Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функции ретиналя - хромофора зрительного пигмента родопсина, в норме и при патологии

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Функции ретиналя - хромофора зрительного пигмента родопсина, в норме и при патологии"

На правах рукописи

005060635

ФЕЛЬДМАН Татьяна Борисовна

ФУНКЦИИ РЕТИНАЛЯ - ХРОМОФОРА ЗРИТЕЛЬНОГО ПИГМЕНТА РОДОПСИНА -В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

3 О МАП 2013

Москва 2013

005060635

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук

Научный консультант: академик РАН

доктор биологических наук, профессор Островский Михаил Аркадьевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Кузьмин Владимир Александрович, заведующий лабораторией Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

доктор биологических наук, профессор Потапенко Александр Яковлевич, заведующий кафедрой физики и математики Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова

доктор физико-математических наук, профессор Шайтан Константин Вольдемарович, профессор Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Защита состоится «19» июня 2013 г. в 12-00 час. на заседании диссертационного совета Д 002.039.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. Н.Н.Семенова Российской академии наук.

Автореферат разослан «/3 » мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 002.039.01

кандидат химических наук

isi&t-'^j Мазалецкая Л. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Родопсин (зрительный пигмент) - типичный представитель большого семейства трансмембранных рецепторов, сопряженных с в-белком (СРСЛ). Отличительная особенность родопсина как вРСИ. состоит в том, что его лигандом является хромофорная группа (остаток ретиналя), расположенная внутри молекулы родопсина и ковалентно связанная с белковой частью (апобелком опсином).

Хромофор как лиганд осуществляет в родопсине две физиологические функции. В темновом состоянии зрительного пигмента остаток 11-1/ис-ретиналя играет роль лиганда-антагониста, который «держит» рецептор в неактивном состоянии и, таким образом, препятствует ложному запуску процесса трансдукции. После поглощения кванта света и изомеризации хромофор превращается в мощный лиганд-агонист, переводящий родопсин в физиологически активированное состояние. Естественно, важнейшей физиологической функцией хромофора в молекуле родопсина является запуск процесса фототрансдукции. Запуск осуществляется фотохимической реакцией изомеризации остатка 11-!/ис-ретиналя в полностыо-/и/?ш/с форму.

Функции хромофора обусловлены его высокоспецифичным взаимодействием с белковым окружением. Нарушение этого взаимодействия может приводить к серьезным патологическим последствиям. Особенности взаимодействия остатка 11-1/г/с-ретиналя как лиганда-антагониста с окружающими его аминокислотными остатками до конца не выяснены и остаются предметом исследования. Открытым остается вопрос о механизме проявления хромофором, «сидящим» в тесной белковой матрице, его уникальных фотохимических свойств, а именно скорости (менее 200 фемтосекунд) и квантового выхода (0.65) реакции фотоизомеризации (свободный 11-г/мс-ретиналь в растворе изомеризуется за время порядка 10 пикосекунд с квантовым выходом менее 0.2).

На последней стадии фотолиза родопсина (у позвоночных) происходит разрыв ковалентной связи опсина с полностью-/яра«с-ретиналем. В норме «отработанный» хромофор высвобождается из белковой части молекулы, восстанавливается до ретинола и быстро удаляется из фоторецепторной мембраны. При некоторых патологиях или при интенсивном действии света механизм удаления полностыо-тра//с-ретиналя из фоторецепторной мембраны нарушается. В такой ситуации ретинапь легко взаимодействует с аминогруппами фосфолипидов (фосфатидилэтаноламина) и белка с образованием т.н. бис-ретиноидов, которые в дальнейшем аккумулируются в липофусциновых гранулах клеток ретинального пигментного эпителия.

Образовавшиеся продукты, как и сам полностью-транс-ретиналь, фотоактивны и, как фотосенсибилизаторы они способны инициировать в клетке фотоокислительные деструктивные процессы. Кроме этого производные полностыо-транс-ретиналя являются флуорофорами. Флуоресцентные свойства этих продуктов стали основой для создания нового неинвазивного метода диагностики дегенеративных заболеваний сетчатки и ретинального пигментного эпителия - метода аутофлуоресценции глазного дна. Одной из нерешенных проблем развития и усовершенствования этого перспективного метода диагностики является отсутствие статистически полной картины о составе флуорофоров липофусциновых гранул, динамике их накопления, фотоокисления и фотодеградации в зависимости от возраста и патологии.

Таким образом, исследование механизмов фотохимической реакции изомеризации остатка ретиналя из 1 \-цис в полностью-/яранс форму; изучение особенностей взаимодействия остатка 11-г/нс-ретиналя с окружающими его аминокислотными остатками в хромофорном центре темнового родопсина; исследование флуоресцентных свойств побочных продуктов фотолиза родопсина (производных полностью-траноретиналя) в зрительной клетке и клетке ретинального пигментного эпителия - актуальные задачи биофизики зрительной рецепции.

Цель и задачи работы. Целью настоящего исследования явилось выяснение молекулярных механизмов, обеспечивающих функции хромофора зрительного пигмента родопсина в норме и при патологии.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать прямую и обратную реакции фотоизомеризации хромофора в родопсине (методы фемтосекундной лазерной спектроскопии и низкотемпературной спектрофотометрии).

2. Изучить особенности пространственной конфигурации остатка 11 -цис-ретиналя и его взаимодействия с ближайшим белковым окружением в хромофорном центре родопсина в его темновом состоянии (метод молекулярного моделирования).

3. Определить спектральные свойства флуорофоров - продуктов превращения полностью-транс-ретиналя (бис-ретиноидов), образовавшихся в результате нарушения зрительного (ретиноидного) цикла в фоторецепторных клетках и клетках ретинального пигментного эпителия. На этой основе предложить пути усовершенствования метода аутофлуоресценции глазного дна - современного неинвазивного метода диагностики старческих и дегенеративных заболеваний сетчатки глаза и ретинального пигментного эпителия.

Научная новизна работы. Методами фемтосекундной лазерной спектроскопии при комнатной температуре и спектрофотометрии при низких

температурах подробно исследована динамика фотопревращения молекулы родопсина. Впервые продемонстрирована сверхбыстрая обратная фотореакция родопсина в фемтосекундном диапазоне времени: его переход из темнового состояния (остаток ретинапя в 11-г/г<с-изомерной форме) в первый фотоиндуцированный промежуточный продукт - фотородопсин (остаток ретинапя в транс-изомерной форме), и затем фотоиндуцированный переход обратно из фотородопсина в родопсин.

Методом молекулярной динамики описано хромофор-белковое взаимодействие в молекуле родопсина в его темновом состоянии, позволяющее представить механизм функционирования 11-г/г/с-ретиналя как лиганда-антагониста. При этом применен новый подход - сравнительный анализ структуры родопсина в его темновом состоянии, апобелка опсина (без остатка 11-г/г/с-ретиналя) и модели мутантной формы родопсина Е181К.

Впервые на модельных системах in vitro и in situ детально описаны флуоресцентные свойства конечных продуктов превращения полностью-транс-ретиналя — неокисленных и фотоокисленных бис-ретиноидов (флуорофоров), образовавшихся в результате нарушения ретиноидного цикла, и проведена оценка возможного вклада этих флуорофоров и/или групп флуорофров в суммарный спектр аутофлуоресценции глазного дна. Подробное описание флуоресцентных свойств бис-ретиноидов (флуорофоров) - продуктов превращения полностью-/и/?а«с-ретиналя — является основой для разработки нового дифференциального подхода в диагностике патологических процессов в сетчатке и ретинапьном пигментном эпителии - компонентного спектрального анализа картины аутофлуоресценции глазного дна.

Научно-практическая значимость работы. Подробное описание взаимодействия остатка 11-г/г/с-ретиналя с ближайшим белковым окружением в родопсине как GPCR дает представление о механизме выполнения хромофором функции лиганда-антагониста, предотвращающего ложный запуск процесса трансдукции.

Результаты исследований фотообратимых реакций родопсина в фемтосекундном диапазоне времени позволяют рассматривать этот светочувствительный белок как прообраз сверхбыстрых молекулярных фотопереключателей для оптической обработки информации (патент РФ на изобретение № 2429773).

Описание флуоресцентных свойств бис-ретиноидов (флуорофоров) и дальнейшее усовершенствование на этой основе современного неинвазивного метода диагностики - аутофлуоресценции глазного дна, открывает перспективы проведения доклинической диагностики патологических процессов в сетчатке и ретинальном пигментном эпителии и прогнозирования

развития этих заболеваний. В рамках проведенных исследований разработан оригинальный способ получения монослоя клеток РПЭ из кадаверных глаз человека (патент РФ на изобретение № 2464783), создана фотохромная композиция для светофильтров защитно-профилактического действия (патент РФ на изобретение № 2466173).

Результаты работы вошли в лекционный курс «Молекулярная физиология зрительного пигмента родопсина», читаемый автором студентам 5-го курса биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и студентам 4-го курса Международного университета природы, общества и человека «Дубна», а также отражены в учебно-методическом пособии «Фотобиология и фотохимия первичных процессов зрения» для студентов биофизиков и студентов медицинских вузов.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, докладывались на международных и всероссийских конференциях, в том числе на 1-ом Советско-японском симпозиуме «Рецепторы: структура и функции» (1989), Third congress of Eur. Soc. for Photobiol., Hungary (1989), XVII и XVIII Менделеевском съездах по общей и прикладной химии, Казань (2003, 2007), III Съезде биофизиков России, Воронеж (2004), Научно-практических конференциях «Федоровские чтения» (2007, 2011, 2012), The International conference: molecular and nanoscale systems for energy conversion, Moscow (2007), Конференциях ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы» (2007, 2008), V Съезде Российского фотобиологического общества, Пущино (2008), l-5th Japan-Russia international workshop MSSMBS "Molecular Simulation Studies in Material and Biological Sciences" Dubna-Moscow (2004, 2006, 2008, 2010, 2012), The International Conference of Defense Mechanisms of the Retina: New Perspectives. Yerevan (2008), 1-й Международной научной школе - Нано 2009, XV Симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, Петрозаводск (2010), Международной конференции IV Сисакяновские чтения «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», Алушта (2010), Научно-практической конференции офтальмологов «Филатовские чтения», Одесса (2011).

Грантовая поддержка работы. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планами ИБХФ РАН и поддержана РФФИ (2003-2012), Программой фундаментальных исследований ОБН РАН «Механизмы физиологических функций: от молекулы до поведения» (2004-2011), Программой фундаментальных исследований Президиума РАН № 27 «Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов» (20092012), Программой фундаментальных исследований Президиума РАН

«Фундаментальные науки - медицине» (2004-2012), Грантами президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации (2004-2012), Государственным контрактом № 02.740.11.0305 в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (2009-2011).

Личный вклад автора. Основные результаты, изложенные в диссертации, получены при определяющем вкладе автора. Это относится к постановке задач, выбору способов их решения, постановке и проведению экспериментов, обработке и интерпретации полученных результатов. Кроме того, большая часть статей, опубликованных по теме работы в соавторстве, написана автором диссертации. Автор являлся научным руководителем 12-ти дипломных работ, защищенных в МФТИ (ГУ) (кафедры химической физики и биохимической физики), МГУ (биологический факультет, кафедра биофизики), МИТХТ (кафедра химии и технологии кино-, фотоматериалов), Международном университете природы, общества и человека «Дубна» (кафедра «Радиационная безопасность человека и окружающей среды»). Автор также являлся консультантом 3-х кандидатских диссертаций, защищенных в ИБХФ РАН и ГУ МНТК «Микрохирургии глаза» им. академика С.Н. Федорова.

Публикации. Основной фактический материал и выводы диссертации опубликованы в 36 статьях, из них 28 статей в журналах, включенных в перечень ВАК, 1 учебно-методическом пособии и 31 тезисе конференций. Практические разработки оформлены 3 патентами.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, включающих обзор литературы, изложение и обсуждение полученных результатов, выводов, списка цитируемой литературы и приложений с описанием методологических подходов к решению поставленных задач и нормативных документов. В диссертации 438 страниц, 130 рисунков и 13 таблиц. Библиография включает 377 источников.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Прямая и обратная фотохимические реакции родопсина в фемтосекундном диапазоне времени. Когерентный характер реакции фотоизомеризации остатка 11-г/кс-ретиналя в молекуле родопсина.

2. Механизмы взаимодействия остатка 11 -г/ис-ретиналя как лиганда-антагониста с белковым окружением в молекуле родопсина, предотвращающие ложный запуск процесса трансдукции.

3. Флуоресцентные свойства конечных продуктов превращения полностью-транс-реттапя - бис-ретиноидов (флуорофоров) - и возможность их использования для усовершенствования неинвазивного метода диагностики в офтальмологии - аутофлуоресценции глазного дна.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. ЗРИТЕЛЬНЫЙ ПИГМЕНТ РОДОПСНН:СТРУКТУРА II ФУНКЦИИ

В главе (обзор литературы) представлены данные о топографии, структуре и функции зрительного пигмента родопсина. Подробно описан хромофорный центр родопсина и взаимодействие остатка 11-г/ис-ретиналя с окружающими его аминокислотными остатками. Даны современные представления о механизме реакции фотоизомеризации остатка 11-г/нс-ретиналя в родопсине и о самом процессе фотолиза, приводящего к инициации фототрансдукции в зрительной клетке. Рассмотрены прямая и обратная фотореакции родопсина в модельных системах и существование альтернативных путей фотопревращения родопсина. Даны современные представления о полностью-тирднс-ретинале — продукте фотолиза родопсина, и его производных, способных инициировать патологические процессы в сетчатке и ретинальном пигментном эпителии.

ГЛАВА 2. ПРЯМАЯ И ОБРАТНАЯ ФОТОРЕАКЦИИ ХРОМОФОРА В РОДОПСИНЕ

Фотоизомеризация хромофорной группы родопсина - остатка 11 -цис-ретиналя - это первая и единственная фотохимическая реакция в зрении, которая запускает процессы трансдукции. Эта реакция совершается в электронно-возбужденном состоянии молекулы примерно за 80 фс, а затем к 200 фс формируется уже в основном состоянии первый промежуточный продукт фотопревращения родопсина — фотородопсин.

Функциональный смысл столь высокой скорости фотоизомеризации хромофора и эффективности реакции (квантовый выход 0.65) состоит в том, чтобы энергия поглощенного кванта света была использована именно для этой реакции, а не рассеялась в виде тепла или высветилась в виде флуоресценции. Далее, фотородопсин переходит в пределах 1-2 пс в следующий промежуточный продукт - батородопсин, в котором запасенная энергия поглощенного кванта света (35 ккал/моль) используется для конформационных перестроек белковой части молекулы на последующих стадиях фотолиза. Эти конформационные перестройки приводят молекулу родопсина в физиологически активированное состояние, при котором становится возможным ее взаимодействие с в-белком (трансдуцином).

Промежуточные продукты фотолиза родопсина фотоактивны. Поглощение ими кванта света может приводить к обратной /лранс-г/мс-изомеризации остатка ретиналя и образованию (фоторегенерации) стабильных при комнатной температуре родопсина или, в меньшей степени, изородопсина (9-г/г/с-ретиналь-опсин). Процесс фоторегенерации наблюдается со всех стадий фотолиза, но с различной степенью эффективности. Существенно, что при обратной реакции

никаких промежуточных продуктов не образуется. Следует отметить, что, если у беспозвоночных фоторегенерация (со стадии метародопсина) является физиологической реакцией, необходимой для восстановления зрительного пигмента, то у позвоночных она не является физиологической. У позвоночных процесс регенерации родопсина представляет собой сложный каскад темновых биохимических реакций. Тем не менее, фоторегенерация (in vitro) является хорошим инструментом для исследования конформационных изменений родопсина на разных стадиях фотолиза. Интерес к изучению фотообратимых реакций родопсина в последнее время возрос в связи с тем, что они могут рассматриваться в качестве прообраза для создания оптических устройств для записи, передачи и хранения информации. Наиболее привлекательными с этой точки зрения являются ранние стадии фотопревращения родопсина, например, стадии образования фото- и батородопсина.

