ганс-ретиналя. Также описываются фотохимические и фотофизические свойства как ретиналя, так и его конъюгатов, формирующихся в фоторецепторных мембранах. Обсуждается возможность наличия фототоксических свойств у конъюгатов ретиналя и обосновывается необходимость экспериментальной проверки этих свойств. Во второй части литературного обзора рассматриваются известные экспериментальные данные, описывающие на тканевом, клеточном и молекулярном уровнях ответ сетчатки различных лабораторных животных и человека на действие ионизирующего излучения. Ответ сетчатки анализируется в сравнении с ответом центральной нервной системы. Также описываются

6

особенности радиационного повреждения и репарации ДНК в фоторецепторах сетчатки.

Материалы и методы исследования. Первая часть работы, посвященная изучению фотоиндуцированных изменений в сетчатке, а именно в фоторецепторных мембранах, была выполнена in vitro.

Исследуемым объектом являлся родопсин в фоторецепторных мембранах, которые получали из сетчатки глаз быка.

Конъюгаты полностыо-трапс-ретипаля с компонентами фоторецепторных мембран были получены в результате инкубации мембран с 2- и 10-кратным молярным избытком ретиналя (по отношению к родопсину) в течение трех суток при температуре 37° (с добавлением необходимых ингибиторов роста бактерии). Образование конъюгатов ретиналя при этих условиях и отсутствие продуктов его окисления регистрировалось спектрально (с помощью спектрофотометра UV-1700, «Shimadzu» (Япония) и спектрофлуориметра RF-5301 PC, «Shimadzu»), а также с помощью

высокоэффективной_жидкостной_хроматографии_(В ЭЖХ)

(хроматографическое оборудование фирмы «Knauer» (Германия)).

Оценка фототоксичного действия полностыо-транс-ретиналя и его конъюгатов на зрительный пигмент родопсин произведена на основе анализа скорости регенерации родопсина. Регенерацию родопсина, т.е. возвращение обесцвеченного родопсина в исходное темновое состояние вследствие реакции рекомбинации опсина (апопротеина) и 11-г/мс-ретиналя (хромофора), оценивали спектрально по восстановлению исходного спектра поглощения родопсина с максимумом при 500 нм.

Оценка перекисного окисления липидов проводилась по определению количества ТБК-активных продуктов, образующихся в результате перекисного окисления липидов и взаимодействующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

Фотофизические свойства полностью-транс-ретиналя и его конъюгатов исследовали с помощью импульсного флуорометра на базе кафедры биофизики Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Вторая часть работы, посвященная радиационно-индуцированным изменениям сетчатки, выполнена в экспериментах in vivo на мышах линии С57В1хСВА (о) в возрасте 2,5 месяцев.

Облучение мышей проведено на базе терапевтических установок ОИЯИ (г.Дубна): общее воздействие у-излучением (^Со) на терапевтической установке «Рокус-М»; локальное воздействие (область головы) клиническим протонным пучком фазотрона ЛЯП ОИЯИ. Поглощенная доза - 14 Гр, мощность поглощенной дозы 0,64 Гр/мин.

После облучения животных умерщвляли в парах хлороформа через 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72 часа после воздействия, а животных, облученных локально, и через 168 часов. После энуклеации для оценки морфологических изменений в сетчатке мышей один глаз фиксировали в растворе Буэна 24 часа и использовали далее для приготовления гистологических срезов (стандартная проводка через спирты восходящей крепости и ксилол, последующая обработка

смесью спирт-ксилол и заливка в парафин). Поперечные срезы толщиной 5 мкм на предметном стекле окрашивали гематоксилин-эозином.

Из второго глаза извлекалась сетчатка для определения количества белков р53 и ATM с помощью Вестерн-блота. Белки разделялись после электрофореза в 12,5%-ном полиакриламидном геле и переносились на нитроцеллюлозную мембрану на блоттере (Helicon Semi-Dry Transfer) в буфере для переноса 1 час. Неспецифическое связывание антител блокировалось 1%-ным бычьим сывороточным альбумином в течение 2 часов при 23°С. Инкубация с первичными антителами (Abeam, mouse monoclonal, разведение 1:2000) проводилась в течение ночи при 4°С. Инкубация с конъюгатом вторичное антитело-пероксидаза хрена (Abeam, mouse IgG antibody, разведение 1:400) - 2 ч при 23 "С. Детекцию осуществляли, используя ECL-систему (Amersham Biosciences) и рентгеновскую пленку Retina. Количество белка в каждой полосе измерялось при помощи программы ImageJ и выражалось в относительных единицах.

Повреждение и репарация ДНК определялись с помощью метода ДНК-комет. клетки сетчатки иммобилизовали в геле из низкоплавкой агарозы на поверхности предметного стекла. Гель-слайды помещали в лизирующий раствор на 12 ч при 4°С. После лизиса ДНК иммобилизованных в агарозу единичных клеток подвергалась электрофорезу: при этом фрагментированная ДНК выходит из ядра клетки и образует характерный «хвост» кометы. При проведении электрофореза при нейтральном значении pH (pH 8,2; 0.5В/см, 15 мА, 40 мин.) определяются преимущественно двунитевые разрывы (Ostling et al., 1984). Для исследования фрагментации ДНК, обусловленной не только двунитевыми, по и однонитевыми разрывами, а также щелочелабильными сайтами использовали щелочной вариант метода (Singh et al., 1989) -электрофорез при pH > 13 (pH 13,5; 0.7 В/см, 170 мА, 21 мин.). После электрофореза гель-слайды погружали на 10 мин. в нейтрализующий раствор (Трис, pH 7,4 после электрофореза в щелочи и 0,3 М NaOH на 5 минут, а затем в Трис, pH 7,4 - после электрофореза в нейтральных условиях) для ренатурации ДНК. Далее слайды высушивали на воздухе и фиксировали в метаноле в течение 30 минут. Перед проведением анализа ДНК их окрашивали пропидиум йодидом. Количество разрывов ДНК считалось прямо пропорциональным длине хвоста кометы и содержанию ДНК в нем. Для анализа ДНК-комет использовали программу CASP. В качестве параметра поврежденности ДНК использовали Момент Хвоста Оливе (Olive Tail Moment), равный произведению расстояния от центра ядра до центра плотности хвоста кометы на % ДНК в хвосте.

Статистическая обработка данных произведена в ППП СТАТИСТИКА. Для проверки гипотезы о различии средних между несколькими группами применяли дисперсионный анализ, а для оценки достоверности различий в 2-х группах - критерий Стыодента t (Гланц, 1998).

