Реакции зрительного цикла в палочках сетчатки амфибий

Колесников, Александр Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Реакции зрительного цикла в палочках сетчатки амфибий
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Реакции зрительного цикла в палочках сетчатки амфибий"

Российская Академия Наук Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова

На правах рукописи

I КОЛЕСНИКОВ

Александр Викторович

РЕАКЦИИ ЗРИТЕЛЬНОГО ЦИКЛА В ПАЛОЧКАХ СЕТЧАТКИ АМФИБИЙ

03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в лаборатории эволюции органов чувств (заведующий - доктор биологических наук В.И. Говардовский) института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

доктор биологических наук В.И. Говардовский

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук Е.В. Розенгарт доктор биологических наук С.С. Колесников

Ведущее учреждение;

Институт биохимической физики РАН

Защита состоится _8_ февраля 2005 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.127.01 при институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, по адресу:

194223 Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, д. 44, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Автореферат разослан 24 декабря 2004 г.

Научный руководитель;

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

loos-ц

¿6244

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Процесс возбуждения палочек сетчатки начинается с поглощения кванта света молекулами зрительного пигмента (родопсина), находящегося в наружном сегменте клетки. Поглощение кванта света вызывает немедленную изомеризацию хромофорной группы родопсина (\\-цис ретиналя) в полностью-транс форму, инициирующую серию конформационных изменений в белковой части молекулы (опсине). Эти изменения приводят к появлению активной конформации белка - метародопсина II, которая запускает внутриклеточный каскад фототрансдукции, генерирующий электрический ответ фоторецепторной клетки (обзоры: Фирсов и Говардовский, 2001; Pugh & Lamb, 2000; Burns & Lamb, 2003).

Быстрые стадии (от фотородопсина до метародопсина I) хорошо изучены как в детергентных экстрактах родопсина, так и в интактных фоторецепторах (обзор: De Grip & Rothschild, 2000). Значительно меньше известно о реакциях, которые происходят после появления метародопсина II. В конечном итоге они приводят к гидролизу связи Шиффова основания полностыо-транс ретиналя с опсином. Поэтому весь процесс от фотоизомеризации до гидролиза получил название фотолиза.

Медленные стадии фотолиза играют важную роль в выключении каскада и восстановлении исходного темнового состояния фоторецептора. Известно, что даже инактивированный путем фосфорилирования родопсинкиназой и последующего связывания с аррестином метародопсин II обладает остаточной каталитической активностью. Поэтому он может стимулировать постоянное возбуждение каскада, понижая чувствительность палочки. Это же относится и к метародопсину П1, возникающему после метародопсина П.

В настоящее время проблема природы и функций метародопсина Ш еще далека от решения. Между тем, знание химической структуры этого продукта является важным для понимания процессов регенерации родопсина и темновой адаптации. Например, если хромофорная группа в состоянии метародопсина III по-прежнему ковалентно связана с остатком лизина-296, то это исключает возможность рекомбинации белка с 11-цис ретиналем, необходимой для регенерации темнового состояния

зрительного пигмента. Кроме того, доступность или недоступность полностью-транс ретиналя в метародопсине III и других поздних продуктах фотолиза ферменту ретинолдегидрогеназе определяет скорость образования полностью-транс ретинола, являющегося субстратом для последующего ресинтеза \\-цие ретиналя в пигментном эпителии (Zimmerman et al., 1975; Rattner et al., 2000). Поэтому распад метародопсина III, вместе с распадом метародопсина II, мог бы контролировать процесс темновой адаптации палочек, в результате которого клетки восстанавливают свою чувствительность при переходе от высоких освещенностей к низким.