В этой главе представлены результаты исследований превращения молекулы родопсина при его прямой и обратной фотореакциях с использованием методов фемтосекундной лазерной спектроскопии при комнатной температуре и низкотемпературной спектрофотометрии.

2.1. Фемтосекундная лазерная спектроскопия родопсина при комнатной температуре В данном разделе представлены результаты исследований первичных процессов фотопревращения молекулы родопсина в фемто- и пикосекундной шкале времени, полученные совместно с лабораторией био- и нанофотоники ИХФ РАН. При помощи лазерной абсорбционной спектроскопии высокого разрешения с использованием двухимпульсной системы была подробно исследована динамика фотоизомеризации остатка 11-//ис-ретиналя в родопсине. При помощи специально разработанной трехимпульсной фемтосекундной лазерной системы впервые была зарегистрирована со стадии фотородопсина сверхбыстрая фотообратимая реакция родопсина.

2.1.1. Прямая фотореакция родопсина, индуцированная фемтосекундным импульсом длиной волны 500 нм. Была измерена временная эволюция дифференциальных спектров поглощения родопсина после фемтосекундного возбуждения. Исследованы осцилляции разрешенных во времени сигналов поглощения продуктов реакции - фотородопсина (Фото570) и родопсина в основном состоянии (Р498). Методом Фурье-анализа осцилляций определены частоты, амплитуды и фазы реакционных колебательных мод.

Регистрация спектров фотоиндуцированного поглощения родопсина проводилась абсорбционным методом «возбуждение-зондирование». В качестве возбуждающего импульса использовали импульс с несущей длиной волны 500 нм, длительностью 20-30 фс и энергией 70 нДж. Зондирование

осуществляли импульсами суперконтинуума в спектральном диапазоне от 400 до 900 нм. На рисунках 1 и 2 представлены кинетические кривые и дифференциальные спектры фотоиндуцированного поглощения родопсина. На длине волны зондирования 610 нм кинетическая кривая отражает быстрое образование Фото57о примерно за 200 фс после фотовозбуждения и переход этого продукта в батородопсин (Бато5з5) за время около 3-х пс (рис. 1А и рис. 2).

Рис. 1. Кинетические кривые фотоиндуцированного поглощения родопсина, полученные при его возбуждении импульсами 500 нм на длинах волн зондирования 610 (А) и 480 (Б) нм. Предварительно была проведена коррекция кинетических кривых с учетом поглощения контрольного раствора детергента.

-0.2 00 0.2 04 0.« 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Время -задержки. ПС

¡5 2-

Рис. 2. Дифференциальные спектры фотоиндуцированного поглощения родопсина, полученные при его возбуждении импульсами 500 нм в диапазоне зондирования 410-700 нм на временах задержки зондирующего импульса -0.2 (1), 0.2 (2) и 3 (3) пс. Предварительно была проведена коррекция спектров с учетом поглощения контрольного раствора детергента.

Длина волны, нм

На длине волны зондирования 480 нм кинетические кривые отражают процесс выцветания Р498 и частичное восстановление поглощения в этой области за счет перехода части возбужденных молекул в исходное состояние (рис. 1Б и рис. 2). На кинетических кривых в диапазоне времен задержки примерно до 2 пс наблюдаются осцилляции сигнала. Осцилляции наблюдаются как в сигналах поглощения Фото570 и Бато5з5, так и в сигналах поглощения Р498.

Был проведен Фурье-анализ осцилляционной составляющей сигналов фотоиндуцированного поглощения родопсина во временном диапазоне 90-1000

фс на разных длинах волн зондирования. Этот анализ позволил определить частоты и амплитуды колебательных мод, формирующих осцилляции в кинетических кривых фотоиндуцированного поглощения первого продукта реакции Ф0ТО570 и колебательно-возбужденной молекулы Р498 (рис. 3).

Во всей полосе поглощения Фото57о был получен одинаковый набор частот: 62, 115, 160, 200, 244, 275, 324 и 364 см"1 с доминирующими частотами 62 см"1 и в меньшей степени 160 см"1 (рис. ЗА). В полосе поглощения Р498 был получен аналогичный набор частот с немного более низкими значениями: 49, 90, 142, 190, 235, 275 и 315 см"1, среди которых доминируют частоты 142 см"1 и в меньшей степени 49 см'1 (рис. ЗБ). Осцилляции с частотой 62 см'1 наблюдались ранее в быстрых фотоиндуцированных сигналах родопсина (Wang et al., 1994), в то время как другие частоты ранее не наблюдались. Полученные частоты осцилляций также хорошо коррелируют с частотами колебательных мод, полученных для родопсина методом резонансного комбинационного рассеяния света и приписанных делокализованным торсионным колебаниям полиеновой цепи ретиналя (Lin et al., 1998). Высокая скорость и квантовый выход фотоизомеризации остатка 11-г/ис-ретиналя в составе зрительного пигмента, а также наличие осцилляций в сигналах поглощения продуктов реакции Фото570, Бато5з5 и Р498, которые наблюдались в течение нескольких пикосекунд после возбуждения, позволили предположить, что эта реакция протекает в когерентном режиме. В рамках модели 2-х состояний, когда в фотохимической реакции принимают участие две поверхности потенциальной энергии (ППЭ) (рис. 4), можно следующим образом представить происходящие процессы. При действии когерентного возбуждающего фемтосекундного импульса происходит когерентное заселение определенных колебательных

Рис. 3. Спектры мощности Фурье-компонент, полученные при анализе осцилляций кинетических кривых фотоиндуцированного поглощения родопсина во временном диапазоне 90-1000 фс на длинах волн зондирования 580, 590, 600 нм (А) и 460, 470, 480 нм (Б) при

Б возбуждении 500 нм.

состояний электронно-возбужденной молекулы, совокупность которых называется когерентным колебательным волновым пакетом (волновой пакет). Когерентная фотореакция может быть представлена как движение волнового пакета по поверхности потенциальной энергии (ППЭ) Б) возбужденного уровня вдоль координаты реакции. Образование продуктов реакции происходит вследствие перехода волнового пакета с 8, на 80 ППЭ в области конического пересечения. Элементарный фотохимический акт происходит быстрее внутримолекулярного перераспределения колебательной энергии в молекуле, в результате чего волновой пакет, образованный на ППЭ реагентов, сохраняется при переходе на ППЭ продуктов. Таким образом, осцилляции, наблюдаемые в сигналах поглощения продуктов реакции, отражают движение волнового пакета по Бо ППЭ.

Рис. 4. Схема строения поверхностей потенциальной энергии молекулы родопсина, описывающая протекание прямой реакции фотоизомеризации остатка 11-гдгс-ретиналя, а также поясняющая принцип протекания обратной реакции фотоизомеризации остатка транс-ретиналя.

Координата изомеризации

11-цис-ретиналь транс-ретиналь

Особенностью когерентных процессов является их зависимость от фаз колебательного движения ядер: изменение фазы осцилляций с определенными частотами в процессе реакции, может указывать на реакционность соответствующих колебательных мод и на когерентный характер самой реакции. Другими словами, движение волнового пакета вдоль координаты реакции будет отражаться в сдвиге фазы реакционных колебательных мод в двух разных волновых пакетах, прошедших через коническое пересечение в разное время (рис. 4). С этой целью была исследована зависимость фазы осцилляций с основными наблюдаемыми частотами 49, 62, 142 и 160 см' от длины волны зондирующего импульса (рис. 5). Для всех исследованных частот осцилляций наблюдается незначительное изменение фазы в области поглощения Р498 и в области поглощения Фото570, и резкое изменение фазы почти на 180° при переходе от одной области к другой. Этот эффект однозначно указывает на то, что переход в области конического пересечения ППЭ из

возбужденного состояния в продукты (Ф0ТО570 и Бат0535) и в исходное состояние Р498 происходит в режиме когерентных ядерных колебаний, присущих волновому пакету. Выявленные в данной работе частоты осцилляции соответствуют колебательным модам, активным в элементарном акте изомеризации остатка 1 Ы/кс-ретиналя в родопсине и в процессе восстановления исходного состояния Р498.

• -4

rf

а-*»-

^-IDO.

•i 4**,

Частота: ■ 49 см"' О 62 см • 142 см' Л 160 см"

• ^......Лй4Лл/

• é ••

: ■■_

ОаооОуОис

ioiîoS

П-1-1-1-1-1-1--Г-

460 480 500 520 540 560 580 600 620

Длина волны, нм

Рис. 5. Зависимость фаз Фурье-компонент с частотами 49, 62, 142 и 160 см"1 от длины волны зондирования, полученных при возбуждении родопсина импульсами 500 нм.

Результаты настоящей работы экспериментально подтверждают когерентный характер реакции фотоизомеризации остатка 11-г/иоретиналя в составе молекулы родопсина. Полученные результаты также подтверждают высказанную ранее гипотезу (Lin et al., 1998; Kim et al., 2003), согласно которой делокализованные торсионные низкочастотные колебания полиеновой цепи остатка 11 -г/ис-ретиналя играют в этой реакции важную роль.

2.1.2. Фотообратимые реакции родопсина в фемтосекундной шкале времени. Для осуществления обратной фотореакции перехода фотородопсина в родопсин была использована фемтосекундная трехимпульсная лазерная система с двумя возбуждающими импульсами и третьим зондирующим импульсом суперконтинуума. Первый возбуждающий импульс имел несущую длину волны 500 нм, энергию не более 100 нДж и длительность 30 фс. Под действием этого возбуждающего импульса протекала фотореакция: 11 -цис-ретиналь + hv! —> (полностью-ш/юнс-ретиналь)*, и за 200 фемтосекунд образовывался фотородопсин (индекс* означает образование продукта в когерентном колебательно-возбужденном состоянии). Второй возбуждающий импульс имел несущую длину волны 620 нм, энергию не более 700 нДж и длительность 30 фс. Спектральные характеристики и энергия второго возбуждающего импульса были подобраны таким образом, чтобы

инициировать только обратную фотореакцию без возбуждения исходного родопсина. Третий зондирующий импульс суперконтинуума имел спектральную ширину 400-900 нм и полную энергию менее 10 нДж. Для получения достоверного сигнала проводили усреднение по 10000 спектрам фотоиндуцированного поглощения, зарегистрированным после действия одного или двух возбуждающих импульсов. Время задержки между первым и вторым импульсом изменялось от сотен фемтосекунд до нескольких пикосекунд.

Через 100 пс после первого возбуждающего импульса в спектральном диапазоне 400-700 нм регистрируются дифференциальные спектры, отражающие динамику образования Бато5з5 и исчезновения Р498. Фото57о к этому времени полностью переходит в Бато535 (характерное время реакции 1-3 пс), время жизни которого наносекунды (рис. 6). При действии второго фемтосекундного возбуждающего импульса наблюдается уменьшение темнового образования Бато535 из Фото57о и одновременно увеличение поглощения исходного Р498. Это может означать, что под действием второго фемтосекундного импульса протекает обратная фотореакция, в которой Фото570 переходит в исходный родопсин (Ро98), т.е., обратная реакция фотоизомеризации остатка ретиналя: полностью-отранс-ретиналь + Ьу2 —>11-г/мс-ретиналь.

/ ^Оп'.+ИУ.

/

450

500 550 600 Длина волны.нм

650

Рис. 6. Дифференциальные спектры фотоиндуцированного поглощения

родопсина, полученные в экспериментах с одним (черная кривая) и двумя (серая кривая) возбуждающими импульсами (с параллельной поляризацией) при временной задержке зондирующего импульса 100 пс. Отрицательная область дифференциального поглощения

отражает выцветание родопсина, а положительная - поглощение Бат0535. Пунктиром обозначены спектральные области, в которых из-за светорассеяния, связанного с прохождением

возбуждающих импульсов, не удалось получить достоверных данных.

Максимальное уменьшение Бато535 и одновременно возрастание исходного Р498 наблюдалось при временной задержке 200 фс. Первичный акт прямой фотореакции происходит за время, меньшее 200 фс. За это время изменения в ближайшем белковом окружении, вероятно, несущественны, поэтому

возможность осуществления прямой и обратной фотореакций может быть схематически представлена с использованием сечения ППЭ, которое используется для описания прямой фотореакции (рис. 4). Второй возбуждающий импульс (620 нм) действует на продукт реакции Фото570, при этом образуется когерентный колебательный волновой пакет на правой ветви электронного возбужденного состояния Si. Он двигается по поверхности ППЭ и аналогично прямой реакции перескакивает на ППЭ основного электронного состояния S0, в ходе чего образуется 11-г/ис-ретиналь. Естественно, что это качественное объяснение наблюдаемого фотохромизма. Фотохромизм в фемто-пикосекундной временной шкале свидетельствует о том, что исследуемые фотохимические реакции осуществляются с участием двух поверхностей потенциальной энергии.

Таким образом, впервые показан фотопереход первого продукта фото превращения родопсина - Фото57о, обратно в родопсин в фемтосекундной шкале времени в широком спектральном диапазоне (400-700 нм) при комнатной температуре. Полученные результаты показывают, что зрительный пигмент родопсин может рассматриваться как прообраз сверхбыстрого молекулярного фотопереключателя, что, в свою очередь, создает основу для попыток моделирования этого процесса в искусственных системах.

2.2. Низкотемпературная спектрофотометрия родопсина.

Одним из невыясненных вопросов, касающихся процесса фотопревращения молекулы зрительного пигмента, является предположение о множественности спектральных форм промежуточных продуктов фотолиза родопсина на каждой его стадии. Предполагается, что наблюдаемые в работе (Sasaki et al., 1980, 1983) две спектральные формы батородопсина, образующиеся в результате облучения родопсина при температуре -190°С, могут являться результатом различного конформационного состояния белка в хромофорном центре (Yamada et al., 2004).

2.2.1. Особенности спектральных свойств продуктов фотопревращения родопсина на стадии перехода батородопсина в люмиродопсин. Для исследования динамики перехода молекулы из бато- в люми-состояние была использована низкотемпературная установка, при помощи которой были проведены спектральные измерения в температурном диапазоне от-155° до -90°С, позволяющем контролировать стадию перехода

батородопсин-кпюмиродопсин. Охлажденный до -155°С дигитониновый экстракт родопсина в смеси с глицерином облучали 5 мин. светом длиной волны 436 нм. Образованная фотостационарная смесь содержала родопсин и батородопсин. При медленном повышении температуры (с интервалом примерно в один градус) до -90°С батородопсин полностью переходил в люми-

состояние. О динамике этого перехода судили по изменениям дифференциальных спектров при нагревании образца (рис. 7). лэ

Длина волны, нм

Рис. 7. Дифференциальные спектры поглощения продуктов фотопревращения родопсина после облучения при -155°С светом длиной волны 436 нм, в течение 5 мин., записанные в интервале температур от -155° до -110°С. 1 - спектр получен путем вычитания спектра поглощения фотостационарной смеси, содержащей родопсин и батородопсин сразу после облучения из спектра поглощения продуктов фотопревращения родопсина, записанного при -155°С через 5 мин. после облучения образца; 2 - при -145°С через 15 мин. после облучения; 3 - при -145°С через 20 мин. после облучения; 4 - при -130°С; 5 - при -120°С; 6 -при -110°С. D - продукты фотолиза родопсина, где цифра обозначает максимум или минимум поглощения данного продукта на дифференциальном спектре.