Фотолндуцнрованные изменения в фоторецепторных мембранах в присутствии полностыо-/и/ш/с-ретпналя

В работе был проведен сравнительный анализ фототоксических свойств ретиналя и его конъюгатов, образующихся в результате его взаимодействия с компонентами фоторецепторных мембран. Фототоксические свойства свободного ретиналя исследовали сразу после его добавления к суспензии мембран, а фототоксическне свойства ковалентно связанного ретиналя исследовали после его инкубации с суспензией мембран в течение 3-х суток в темноте при 37°С.

Получение к'оныогатов нолностио-трй//с-г>етпналя

Конъюгаты ретиналя, образующиеся в фоторецепторных мембранах, представляют собой продукты его взаимодействия с неспецифическими аминогруппами родопсина и фосфатидилэтаноламина. Спектры поглощения, зарегистрированные в ходе получения конъюгатов ретиналя, представлены на рисунке 1.

Рис.1. Спектры поглощения: 1 - тешювая суспензия фоторецепторных мембран (контроль); 2 - темповая суспензия мембран в присутствии 10-кратного избытка ретиналя (спектр записан сразу после добавления ретиналя к суспензии 10-кратного избытка); 3 - темновая суспензия мембран, инкубированная в темноте с 10-кратным избытком ретиналя в течение 3-х суток при

Вставка: Дифференциальные спектры, полученные при вычитании спектра суспензии фоторецепторных мембран из спектра суспензии мембран, инкубированной с различными избытками ретиналя: 4а, 46, 4в — с 2-, 5- и 10-кратныч избытком ретинапя, соответственно.

Спектр поглощения темновой суспензии фоторецепторных мембран имеет максимум при 500 нм и соответствует спектру поглощения нативного родопсина (рис. 1, спектр 1). Добавление к суспензии 10-кратного избытка ретиналя приводит к появлению характерного для него спектра с максимумом при 380 нм, на фоне которого спектр поглощения суспензии мембран с максимумом в области 500 нм почти не виден (рис. 1, спектр 2). В процессе инкубирования этой смеси происходит взаимодействие ретиналя с аминогруппами фосфатидилэтаноламина и родопсина, приводящее к появлению конъюгатов ретиналя с компонентами фоторецепторных мембран. Спектр 3 является спектром смеси этих соединений и характеризуется пиком при 280 нм, плечом, отражающим полосу поглощения при 320-340 нм и выраженным широким максимумом в области 440-460 нм.

Сравнение спектра 3 со спектрами известных производных ретиналя позволяет предположить, что в нашей модельной системе мо1ут быть как неспецифические основания Шиффа ретиналя с аминогруппами опсина и

фосфатидилэтаноламина, так и продукты вторичного взаимодействия оснований Шиффа со второй молекулой ретиналя.

Флуоресцентные характеристики копъюгатов полностыо-отрднс-петиналя

Суммарный спектр флуоресценции суспензии фоторецепторных мембран, содержащей конъюгаты ретиналя, характеризуется выраженными полосами с максимумами при 480 нм и 555 нм (рис.2, спектр 3). При этом, квантовый выход флуоресценции суспензии мембран, содержащей конъюгаты ретиналя, значительно выше (в 20 раз), чем у суспензии мембран, содержащей ретиналь (соотношение между квантовыми выходами определялось из соотношения площадей под кривыми флуоресценции 2 и 3 соответствующих спектров флуоресценции).

Рис.2. Спектры флуоресценции при возбуждении светом длиной волны 350 нм (А) и 460 нм (Б) 1 - суспензия фоторецепторных мембран; 2 - суспешия мембран в присутствии 10-кратного избытка ретиналя (спектр прописан сразу после добавления ретиналя к суспензии); 3 -суспешия мембрна после инкубации с 10-кратным избытком ретиналя в течение 3-х суток при 37°С;

Рис.3 Спектры возбуждения флуоресценции, зарегистрированной при 460 нм (А) и 555 нм (Б). 1 — суспешия фоторецепторных мембран; 2 — суспензия мембран в присутствии 10-кратного избытка ретиналя; 3 - суспешия мембран, инкубированная в темноте с 10-кратным избытком ретиналя. Узкая полоса, указанная стрелкой, является вкладом от Рамановского рассеяния растворителя.

Спектры флуоресценции (рис.2) и возбуждения флуоресценции (рис.3) позволяют выделить в модельной системе как минимум три группы веществ, образующихся в ходе инкубации ретиналя с фоторецепторными мембранами, и позволяют предположить образование производных ретиналя как моно -(основания Шиффа), так и бисретиноидной природы.

Так, продукт Р355, поглощающий при 355 им и испускающий при 460 нм, скорее всего, характеризует неспецифические основания Шиффа между ретиналем и аминогруппами фосфатидилэтаноламина и белка. Продукт Р335/440, имеющий две полосы поглощения при 335 и 440 нм и испускающий при 460 и 555 нм, мог бы представлять собой димер ретиналя, так как димер имеет максимумы поглощения при 290 и 430 нм (как и его конъюгат с фосфатидилэтаноламином в непротонированной форме), и его спектральные характеристики наиболее близко совпадают с максимумами, полученными нами. Продукт Р335/460, имеющий две полосы поглощения при 335 и 460 нм и испускающий при 460 и 555 нм, мог бы характеризовать собой такие соединения с близкими спектральными свойствами, как jV-бисретинилиден производное фосфатидилэтаноламина (А2-РЕ), дигидро-А^-бисретинилиден производное фосфатидилэтаноламина (A2-DHP-PE) и А2-родопсин (каждый из трех лизинов которого связан с двумя молекулами ретиналя). Их максимумы, как следует из литературных данных, наиболее приближены к полученным нами.

Хроматографический анализ (ЪЭЖХ)

Чтобы убедиться, что весь ретиналь, добавленный к суспензии фоторецепторных мембран, химически модифицировался в результате инкубации при 37°С, использовали хроматографический анализ (ВЭЖХ) присутствующих в реакционной смеси изомеров ретиналя (рис.4А) и его конъюгатов (рис.4Б).