Совокупность реакций, обеспечивающих регенерацию родопсина, называется зрительным циклом (обзоры: Kuksa et al., 2003; Lamb & Pugh, 2004). При распаде метапродуктов полностью-транс ретиналь отделяется от опсина. Затем он восстанавливается в ретинол с помощью ретинолдегидрогеназы. Перед восстановлением небольшая часть ретиналя может образовывать так называемый "индикатор желтый", состав которого был проанализирован еще более 30 лет назад. Было установлено, что этот продукт представляет собой различные Шиффовы основания ретиналя с аминогруппами опсина и фосфатидилэтаноламинов фоторецепторной мембраны (обзоры: Dartnall, 1957; Kropf, 1972). Далее ретинол переносится из палочек в клетки пигментного эпителия, где подвергается многоэтапному ферментативному превращению в 11 -цис ретиналь. Затем 11 -цис ретиналь возвращается обратно в наружные сегменты палочек и рекомбинирует с опсином, регенерируя родопсин.

Сейчас известно множество дефектов зрительного цикла, которые приводят к его разрыву и являются причиной заболеваний сетчатки, связанных с нарушением темновой адаптации (Weng et al., 1999; Maugeri et al., 2000; Jang et al., 2001). Поэтому важно знать, какая из стадий цикла лимитирует скорость его работы. Однако лимитирующая стадия зрительного цикла, как в нормальных условиях, так и при различных патологических состояниях, до сих пор не определена.

До последнего времени реакции зрительного цикла исследовались преимущественно m vitra на детергентных экстрактах зрительного пигмента, препаратах изолированных фоторецепторных мембран и экстрагированных ферментах. Такой подход дает лишь ограниченную информацию о полной картине цикла, поскольку возмож-

>-' At»>>*< » - " ч W'll,1.!-« '

••■г i '¿л .

ные регуляторные механизмы и параметры отдельных реакций могут существенно зависеть от морфологической целостности клетки и нативности окружения реагирующих молекул. Общим недостатком имеющихся работ, посвященных изучению медленных стадий фотолиза родопсина и реакций зрительного цикла в палочках (Donner & Reuter, 1969; Baumann, 1972; Baumann, 1978; Chabre & Breton, 1979), является то, что они выполнены с использованием методик, обладающих низким временным разрешением и не позволяющих надежно идентифицировать все продукты.

Цель работы

Исследовать медленные стадии фотолиза и другие реакции зрительного цикла, протекающие в интактных наружных сегментах палочек сетчатки амфибий.

Задачи работы

1. Определить природу метародопсина П1 и его положение в общей кинетической схеме взаимопревращений долгоживущих интермедиатов фотолиза.

2. На основе знаний структуры и взаимопревращений продуктов, образующихся в ходе медленных стадий фотолиза, оценить их возможную роль в процессе тем-новой адаптации палочек амфибий.

3. Выяснить, может ли какая-либо из реакций зрительного цикла, происходящих в наружном сегменте палочки (распад метапродуктов, образование полностью-транс ретинола и рекомбинация \\-цис ретиналя с опсином), лимитировать скорость работы цикла в нормальных условиях.

Научная новизна результатов исследования

Применение скоростной поляризационной микроспектрофотометрии впервые позволило надежно идентифицировать все долгоживущие продукты фотолиза (ме-тародопсины I, II и Ш и различные формы "индикатора желтого") в интактных палочках и установить кинетическую схему взаимопревращений между ними.

В работе впервые удалось сопоставить временной ход распада метапродуктов с кинетикой затухания "эквивалентного фонового света", десенситизирующего па-

лочки. На основе этого был сделан вывод о том, что по крайней мере при низких уровнях обесцвечивания родопсина распад метапродуктов может являться фактором, контролирующим процесс темновой адаптации палочек.

Исследование кинетики распада метародопсинов, образования ретинола и рекомбинации 11 -цис ретиналя с опсином позволило установить, что при высоких уровнях освещенности ни одна из этих стадий не является лимитирующей в работе зрительного цикла в нормальных условиях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В процессе фотолиза родопсина в интактных палочках происходит параллельный распад метародопсинов II и ГО на полностыо-/ярянс ретиналь и опсин. При этом хромофорный центр белка становится доступным для последующей регенерации пигмента с 1 \-цис ретиналем.