При нагревании образца в интервале температур от -155°С до -145°С видно, что с ростом температуры в спектральной области 440 нм наблюдается увеличение поглощения (D440), а в области 520 нм - уменьшение (D520). На дифференциальных спектрах наблюдается изобестическая точка в области 460 нм. Можно предположить, что D440 образуется непосредственно из продукта D520. При дальнейшем повышении температуры примерно от -140°С и выше на дифференциальных спектрах появляется второй максимум в области 475 нм (появление люмиродопсина) и второй минимум около 555 нм (исчезновение батородопсина), при этом изобестическая точка уже отсутствует. Этот факт указывает на то, что переход батородопсин->люмиродопсин представляет собой сложный процесс. Можно предположить, что переходы D520->D440 и D555->D475 происходят практически одновременно, однако первый переход D520->D440 немного опережает второй. При температурах от -110°С и выше дифференциальные спектры уже содержат один максимум в области 475 нм и

один минимум в области 555 нм. Как мы полагаем, эти изменения в спектрах отражают классический переход батородопсина в люмиродопсин.

Таким образом, полученные данные, указывают на существование альтернативных путей фотопревращения родопсина, по крайней мере, на стадии перехода батородопсип >люмиродопсин. Можно предположить, что облучение родопсина синим светом (436 нм) при низких температурах приводит к образованию как минимум двух спектральных форм батородопсина, которые релаксируют в две спектральные формы люмиродопсина.

2.2.2. Изомерный состав ретиналя в продуктах фотопревращения родопсина при низких температурах. Для исследования конформационного состояния хромофора в продуктах фотопревращения родопсина при низких температурах был применен комплексный - спектральный и хроматографический, подход. Соотношение цис- и транс-томеров ретиналя в продуктах прямой и обратной фотореакций родопсина определяли как по изменению интенсивности полосы поглощения на длине волны 500 нм, так и прямым анализом изомерного состава ретиналей методами ВЭЖХ.

Нативный необлученный родопсин содержит остаток ретиналя в 11 -цис-изомерной форме, что подтверждается анализом ВЭЖХ как ретинальоксимов, так и ретиналей (рис. 8, спектр 1; табл. 1А). Из таблицы следует, что результат анализа изомерного состава ретиналей в исходном необлученном родопсине практически не зависит от метода его определения.

400 500 600

Длина волны, нм

Рис. 8. Спектры поглощения родопсина и продуктов его фотопревращения: при комнатной температуре (1), при -196°С (2), после облучения синим светом (436 нм) 10 мин. при -196°С (3) и после нагревания до комнатной температуры (4), фоторегенерированный родопсин при -196°С (облучение 10 мин. синим светом (436 нм) и 6 мин. желтым светом (579 нм)) (5) и при комнатной температуре (6), полностью обесцвеченный родопсин при комнатной температуре (7).

При облучении родопсина синим светом (436 нм) при -196°С образуется фотостационарная смесь, содержащая батородопсин, родопсин и изородопсин (9-1/ис-ретиналь-опсин) (рис. 8, спектр 3). Спектр поглощения, зарегистрированный после нагревания этой фотостационарной смеси до комнатной температуры (рис. 8, спектр 4), указывает на то, что в этой смеси

содержится около 40% стабильных при комнатной температуре родопсина, содержащего остаток 11-г/г/с-ретиналя, и изородопсина - остаток 9-цис-ретиналя. Остальные 60% молекул в результате фотохимической реакции при -196°С перешли в бато-продукт и при нагревании распались на опсин и свободный полность-/иранс-ретиналь. Однако метод ВЭЖХ ретинальоксимов показал, что в смеси изомеров ретиналей, экстрагируемых из экспериментального образца только около 30% являются 11 -цис и 9-цис-изомерами ретиналя в сумме, а метод ВЭЖХ ретиналей - 21%. Соответственно, содержание полностью-/ираис-изомера в смеси, определяемое методом ВЭЖХ ретинальоксимов составляет около 68%, а методом ВЭЖХ ретиналей - около 78% (табл. 1Б).

ТАБЛИЦА 1. Изомерный состав ретиналя при облучении родопсина синим (436 нм) и желтым (579 нм) светом при температуре -196°С.

Метод определения изомеров ретиналя 11-1/ИС % 9-цис % транс % 13-цис %

А. Исходный необлученный родопсин (контроль)

Спектральный ВЭЖХ ретинальоксимов ВЭЖХ ретиналей 100 96 ±0,1 94,5 ± 0,5 ; 3 ± 0,1 4,5 ± 0,5 1 1

Б. Облученный родопсин (436 нм)

Спектральный ВЭЖХ ретинальоксимов ВЭЖХ ретиналей 40 ±1,3 26,2 ± 1 16,7 ± 1,1 4.2 ±0,6 4.3 ± 1,8 59.6 ± 1,6 67,8 ± 1,4 77.7 ±2,3 1,8 ±0,3 1,3 ± 0,4

В. Фоторегенерированный родопсин (436 нм + 579 нм)

Спектральный ВЭЖХ ретинальоксимов ВЭЖХ ретиналей 9В ± 1 94,3 ± 0,4 94,0 ±0,6 4.2 ± 0,6 4.3 ± 1,8 2 ±0,2 3,7 ± 0,4 5,0 ± 1,6 2 1

Если фотостационарную смесь, полученную при облучении родопсина синим светом (436 нм) при -196°С, не нагревая, облучить при той же температуре, желтым светом (579 нм, 10 мин.), максимум полосы поглощения смещается в коротковолновую область примерно до 498 нм (рис. 8, спектр 5). Это означает, что при этом происходит фоторегенерация зрительного пигмента, т.е. переход транс-ретиналя, в основном, в 11-1/г/с-форму. Небольшое отличие максимума поглощения образовавшегося продукта (498 нм) от максимума у нативного родопсина (504 нм при -196°С) указывает на накопление в смеси изородопсина (максимум поглощения 486 нм). При нагревании образца до комнатной температуры спектр поглощения полученного таким образом продукта практически не отличается от спектра поглощения нативного родопсина (рис. 8, спектр 6). Согласно спектру поглощения в смеси находится

около 98% родопсина и изородопсина, что соответствует практически полной фоторегенерации зрительного пигмента. Анализ ВЭЖХ изомерного состава ретиналей и ретинальоксимов также показал практически полный переход /я/?да/с-ретиналя в 11 -цис или 9-г/мс-формы (табл. 1В).

Таким образом, для нативного, необлученного родопсина и для фоторегенерированного родопсина при -196°С результаты анализа конформационного состояния хромофора в зрительном пигменте, не зависимо от метода определения, совпадают: суммарное процентное содержание родопсина и изородопсина (11 -цис и 9-//мс-изомеров ретиналя, соответственно) в анализируемых образцах практически одинаково (табл. 1 А и В). Для фотостационарной смеси, образовавшейся при облучении родопсина синим светом (436 нм) при -196°С, результаты анализа конформационного состояния хромофора в зрительном пигменте, полученные разными методами, не совпадают: суммарное процентное содержание родопсина и изородопсина (11-цис и 9-г/ис-изомеров ретиналя, соответственно) в анализируемом образце заметно отличается в зависимости от используемого метода (табл. 1 Б).

Можно предположить, что при облучении родопсина синим светом (436 нм) при -196°С в фотостационарной смеси помимо батородопсина, родопсина и изородопсина образуется еще один продукт, спектрально идентичный родопсину и стабильный при комнатной температуре. Однако хромофор в этом продукте не находится в 11-цис или 9-г/г/с-изомерной форме, характерной для стабильного пигмента. Вполне вероятно, что хромофор в данном продукте находится в некой «трансоидной» форме, которая не инициирует дальнейшие стадии фотолиза родопсина, и такая молекула остается стабильной и при комнатной температуре. Однако при нарушении хромофорного центра этого продукта в результате экстрагирования хромофора при ВЭЖХ анализе может происходить релаксация «трансоидного» ретиналя в полностью-транс-конфигурацию. Поэтому ВЭЖХ анализ показывает меньшее содержание 11 -цис и 9-г/г<с-изомеров ретиналя в продуктах фотостационарной смеси. Авторы работ (Sasaki et al., 1980, 1983) предполагают, что в двух формах бато-продукта хромофор находится в «трансоидной» форме, которая может релаксировать в цис- или транс-форму в зависимости от его микроокружения в хромофорном центре.

Таким образом, результаты анализа дифференциальных спектров, отражающих динамику перехода батородопсина в люмиродопсин при низких температурах, а также несовпадение результатов анализа разными методами конформационного состояния хромофора в фотостационарной смеси, полученной при облучении родопсина синим светом (436 нм, -196°С), позволяет предположить, что первый, спектрально идентифицируемый продукт

фотолиза - батородопсин, не является гомогенным: существует, по крайней мере, две спектральные формы бато-продукта. Другими словами, результаты экспериментов указывают на возможность существования альтернативных путей фотопревращения родопсина при низких температурах.

ГЛАВА 3. 11 -/ЩС-РЕТИНАЛЬ КАК ЛИГАНД-АНТАГОНИСТ РОДОПСИНА В ЕГО ТЕМНОВОМ СОСТОЯНИИ

Остаток 11-г/мс-ретиналя в темновом родопсине выполняет важную физиологическую функцию - он обеспечивает поддержание молекулы зрительного пигмента в неактивном состоянии, препятствуя ложному запуску процесса трансдукции. Именно это свойство остатка 11-г/ис-ретиналя делает фоторецепторную клетку (палочку) максимально чувствительным фотосенсором, способным давать физиологический ответ на поглощение всего одного кванта света. Поскольку палочка содержит огромное количество плотно упакованных и способных к активации молекул родопсина (примерно 109 молекул на палочку), то высокая эффективность остатка 11-г/ис-ретиналя как лиганда-антагониста исключительно важна для обеспечения ее максимально низкого темнового теплового «шума».

Функция остатка 11-г/ис-ретиналя как лиганда-антагониста определяется специфическим взаимодействием с окружающими его аминокислотными остатками в хромофорном центре родопсина. Для выяснения особенностей этого взаимодействия был проведен сравнительный анализ молекулярной динамики (МД) 3-х модельных систем: молекулы родопсина (с остатком 11-г/г/с-ретиналя), апобелка - свободного опсина (без остатка 11-г/ыс-ретиналя) и модели мутантной формы родопсина Е181К. МД была прослежена во временном интервале, равном 3000 пикосекунд. Получено и проанализировано ЗхЮ6 дискретных конформационных состояний для всех модельных систем. Под начальным состоянием (1=0) понимается структура родопсина из РОВ файла при физиологической температуре Т=300К. Процесс моделирования начинали при этой температуре в момент времени (1=0), когда система в целом достигала минимального значения энергии при этих условиях и приходила в равновесное состояние (примерно в течение 50-70 пикосекунд после «нагревания» молекулы до Т=300К). В процессе моделирования в системе происходили локальные внутримолекулярные перестройки, приводящие систему к минимизации энергии уже во всем объеме. Предполагается, что к моменту окончания процесса моделирования (1=3000 пс) модель молекулы родопсина описывает МД зрительного пигмента в его темновом нативном физиологическом состоянии. Модель молекулы родопсина была создана в компьютерном центре Лаборатории радиационной биологии Объединенного Института ядерных исследований.

3.1. Молекулярная динамика остатка 11-цмс-ретиналя в родопсине

Остаток 11-г/мс-ретиналя в темновом родопсине имеет непланарную и скрученную конфигурацию в большей степени за счет того, что р-иононовое кольцо повернуто примерно на 50-65° относительно плоскости полиеновой цепи хромофора (Salgado et al., 2004). Этим его конформационное состояние отличается от протонированного Шиффова основания ретиналя в растворе (Sugihara et al., 2002). Считается, что именно такая конфигурация хромофора в родопсине и определяет его уникальные фотохимические свойства, однако молекулярные механизмы, «заставляющие» хромофор принять такую «энергетически невыгодную» форму до сих пор остаются неясными.

Результаты моделирования показали, что р-иононовое кольцо остатка 11-г/мс-ретиналя в родопсине находится в 6-8-г/«с-конф игу рации по отношению к полиеновой цепи (рис. 9), что хорошо согласуется с экспериментальными данными.

t=o.

90 60

30

1 l-i/ис-ретиналь

Р-,

Рис. 9. Молекулярная динамика остатка 11 -цис-ретиналя в хромофорном центре родопсина (конформационное состояние хромофора в начальный момент времени (t=0) и через 3000 иикосекунд (t=3 ns)). В центре представлена диаграмма торсионных углов поворотов пяти метальных групп (С16-С20) остатка 11-г/ис-ретиналя.

Из рисунка видно, что примерно через 400 пикосекунд после начала моделирования происходит резкий поворот р-иононового кольца (метальные группы С16, С17 и С18) вокруг С6-С7 одинарной связи примерно на 60° относительно начальной конфигурации. Следует отметить, что хромофорный центр темнового родопсина не является специфическим местом связывания только для 11-г/мс-ретиналя. Он довольно просторный и способен «принять» и другие изомеры ретиналя (например, 9-г/ис-ретиналь), а также его модификации

Aspl90

Г.,п.11.

(Singh et al., 2001). Это может являться свидетельством того, что \\-цис-ретиналь, попадая в хромофорный центр, принимает «энергетически невыгодную» конфигурацию не за счет стерических затруднений, а именно за счет динамического взаимодействия с окружающими его аминокислотными остатками. Вполне возможно, что это и есть молекулярный механизм «адаптации» хромофора в родопсине при его физиологической регенерации, необходимый для того, чтобы зрительный пигмент стал высокоэффективным триггером процесса фототрансдукции.

3.2. Молекулярная динамика аминокислотных остатков в хромофорном центре родопсина

Для того, чтобы понять, каким образом аминокислотные остатки «заставляют» 11-г/кс-ретиналь изменить свою пространственную конфигурацию, была проанализирована МД «ароматического кластера» (Trp265, Phe261 и Туг268), окружающего р-иононовое кольцо хромофора и принадлежащего H-VI а-спирали. Считается, что именно «ароматический кластер» играет важную роль в сохранении скрученной и напряженной конфигурации ll-i/ис-ретиналя в темновом неактивном состоянии родопсина. Предполагается, что между Тгр265 и р-иононовым кольцом существует сильное электростатическое взаимодействие, в результате которого р-иононовое кольцо блокирует движение Тгр265, стабилизируя, таким образом, всю H-VI а-спираль и предотвращая тем самым спонтанную активацию родопсина в темноте (Menon et al., 2001). Фотоизомеризация же ретиналя, наоборот, инициирует изменение пространственной конфигурации H-VI а-спирали. Считается, что эти изменения являются ключевыми в образовании активной формы зрительного пигмента - метародопсинаП, способного взаимодействовать с G-белком (трансду цином).

Результаты анализа МД аминокислотных остатков «ароматического кластера» показали, что Тгр265 и Туг268 в ходе «адаптации» остатка 11 -цис-ретиналя в хромофорном центре становятся ближе к р-иононовому кольцу примерно на 2 А (рис. 10, А). При этом их ароматические кольца и находящееся между ними р-иононовое кольцо становятся почти параллельными друг другу. Такое взаимное расположение ароматических колец может означать возникновение сильного электростатического взаимодействия между этими группами атомов. Можно предположить, что именно эти аминокислотные остатки своими ароматическими кольцами «удерживают» р-иононовое кольцо в скрученном состоянии, не давая ему вернуться в планарную конфигурацию по отнощению к плоскости полиеновой цепи остатка ll-i/мс-ретиналя. Аналогичное расположение Тгр265 и р-иононового кольца подтверждается результатами молекулярного моделирования в работе (Isin et al., 2008).