Как видно из рис.4А, хроматограмма а, в темно-адаптированном родопсине содержание 11 -цис- и полностью-яг/?анс-ретиналя составляет 90 и 5% соответственно (остальные 5% приходятся на минорные изомерные формы). После добавления 10-кратного избытка полностью-»г/>£шс-ретиналя к суспензии (без инкубирования образца) соотношение изомеров ретиналя резко меняется: транс-форма начинает доминировать над г^ис-изомером (примерно с соотношением 10 : 1) (хроматограмма б). После инкубации суспензии мембран с полностью-шранс-ретиналем при 37°С соотношение изомеров ретиналя снова сильно меняется и становится практически идентичным соотношению изомеров ретиналя в контрольном образце (хроматограмма е). Таким образом, весь экзогенный полпостыо-транс-ретиналь, добавленный в 10-кратном молярном избытке к суспензии фоторецепторных мембран, связался с их компонентами в ходе инкубации.

5 10

Время удерживания, мин

0 10 20

Время удерживания, мин

Рис. 4,А. ВЭЖХ анализ изомеров ретиналя (нормальная фаза), детектирование на длине волны 365 нм. Колонка IBM Silica, 5 мкм, 250 х 4,5 мм, скорость элюэнта 1,5 мл/мин, система: н-гексан : этилацетат - 95 : 5; а -изомеры ретиналя, экстрагированные из темнового родопсина в суспензии мембран (контроль); б - изомеры ретиналя, экстрагированные из суспензии

фоторецепторных мембран, содержащей родопсин плюс 10-кратный избыток транс-ретиналя; в - изомеры ретиналя, экстрагированные из суспензии

фоторецепторных мембран, содержащей родопсин плюс 10-кратный избыток транс-ретиналя после инкубации при 37°С. Все хроматограммы нормированы

Рис. 4,Б. ВЭЖХ анализ ретиналя и его конъюгатов (обращенная фаза), детектирование на длине волны 430 нм. Колонка Диасфер-110-С18, 5 мкм, 250x4мм, скорость элюэнта 1,5мл/мин, система: градиент ацетонитрил (84100%) : раствор 0,05% ТФУ в воде (16%-0%): 84-90% -5мин, 88% -Ямин, и 100% -30 мин, а - Хлороформ-мета-нольный экстракт из суспензии мембран с 10-кратным избытком транс-ретпапя после инкубации при 37°. б - Хлороформ-метанольный экстракт из суспензии мембран. Все хроматограммы нормированы.

Анализ на обращенной фазе ВЭЖХ суспензии мембран после инкубации с полностью-тиранс-ретиналем показал образование дополнительных пиков (рис.4Б, хроматограмма а), принадлежащих, по всей видимости, продуктам модификации компонентов мембраны ретиналем.

В качестве контроля были проведены эксперименты по исследованию спектральных свойств ретиналя при его инкубировании в тех же самых условиях, но в отсутствие фоторецепторных мембран. Сравнительный спектральный и ВЭЖХ анализ продуктов окисления ретиналя (приведены в диссертации) показал, что в суспензии мембран, инкубированной с ретиналем, продуктов окислительной деградации ретиналя не наблюдается. Тем не менее, поскольку реакции конденсации ретиналя с аминогруппами и его окисления (по двойным связям) не являются конкурентными между собой, мы не можем исключить окисления ретиналя, но уже в составе его конъюгатов с компонентами фоторецепторных мембран. Поскольку эти гипотетические окисленные производные ТР в своем большинстве имеют липидный «хвост», то

на хроматограмме (рис. 4Б), если они и есть, то, скорее всего, присутствуют в общей массе конъюгатов, имеющих время удерживания 23 минуты.

Исследование в никосекундном диапазоне времен кинетики затухания флуоресценции нолностыо-отрдлс-рстиналя и его конъюгатов

Для сравнительного исследования фотофизических свойств ретиналя и его конъюгатов с компонентами мембран, были зарегистрированы кинетики затухания флуоресценции в пикосекундном диапазоне времен после их возбуждения излучением с длиной волны 353 нм (рис.5).

Как видно из рис. 5А, хромофор молекулы зрительного пигмента практически не флуоресцирует (квантовый выход флуоресценции молекулы родопсипа после поглощения кванта света ll-ijKc-ретиналем в видимой области спектра очень низкии и оценивается в 10°), тогда как сигналы флуоресценции ретиналя или его конъюгатов с компонентами мембран являются хорошо разрешимыми (рис.5Б-Г). Кинетика флуоресценции Ф(х) ретиналя хорошо аппроксимируется в 2х-экспоненцнальном приближении кривой вида: Ф(/)=4ехр(-^/г1)+/12ехр(-//г2), а для конъюгатов ретиналя наилучшая аппроксимация достигается в Зх-экспоненциальном приближении кривой вида: Ф(г)= ехр(-//г;), где А,- и г,- амплитуда и длительность /'-компонента.

t S !

* Sit Рис Кинетика затухания флуорещенции при

Щр^У i'o: k ft возбуждении излучением с длиной волны 353 нм. А

1 ! IM - суспензия фоторецепторных мембран; Б -

..........з.....| ретиналь в буфере; В - ретиналь, добавленный в

вр««.№ | ei»««.» Ю-кратном избытке к суспензии мембран ^ 1 | (регистрация сразу после добавления ретиналя); Г j \ |„j j i\ - суспензия мембран, инкубированная с 10-J: £ I Г** кратным шбытком ретиналя в течение 3 суток при ....................,L 1 iL_________________,.______З7°с

.13 6? Ц 1 3 5 7

Бяеш, не не

Определено, что для ретиналя т=31+2 пс, а для его конъюгатов - ii=48+2 пс (22%), т2=208±5 пс (48%), т3=900±10пс (30%). Наличие трех компонент в кинетике флуоресценции инкубированного образца можно объяснить присутствием, как минимум, 3-х центров свечения.

Более короткое время жизни возбужденного состояния, а также более низкий квантовый выход флуоресценции ретиналя по сравнению со значениями этих параметров у его конъюгатов свидетельствуют о более высоких значениях констант скоростей дезактивации возбужденного состояния ретиналя. В частности, можно ожидать, что константа скорости фотохимических превращений и реакций, в которых может принимать участие ретиналь, больше, чем у его конъюгатов.

Ип'чснне фнкинифсждакицнх свойств iio.iiiociutw«pff«i-in.'nma.iii и его конъюгатов с компопептами фотореле i пори 1,1 \ мембран

Основной целью нашей ¡заботы являлось исследование фототоксических свойств конъюгатов ретиналя с компонентами фоторецепторных мембран. Фотоинду цированные изменения в фоторецепторных мембранах в присутствии ретиналя и его конъюгатов мы оценивали по (1) изменению скорости регенерации зрительного пигмента родопсина и (2) фотоокислению липидов фоторецепторных мембран.