2. Распад метародопсинов может лимитировать скорость темновой адаптации палочек при низких уровнях обесцвечивания.

3. Именно распад метапродуктов, а не активность ретинолдегидрогеназы, определяет скорость образования ретинола в наружном сегменте.

4. Рекомбинация 1 \-цис ретиналя с опсином в наружном сегменте происходит значительно быстрее, чем регенерация родопсина в интактном глазу.

5. В нормальных условиях скорость работы зрительного цикла палочек при высоких уровнях обесцвечивания определяется какой-то стадией (стадиями), протекающей за пределами наружного сегмента - при транспорте ретиноидов через межфоторецепторное пространство или ферментативном ресинтезе 11 -цис ретиналя в пигментном эпителии.

Теоретическая и практическая значимость работы

Подробное исследование медленных стадий фотолиза позволило приблизиться к пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе процесса темновой адаптации палочек.

Результаты исследований, полученные на палочках амфибий, могут быть справедливы и для палочек млекопитающих, включая палочки человека, поскольку в настоящее время предполагается, что процесс фотолиза родопсина у холоднокровных и теплокровных позвоночных во многом сходен (Hofmann, 2000; De Grip & Rothschild, 2000). Они также могут оказаться полезными при изучении других клеточных сигнальных систем, о которых известно значительно меньше, чем о передаче сигнала при зрительном возбуждении.

В результате работы был сделан шаг к выяснению вопроса о том, где лежит лимитирующая стадия (стадии) зрительного цикла позвоночных в нормальных условиях. Полученные данные необходимы для дальнейшего изучения механизмов функционирования зрительного цикла при различных заболеваниях сетчатки, связанных с нарушениями темновой адаптации.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на V Всероссийской медико-биологической конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2002), VI Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2002), II Международном симпозиуме "Visionarium П" (Твярминне, Финляндия, 2003), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), XVI Международном конгрессе по исследованию зрения (ICER) (Сидней, Австралия, 2004) и III Международном симпозиуме "Visionarium III" (Твярминне, Финляндия, 2004). По материалам диссертации опубликованы 3 научные статьи в рецензируемых журналах (2 из них - в международных) и 6 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 156 страницах и состоит из введения, четырех глав (обзора литературы, материалов и метода исследования, результатов и обсуждения результатов), выводов, списка литературы (включает 192 источника) и приложения. Диссертация иллюстрирована 38 рисунками и 1 таблицей.

Материалы и метод

Измерения были выполнены на "красных" (родопсиновых) палочках лягушек Rana temporaria и Rana ridibunda и жаб Bufo bufo. Для адаптации перед экспериментом животные находились 12 часов в темноте.

Во избежание обесцвечивания зрительного пигмента все операции по выделению сетчатки из глаз проводились при слабом красном свете. Дальнейшие манипуляции с сетчаткой зависели от цели конкретного эксперимента.

Для исследования продуктов фотолиза в структурно интактных, но метаболически неактивных наружных сегментах палочек (НСТТ) приготовляли "запечатанные" препараты (Govardovskii et al., 2000). Физиологический солевой раствор содержал 110 мМ NaCl, 2.5 мМ КС1, 1 мМ СаС12, 1 мМ MgS04, 5 мМ NaHC03, 10 мМ глюкозы, 50 мкМ ЭДТА. рН раствора поддерживался посредством 10 мМ NaHEPES (рН 7.5, в большинстве случаев), 10 мМ Na-фосфатного буфера (в диапазоне рН 5.0-6.5) или 10 мМ Tris-HCl (в диапазоне рН 8.0-9.0). В некоторых случаях для ускорения рН-равновесия между НСП и средой в раствор добавляли протонофор СССР (карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон; Sigma, США) до конечной концентрации 0.2-0.5 мкМ. При исследовании устойчивости фоторегенерированного пигмента к гидроксиламину 20 мМ NaCl было замещено таким же количеством NH2OH. Эти эксперименты проводились при рН 6.0.