Интересная динамика наблюдается у РЬе261: его флуктуации коррелируют с торсионными флуктуациями р-иононового кольца. Вполне вероятно, что именно этот аминокислотный остаток инициирует поворот |3-иононового кольца остатка 11-^ис-ретиналя (рис. 10, Б(1)).

А Б

Рис. 10. А - Молекулярная динамика H-VI а-спирали и ее аминокислотных остатков, находящихся рядом с остатком П-уиоретиналя, в начальный (t = 0) и в конечный (t = 3 ns) момент моделирования. Остаток 11-^ис-ретиналя изображен в виде шариков, аминокислотные остатки - в виде объемных структурных формул. Б - Диаграмма изменения межатомных расстояний между углеродным атомом С18 (5-иононового кольца остатка 11-г^с-ретиналя и различными атомами Phe261 (1). Торсионные углы поворотов метальных групп остатка 11-уис-ретиналя (2).

Также была отмечена необычная динамика Leu266 по отношению к хромофору. На рисунке 10 (А) видно резкое изменение его положения по отношению к ретиналю. Через 400 пс после начала моделирования расстояние между Leu266 и Р-иононовым кольцом уменьшается в среднем на 6 А, а наименьшее расстояние между этими группами становится около 3,5 А (рис. 11). Плоскость р-иононового кольца после его поворота располагается в одной плоскости с двумя симметричными метальными группами Leu266, и при дальнейшем моделировании взаимное расположение этих групп атомов остается постоянным. Можно предположить, что между ними устанавливается стерическое взаимодействие. Что является движущей силой этого процесса, пока остается неясным. Можно, однако, обсуждать функциональную роль такой конформационной перестройки. Например, предполагается, что Leu47 в родопсине участвует в ориентации боковой цепи Lys296 вдоль длинной оси молекулы родопсина (Menon et al., 2001). Возможно, Leu266 участвует в переориентации р-иононового кольца и фиксировании его нового положения.

1=0. 1=3.0118

Рис. 11. Молекулярная динамика остатка 11-г^ыс-ретиналя и Ьеи266 в молекуле родопсина в начальный (1^0) и конечный (1=3 ш) момент моделирования. В центре представлена диаграмма межатомных расстояний между различными атомами Ьеи266 и углеродным атомом СЗ (3-иононового кольца.

Сопоставление временных параметров МД Тгр265, Туг268, РЬе261 и Ьеи266 позволило предположить следующий фрагмент механизма «адаптации» остатка 11-г/ис-ретиналя в хромофорном центре: РКе2б 1 «инициирует» торсионные колебания (3-иононового кольца, далее происходит его стерическое взаимодействие с Ьеи266, где последний «фиксирует» новое положение (> иононового кольца, и, наконец, Тгр265 и Туг268, удерживая р-иононовое кольцо в новом положении за счет сильного электростатического взаимодействия, стабилизируют всю структуру остатка 11-^иоретиналя. Другими словами, анализ динамики аминокислотных остатков «ароматического кластера» и Ьеи266 позволяет предположить, с одной стороны, механизм «удерживания» 11-г/ис-ретиналя в «энергетически невыгодном», скрученном состоянии, а с другой стороны, механизм блокирования подвижности VI а-спирали хромофором в роли лиганда-антагониста.

3.3. Молекулярная динамика аминокислотных остатков в области цитоплазматической части молекулы родопсина.

В темновом родопсине активный центр связывания с в-белком, трансдуцином «закрыт». Для выяснения механизмов блокирования этого центра был проведен сравнительный анализ МД родопсина и опсина. Важно подчеркнуть, что сам опсин также способен к взаимодействию с О-белком и его активации. Однако при этом активность без-лигандного опсина составляет всего 10"6 активности опсина, с которым связан лиганд-агонист, остаток полностью-транс-ретиналя (МеИа й а!., 1997). Низкая, но все же существующая активность без-лигандного опсина входит составной частью в молекулярный механизм световой адаптации фоторецепторной клетки.

Сравнительный анализ МД цитоплазматических петель родопсина и опсина показал, что в родопсине «встроенный» хромофор стабилизирует конформационное состояние белка и в периферийной части молекулы. В присутствие остатка 11-г/мс-ретиналя в хромофорном центре происходит сближение участка С-концевого пептида, содержащего 8ег334, с участком С-Ш петли, содержащим А1а241 (рис. 12, А).

ИР»

Рис. 12. Модель молекулы родопсина в фоторецепторной мембране (слева). Молекулярная динамика Ser334 (С-концевой пептид) и А1а241 (С-Ш петля) в цитоплазматических доменах родопсина в присутствии остатка 11 -цис-ретиналя в хромофорном центре опсина (А) и в его отсутствии (Б) (справа). t=0 - расположение Ser334 (С-концевой пептид (C-end)) и А1а241 (С-III петля) в начальный момент моделирования; t=3 ns - расположение Ser 334 и А1а241 в конечный момент моделирования. В центре - диаграммы изменения расстояний между отдельными атомами Ser 334 и А1а241.

На диаграмме видно, что в начальный момент времени моделирования эти аминокислотные остатки находятся на довольно большом расстоянии друг от друга (6-8 Á), и флуктуации этих участков имеют довольно большую амплитуду. Однако уже примерно через 400 пс происходит их резкое сближение: амплитуда колебаний становится заметно меньшей, а расстояние между Ser334 и А1а241 становится настолько малым (около 3Á), что становится возможным образование между ними водородной связи. Известно, что эти аминокислотные остатки находятся в активном центре связывания трансдуцина (Yamashita et al., 2000). Вполне возможно, что сближение Ser334 и А1а241, а также образование водородной связи между ними является составной частью внутримолекулярного механизма инактивации центра связывания трансдуцина в темновом родопсине. МД цитоплазматических петель в безлигандном опсине к 3000 пс практически не отличается от начального этапа моделирования (t=0): между Ser334 и А1а241 не происходит формирования возможной водородной

связи (рис. 12, Б). Другими словами, именно присутствие остатка 11 -цис-ретиналя в белке инициирует такие конформационные перестройки цитоплазматических петель, которые обеспечивают недоступность темнового родопсина для трансдуцина. Более того, процесс сближения этих двух амнокислотных остатков находится в строгой корреляции со временем поворота Р-иононового кольца остатка ll-i/ис-ретиналя (в области 400 пс). Другими словами, темновая «адаптация» хромофора инициирует конформационные перестройки белковой части молекулы не только в ее хромофорном центре, но и приводит к изменению пространственной конфигурации цитоплазматических петель.

Таким образом, модель демонстрирует одно из важнейших функциональных свойств остатка \\-цис-ретиналя как лиганда-антагониста родопсина в его темновом состоянии.

3.4. Молекулярное моделирование родопсина с точечной мутацией Е181К, связанной с патогенезом пигментной дегенерации сетчатки

Для того чтобы понять, к каким последствиям может привести нарушение хромофор-белкового взаимодействия в хромофорном центре родопсина, была проанализирована МД модели мутантной формы родопсина Е181К, где в положении 181 находится Lys вместо Glu. Известно, что такого рода мутации в родопсине являются причиной возникновения пигментной дегенерации сетчатки (ПДС) - наиболее распространенной группы наследственных ретинопатий. Эти мутации могут вызывать гибель фоторецепторных клеток и дегенерацию сетчатки. ПДС, вызванная мутантными формами родопсина, может быть отнесена к «конформационным болезням», поскольку при этом нарушено нативное конформационное состояние опсина. Точечные мутации в белке приводят к его неправильной упаковке (сворачиванию), что, в свою очередь, делает невозможным образование устойчивой ковалентной связи (протонированное Шиффово основание) между остатком 1 l-ifuc-ретиналя и Lys296. Внутримолекулярный механизм, приводящий к нарушению нормального «встраивания» 11-^мс-ретиналя в хромофорный центр мутантного опсина остается неясным.

Анализ МД мутантной формы родопсина Е181К показал, что при такой точечной мутации происходит нарушение электростатических взаимодействий остатка 11-г/ис-ретиналя с окружающими его аминокислотными остатками в области связи протонированного Шиффова основания (рис. 13). Можно предположить, что в результате такого нарушения становится невозможным создание комплекса специфических нековалентных связей, характерных для нативного родопсина. При такой мутации связь протонированного Шиффова основания становится нестабильной, и зрительный пигмент в темноте (без

воздействия света) легко распадается на опсин и свободный ретиналь. Более того, в мутантном родопсине не происходит образования необходимой водородной связи между Ser334 и А1а241 в цитоплазматической части молекулы родопсина. МД мутантного родопсина в этом отношении похожа на динамику опсинабез 11 -ш/с-ретиналя (рис. 12 (Б)).

Рис. 13. Молекулярная динамика Glull3, Serl86, Glul81, Lysl81 и остатка 11-г<ис-ретиналя в области протонированного Шиффова основания ((+)N(PSB)) в нативном родопсине (А) и мутантной форме Е181К (Б). Внизу представлена предполагаемая схема нарушения механизма стабилизации ко-валентной связи остатка 11 -цис-ретиналя с опсином - (+)N(PSB). В мутантном родопсине протон Шиффова основания легко акцептируется Glu 113 при опосредованном участии Serl86, в результате чего эта связь становится нестабильной.

Результаты моделирования показали, что в случае мутантной формы Е181К не происходит нормального «встраивания» 11 -г;ис-ретиналя в хромофорный центр опсина, т.е. нормальной регенерации родопсина. Более того, нарушение хромофор-белкового взаимодействия в хромофорном центре молекулы приводит к нарушению конформационного состояния и в ее цитоплазматических фрагментах. Как мы предполагаем, этот факт и может приводить к поддержанию молекулы родопсина в постоянном, физиологически активном, «световом» состоянии, способном запускать процесс фототрансдукции в отсутствие света, и инициировать процесс апоптоза в фоторецепторной клетке (Chen et al., 2006).

Таким образом, точечные мутации в области хромофорного центра родопсина приводят к нарушению нормального процесса взаимной «подгонки» хромофора и белковой части молекулы. Это, в свою очередь, приводит к «поломке» уникального механизма, обеспечивающего, с одной стороны, функцию 11-г/мс-ретиналя как лиганда-антагониста, а с другой стороны, само встраивание 11-г/мс-ретиналя как хромофорной группы в хромофорный центр опсина.

ГЛАВА 4. ПОБОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ ФОТОЛИЗА РОДОПСИНА -ПРОИЗВОДНЫЕ ПОЛНОСТЫО-77МЯС-РЕТИНАЛЯ - КАК ИСТОЧНИК АУТОФЛУОРЕСЦЕНЩШ ГЛАЗНОГО ДНА ЧЕЛОВЕКА

Метод аутофлуоресценции глазного дна - современный и перспективный неинвазивный метод диагностики старческих изменений и дегенеративных заболеваний сетчатки и ретинального пигментного эпителия (РПЭ) глаза. Он позволяет оценить состояние, сохранность и жизнеспособность комплекса РПЭ/фоторецепторы (Schmitz-Valckenberg et al., 2008). Этот метод основан на собственной аутофлуоресценции побочных продуктов фотолиза родопсина -производных полностью-/и/7днс-ретиналя (далее /иранс-ретиналь), которые образуются в фоторецепторных клетках, а затем аккумулируются в клетках РПЭ. Одним из феноменов аутофлуоресценции глазного дна является гипераутофлуоресценция, механизм и источники возникновения которой остаются неясными. Предполагается, что это могут быть продукты взаимодействия /иранс-ретиналя с аминогруппами молекул фосфолипида (фосфатидилэтаноламина) и белка в фоторецепторных мембранах наружного сегмента зрительной клетки и/или продукты фотоокисления и фотодеградации бис-ретиноидов в клетках РПЭ (Sparrow et al., 2012).

4.1. Модельные системы избыточного накопления полностью-транс-ретиналя и его производных в фоторецепторных клетках сетчатки Фотолиз зрительного пигмента родопсина завершается разрывом ковалентной связи Шиффова основания между опсином и /ирянс-ретиналем и высвобождением последнего из хромофорного центра молекулы. Высвободившийся транс-ретналь восстанавливается с участием ретинолдегидрогеназы до транс-ретинола и в таком виде переносится при помощи ретинол-переносящих белков из наружного сегмента палочки в клетку РПЭ. Транс-рвтаналь может также удаляться из фоторецепторной мембраны при помощи АТФ-зависимого белка-переносчика (ABCR). При некоторых дегенеративных заболеваниях сетчатки, например, при болезни Штаргардта, когда белок-переносчик (ABCR) является дефектным, транс-ретиналь накапливается в фоторецепторной мембране (Rozanowska et al., 2005). Возможна также ситуация избыточного обесцвечивания родопсина, в результате чего в фоторецепторной мембране также происходит накопление транс-ретиналя (Rozanowska et al., 2012). Избыточный транс-ретиналь легко взаимодействует с доступными аминогруппами родопсина и липидов (фосфатидилэтаноламина), образуя с ними неспецифическую ковалентную связь Шиффова основания. Эти соединения, в свою очередь, могут вступать во взаимодействие еще с одной молекулой транс-ретиналя, приводя к образованию бис-ретиноидов (например, N-бис-ретинилиден-

фосфатидилэтаноламина - А2-РЕ или А2-родопсина). Эти побочные продукты являются устойчивыми соединениями и представляют собой источник накопления бис-ретиноидов в фоторецепторной клетке.

Производные траноретиналя являются фототоксичными (Островский и др. 1992; ВоиКоп ег а1., 1993; Веп-8ЬаЬа1 а а1„ 2002; Клт е1 а1., 2006), а их окисленные формы становятся токсичными и в темноте (ИогашмБка е1 а1., 2005). Таким образом, накопление в фоторецепторных мембранах свободного траяс-ретиналя может рассматриваться как фактор риска, объясняющий усугубляющее действие света при развитии различных дегенеративных заболеваний сетчатки и РПЭ (Мае<1а й а1., 2012; Яогапохувка е1 а1., 2012).

В данном разделе представлены результаты спектральных исследований модельных систем, имитирующих ситуацию избыточного накопления в фоторецепторных мембранах как свободного /ирсшоретиналя, так и связанного с аминогруппами белка и окружающих его фосфолипидов.

4.1.1. Спектральные и фотохимические характеристики /ирднс-ретиналя и продуктов его взаимодействия с родопсином и липидами в фоторецепторной мембране наружного сегмента палочки сетчатки глаза. В данном разделе представлены результаты сравнительного анализа спектральных свойств транс-ретиналя и продуктов его модификации в фоторецепторной мембране наружных сегментов палочек сетчатки как флуорофоров, вносящих возможный вклад в картину аутофлуоресценции глазного дна, с использованием модельной системы, описанной в работе ^¡БЬкт et а1., 2003).

Исследование модельной системы избыточного накопления гпранс-ретиналя в мембранах фоторецепторов показало, что в условиях, близких к физиологическим (при 37°С) в течение 3-х суток транс-ретиналь вступает во взаимодействие с родопсином и липидами, приводя к образованию продуктов с выраженными флуоресцентными свойствами (рис. 14).

Были зарегистрированы спектры возбуждения флуоресценции при 460 и 555 нм (рис. 15 (а) и 15 (б), соответственно).

Анализ спектров флуоресценции и возбуждения (табл. 2) позволяют предположить, что образуются три типа соединений: согласно литературным данным это могут быть непротонированные Шиффовы основания, протонированные Шиффовы основания и продукты вторичного взаимодействия транс-ретиналя с Шиффовым основанием (например, А2-РЕ и А2-родопсин).