1. Фотоиндуцировтное снижение скорости регенерации родопсина к присутствии полностъю-транс-репшналя и его конъюгатов

Регенерация родопсина, т.е. возвращение обесцвеченного родопсина в исходное темповое состояние вследствие реакции рекомбинации о псин а (ашпротеина) и 11-^ис-решнад? (хромофора), является его важным функциональным свойством. Регенерация родопсина регистрируется спектрально по восстановлению максимума при 500 нм в спектре поглощения, характерного для темноадаптирошннога родопсина. Изменение первичной структуры (мутантный родопсин) и/или нарушение кон формации белковой части молекулы родопсина (анобелка опсина) обычно приводят к затруднению шш полной неспособности ] l-j/кс-ретиналя встраиваться в хромофорный центр опсина. Более тога, регенерация родопсина очень чувствительна к своему липидному окружению, поддерживающему нативную кон формацию белка.

Б

В -д

шщ

Й1-ТР 10I-TP

Рис. 6, Количество регенерировавшего за 15 минут родопсина в присутствии рептнаяя или его конъюгатов при различных условиях облучения. А после облучения 120 мин светом а диапазоне от 500 -700 им Р - 0.000429 при 5%-ном уровне значимости. Б - после облучения 120 мин светом н диапазоне от 400-700 им Р^О.ОООООО при 5%-ном уровне значимости. Темные столбцы - образцы в присутствии per и паля, светлые столбцы образцы в присутс! вни конъюгатов ретиналя.

Контроль ■ образцы без добавления ретиналя «ли его конъюгатов. 2х-ТР - образцы с явукратньгм избытком ретиналя или его копъюгатов, 10х-ТР образцы с десятикрат ным избытком ретиналя или его конъюгатов.

I

Эксперименты проводились при различных условиях облучения образцов: 1) облучение «мягким» светом в диапазоне 500-700 ям (длинноволновая область видимого спектра), в котором поглощение

конъюгатов ретин зля (А2-РЕ, А2-ВНР-РЕ, димера ретин ал я, кон ногата димера ретииаля с фосфатидилэтанол амином, А2-родопсипа) практически отсутствует (рис.1, спектр 3); 2) обличение ^жестким» светом в области 400-700 нм (видимый свет), захватывающим область поглощения этих конъюгатов ретииаля.

Обнаружено, что в условии «мягкого» облучения (500-700 нм) фототоксические свойства как ретиналя, так и его конъюгатов проявляются довольно слабо (рис. 6 А). Способность родопсина к регенерации в этих образцах почти полностью сохраняется и довольно близка к скорости регенерации зрительного пигмента в контрольной суспензии фоторецеггторных мембран.

Однако при облучении образцов «жестким» светом (400-700 нм), то есть в области поглощения конъюгатов ретииаля. картина резко меняется. Количество родопсина, регенерирующего 11 течение 15 минут, существенно падает по сравнению с контролем, причем как в присутствии ретиналя, гак и его конъюгатов (рис б, Б). Это означает, что выраженным фот оповреждагощим действием обладает свет именно в синей области спектра, где находится область поглощения конъюгатов ретиналя с компонентами фрторецепторных мембран, а также самого ретиналя.

2. Фотоиндуцированное перекисное окисление липидов фоторецепторной мембраны в присутствии полностью-транс-репшналя или его конъюгатов

Для оценки степени переписного окисления липидов определяли количество ТБК-производных диальдегидов, продуктов нерекисного окисления липидов.

Обнаружено, что облучение белым светом в течение 2"" часов не меняет уровень ТБК-а«пивных продуктов в контрольных образцах (рис.7, 1). В то же время в суспензии фоторецептор пых мембран, содержащей 10-к ратный избыток ретииаля, после облучения белым светом уровень ТЕК-продуктов увеличивается в 4 раза. Для суспензии мембран, инкубированной в присутствии 10-кратного избытка ретиналя, также характерно увеличение уровня образования ТНК-акттшных продуктов; Однако значимых отличий между двумя опытными суспензиями, содержащими ретинадь или его производные, обнаружено не было: Р = 0,938 при 5%-пом уровне значимости по критерию Стыодента.

Рис 7. Изменение количества ТБК-акпшвныХ продуктов имеющихся в суспензии до (темные столбцы) и после (свептые столбцыI облучения светом (400-700 им/ в течение 2 часов.

I- контрольная суспензия фоторецепторных мембран; 2

суспензия мембран I) присутствии Ю-кратнот избытка

ретиналя: Л - суспензия мембран, инкубированная п темноте

с Ю-кратным избытком ретиналя в течение 3-х суток при

М 37° С. | г з

Очевидно, что и конъюгаты ретиналя, и сам ретиналь, действуя как фотосенсибилизаторы, способствуют перекисному окислению липвдов при воздействии белого света (400-700 нм) на фоторецепторные мембраны. Различия между темновыми и облученными образцами в двух опытных группах достоверны: Р = 0,035294 в присутствии ретиналя и 0,000779 в присутствии его конъюгатов при 5%-ном уровне значимости по критерию Стыодента. Накопление продуктов перекисного окисления липидов в избыточном количестве меняет структуру мембран, что, в свою очередь, может оказывать влияние на конформацшо родопсина. Возможно, именно этим объясняется снижение скорости регенерации родопсина при его облучении в присутствии TP или его конъюгатов.

Таким образом, основываясь на результатах исследования искусственной модели избыточного присутствия полностью-тя/зянс-ретиналя в фоторецепторных мембранах, можно сделать следующее заключение. Находясь в фоторецепторной мембране, полностыо-т/м//с-ретиналь способен легко взаимодействовать с ее компонентами. В результате образуются конъюгаты ретиналя с компонентами фоторецепторных мембран, что подтверждается экспериментально комплексом спектральных и хроматографических методов анализа. По своим фотофизическим свойствам эти бисретиноидные конъюгаты ретиналя являются флуоресцирующими пигментами. Реальные времена жизни их возбужденного состояния, как установлено нами, больше, чем у ретиналя.

Конъюгаты ретиналя, как и сам ретиналь, обладают свойствами фотосенсибилизаторов, вызывая при действии света перекисное окисление липидов фоторецепторной мембраны и нарушая, при этом, скорость регенерации находящегося в этой мембране зрительного пигмента родопсина.