Для исследования продуктов фотолиза в метаболически активных одиночных палочках, находящихся на краю небольших кусочков сетчатки, использовали камеру для перфузии. Эту же камеру использовали в экспериментах с быстрой сменой рН раствора. К входной части камеры подсоединяли систему из двух шприцев, заполненных растворами с необходимыми значениями рН, с добавлением СССР (или NH2OH в исследованиях по фоторегенерации пигмента). При плавном нажатии на поршень одного из шприцев раствор в камере заменялся на новый в течение нескольких секунд.

При исследовании образования метародопсина Ш после небольших засветок измерения проводились на целой сетчатке из одного глаза, расстеленной на нижнем стекле перфузионной камеры фоторецепторной стороной вверх.

Записи спектров проводились с помощью скоростного дихроичного микроспектрофотометра (Govardovskii & Zueva, 2000), позволяющего регистрировать спектры поглощения одиночных фоторецепторов при двух направлениях поляризации света (Г-, в плоскости мембраны дисков, или L-, перпендикулярно ей). Скорость сканирования прибора - 1200 юл/с.

Перед измерением спектра поглощения препарата световой зонд под контролем инфракрасной телевизионной системы устанавливали на свободное пространство рядом с клеткой и записывали базовую линию (4 раза). Затем исследуемая структура вводилась в измерительный луч, сканирование проводилось один раз, и в память компьютера записывались Т- и L- массивы значений оптической плотности. Оптическая плотность препарата на каждой длине волны рассчитывалась компьютерной программой (отдельно для Т- и L- поляризаций) как десятичный логарифм отношения интенсивностей при записи соответствующей базовой линии и структуры.

Уровень обесцвечивания родопсина в изолированных НСП измерительным зондом составлял около 0.5% от темнового пигмента за одно сканирование. При исследовании образования метародопсина III после небольших засветок проводили записи на целой сетчатке с использованием широкого (порядка 300x300 мкм) зонда, покрывающего более 1000 палочек, что позволяло снизить уровень обесцвечивания лучом до < 0.05% за одно сканирование.

Обесцвечивание зрительного пигмента и продуктов его фотолиза проводилось с помощью ярких светодиодов (Marl International Ltd., Англия), излучающих свет в ультрафиолетовой (380 нм), синей (465 нм) или зеленой (525 нм) областях спектра, или с помощью вставленных в осветитель светофильтров ЗС-1 (максимум спектра пропускания - 530 нм, полуширина - 50 нм) или ОС-12 (пропускает свет с X > 580 нм). При использовании светодиодов для достижения фоторавновесного состояния было достаточно вспышки длительностью 500 мс. Первая запись после обесцвечивания (в дальнейшем будет обозначаться как 0 с) начиналась через 0.02 с после окончания засветки.

Первичная обработка данных производилась с помощью специальной компьютерной программы, написанной в лаборатории эволюции органов чувств ИЭФБ

(СоуагёоуэкН ег а1., 2000). В ее функции входит усреднение многих спектров (обычно проводилось усреднение 6-12 спектров, в зависимости от уровня шума), коррекция базовой линии, сглаживание спектра и возможность "подогнать" к имеющемуся спектру стандартную кривую, описывающую поглощение зрительного пигмента.

Результаты и обсуждение

Серия усредненных спектров поглощения изолированных НСП жабы Вгфз Ьгфэ, записанных при двух направлениях поляризации света в темноте и через определенные интервалы времени после обесцвечивающей вспышки (500 мс, 525 нм) при рН 7.5, показана на рис. 1. Эти спектры скорректированы на "необесцвеченный" пигмент (~ 10% от темнового уровня родопсина), фоторегенерированный из метародоп-сина I за время вспышки.