Для сравнительного исследования фотохимических свойств транс-ретиналя и его конъюгатов с родопсином и липидами были зарегистрированы кинетики затухания флуоресценции в пикосекундном диапазоне времени после их возбуждения импульсом длительностью ~20 пс с длиной волны 353 нм.

Длина волны. *м

Рис. 14. Спектры флуоресценции суспензии наружных сегментов палочек (НСП), содержащей родопсин при возбуждении в 460 нм (а) и 320 нм (б). 1 - Суспензия НСП без добавления экзогенного транс-ретпаля, используемая в качестве контроля до инкубации и 1' - после инкубации; 2 - суспензия НСП в присутствии 10-кратного избытка транс-ретиналя (спектр прописан сразу же после добавления траяс-ретиналя) и 2' - после инкубации с 10-кратным избытком транс-ретиналя в течение 3-х суток в термостате при 37°С в темноте.

Длииа волны, нм

Рис. 15. Спектры возбуждения флуоресценции, зарегистрированные при 460 нм (а) и 555 нм (б). 1 - Темновая суспензия наружных сегментов палочек (НСП); 2 - темновая суспензия НСП в присутствии 10-кратного избытка транс-ретиналя (спектр записан сразу после добавления к суспензии 10-кратного избытка т/адноретиналя); 3 - темновая суспензия НСП, инкубированная в темноте с 10-кратным избытком транс-ретиналя. Узкая полоса, указанная стрелкой, является вкладом от Рамановского рассеяния растворителя.

Таблица 2. Продукты модификации родопсина и липидов, образующиеся при инкубации с экзогенным транс-ретиналем в течение 3-х суток при 37°С.

Спектральные продукты Хшах (поглощение), нм Хщах (испускание), нм

Непротонированные основания Шиффа 355 480

Протонированные основания Шиффа 440 545

А2-производные 335,460 460, 555

Кинетика затухания флуоресценции транс-ретиналя в буфере практически моноэкспоненциальна (ti=31±2 пс) и характеризует время жизни возбужденного состояния. Исследование кинетики затухания флуоресценции суспензии наружных сегментов палочек после инкубации с лгрянс-ретиналем в течение 3-х суток при 37°С показало, что характер кинетической кривой существенно меняется. Наилучшая аппроксимация этой кинетики достигается в

Зх-экспоненциальном приближении кривой вида: = ехр(-</г,), где i -

t

число компонент, А - амплитуды, т - длительность компонент. Найдено, что Ti=48±2 пс (22%), т2=208±5 пс (48%), т3=900±10пс (30%). Наличие трех компонент в кинетике флуоресценции инкубированного образца можно объяснить присутствием как минимум 3-х центров свечения.

Сопоставление с литературными данными позволяет предположить, что первая компонента (48 пс) принадлежит протонированным основаниям Шиффа, вторая компонента (208 пс) принадлежит, по-видимому, А2-производным ретиналя, а третья компонента (900 пс) - непротонированным основаниям Шиффа.

Таким образом, описанная выше модельная система позволяет предположить, что в ситуации избыточного накопления иг/кшс-ретинагтя в фоторецепторной клетке происходит образование трех типов соединений: непротонированные Шиффовы основания, протонированные Шиффовы основания и продукты вторичного взаимодействия трошс-ретиналя с Шиффовым основанием, т.н. бис-ретиноиды (например, А2-РЕ и А2-родопсин).

4.2. Флуорофоры (производные полностью-транс-ретиналя) липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека

«Отработанные» обломки наружных сегментов фоторецепторных клеток, постоянно фагоцитируются клетками ретинального пигментного эпителия (РПЭ). В результате неполной лизосомальной деградации этих обломков образуется «пигмент старости» - липофусциновые гранулы. В них и происходит дальнейшее накопление побочных продуктов зрительного цикла -производных транс-ретиналя (Sparrow et al., 2010). В липофусциновых гранулах из А2-РЕ в процессе ферментативного гидролиза фосфолипидной связи образуется 7/-ретинил-Л/-ретинилиденэтаноламин — А2Е. В последнее время в липофусциновых гранулах идентифицировано еще несколько различных бис-ретиноидов. Бис-ретиноиды не утилизируются в результате метаболизма, а накапливаются в клетках РПЭ в течение всей жизни (Sparrow et al., 2008; Wuetal, 2011).

Исследования последних лет выявили корреляцию между накоплением липофусциновых гранул в РПЭ и дегенеративными заболеваниями сетчатки, в том числе такой ее тяжелой и распространенной формой как возрастная макулярная дегенерация. При действии видимого света липофусциновые гранулы способны образовывать активные формы кислорода. В настоящее время накоплена большая литература об их фототоксичности и патогенетической роли.

Липофусциновые гранулы обладают ярко выраженной флуоресценцией в видимой области спектра. Их флуоресцентные свойства обусловлены, в основном, наличием в них конъюгатов транс-ретнэля различной природы. В состав липофусциновых гранул входит до 10-12 флуорофоров. В настоящее время достаточно хорошо изученным является, практически, только один флуорофор - А2Е.

Под действием света в присутствии кислорода А2Е и тране-ретиналь-димер могут фотоокисляться и фотодеградировать с образованием различных окисленных форм, в том числе альдегидов и кетонов (Wang et al., 2006; Sparrow et al., 2012). Эти продукты способны оказывать токсическое действие на клеточные структуры уже без участия света. Окисленные формы А2Е были обнаружены в липофусциновых гранулах, выделенных как из старческих глаз человека, так и из РПЭ глаз мышей с мутацией в ABCR гене, моделирующем болезнь Штаргарда (Avalle et al., 2004; Radu et al., 2004). Вполне вероятно, что продукты фотоокисления и фотодеградации А2Е могут играть важную роль в развитии дегенеративных процессов в сетчатке и РПЭ (Sparrow et al., 2010). Важно подчеркнуть, что образование и накопление окисленных продуктов отражается и на спектральных характеристиках липофусциновых гранул: при действии света меняются их спектры поглощения и флуоресценции.

Липофусциновые гранулы являются основным источником аутофлуоресценции глазного дна. Для повышения информативности этого неинвазивного метода диагностики важно понимать, как именно при действии света в видимой области спектра, а также в ходе старческих изменений или при патологии меняются флуоресцентные свойства липофусциновых гранул.

4.2.1. Спектральные характеристики флуорофоров липофусциновых гранул. Считается, что А2Е вносит основной вклад в суммарную картину аутофлуоресценции глазного дна (Schmitz-Valckenberg et al., 2008). Вопрос о вкладе других флуорофоров остается открытым. Вполне вероятно, что при старении, при разных формах дегенерации сетчатки и на различных стадиях патологического процесса содержание различных флуорофоров в липофусциновых гранулах или их соотношение может варьировать. Так, например, предполагается, что гипераутофлуоресценция глазного дна при

некоторых патологиях может быть вызвана накоплением окисленных форм как А2Е, так и других конъюгатов транс-ретиналя (Sparrow et al., 2010). Одной из актуальных задач сейчас становится необходимость подробного изучения флуоресцентных свойств всех флуорофоров, входящих в состав липофусциновых гранул, и их вклада в суммарную картину аутофлуоресценции глазного дна (Smith et al., 2005).

В данном разделе представлены результаты компонентного анализа спектральных свойств отдельных флуорофоров (или их групп) и оценка их возможного вклада в суммарный спектр флуоресценции липофусциновых гранул с использованием методов флуорометрии, спектрофотометрии и ВЭЖХ. Для проведения компонентного анализа из липофусциновых гранул, полученных из РПЭ кадаверных глаз человека, были экстрагированы липофильные соединения при помощи хлороформа и затем при помощи ВЭЖХ разделены на отдельные составляющие или их группы. На рисунке 16 представлена хроматограмма хлороформного экстракта из липофусциновых гранул. Видно, что образец содержит довольно большое количество компонентов. Нами были идентифицированы А2Е (пик № 15), iso-A2E (пик № 17), а также окисленные формы А2Е (пики №№ 12 и 13). Природа пиков (1-11) с меньшими временами удерживания не известна. Предполагается, что эти вещества представляют собой продукты фотодеградации или фотоокисления А2Е. Фракции 18 и 19 могут содержать такие конъюгаты «рднс-ретиналя как A2-DHP-PE и A2-DHP-E (Wu et al., 2009), ATR-dimer, ATR-dimer-E (Kim et al., 2007).

Рис. 16. Хроматограмма хлороформного экстракта липофусциновых гранул. Детекция на длине волны 430 нм. Вертикальными линиями ограничены группы пиков, которые собирались в виде отдельных фракций для определения спектральных характеристик флуорофоров в экстракте. Эти фракции обозначены буквами /а-з/ _ _ (вверху хроматограммы).

t t 8 » 1011 ' '*Г1Я«1516 17 »19

It 10 zo

Время, мин.

Для определения спектральных свойств детектируемых веществ были отобраны фракции /а-з/ (рис. 16) и зарегистрированы их спектры поглощения

(рис. 17). Видно, что пики, принадлежащие А2Е (пик № 15) и ¡зо-А2Е (пик № 17) являются доминирующими продуктами по поглощению в видимой области спектра (400-500 нм).

Для определения флуоресцентных свойств детектируемых продуктов был проведен хроматографический анализ на флуоресцентном детекторе, последовательно присоединенном к спектрофотометрическому детектору хроматографа (рис. 18). Были зарегистрированы хроматограммы, при разных длинах волн возбуждения флуоресценции (340, 430, 480) и эмиссии (470, 500, 540, соответственно).

Рис. 17. Спектры поглощения отдельных Рис. 18. Хроматограммы флуоресценции

фракций, полученных при ВЭЖХ анализе хлороформного экстракта липофусциновых

хлороформного экстракта липофусциновых гранул. А (А1) - возбуждение 340 нм,

гранул. Буквы обозначают фракции, а цифры детектирование эмиссии на 470 нм, Б -

номера отдельных пиков на хроматограмме возбуждение 430 нм, детектирование

(см. рис. 16). Спектры получены при отборе эмиссии на 500 нм, В - возбуждение 480 нм,

фракций от однократного ВЭЖХ анализа. детектирование эмиссии на 540 нм.

При сопоставлении хроматограмм по поглощению и флуоресценции (рис. 16 и 18) отчетливо видно, что интенсивность флуоресценции А2Е по

сравнению с другими продуктами не является доминирующей, как это считается в настоящее время (Wu et al., 2010). Наибольшая интенсивность флуоресценции обнаруживается у продуктов с характерными временами удерживания до 3-х минут (рис. 16, пики 1 и 2). Вклад флуоресценции этих продуктов остается доминирующим при различных длинах волн возбуждения и эмиссии (рис. 18). Более того, при возбуждении длиной волны 480 нм (близкой к 488 нм - длине волны возбуждения, используемой в коммерческом сканирующем лазерном офтальмоскопе фирмы Heidelberg, Германия) флуоресценция А2Е практически исчезает на длине волны детектирования 540 нм.

Для более подробного анализа спектральных характеристик отдельных флуорофоров и/или групп флуорофоров в хлороформном экстракте липофусциновых гранул были исследованы флуоресцентные свойства отдельных фракций /а-з/ (рис. 17) при возбуждении их флуоресценции длиной волны 430 нм (рис. 19). Из рисунка видно, что наибольшей интенсивностью флуоресценции обладает фракция /а/. Флуоресценция фракций /в/, /г/, /д/ и окисленных форм А2Е, принадлежащих фракции /е/, практически не детектируется. Фракция /б/ также дает низкую интенсивность флуоресценции. Наиболее длинноволновая флуоресценция из анализируемых фракций принадлежит А2Е и iso-A2E (фракция /ж/) и последней фракции /з/ (максимумы в области 500 нм). Эти фракции вносят, практически, равноценный вклад в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта липофусциновых гранул. Таким образом, если рассматривать спектральную область 500-600 нм, где в офтальмологической клинике на коммерческом офтальмоскопе детектируется суммарная картина аутофлуоресценции глазного дна, то, судя по всему, необходимо учитывать вклад не только флуорофоров А2Е и iso-A2E, но и тех продуктов, которые находятся во фракциях /а/ и /з/.

На рисунке 20 представлена диаграмма распределения интенсивностей флуоресценции различных фракций хлороформного экстракта липофусциновых гранул при возбуждении длиной волны 430 нм и регистрации эмиссии на длинах волн 510, 550, 570 и 570 нм. Из диаграммы следует, что А2Е, действительно, не является доминирующим флуорофором в хлороформном экстракте липофусциновых гранул. Не исключено, что А2Е не является доминирующим флуорофором и в суммарной картине аутофлуоресценции глазного дна. Существенный вклад в эту картину, помимо А2Е, могут вносить также продукты, детектируемые при хроматографическом анализе на начальных временах удерживания (до 3-х минут) и продукты, выходящие после А2Е (после 20 минут).

а-е+з ж

Л 550нм 600 HM

я I

а-е+з ж а-е+з ж

Рис. 20. Диаграммы распределения интенсивностей флуоресценции для суммированных фракций /а-е,з/ и изомеров А2Е (фракция /ж/) на длинах волн 510, 550, 570 и 600 нм, возбужденной на длине волны 430 нм.

Рис. 19. Спектры флуоресценции фракций хлороформного экстракта липофусциновых гранул (длина волны возбуждения 430 нм), обозначения фракций взяты из хроматограммы на рисунке 17. Рисунок на вставке - спектр флуоресценции хлороформного экстракта липофусциновых гранул (длина волны возбуждения 430нм).

4.2.2. Изменение спектров поглощения липофусциновых гранул и синтетического А2Е при облучении их видимым светом. Липофусциновые гранулы в РПЭ в течение жизни подвергаются воздействию света в присутствии кислорода. Была использована модельная система - суспензия липофусциновых гранул в фосфатном буфере, а также раствор синтетического А2Е в метаноле для изучения спектральных свойств продуктов фотоокисления и фотодеградации бис-ретиноидов липофусциновых гранул в клетках РПЭ.

Липофусциновые гранулы и А2Е были подвергнуты интенсивному облучению видимым светом в течение 2-х часов в диапазоне 390-700 нм. Были также исследованы флуоресцентные свойства хлороформных экстрактов липофусциновых гранул до и после их облучения видимым светом. На рисунке 21 приведены спектры флуоресценции суспензии липофусциновых гранул в фосфатном буфере (а-с), хлороформного экстракта липофусциновых гранул (с1-1) и раствора синтетического А2Е в метаноле до и после их облучения.

При облучении всех образцов видимым светом в спектрах флуоресценции наблюдаются заметные изменения: максимумы всех спектров смещаются в коротковолновую область на 25-40 нм. Масс-спектрометрический анализ показал, что одними из продуктов облучения являются окисленные формы А2Е. Следует отметить, что в модельных системах (хлороформный экстракт липофусциновых гранул и синтетический А2Е) продукт с полосой

флуоресценции с максимумом в области 540 нм вносит незначительный вклад в суммарные спектры флуоресценции, в то время как в самих липофусциновых гранулах хорошо виден (рис. 21, Ех340 и Ех430). Скорее всего, эта флуоресценция принадлежит одному или нескольким флуорофорам, которые не экстрагируются из липофусциновых гранул в хлороформ, либо при экстрагировании нарушаются их ковалентные или нековалентные связи с белками и/или липидами.

0 _I_I_I_I_L.

3S0 3» 400 450 500 Х/нм

Ж 440 500 560 620 унм

445 530

/„(отн.ед) 60

615 У«» /

530 615

/л (отн. ед.) 18

У ям /

615 Х/ам

(о™. ед.)