Радиационно-индуцированные изменения в сетчатке

Связь между поврежденностью ДНК и апоптозом фоторецепторов предполагается, но не доказана. Установлено, что гибели фоторецепторов предшествует всплеск вторичной поврежденности ДНК (наблюдаемый на сетчатке кроликов спустя год после действия радиации (Lett et al., 1986)). Облучение мышей (линии C57BL/6J) Х-лучами в дозах 10 и 15 Гр не приводит к достоверным патологическим изменениям в ткани сетчатки (Gorgels et al, 2007). Однако при облучении в дозах от 18,5 до 25 Гр спустя 7 суток после облучения наблюдается массовый апоптоз фоторецепторов. Такая отчетливая пороговая зависимость проявления гибели фоторецепторов может свидетельствовать как о необходимости достижения определенного начального уровня поврежденности, так и об усилении и развитии этого первичного уровня поврежденности в течение 7 суток.

В рамках нашего исследования мыши были облучены в дозе 14 Гр. Существенным для нас было оценить ранний ответ клеток сетчатки на такую условно «безопасную для фоторецепторов» дозу: охарактеризовать первичную поврежденность ДНК и активность репаративной системы, проследить динамику изменения поврежденности ДНК на протяжении 7 суток после

16

воздействия, а также определить уровень экспрессии белка р53, играющего важную роль в системе контроля и поддержания целостности генома.

Гепотока мсскос действие шннпщщощег» шлддшя ил ссгчаи;у ио.юширепых мышей

Генотоксттческое действие облучения исследовали методом ДНК-комет. Для анализа разрывов ДНК в каждой временной точке спустя различное время после облучения использовали гго 2-3 сетчатки от равных животных. В каждой сетчатке анализировали не менее 100 ДНК-комет, соответствующих ДНК из 100 клеток сетчатки. Для каждой выборки комет (2-3 на каждую временную точку) были построены распределения, отражающие частоту встречающихся в выборке комет с определенным ''Моментом Хвоста" (ОТМ). Типичные примеры полученных распределений приведены па рис. 8.

ИИТ|1>ТНЫ> тогкн

ШШШШшШ

го « ш ш

I-доцмшн гь ДНК

ШШ рптапмкщд е 1Ш1Ш111 г аивд ямои* НИЗ.

Зч

* _,_.

¿0 10 130 1«

Поврв»/.п-м " | ЛИК

6-6 ч

№ -10 130 140 Лпнр^ж/тниосп..''." I

здитаиаи

м I,.

; м

к.

■а

л н а II

Пссрщинкстъ ДИН

¡"1

ОД -

Шк. ■■■■ ■

I

"' ».г » : *■ ДНК

Рис.8. Ми кро фотограф ии типичных коме/н (после электрофореза при рН 14,0) и их распределения по степени поврежденноепп! ДНК спустя различное время после облучения (А) у-лучами и (Б) ускоренными протонами. В качестве показателя поврежденности ДНК использовался Момент Хвоста (ОТМ).

Чтобы выявить различия между поврежденностью ДНК спустя различное время после облучения, необходимо было сравнить распределения ДНК-комет в различных временных точках. Вначале мы подвергали анализу распределения ДНК-комет, принадлежащие одной временной точке, определяя медианы, характеризующие эти распределения. По средним значениям из совокупностей медиан, подчиняющихся нормальным распределениям (ЬоусИ с1 а!., 2008), в каждой временной точке, были построены зависимости доли поврежденной ДНК (ОТМ), приходящейся на одну клетку, от времени, прошедшего после облучения (рис. 9). Полученные зависимости позволили нам проследить за динамикой изменения поврежденности ДНК в клетках после облучения.

X 25

520

л

S 15 1 10

I 5 Í 0

10 20 30 40 50 60 70 Время после облучения, ч

0 20 40 60 80 160 Время после облучения, ч

Рис.9 Динамика изменения поврежденности ДНК клеток сетчатки мышей спустя различное время после облучения животных у-лучами (А) и ускоренными протонами (Б) в дозе 14 Гр. В качестве показателя поврежденности ДНК использовался Момент Хвоста (ОТМ). —о— Двунитевые разрывы ДНК (как результат электрофореза при рН 8,2) —■—Однонитевые разрывы ДНК (как результат электрофореза при рН 13,5).

Из рисунка 9 видно, что облучение животных как у-лучами, так и ускоренными протонами способствует появлению в ДНК клеток сетчатки значительного количества однонитевых и двунитевых разрывов, которые почти полностью удаляются к 6-12 часам после облучения. Однако далее снова появляются клетки, ДНК которых повреждена и содержит разрывы. Это хорошо видно на распределениях (рис.8) клеток по степени поврежденности. И протоны, и у-излучение приводят к появлению 10% клеток с сильно поврежденной ДНК.

Используемая нами модификация метода ДНК-комет позволяет нам из множества возможных типов повреждений ДНК определять только разрывы, тогда как основным типом повреждений, образующимся под действием используемых нами видов радиации, являются модифицированные оксиадцукты оснований ДНК, главным механизмом репарации которых является эксцизионная репарация оснований - BER. В ходе BER с помощью моно- или бифункциональных ДНК-гликозилаз все одиночно расположенные модифицированные основания превращаются в апуриновые/апиримидиновые

сайты (АП-сайты), которые при электрофорезе ДНК-комет в агрессивных щелочных условиях трансформируются в однонитевые разрывы, которые мы уже могли наблюдать. Кроме этого, далее, в процессе BER, АП-эндонуклеаза превращает все АП-сайты в разрывы, которые также мы могли детектировать с помощью метода ДНК-комет.

Одиночно расположенные однонитевые разрывы и модифицированные основания, индуцированные радиацией, репарируются за первые 10-15 минут после облучения. Двунитевые разрывы ДНК репарируются медленнее - период их 50%-ного восстановления в разных клетках может составлять от 2 до 4 часов пострадиационного времени. Однако процесс полного восстановления от этих повреждений может продолжаться и до 24 ч (Газиев, 1999). Локальные множественные повреждения ДНК (у-излучение приводит к кластерам из поврежденных оснований, а протоны - к кластерам как с однонитевыми, так и с двунитевыми разрывами ДНК), в зависимости от типа и сложности повреждения, репарируются крайне медленно и уже с участием различных систем репарации - системы соединения негомологичных концов, эксцизионной репарации нуклеотидов или оснований. Количество отдельных повреждений и их пространственное распределение по отношению друг к другу определяют и влияют на ход их последующей репарации. Так, эксцизионная активность ряда эндонуклеаз и гликозилаз по отношению к какому-либо повреждению ДНК зависит от соседнего повреждения. Однонитевой разрыв ингибирует эксцизионную активность АП-эндонуклеазы, стремящейся отрепарировать соседнее модифицированное основание (Terato, 2004). И пока этот разрыв не будет отрепарирован, основание останется поврежденным. Таким образом, модифицированные основания, находящиеся в кластерах, превращаются в АП-сайты, а потом в однонитевые разрывы не сразу, а постепенно, в течение некоторого времени.