300

/„(отн.сд.) Ш

3S0 350 400 450 500 Я/им

Рис. 21. Спектры флуоресценции (fl) суспензии липофусциновых гранул в фосфатном буфере (а-с), хлороформных экстрактов липофусциновых гранул (d-f) и синтетического флуорофора А2Е в метаноле (g-i) до облучения (1) и после облучения в течение 2-х часов (2). Флуоресценцию возбуждали светом с длинами волн 280 (a, d, g), 340 (b, е, h) и 430 нм (с, f, i).

Был проведен сравнительный анализ ВЭЖХ хлороформных экстрактов липофусциновых гранул и синтетического А2Е до и после их облучения (рис. 22). При облучении А2Е в метаноле на хроматограмме наблюдается появление 2-х новых пиков - окисленных форм А2Е (рис. 22 А, пики Оху-А2Е). Одновременно с образованием этих новых продуктов наблюдается снижение количества самого А2Е. Следует отметить, что помимо этих идентифицированных окисленных форм на хроматограмме видно появление новых продуктов - предположительно, продуктов фотодеградации А2Е,

4 (отн. ед.) 50

440 500 560 620 Унм

которые имеют более короткие времена удерживания по сравнению с А2Е и его оксиформами (рис. 22 А, группы пиков 1 и 2).

Аналогичные результаты были получены и при хроматографическом анализе хлороформных экстрактов липофусциновых гранул до и после облучения суспензии липофусциновых гранул видимым светом (рис. 22 Б). Изменение соотношения отдельных пиков на хроматограмме после облучения липофусциновых гранул представлено в таблице 3. Как и в случае синтетического А2Е, при облучении липофусциновых гранул на хроматограмме также наблюдается появление 2-х новых пиков - окисленных форм А2Е (рис. 22 Б, пики Оху-А2Е).

xU

Ьо-А2ЕРис. 22. Анализ ВЭЖХ синтетического флуорофора А2Е в метаноле (А) и хлороформного экстракта липофусциновых гранул (Б) до облучения (1) и после облучения видимым светом в течение I (2) и 2 (3) часов.

о ю

Время (мин.)

ТАБЛИЦА 3. Относительное содержание различных флуорофоров в хлороформном экстракте липофусциновых гранул до и после облучения видимым светом суспензии липофусциновых гранул в фосфатном буфере.

.№ пика /группы Необлученные Облученные Облученные

пиков на липофусциновые липофусциновые липофусциновые

хроматограмме гранулы гранулы 1 час гранулы 2 часа

(рис. 112, Б) (рис. 112 (Б), 1)% (рис. 112(E), 2),% (рис. 112 (Б), 3), %

1 17,83±2,21 18,87±2,3 1 19,92±1,32

2 18,87±1,76 22,97±2,25 24,98±2,27

3 3,72±0,56 3,76±0,76 3,64±0,52

4 4,65±0,78 3,99±0,35 3,73±0,73

5 (Оху-А2Е) 7,56±0,23 6,98±0,28 6,32±0,54

6 (А2Е) 29,67±1,56 27,91±1,72 26,81±1,65

7 1,93±0,32 1,31±0,12 1,03±0,34

8 (ISO-A2E) 15,77±1,27 14,21±1,31 13,57±1,43

Среднестатистические данные рассчитаны по критерию Стьюдента. Достоверность р<0,05

Помимо окисленных форм на хроматограмме видно увеличение интенсивности полос, аналогичных продуктам фотоокисления и фотодеградации А2Е (рис. 22 Б, группы пиков 1 и 2). Времена удерживания вновь образующихся продуктов фотоокисления и фотодеградации как в облученном А2Е в метаноле, так и в хлороформных экстрактах облученных липофусциновых гранул находятся в хорошем соответствии. Такое соответствие указывает на то, что А2Е как в метаноле, так и в составе липофусциновых гранул окисляется с образованием продуктов с идентичными свойствами, в том числе спектральными.

4.2.3. Спектры флуоресценции и состав флуорофоров липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз в норме и в случае визуализируемой патологии. Одной из нерешенных проблем, касающихся метода диагностики глазных патологий - аутофлуоресценции глазного дна, является вопрос о составе флуорофоров липофусциновых гранул, формирующих картину аутофлуоресценции, и об их вкладе в общую интенсивность флуоресценции. До сих пор остается невыясненным вопрос о том, может ли меняться состав флуорофоров с возрастом или при патологии. При изучении модельных систем (облучение синтетического А2Е и суспензии липофусциновых гранул светом в видимой области спектра) нами была показана корреляция между накоплением продуктов фотоокисления и фотодеградации А2Е и сдвигом максимумов спектров поглощения и флуоресценции в коротковолновую область. Можно предположить, что спектральные характеристики аутофлуоресценции глазного дна при некоторых патологиях могут быть отличными от нормы, а анализ спектров флуоресценции и состава флуорофоров липофусциновых гранул мог бы дать дополнительную информацию для развития метода аутофлуоресцентной диагностики глазного дна. В данном разделе представлены результаты сравнительного анализа спектральных характеристик суспензии клеток РПЭ и состава флуорофоров липофусциновых гранул, выделенных из индивидуальных кадаверных глаз человека в норме и при патологии.

Всего было проанализировано 26 образцов из РПЭ индивидуальных кадаверных глаз. Было проведено детальное описание глазного дна каждого кадаверного глаза специалистом врачом-офтальмологом и сделаны фотографии глазного дна всех образцов. Из этого количества 24 образца были получены из кадаверных глаз без видимых патологических изменений в РПЭ (норма), а 2 образца - из кадаверных глаз с визуализированной патологией - возрастной макулярной дегенерацией (ВМД) (рис. 23).

Были получены суспензии клеток РПЭ отдельно для каждого глаза и зарегистрированы их спектры флуоресценции (рис. 24). Сравнительный анализ

спектров флуоресценции показывает, что для образца с патологией максимум флуоресценции (в области 495 нм) сдвинут по сравнению с максимумом флуоресценции образца в норме (в области 530 нм) в коротковолновую область примерно на 35 нм.

Рис. 23. Фотографии глазного дна кадаверных глаз после удаления нейросенсорного слоя сетчатки. А - норма (донор № 21, 59 лет), Б - патология ВМД (донор № 20, 58 лет). 1 - диск зрительного нерва, 2 - макулярная зона, 3 - фрагменты сетчатки.

Также были получены хлороформные экстракты из образцов суспензии РПЭ и затем проведен ВЭЖХ анализ флуорофоров отдельно для каждого индивидуального образца (рис. 25).

450 500 550 800 650 700 Длина волны, нм

Рис. 24. Спектры флуоресценции суспензии клеток РПЭ из отдельных кадаверных глаз при возбуждении длиной волны 430 нм. А - норма (донор № 21, 59 лет), Б - патология (донор № 20, 58 лет). Нормализованные.

Время, мин.

Рис. 25. ВЭЖХ анализ хлороформного экстракта из РПЭ индивидуальных кадаверных глаз. А — норма (донор № 21, 59 лет), Б -патология (донор № 20, 58 лет). Детекция на длине волны 430 нм.

Сравнительный ВЭЖХ анализ хлороформных экстрактов также показал различие в содержании флуорофоров липофусциновых гранул из РПЭ кадаверного глаза в норме и при патологии. В образце, полученном из кадаверного глаза с визуально наблюдаемыми патологическими изменениями (рис. 23, Б), набор пиков для фракции 1 и 2, как можно видеть, более разнообразный. Наблюдается также увеличение относительного содержания А2Е (пик 6).

Из данных ВЭЖХ анализа определено относительное содержание отдельных флуорофоров и/или групп флуорофоров в хлороформных экстрактах липофусциновых гранул для каждого индивидуального кадаверного глаза (рис. 26).

№1(17 лет)...—>...№26(78 лет)

А_

7 8 (¡эо-А2Е) № пика на хроматограмме, рис. 25

9

Рис. 26. Диаграмма относительного содержания флуорофоров или их групп в хлороформных экстрактах из РПЭ, полученных из индивидуальных кадаверньгх глаз. Ось абсцисс - номера пиков, представленных на хроматограмме рис. 25, ось ординат - относительное содержание флуорофоров или их групп в хлороформном экстракте. Серые столбцы — норма, черные -патология. Столбцы обозначают возраст доноров слева направо: № 1 - 17 лет, № 2 - 20 лет, №3-22 года, № 4 - 24 года, № 5 - 30 лет , № 6 - 34 года, № 7 - 35 лет, № 8 - 35 лет, № 9 -37 лет, № 10 - 37 лет, № 11 - 38 лет, № 12 - 40 лет, № 13 - 40 лет, № 14 - 45 лет, № 15 - 45 лет, № 16-48 лет, № 17-51 год, № 18-51 год, № 19-51 год, № 20 - 5 8 лет (патология), 21 - 59 лет, № 22 - 60 лет, № 23 - 61 год, № 24 - 65 лет, № 25 - 70 лет (патология), № 26 - 78 лет.

Из диаграммы хорошо видно увеличение с возрастом донора относительного содержания А2Е (пик № 6), а также его продуктов фотоокисления и фотодеградации (пики № 1-5). Следует отметить, что возрастное увеличение относительного содержания большинства соединений, детектируемых при ВЭЖХ анализе, носит практически линейный характер.

Этот результат хорошо коррелирует с данными работы (Delori et al., 2001), где показано, что с возрастом пациента, у которого нет зрительной патологии (в норме), происходит линейное возрастание интенсивности аутофлуоресценции глазного дна. Совершенно непонятным является феномен, обнаруженный нами в различных экспериментах: резкое падение относительного содержания в хлороформном экстракте изо-формы А2Е (пик № 8) с увеличением возраста донора.

Анализ двух образцов, полученных из кадаверных глаз с визуально наблюдаемой патологией в РПЭ, показал, что относительное содержание почти всех компонентов хлороформного экстракта отличается от нормы. Особенно заметна эта разница для группы пиков 1 (их относительное содержание почти в 2 раза меньше). Для всех остальных компонентов хлороформного экстракта их относительное содержание повышено, хотя разница не такая большая, как для группы пиков 1.

Таким образом, в экспериментах in vitro, показано увеличение относительного содержания А2Е и продуктов его фотоокисления и фотодеградации в хлороформных экстрактах, полученных из РПЭ индивидуальных кадаверных глаз без видимых патологий с возрастом доноров. При наличии визуально наблюдаемых патологий в РПЭ наблюдается изменение относительного состава флуорофоров хлороформного экстракта из РПЭ, а именно: уменьшение относительного содержания продуктов 1-й группы пиков, увеличение относительного содержания продуктов 2-й группы пиков (1-я и 2-я группы пиков, как мы предполагаем, могут быть продуктами фотоокисления и фотодеградации А2Е) и увеличение содержания А2Е. При этом меняется (смещается в коротковолновую область максимум спектра) и суммарный спектр флуоресценции исследуемого хлороформного экстракта. Можно предположить, что спектральные характеристики аутофлуоресценции глазного дна in vivo могут также быть различными в норме и при патологии. В этой связи оценка вклада неокисленных и окисленных форм флуорофоров может представить существенный интерес для доклинической диагностики дегенеративных заболеваний на ранних стадиях их развития. При этом становится очевидной необходимость проведения спектральных исследований более нативной системы, а именно клеток РПЭ без нарушения целостности их структуры (эксперименты in situ) с использованием метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

4.2.4. Разработка методологического подхода к исследованию in situ флуоресцентных свойств липофусциновых гранул. В данном разделе представлено описание нового экспериментального подхода к исследованию флуоресцентных характеристик липофусциновых гранул в экспериментах in

situ и установлению корреляции между этими характеристиками и составом флуорофоров в липофусциновых гранулах, определенных в экспериментах in vitro. Особенностью этого подхода является проведение всех экспериментальных исследований на одном кадаверном глазе. Сравнительный анализ результатов исследований флуоресцентных характеристик липофусциновых гранул в клетках РПЭ, полученных в экспериментах как in situ, так и in vitro, позволит определить корреляцию между составом флуорофоров и их относительным содержанием в липофусциновых гранулах, с одной стороны, и картиной аутофлуоресценции глазного дна in vivo, с другой стороны. Такого рода сравнительный анализ позволяет исследовать динамику изменения спектральных свойств липофусциновых гранул в зависимости от возраста и патологии и открывает перспективу разработки технологии дифференцированной аутофлуоресцентной диагностики глазного дна при возрастных изменениях и дегенеративных заболеваниях сетчатки.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Методами фемтосекундной лазерной спектроскопии изучены механизмы фотохимической реакции изомеризации остатка 11-^мс-ретиналя в родопсине при комнатной температуре. Показано, что реакция цис-транс-фотоизомеризации ретиналя в родопсине протекает в когерентном режиме: выявлены частоты и амплитуды колебательных мод, участвующих в фотореакции молекулы родопсина (44 и 142 см"1 - для родопсина и 62 и 160 см"1 — для фотородопсина).

2. Впервые продемонстрирована обратная фотореакция зрительного пигмента родопсина в фемтосекундном диапазоне времени. Это позволяет рассматривать молекулу родопсина как прообраз сверхбыстрого молекулярного фотопереключателя.

3. Методом низкотемпературной спектрофотометрии получены спектральные характеристики продуктов фотопревращения родопсина в температурном диапазоне от -196° до -80°С (стадии образования бато- и люмиродопсина) и определен изомерный состав ретиналя в этих продуктах. Показано, что при облучении родопсина синим светом (436 нм) образуется, как минимум, две спектральные формы батородопсина. Эти результаты предполагают существование альтернативных путей фотопревращения родопсина.

4. Методом молекулярного моделирования показано, что процесс «адаптации» остатка 11-i/мс-ретипаля в хромофорном центре темнового родопсина сопровождается конформационными перестройками в ближайшем белковом окружении ретиналя и в цитоплазматическом домене. Предполагается, что эти внутримолекулярные перестройки важны для поддержания молекулы

родопсина в темновом, физиологически неактивном состоянии, в котором остаток 11-1/ис-ретиналя выступает в качестве лиганда-антагониста.

5. На примере модели мутантной формы родопсина Е181К, характерной для патологии (пигментного ретинита), методом молекулярного моделирования описан механизм нарушения хромофор-белкового взаимодействия, при котором в хромофорном центре не формируется устойчивая ковалентная связь 11-1/г/с-ретиналя с остатком Ьув296, а в цитоплазматическом домене не блокируется активный центр связывания с в-белком (трансдуцином).

6. Подробно изучены спектральные характеристики и относительное содержание флуорофоров (производных полностью-/яра//с-ретиналя - бис-ретиноидов) в хлороформном экстракте липофусциновых гранул, выделенных из ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека.

Показано, что в процессе старения относительное содержание продуктов фотоокисления и фотодеградации бис-ретиноидов в липофусциновых гранулах увеличивается. Впервые показано в двух случаях офтальмологически визуализированной патологии, что относительное содержание практически всех флуорофоров в том же возрастном диапазоне отличается от нормы. Предполагается, что в суммарную картину аутофлуоресценции глазного дна, помимо А2Е, существенный вклад вносят продукты его фотоокисления и фотодеградации.

Спектральная оценка вклада неокисленных и окисленных форм флуорофоров может стать основой для компонентного спектрального анализа картины аутофлуоресценции глазного дна - современного неинвазивного метода диагностики старческих и дегенеративных заболеваний сетчатки и ретинального пигментного эпителия глаза человека.

7. Совокупность полученных данных представляет собой новые знания о хромофорной группе молекулы зрительного пигмента родопсина: а) об 11-цис-ретинале как лиганде-антагонисте родопсина в его темновом состоянии; б) о когерентной природе реакции фотоизомеризации остатка ретиналя из 11-цис в транс-форму; в) о динамике накопления с возрастом и при патологии побочных продуктов превращения полностью-/ярднс-ретиналя - бис-ретиноидов. Эти знания вносят важный вклад в понимание молекулярных механизмов зрительной рецепции в норме и при патологии.