Поэтому мы предполагаем, что разрывы, наблюдаемые нами спустя первые часы после облучения, могут представлять собой первичные двунитевые разрывы, индуцированные действием радиации, а также разрывы, образующиеся в ходе репарации повреждений ДНК, локализованных в кластерах, поскольку все односайтовые однонитевые разрывы и модифицированные основания должны быть к этому времени отрепарированы. Помимо этого, весьма вероятно, что сюда вносят значительный вклад и разрывы, образующиеся вновь в результате развития различных постлучевых процессов. К сожалению, отделить первичные повреждения, индуцированные ионизирующим излучением, от вторичных, вызванных радиационно-индуцированными метаболическими процессами (оксидативным стрессом, ответной репарацией, начавшейся гибелью клеток) мы не можем. Но то, что кинетика изменения относительного количества одно- и двунитевых разрывов ДНК практически совпадает, скорее всего, свидетельствует именно в пользу преобладающего вклада от вновь возникших повреждений ДНК в наблюдаемые нами разрывы в первые часы после облучения.

Возможно, что продолжающиеся в клетках постлучевые изменения метаболизма приводят к поврежденности ДНК, наблюдаемой нами и спустя 12

часов после воздействий. Можно предположить, что эти разрывы могли бы свидетельствовать о начале деградации ДНК вследствие гибели клеток. И действительно, наличие небольшого, но стабильного, уровня поврежден пост и, еще долго сохраняющегося после облучения, можно проследить и на тканевом уровне (рис.! О-II). И хотя резких морфологических изменений в ткани сетчатки мы не наблюдали, однако, отдельные, на первый взгляд, незначительные повреждения все же имеют место.

- ^ «ДО «.5 ч 'Ч""«1

г.» -и -.'^-у ;»*-*

Рис. 10. Микрофотографии сетчатки мышей до и после воздействия излучения на животных в дозе 1-1 Гр. СПЭ - слой пигментного эпителия, СФР -слой наружных и внутренних сегментов фоторецептерных клеток НЯС -наружный ядерный слой, НСС - наружный сетчатый слой, ВЯС - внутренний ядерный слой, ПСС - внутренний сетчатый слой, СПС - слой га игл лозных клеток. Увеличение 300.

Рис.11. Микрофотографии фоторецеппюрного слоя сетчатки мышей до и после воздействия у-излучения иа животных в дозе 14 Гр. А. Наружные и внутренние сегменты фоторецепторов; Б Ядерный слой фоторецепторов; Стрелками отмечены фрагаентированные ядра. Увеличение 1500.

72 ч

На примере срезов, полученных после облучения животных у-лучамн (после протопоп мы наблюдали схожий .эффект) видно, ч то нее слои сетчатки сохраняются и практически не претерпевают каких-либо изменений на всех сроках исследования ткани после облучения. Плотность упаковки ядер в наружном и внутреннем ядерных слоях не изменяется и сохраняется таковой на протяжении более 3 суток для ^излучения и 7 суток - для протонов. Однако отдельные, па первый взгляд незначительные повреждения все же имеют место. Видны единичные апоптетические ядра в наружном ядерном слое (на рисунке 11 они указаны стрелками), небольшие разрыхления в фоторепс и торном слое, и нехарактерные для здоровой ткани лакуны в сетчатом слое (рис. 10). Апоптотические ядра в наружном ядерном слое могут свидетельствовать о гибели отдельных фоторецепторов.

Нельзя исключить и возможность того, что наблюдаемые нами разрывы ДНК спустя 12 часов после облучения могут представлять собой системный ответ ткани сетчатка.

Таким образом, можно заключить, что у-излучепие и ускоренные протоны н дозе 14 Гр приводят к появлению однонитевых и двунитевых разрывов ДНК н клетках сетчатки, которые почти полностью удаляются к 6-12 часам после облучения. Однако далее в клетках сетчатки снова появляются клетки (10%) с поврежденной ДНК.

Со.кЧ'жаннс белкой n53 п ATM в сетчатке \n.imeii после ишдеиетвпи -/-излучении Ii ускоренных протопоп в лом1 14 Гр

Увеличение содержания белка р53 в клетках является обычной реакцией на повреждение ДНК. Разрывы же ДНК часто являются индуктором р53-зависимого апонтоза. Более того, р53-зависимыЙ апоптоз наблюдается в клетках сетчатки новорожденных мышей, облученных в дозах 2 и 14 Гр (Borges et al., 2004). Поэтому нам было важно оценить изменение количества белка р53 в клетках сетчатки половозрелых мышей после воздействия на них ионизирующего излучения.

Результат Вестерн-бдота для р53 представлен на рисунке 12. Видно, что в ответ на действие у-излучения и протонов в клетках сетчатки мышей происходит накопление р53. Его количество увеличивается сразу в первые часы после облучения и сохраняется примерно на этом уровне в течение 72 часов после у-излучен и я и в течение 24 часов - после протонов. Одним из активаторов белка р53 часто является протеинкиназа ATM (Ataxia telangiectasia mutated), участвующая в репарации двунитевых разрывов и являющаяся их сенсором. Облучение протонами приводит к увеличению количества ATM, которое предшествует накоплению р53 (рис. 13).

В целом, увеличение количества р53 должно свидетельствовать о наличии повреждений в ДНК. Однако, как установлено нами выше (рис.9), практически все разрывы в ДНК оказываются удаленными к 6-12 часам после воздействия радиации. Можно предположить, что в клетках имеются другие повреждения ДНК (например, сшивки), которые не обнаруживаются в нашей

модификации метода ДНК-комет, но которые служат сигналом к стабилизации и увеличению количества р53. Обращает па ссбя внимание такой длительный по времени повышенный уровень белка. Это, возможно, свидетельствует о продолжающихся процессах постлучевых изменений в клетке, возможном оксидагишюм стрессе, приводящем к непрерывному процессу повреждения ДНК

у-излучение

у 3000

ускоренные протоны

контроль 1

2 « 1! И 46 72 Время после облучении, ч

6 А 5 « и

Время после облучения, ч

Рис. 12. Интенсивность свечения полосы Вестерн-б.'юта белковых экстрактов сетчатки, соответствующая содержанию р53 в различное время после воздействия ^излучения или ускоренных протонов в дозе 14 Гр на мышей.

ш-

S

è îoto

в г t 4 ^ » и л

BiJfWïtlIflClït 5УЯуЧ4МНМ.Ч

РиЩЗ, Интенсивность свечения полосы Вестерн-блота белковых экстрактов сетчатки,

соответст вую щая содержа и ию ATM в различное время после воздействия ускоренных

протонов в дозе 14 Гр на мышей.

Таким образом, на основании полученных результатов мы можем сделать следующее заключение. Облучение половозрелых мышей у-лучами и ускоренными протонами в дозе 14 Гр приводит к повреждению ДНК, которое поддерживается на слабом уровне в течение длительного времени. Этот процесс сопровождается накоплением белка р53, транскрипционного фактора многих генов, кодирующих белки, участвующие в ап о птозе. Однако апоптоза (массового) в клетках сетчатки не наблюдается Возможно, что В нашем случае белок р53 трансактив нру ет гены репарации ДНК.

t

Выводы

1. При модификации полностыо-»//7а//с-ретиналем компонентов фоторецепторных мембран образуется нескольких флуорофоров с максимумами поглощения в области 355, 335/440 и 335/460 нм и флуоресценции в области 480, 480/555 и 480/555 нм соответственно.

2. Показано, что реальные времена жизни возбужденного состояния конъюгатов полностыо-/«/?янс-ретиналя (48, 208 и 900 пс) больше, чем у свободного полностыо-7;)/>а//с-ретиналя (31 пс).

3. Облучение полным видимым светом (400 - 700 нм) фоторецепторной мембраны, содержащей конъюгаты полностью-ягряис-ретиналя, приводит к накоплению продуктов перекисного окисления липидов.

4. Облучение полным видимым светом (400 - 700 нм) фоторецепторной мембраны, содержащей конъюгаты полностью-7и/>аиоретиналя, приводит к снижению скорости регенерации родопсина. В то же время облучение видимым светом в длинноволновой области 500 - 700 нм не приводит к этому эффекту.

5. Облучение половозрелых мышей у-излучением и ускоренными протонами в дозе 14 Гр не приводит к апоптозу фоторецепторов сетчатки в течение первой недели после воздействия.

6. Облучение половозрелых мышей в дозе 14 Гр способствует образованию одно- и двунитевых разрывов в ДНК их сетчатки, которые практически полностью устраняются в течение 12 часов после облучения. Спустя 24ч и далее в течение 7 суток после облучения среди нормальных клеток с неповрежденной ДНК встречается 10% клеток с поврежденной ДНК.

6. Облучение половозрелых мышей в дозе 14 Гр приводит к увеличению количества белка р53 в первые часы после воздействия. Повышенный уровень белка сохраняется в течение длительного времени после облучения.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Публикации в рецензируемых журналах:

1. М.Ю.Логинова, Е.В.Ростовцева, Т.Б.Фельдман, М.А.Островский Фотоповреждающее действие полностью-мранс-ретиналя и продуктов его превращения на молекулу родопсина в составе фоторецепторной мембраны // Биохимия. - 2008. - Т.73. - Вып.2. - С. 162-172.

2. М.Ю.Логинова, Е.В.Ростовцева, Т.Б.Фельдман, М.А.Островский Нарушение способности А2-родопсина к регенерации, вызванное видимым (синим) светом // Доклады академии наук. - 2008. - Т.419. - №6. - С.838-841.

3. М.Ю.Логинова, В.А.Тронов, Т.А.Белецкая, Т.Б.Фельдман, И.Г.Панова, М.А.Островский Радиорезистентность сетчатки: под действием у-излучения в сетчатке мышей формируются разрывы ДНК, увеличивается уровень белка р53, сопровождаемые репарацией ДНК и отсутствием

апоптоза клеток // Радиационная биология. Радиоэкология: - 2008. - Т.48. - № 6. - С.698-704.

4. М.Ю.Логипова, В.Э. Загидуллин, Т.Б. Фельдман, Е.В. Ростовцева, В.З. Пащенко, А.Б. Рубин, М.А. Островский Спектральные характеристики флуорофоров - продуктов взаимодействия полностью-от^анс-ретиналя с родопсином и липидами в фоторецепторной мембране наружного сегмента палочек сетчатки глаза // Биологические мембраны. - 2009. -Т.26. - № 2. - С.83-93.

Публикации в трудах конференций:

1. МА. Островский, КО. Муранов, А.К. Тимофеева, A.B. Кривандин, Т.Б. Фельдман, М.Ю. Логинова, М.А. Яковлева, Г.Н. Тимошенко Исследование повреждающего действия ядер бора (В11) высоких энергий (32 МэВ/нуклон) на белки хрусталика глаза - кристаллины и зрительный пигмент сетчатки - родопсин // Тезисы докладов Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине». - Москва. - 2004. - С.229.

2. М.Ю. Логинова, Е.В. Ростовцева, Т.Б. Фельдман, М.А. Островский Фототоксичное действие полностью-/и/?анс-ретиналя и продуктов его превращения на молекулу родопсина в фоторецепторной мембране // Тезисы докладов 6-й Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы "Биохимическая физика". - Москва. -2006.

3. М.Ю. Логинова, Е.В.Ростовцева, Т.Б.Фельдман, М.А.Островский Полностью-7и/>£гос-ретиналь и продукты его превращения как фотосенсибилизаторы в механизме повреждающего действия света на молекулу зрительного пигмента родопсина в фоторецепторной мембране зрительной клетки // Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. - Москва. - 2007. - С.551.

4. В.А.Тронов, М.Ю.Логинова, Т.А.Белецкая, А.Д.Козлова, Т.Б.Фельдман, Исследование повреждения ДНК и индукции апоптоза в сетчатке мышей под действием ионизирующей радиации и метилнитрозомочевины // Тезисы докладов Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине». - Москва. -2007.-С. 117.

5. М.Ю.Логинова, Т.А.Белецкая, Радиорезистентность сетчатки глаза: гамма-облучение мышей индуцирует в сетчатке повреждение ДНК, экспрессию р53, сопровождаемые репарацией, но не апоптозом // Тезисы докладов VII Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной дню космонавтики и приуроченной к 45-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН. - Москва. - 2008. - С.47.

6. М.Ю.Логинова, В.Э Загидуллин, Е.В.Ростовцева, Т.Б.Фельдман, В.З.Пащенко, А.Б.Рубин, М.А.Островский Полностью-трднс-ретиналь и продукты его превращения как фотосенсибилизаторы в механизме повреждающего действия света на молекулу зрительного пигмента родопсина в фоторецепторной мембране зрительной клетки // Тезисы

докладов V Российского фотобиологического съезда. - Пущино. - 2008. -С.156.