ПРИЛОЖЕНИЯ

В данном разделе диссертации описаны методы экспериментальных и теоретических исследований, представлены нормативные документы, позволяющие проводить экспериментальную работу с кадаверными глазами человека, а также копии патентов на изобретение.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Т.Б. Протасова (Фельдман), КБ. Федорович, Г.П. Борисевич, М.А. Островский, А.Б. Рубин. Фото- и электроиндуцированные спектральные изменения родопсина в сухих пленках фоторецепторных мембран. // Биол. мембраны—1987.-Т. 4,-С. 695-701.

2. Т.Б. Протасова (Фельдман), В.Ф. Тарасов, И.Б. Федорович. Изомерный состав ретиналя в облученном при 77К родопсине лягушки. // Сенсорные системы.-1989.-Т. 3.-№ 1.-С. 19-24.

3. Островский М.А., Федорович КБ., Протасова Т.Б. (Фельдман). Необратимые изменения родопсина под действием света. В кн.: «Труды Международной конференции по ретинальсодержащим белкам». Отв. ред. Ю.А.Овчинников.//М„ Наука.-1989.-С. 82-87.

4. Т.В. Protasova (Фельдман), I.B. Fedorovich, М.А. Ostrovsky. Retinal isomers in photo- and electroinduced rhodopsin intermediates. // Light in Biology and Medicine.-1991.-V. 2.-P. 545-555.

5. Фельдман Т.Б., Федорович К.Б., Островский М.А. Особенности фотопревращения родопсина на ранних стадиях фотолиза. // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова.-2003.-Т. 89.-№ 2.-С. 113-122.

6. С.А. Антипин, Т.Б. Фельдман, Ф.Е. Гостев, O.A. Смитиенко, О.М. Саркисов, М.А. Островский. «Фемтосекундная динамика внутримолекулярного переноса энергии в зрительном пигменте родопсине». // ДАН.-2004.-Т. 396,-№ 1.-C.I-4.

7. X. Т. Холмуродов, Т.Б. Фельдман, М.А. Островский. Молекулярная динамика родопсина и свободного опсина: компьютерное моделирование. // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова.-2005.-Т. 91.-№ 12.-С.1377-1397.

8. А.Е. Донцов, Н.Л. Сакина, Б. Билиньска, Л. Кржижановский, Т.Б. Фельдман, М.А. Островский. Сравнение фотосенсибилизирующего действия липофусциновых гранул из пигментного эпителия глаза человека и их флуорофора А2Е. // ДАН.-2005.-Т. 405.-№ 6,- С. 458-460.

9.А.Н. Петрухин, A.A. Астафьев, П.Н. Золотавин, Т.Б.Фельдман, А.Е. Донцов, О.М. Саркисов, М.А. Островский. Гетерогенность структуры и флуоресценция одиночной липофусциновой гранулы из ретинального пигментного эпителия глаза человека: исследование методами атомно-силовой микроскопии и микроскопии ближнего поля. //ДАН.-2005.-Т. 405.-№ 6.-С. 445-449.

10. Kh. Т. Kholmurodov, T.B. Feldman, М.А. Ostrovsky. Visual pigment rhodopsin: molecular dynamics of 11-d.s-retinal chromophore and amino-acid residues in the chromophore center. Computer simulation study. // Mendeleev comm.-2006.-№ 1 — P. 1-8.

11. Яковлева M.А., Сакина Н.Л., Кононихин A.C., Фельдман Т.Б., Николаев E.H., Донцов А. Е., Островский М.А. Обнаружение и исследование продуктов фотоокисления JV-ретинилиден-Л''-ретинилэтаноламин (А2Е) - флуорофора липофусциновых гранул из клеток пигментного эпителия глаза человека. // ДАН.-2006.—Т. 409.-№ З.-С. 411-414.

12. X.Т. Холмуродов, Т.Б. Фельдман, М.А. Островский. Взаимодействие хромофора, 11-г/нс-ретиналя, с аминокислотными остатками зрительного пигмента родопсина в области протонированного шиффова основания: компьютерное молекулярное моделирование. // Известия Академии наук. Серия химическая .-2007.-№ 1.-С. 19-27.

13. Kh. Т. Kholmurodov, T.B. Feldman, М.А. Ostrovskii. Molecular Dynamics Simulation and Experimental Studies of the Visual Pigment Rhodopsin: Multiple Conformational States and Structural Changes. In «Molecular Simulation Studies in Materials and Biological Sciences - International Workshop». // Nova Science Publishers Inc., ISBN:l-59454-607-x.-2007.-P. 85-113.

14.М.Ю. Логинова, E.B. Ростовцева, Т.Б. Фельдман, М.А. Островский Фотоповреждающее действие полностью-/и/?да/с-ретиналя и продуктов его превращения на молекулу родопсина в составе фоторецепторной мембраны. // Биохимия.-2008.-Т. 73.-Вып. 2.-С. 162-172.

15. Смитиенко O.A., Шелаев И.В., Гостев Ф.Е., Фельдман Т.Б., Надточенко В.А., Саркисов О.М., Островский М.А. Когерентные процессы при образовании первичных продуктов фотолиза зрительного пигмента родопсина. // ДАН,-2008.-Т. 421.-Х» 2.-С. 277-281.

16. М.Ю. Логинова, Е.В. Ростовцева, Т.Б. Фельдман, М.А. Островский. Нарушение способности А2-родопсина к регенерации после облучения его видимым (синим) светом. // ДАН.-2008.-Т. 419.-X« 6.-С. 838-841.

17. Т.Б. Фельдман, Х.Т. Холмуродов, М.А. Островский. Молекулярная физиология зрительного пигмента родопсина: компьютерное моделирование. // Письма в ЭЧАЯ (элементарные частицы атомного ядра).-2008.-X» 2.-С. 226248.

18. A.B. Соколов, B.C. Соколов, Т.Б. Фельдман, М.А. Островский. Взаимодействие полностью-траис-ретиналя с бислойными липидными мембранами. // Биологические мембраны—2008.-Т. 25.-Х»6.-С. 499-507.

19. Т.Б. Фельдман, Х.Т. Холмуродов, С.А. Борзенок, Х.П. Тахчиди, М.А. Островский. Молекулярное моделирование зрительного пигмента родопсина с точечной мутацией El81 К, связанной с патогенезом пигментной дегенерации сетчатки. // Офтальмохирургия.-2008.-№ 4.-С. 39-43.

20. T.B. Feldman, К.Т. Kholmurodov, М.А. Ostrovsky. Role of GIul81 in the mechanism of protonated Schiff base linkage stabilization in dark-adapted visual pigment rhodopsin: molecular dynamics simulation. In "Molecular and Nanoscale Systems for Energy Conversion" // Nova Science Publishers, Inc. (N.Y.). ISBN: 978-1-60456-682-6.-2008.-P. 157-170.

21. М.Ю. Логинова, В.Э. Загидуллин, Т.Б. Фельдман, E.B. Ростовцева, В.З. Пащенко, А.Б. Рубин, М.А. Островский. Спектральные характеристики флуорофоров — продуктов взаимодействия полностью-тирсшс-ретиналя с родопсином и липидами в фоторецепторной мембране наружного сегмента палочек сетчатки глаза. // Биологические мембраны.-2009.-Т. 26.-Х» 2.-С. 8393.

22. Т.Б. Фельдман, Х.Т. Холмуродов, М.А. Островский, М.Г. Хренова, A.B. Немухин. Изучение конформационного состояния хромофорной группы, 11-i/г/с-ретиналя, в родопсине методами компьютерного молекулярного моделирования. // Биофизика.-2009.-Т. 54.-№ 4.-С. 660-667.

23. Т.В. Feldman, К.Т. Kholmurodov, М.А. Ostrovsky. Molecular simulation of retinitis pigmentosa: rhodopsin mutation. In «Molecular Simulation in Material and Biological Research». // Nova Science Publishers, Inc. (N.Y.). ISBN: 978-1-60741-553-4.-2009.-P. 57-71.

24.Яковлева M.A., Фельдман Т.Б., Полонская 3.M., Донцов А.Е., Борзенок С.А.,Тахчиди Х.П., Островский М.А. Вызванные видимым светом изменения спектров флуоресценции флуорофоров липофусциновых гранул, полученных из ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека. // Офтальмохирургия.-2009.-№ 5.-С. 59-64.

25. Т.Б. Фельдман, М.А. Яковлева, Донцов А.Е., Островский М.А. Спектры флуоресценции и возбуждения флуорофоров липофусциновых гранул, полученных из ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека. // Известия Академии наук. Серия химическая.-2010.-№ 1.-С. 269-276.

26. Смитиенко O.A., Мозговая М.Н., Шелаев И.В., Гостев Ф.Е., Фельдман Т.Б., Надточенко В.А., Саркисов О.М., Островский М.А. Фемтосекундная динамика образования первичных продуктов фотопревращения зрительного пигмента родопсина. // Биохимия-2010—Т. 75 - Вып. 1.-С. 34-45.

27. М.Н. Мозговая, O.A. Смитиенко, И.В. Шелаев, Ф.Е. Гостев, Т.Б. Фельдман, В.А. Надточенко, О.М. Саркисов, М.А. Островский. Фотохромизм зрительного пигмента родопсина в фемтосекундной шкале времени: когерентное управление фотоизомеризацией хромофора ретинапя. // ДАН.-2010.-Т. 435.-№ 2.—С. 1-5.

28. М.А. Яковлева, Т.Б. Фельдман, A.C. Крупенникова, С.А. Борзенок, М.А. Островский. Флуорофоры липофусциновых гранул, ответственные за аутофлуоресценцию глазного дна человека. // Известия Академии наук. Серия химическая.-2010.-№ 12.-С. 2252-2260.

29. Патент РФ на изобретение № 2420773 (10.06.2011): Островский М.А., Мозговая М.Н., Фельдман Т.Б., Смитиенко O.A., Шелаев И.В., Гостев Ф.Е., Надточенко В.А., Саркисов О.М, Кирпичников, М.П., Некрасова О.В. «Способ фотопереключения ретинальсодержащего белка и оптический логический элемент на его основе».

30. Т.В. Feldman, К. Т. Kholmurodov, М.А. Ostrovsky. Chromophore rearrangement in binding pocket of rhodopsin makes sense for its physiological dark-adapted state: computer molecular simulation study. In «Molecular Dynamics of Nanobiostructures». // Nova Science Publishers, Inc. (N.Y.). ISBN: 978-1-61324-320-6.-2011.-P. 25-42.

31. М.А. Островский, Т.Б. Фельдман. Фотобиология и фотохимия первичных процессов зрения. // Учебно-методическое пособие. Дубна: Междунар. ун-т природы, о-ва и человека «Дубна».-2011.-58, [2] с.: ил.

32. Островский М.А., Фельдман Т.Б., Яковлева М.А., Ловягина Е.Р., Чуркина Л.А., Кирпичников М.П., Долгих Д.А., Некрасова О.В., Коршун В.А., Тахчиди Х.П., Борзенок С.А., Шурыгина М.Ф., Гинтер Е.К., Хлебникова О.В., Поляков A.B. Зрительный цикл, белок ABCR4 и моногенное заболевание сетчатки глаза - болезнь Штаргардта (методы генной диагностики). В кн. «Постгеномные исследования и технологии» под ред. С.Д. Варфоломеева. // Изд. МГУ-2011-С. 376-422.

33. Т. Feldman, М. Ostrovsky, Kh. Kholmurodov, К. Yasuoka. Model of Abnormal Chromophore-Protein Interaction for E181K Rhodopsin Mutation: Computer Molecular Dynamics Study. // The Open Biochemistry Journal.-2012.-V. 6.-P. 94102.

34. Арбуханова U.M., Борзенок C.A., Яковлева M.A., Фельдман Т.Б., Островский М.А. Разработка метода получения монослоя клеток ретинального пигментного эпителия из кадаверного глаза человека для исследования in situ флуоресцентных свойств липофусциновых гранул. // Сенсорные системы-2012.-Т. 26.-№ 2.-С.117-123.

35. Шемякин П.В., Коварский А.Л., Каспаров В.В., Фельдман Г.Б., Островский М.А. Исследование фотоиндуцированной конформационной подвижности спин-меченного регенерированного родопсина методом ЭПР спектроскопии. // Химическая физика.-2012.-Т. 31.-№ 11.-С. 8-13.

36. Надточенко В.А., Смитиенко O.A., Фельдман Т.Б., Мозговая М.Н., Шелаев И.В., Гостев Ф.Е., Саркисов О.М., Островский М.А. Участие конического пересечения в фемтосекундной динамике цис-транс фотоизомеризации хромофора зрительного пигмента родопсина. // ДАН.-2012.-Т. 446.-№ 4.-С. 460-465.

37. МЛ. Островский, Т.Б. Фельдман. Химия и молекулярная физиология зрения: светочувствительный белок родопсин. // Успехи химии.-2012.-Т. 81.-№ 11.-С. 1071-1090.

38. Арбуханова П.М., Яковлева М.А., Фельдман Т.Б., Борзенок С.А., Островский М.А. Спектры флуоресценции и состав флуорофоров липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз в норме и в случае визуализируемой абиотрофии. // Офтальмохирургия.—2012.— №3.-С. 54-58.

39. Патент РФ на изобретение № 2466173 (10.11.2012) Островский М.А., Минкин В.И., Лукьянов Б.С., Муханов Е.Л., Фельдман Т.Б. «Светочувствительная композиция для светофильтров защитно-профилактического назначения».

40. Патент РФ на изобретение № 2464783 (27.10.2012): Тахчиди Х.П., Борзенок С.А., Островский М.А., Арбуханова П.М„ Фельдман Т.Е., Муранов КО., Комах Ю.А. «Способ выделения и фиксации клеток ретинального пигментного эпителия трупных глаз человека».

Формат 60x90/16. Заказ 1670. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 2,5. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Фельдман, Татьяна Борисовна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук_

На правах рукописи

05201351 000 Фельдман

Татьяна Борисовна

ФУНКЦИИ РЕТИНАЛЯ - ХРОМОФОРА ЗРИТЕЛЬНОГО ПИГМЕНТА РОДОПСИНА -В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

академик РАН, д.б.н., профессор М.А. Островский

Москва 2013

РЕФЕРАТ

Диссертация содержит: 438 стр., 130 рисунков, 13 таблиц.

Ключевые слова: зрение, фоторецепция, родопсин, 11-г/мс-ретиналь, фотоизомеризация, полностью-трянс-ретиналь, фотолиз, G-белок-связывающий рецептор, лиганд-антагонист, зрительный цикл, сетчатка, ретинальный пигментный эпителий, производные полностью-ретинапя, липофусциновые гранулы, флуорофоры, метод аутофлуоресценции глазного дна.

Сокращения:

A2-DHP-PE - бис-ретинилиден-дигидропиридин-фосфатидилэтаноламин A2-DHP-E - бис-ретинилиден-дигидропиридин-этаноламин А2Е - бис-ретинилиден этаноламин (N-bis-retinylidene-ethanolamine) А2РЕ - бис-ретинилиден фосфатидилэтаноламин (N-bis-retinylidene-

phosphatidylethanolamine) ABCR - АТФ-зависимый белок-переносчик полностью-транс-ретиналя

(ATP-binding cassette transporter) ATR-dimer - полностью-транс-ретиналь димер

ATR-dimer-E - полностью-т/?а«с-ретиналь димер этаноламин коньюгат

(ATR-dimer-ethanolamine conjugate) ATR-dimer-PE - полностью-транс-ретиналь димер

фосфатидилэтаноламин коньюгат (ATR-dimer-phosphatidylethanolamine conjugate) BSI - синий интермедиат фотолиза (blue-shifted intermediate) CRALBP - клеточный ретиналь-связывающий белок (Cellular Retinal-Binding Protein)

CRBP - клеточный ретинол-связывающий белок (Cellular Retinol-Binding Protein)

DOPC - диолеоилфосфатидилхолин

DPhPC - дифитаноилфосфатидилхолин

IRBP - межфоторецепторный ретиноид-связывающий белок

(interphotoreceptor retinoid-binding protein) GPCR - рецепторы, сопряженные с G-белками (G-Protein Coupled Receptors) Iso-A2E - изоформа бис-ретинилиден этаноламина

LRAT - лецитин-ретинол-ацилтрансфераза (Lecithin Retinol Acyl Transferase) N - нонактин

NRPE - /V-ретинилиден-фосфатидилэтаноламин Oxy-A2E - окисленная форма А2Е Р498 - родопсин

PFC - начальное ФК-состояние родопсина

P*5io _ электронно-возбужденное состояние родопсина

PCP - пентахлорфенол

РЕ - фосфатидилэтаноламин

PSB - протонированное Шиффово основание

Ral - ретиналь,

Rh - родопсин

Rol - ретинол

RPE65 - связывает эфиры полностью-т/?анс-ретинола, осуществляет их изомеризацию и гидролиз до 11 -г^мс-ретинола (retinal pigment epithelium 65-kDa protein) АФ - аутофлуоресценция глазного дна Бато535 - батородопсин БЛМ - бислойная липидная мембрана ВМД - возрастная макулярная дистрофия сетчатки ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография KB 1 - метод конфигурационного взаимодействия с учетом однократных

возбуждений КВП - метод компенсации внутримембранного поля

КМ/ММ - метод квантовой и молекулярной механики

JIT - липофусциновые гранулы

MI, МП, MIII - метародопсины I, II и Ш

НСП - наружные сегменты палочек

ПДС - пигментная дегенерация сетчатки

ППЭ - поверхность потенциальной энергии

ПТР - полностью-транс-ретиналь

РДГ - ретинолдегидрогеназа

РПЭ - ретинальный пигментный эпителий

ТБК - тиобарбитуровая кислота

УФ - ультра-фиолетовый свет

ФК - возбужденное состояние Франка-Кондона

Фото57о - фотородопсин

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

В диссертации представлены результаты экспериментальных данных и теоретических расчетов, касающихся функциональных свойств хромофора зрительного пигмента родопсина - 11-г/мс-ретиналя. Рассматриваются механизмы первой и единственной реакции в зрении - фотоизомеризации 11-г/ис-ретиналя в транс-форму; роль 11 -г/мс-ретиналя как лиганда-антагониста родопсина - G-белок-связывающего рецептора; флуоресцентные свойства производных полностью-/яра«с-ретиналя - побочных продуктов фотолиза родопсина, и их возможный вклад в суммарную картину аутофлуоресценции глазного дна - современного неинвазивного метода диагностики зрительных патологий.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................11

ГЛАВА 1. ЗРИТЕЛЬНЫЙ ПИГМЕНТ РОДОПСИН: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ..................................................................................15

1.1. Глаз, сетчатка, фоторецепторная клетка, наружный сегмент, фоторецепторная мембрана, зрительные пигменты..........................15

1.2. Структура родопсина: рентгеноструктурный анализ и молекулярное моделирование.......................................................................23

1.3. Фотолиз родопсина..................................................................32

1.3.1. Первичные фотохимические процессы в родопсине........................33

1.3.2. Стадии фотолиза родопсина...................................................41

1.3.3. Существование альтернативных путей фотолиза родопсина..........52

1.3.4. Обратные фотореакции родопсина...........................................54

1.4. Продукты фотолиза родопсина - полностью-транс-ретиналь и его производные как фотосенсибилизаторы деструктивных процессов в клетках ретинального пигментного эпителия и фоторецепторов..........60

1.5. Производные полностью-транс-ретиналя как источник

аутофлуоресценции глазного дна......................................................67

ГЛАВА 2. ПРЯМАЯ И ОБРАТНАЯ ФОТОРЕАКЦИИ ХРОМОФОРА В

РОДОПСИНЕ...............................................................................71

2.1. Фемтосекундная лазерная спектроскопия родопсина при комнатной

температуре...........................................................................72

2.1.1. Первичные реакции родопсина, индуцированные импульсами 500, 535 и 560 нм при возбуждении молекулы в а-полосе поглощения................75

2.1.2. Первичные реакции родопсина, индуцированные импульсами 405 нм при возбуждении молекулы в ¡3-полосе поглощения..............................91

2.1.3. Анизотропия сигналов поглощения первичных фотопродуктов родопсина............................................................................99

2.1.4. Первичные реакции родопсина, индуцированные УФ импульсами 308 нм при возбуждении молекулы в у-полосе поглощения.......................108

2.1.5. Сравнение фотоиндуцированных реакций родопсина при возбуждении импульсами 500, 405 и 308 нм..................................................115

2.1.6. Фотообратимые реакции родопсина в фемтосекундной шкале времени..............................................................................117

2.2. Низкотемпературная спектроскопия родопсина.............................127

2.2.1. Особенности спектральных свойств продуктов превращения родопсина в ходе его фотолиза на стадии перехода батородопсина в люмиродопсин.....................................................................128

2.2.2. Изомерный состав ретиналя в продуктах фотопревращения родопсина при низких температурах.........................................139

2.2.2.1. Изомерный состав ретиналя в продуктах облучения родопсина при -196° С (стадия образования батородопсина)...........................140

2.2.2.2. Изомерный состав ретиналя в продуктах облучения родопсина при -40° С (стадия образования люмиродопсина).............................148

2.2.2.3. Изомерный состав ретиналей в изохромных формах родопсина при -25° С (стадия образования метародопсина I)...........................151

2.3. Заключение..........................................................................156

ГЛАВА 3. 11 -Z|/fС-РЕТИН А ЛЬ КАК ЛИГАНД-АНТАГОНИСТ

РОДОПСИНА В ЕГО ТЕМНОВОМ СОСТОЯНИИ..............................160

3.1. Сравнительное исследование молекулярной динамики родопсина и его

белковой части - опсина..........................................................162

3.1.1. Молекулярная динамика а-спиральных участков родопсина, расположенных внутри фоторецепторной мембраны..................163

3.1.2. Молекулярная динамика цитоплазматических участков родопсина. .167

3.1.3. Молекулярная динамика внутридисковых участков родопсина........172

3.2. Молекулярная динамика 11-г/мс-ретиналя в хромофорном центре родопсина............................................................................174

3.2.1. Пространственная конфигурация 11-цис-ретиналя.....................174

3.2.2. Оценки сдвига полосы поглощения 80-81 хромофора при повороте /3-иононового кольца относительно плоскости полиеновой цепи 11-цис-ретиналя.............................................................................179

3.3. Молекулярная динамика аминокислотных остатков в хромофорном центре родопсина..................................................................182

3.3.1. Молекулярная динамика 11-цис-ретиналя и окружающих его аминокислотных остатков в области /З-иононового кольца...........183

3.3.1.1. Молекулярная динамика Тгр265, Туг268, Ьеи266 и 11 -цис-ретиналя183

3.3.1.2. Молекулярная динамика С1и122, Шя211 и 11-цис-ретиналя........189

3.3.2. Молекулярная динамика 11 -цис-ретиналя и окружающих его аминокислотных остатков в области протонированной связи Шиффова основания............................................................193

3.3.2.1. Молекулярная динамика 01и113............................................193

3.3.2.2. Молекулярная динамика аи181 и 8ег186................................201

3.3.2.3. Молекулярная динамика Абп1 11, Рке115 иРИеПб.....................205

3.3.3. Молекулярная динамика аминокислотных остатков в области цитоплазматической части молекулы родопсина........................211

3.3.4. Молекулярное моделирование зрительного пигмента родопсина с

точечной мутацией Е181К, связанной с патогенезом пигментной дегенерации сетчатки..........................................................213

3.4. Модель фотопревращения хромофора родопсина и путей его реагирования после поглощения кванта света..............................219

3.5. Исследование фотоиндуцированной конформационной подвижности спин-меченного регенерированного родопсина методом ЭПР спектроскопии.......................................................................225

3.6. Заключение..........................................................................233

ГЛАВА 4. ПОБОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ ФОТОЛИЗА РОДОПСИНА -ПРОИЗВОДНЫЕ ПОЛНОСТЬЮ- ГРЛЯС-РЕТИНАЛЯ КАК ИСТОЧНИК АУТОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ГЛАЗНОГО ДНА ЧЕЛОВЕКА....................239

4.1. Модельные системы избыточного накопления полностью-транс-ретиналя и его производных в фоторецепторных клетках сетчатки............239

4.1.1. Спектральные и фотохимические характеристики полностью-транс-ретиналя и продуктов его взаимодействия с родопсином и липидами в фоторецепторной мембране наружного сегмента палочки сетчатки глаза...................................................................................241

4.1.1.1. Спектры поглощения и флуоресценции, модифицированных полностъю-транс-ретиналем родопсина и липидов в фоторецепторной мембране наружного сегмента палочки....................................241

4.1.1.2. Спектры поглощения и флуоресценции свободного полностью-транс-ретиналя и продуктов его окисления в отсутствие суспензии наружных сегментов палочек.................................................251

4.1.1.3. Определение природы модифицированных продуктов.................253

4.1.1.4. Исследование кинетики затухания флуоресценции свободного полностью-транс-ретиналя и модифицированных полностъю-транс-ретиналем родопсина и липидов в фоторецепторной мембране наружных сегментов палочек в пикосекундном диапазоне времен...251

4.1.2. Фотоповреждающее действие полностью-транс-ретиналя и его конъюгатов на фоторецепторные и искусственные мембраны.......262

4.1.2.1. Фотоиндуцированное перекисное окисление липидов фоторецепторной мембраны в присутствии свободного полностью-транс-ретиналя или его конъюгатов.........................................262

4.1.2.2. Взаимодействие полностью-транс-ретиналя с искусственными бислойными липидными мембранами........................................264

4.2. Флуорофоры (производные полностью-транс-ретиналя) липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека..............................................................269

8

4.2.1. Спектральные характеристики флуорофоров липофусциновых гранул..................................................................................271

4.2.1.1. Спектры возбуждения суспензии липофусциновых гранул............272

4.2.1.2. Флуоресцентные свойства отдельных липофусциновых гранул.....274

4.2.1.3. Спектры поглощения суспензии и хлороформного экстракта липофусциновых гранул...........................................................278

4.2.1.4. Хроматографический анализ хлороформного экстракта из липофусциновых гранул (по поглощению). Спектры поглощения отдельных флуорофоров или их групп........................................279

4.2.1.5. Хроматографический анализ хлороформного экстракта из липофусциновых гранул (по флуоресценции). Спектры флуоресценции отдельных флуорофоров или их групп........................................282

4.2.2. Изменение спектров поглощения липофусциновых гранул и синтетического А2Е при облучении их видимым светом...............292

4.2.2.1.Изменение спектров поглощения липофусциновых гранул и синтетического А2Е при облучении их видимым светом.................293

4.2.2.2. Изменение спектров флуоресценции липофусциновых гранул и синтетического А2Е при облучении их видимым светом.................295

4.2.2.3.Хроматографический анализ хлороформного экстракта липофусциновых гранул и А2Е в метаноле до и после облучения видимым светом................................................................................298

4.2.3. Спектры флуоресценции и состав флуорофоров липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз в норме и в двух случаях визуализируемой абиотрофии..................................301

4.2.4. Разработка методологического подхода к исследованию in situ флуоресцентных свойств липофусциновых гранул.........................314

4.3. Заключение...........................................................................321

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................327

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ................................336

ПРИЛОЖЕНИЕ А. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ........375

ПРИЛОЖЕНИЕ Б. НОРМАТИВНЫЕ ДОКУМЕНТЫ...........................428

ПРИЛОЖЕНИЕ В. ПАТЕНТЫ........................................................436

ВВЕДЕНИЕ

Родопсин является одним из самых древних белков животного царства -он возник в докембрийский период, около 550-580 миллионов лет назад (Lamb et al., 2007). Хромофорный центр этого белка исключительно консервативен, и фотоизомеризация хромофора как триггера процесса фототрансдукции является универсальной реакцией в процессе фоторецепции у всех организмов - от самых примитивных (фототаксис) до высокоорганизованных (зрение).

Интерес к этой молекуле возник еще в середине XVIII века, когда немецкий физиолог Генрих Мюллер извлек из лягушачьего глаза сетчатку и просто, без всяких приборов, взглянул на нее. Она оказалась розовато-пурпурной. Однако это любопытное наблюдение не привлекло особого внимания ученых. Лишь через четверть века австриец Ференц Болль повторил опыт Мюллера и написал в короткой статье 1876 года: «Вытащенная из глаза розовая сетчатка на свету выцветает, становится белесой. Выцветание должно быть как-то непосредственно связано с процессом зрения» (Boll, 1876). Сегодня это явление называют «обесцвечивание». Статья Ф. Болля положила начало систематическому изучению зрительных пигментов. С тех пор и по сегодняшний день светочувствительный зрительный пурпур, или родопсин, остается одним из самых интересных и подробно изучаемых белков.

Несмотря на столь внушительный период (более 150 лет) исследования зрительных пигментов остается ряд невыясненных вопросов, касающихся, в том числе, фотохимии родопсина.

В настоящее время одной из основных задач современных

фотобиологических исследований процесса зрительной рецепции является

изучение конформационных перестроек хромофорной группы (11 -цис-

ретиналя) и белковой части (апобелка) на начальных стадиях

фотопревращения молекулы родопсина. Эти перестройки и определяют, в

11

конечном счете, инициацию фототрансдукции - превращения энергии поглощенного кванта света в фоторецепторный сигнал в зрительной клетке.

Особое внимание в теоретических и экспериментальных исследованиях уделяется изучению конфигурационного состояния 11-г/мс-ретиналя и его взаимодействию с ближайшим белковым окружением в хромофорном центре темнового необлученного родопсина и в продуктах его фотопреващения. Именно это взаимодействие определяет уникальные фотохимические свойства родопсина: исключительно высокую скорость изомеризации хромофора (менее 200 фемтосекунд) и высокий квантовый выход этой реакции (0,65).

Кроме того, родопсин является типичным представителем большого семейства G-белок-связывающих рецепторов (G-protein-coupled receptors /GPCR/), играющих ключевую роль в регуляторных процессах организма (Mirzadegan et al., 2003). Сигнальные пути, регулируемые этими белками-рецепторами, определяют множество важнейших биологических процессов, включая процессы сенсорной рецепции, эндокринной регуляции и синаптической передачи. Около 5% генома человека (более 600 генов) содержит информацию об этих белках (Venter et al., 2001). Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе функционирования этих белковых рецепторов, может позволить управлять многими биохимическими процессами, происходящими в организме.

Зрительный пигмент родопсин, локализованный в фоторецепторной

мембране наружного сегмента зрительной клетки, является прекрасной

моделью для исследования структуры и функции G-белок-связывающих

рецепторов. Запускаемый родопсином при поглощении им кванта света

механизм фототрансдукции изучен достаточно хорошо. В этом механизме

преобразования, передачи и многократного усиления первичного светового

сигнала самым первым событием является фотохимическая реакция

изомеризации хромофорной группы родопсина - 11-г/мс-ретиналя.

Изомеризация приводит, в конечном итоге, к конформационным

12

перестройкам белковой части молекулы,