7. Т.А.БелецкаяL М.ЮЛогинова, В.А.Тронов, Т.Б.Фельдман, И.Г.Панова, М.А.Островский Радиорезистентность сетчатки глаза половозрелых мышей в ответ на гамма-излучение // Тезисы докладов VIII Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы "Биохимическая физика". - Москва. - 2008. - С.21-22..

8. В.А.Тронов, М.ЮЛогинова, Т.А.Белецкая, Т.Б.Фельдман, М.А.Островский Исследование апоптотического ответа, активируемого повреждением ДНК в клетках сетчатки мышей на действие метилирующего агента и ионизирующей радиации // Тезисы докладов Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине». -Москва. - 2008. - С.117.

9. Логинова М.Ю., Тронов В.А., Белецкая Т.А., Фельдман Т.Б., Тимошенко Г.Н., Молоканов А.Г., Островский М.А. Ответ сетчатки мышей на действие гамма-излучения, протонов и метилнитрозомочевины // Тезисы докладов 30-й сессии программно-консультативного комитета по физике конденсированных сред. - Дубна. - 2009.

Подписано в печать 07 сентября 2009 г. Объем 1,2 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 857 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Логинова, Марина Юрьевна

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Действие физических факторов - видимого света и ионизирующей радиации - на сетчатку глаза"

Цель диссертационной работы.11

Основные задачи исследования.12

Научная новизна.12

Научная и практическая ценность работы.13

Основные положения, выносимые на защиту.14

Апробация диссертации и публикации результатов исследования.15

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Логинова, Марина Юрьевна

ВЫВОДЫ.152

БЛАГОДАРНОСТИ .154

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Логинова, Марина Юрьевна, Москва

1. ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

2. TP полностью-трянс-ретиналь

3. РПЭ — ретинальный пигментный эпителий

4. НСП — наружные сегменты палочек

5. ФЭА — фосфатидилэтаноламин

6. ДГК — докозогексановая кислота

7. ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография1. Мета I — Метародопсин I1. Мета II — Метародопсин II

8. Мета III — Метародопсин III

9. РДГ — ретинолдегидрогеназа

10. A2-DHP-PE А2-дигидропиридинное производное фосфатидилэтаноламина А2Е - TV-бис-ретинилиден-этаноламин ATR -димер - димер TP

11. ATR -димер-РЕ конъюгат димера TP с фосфатидилэтаноламином

12. JIT липофусциновые гранулы

13. ФМ — фоторецепторные мембраны1. ИИ ионизирующее излучение

14. ЦНС центральная нервная система

15. ГЭБ — гематоэнцефалический барьер

16. VEGF фактор роста эндотелия сосудов (Vascular Endothelial Growth Factor) OP — однонитевые разрывы (ДНК) ДР - двунитевые разрывы (ДНК)

17. ЛМП локальные множественные повреждения (ДНК) ЛПЭ - линейная передача энергии

18. PBS — фосфатно-солевой буфер (Phosphate Buffer Solution) OTM Момент Хвоста Olive (Olive Tail Moment)1. ВВЕДЕНИЕ1. Актуальность проблемы

19. Основные задачи исследования

20. Исследовать спектральные и фотофизические свойства конъюгатов полностью-/я/?аноретиналя с компонентами фоторецепторных мембран.

21. Выявить и описать ранние морфологические изменения сетчатки после действия у-излучения и ускоренных протонов в высокой дозе (14 Гр).

22. Охарактеризовать поврежденность генома и активность репаративной системы зрелой сетчатки после действия у-излучения и ускоренных протонов в указанной дозе.

23. Оценить изменение уровня экспрессии белка р53, регулирующего ответ ряда клеточных систем и активирующегося в ответ на повреждение генома после действия ионизирующего излучения (ИИ).1. Научная новизна

24. Научная и практическая ценность работы

25. Результаты данной работы имеют большую значимость для понимания механизмов развития радиационно-индуцированного патогенеза сетчатки ирасширяют представления о биологических последствиях воздействия ионизирующего излучения на зрелую сетчатку.

26. Основные положения, выносимые на защиту:

27. Связывание полностью-транс-ретиналя с компонентами фоторецепторной мембраны приводит к образованию нескольких флуорофоров с различными максимумами поглощения при 355, 335/440, 335/460 и флуоресценции при 480, 480/550 и 480/550 нм, соответственно.

28. Реальные времена жизни конъюгатов полностью-транс-ретиналя с компонентами фоторецепторной мембраны выше, чем у полностью-транс-ретиналя, и составляют 48, 208 и 900 пс.

29. Скорость регенерации родопсина, находящего в окружении конъюгатов полностью-транс-ретиналя с компонентами фоторецепторной мембраны, резко падает после обесцвечивания светом в диапазоне 400-700 нм.

30. Облучение светом в диапазоне 400-700 нм фоторецепторных мембран, содержащих конъюгаты полностью-транс-ретиналя, индуцирует перекисное окисление липидов.

31. Облучение приводит к увеличению количества белка р53, повышенный уровень которого сохраняется в течение длительного времени после облучения.

32. Облучение не приводит к резким морфологическим изменениям в сетчатке в течение первой недели после воздействия.

33. Апробация диссертации и публикации результатов исследования

34. Основные материалы диссертации опубликованы в 4 статьях; докладывалисьи обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах

35. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Фотоиндуцированные изменения в фоторецепторных мембранах в присутствии полностью-град/с-ретиналя11. Объект исследования11.1. Строение сетчатки глаза

36. Рис. 1. Слева схематичное строение глаза позвоночного.

37. Справа схематичное строение сетчатки

38. Цитоплазматическое пространство

39. Участии взаимодействия с Сайты фосфорилировония цитоппазматичесними белками.

40. Олигосахаридные цепи Внутридисковое пространство

41. Рис.3. Структура зрительного пигмента родопсина 6, с изменениями. Желтым цветом отмечены аминокислотные остатки лизинов.

42. Рис.4. Спектр поглощения родопсина 3. 1.2 Фотолиз родопсина палочек

43. Процесс от поглощения кванта света до образования Метародопсина I (Мета I) занимает около 50 мкс. Далее, в течение миллисекунд при комнатной температуре Мета I обратимо превращается в метародопсин II (Мета II).н

44. Протежированное Шнффово основание 11-кис-ретиналя

45. Бычий родопсин (А^г498 нм)12.1. Метародопсин II

46. Именно этот интермедиат фотолиза инициирует последующиемолекулярные события в каскаде Рис. 5. Схема фотолиза родопсина, фототранедукции, обладая