Длина волны, ни Длина волю, ни

Рис. 1. Г- и I- спектры поглощения фотопродуктов в изолированных НСП жабы, скорректированные на фоторегенерированный за время вспышки пигмент (~ 10% от темнового родопсина). Кривые 1 соответствуют темновому спектру родопсина. Кривые 2 (0 с после обесцвечивания пигмента), 3 (200 с) и 4 (2700 с) отражают появление метародопсинов I и II, метародопсина 1П и "ре-тинального" компонента + Р-440, соответственно. Каждая кривая - среднее из 11 клеток.

Сразу после обесцвечивания родопсин исчезает, и появляется высокий пик на 380 нм, соответствующий метародопсину II (кривые 2). Субпик при 475 нм соответствует метародопсину I, который находится в равновесии с метародопсином П. Ме-

тародопсин II ориентирован в плоскости мембраны даже более строго, чем темновой родопсин (что видно из сравнения относительных амплитуд кривых / и 2 на Т- и L-панелях) В дальнейшем на Г-спектрах прослеживается распад метародопсина П и появление метародопсина III (пик около 475 нм, максимум на 200 с; кривая 3, Т-панель), который также со временем распадается. По мере распада метародопсинов П и Ш изначально низкий пик на 380 нм на L-спектрах возрастает, что интерпретируется как появление полностью-трамс ретиналя, ориентированного преимущественно перпендикулярно к плоскости мембраны (кривая 4, I-панель). Конечный спектр на 45 минуте состоит из основного пика на « 375 нм (так называемого "рети-нального" компонента, см. ниже) и длинноволнового плеча с максимумом поглощения « 440 нм. В дальнейшем этот продукт будет обозначаться Р-440. Заметного количества ретинола в изолированных НСП не образуется (пик ретинола на » 325 нм практически отсутствует). По-видимому, это связано с недостатком кофактора ретинолдегидрогеназной реакции - НАДФН.

Несмотря на спектральное сходство, метародопсин Ш и Р-440 имеют совершенно разную природу. Эти продукты не различались в большинстве предыдущих исследований, в которых измерения проводились на одной или двух длинах волн или на неориентированных системах (мембранных суспензиях или детергентных экстрактах) (обзор: De Grip & Rotschild, 2000). На рис. 2 А показаны рассчитанные спектры метародопсина Ш В. bufo и R. temporaria. Их дихроичные отношения (отношения Т- и ¿-поглощений) « 13-14, что значительно больше, чем для темнового родопсина (« 6). Это означает, что хромофорная группа в метародопсине III ориентирована даже более строго в плоскости мембраны, чем в темновом родопсине. Форма спектра метародопсина III практически не зависит от рН.

В отличие от метародопсина Ш, дихроизм Р-440 составляет около 0.5 (рис. 2 Б). Это означает, что ретиналь в этом компоненте ориентирован преимущественно поперек плоскости мембраны. Р-440 представляет собой протонированную форму Шиффовых оснований полностью-транс ретиналя с различными аминогруппами опсина и фосфолипидов мембраны и является частью "индикатора желтого". Перенос полностью- транс ретиналя с исходного места связывания на другие неспецифи-

ческие сайты мембраны (с образованием "индикатора желтого") в ходе фотолиза был установлен с помощью прямого химического анализа продуктов обесцвечивания (Van Breugel et al., 1979), однако ошибочно приписан метародопсину Ш. Другую часть "индикатора желтого" составляет "ретинальный" компонент, состоящий из свободного ретиналя и его непротонированных Шиффовых оснований. Форма спектра "индикатора желтого", т.е. соотношение протонированного и непротониро-ванного компонентов (каждый из которых сам по себе не является гомогенным), сильно зависит от рН. Кислые значения рН способствуют накоплению Р-440.

Рис. 2. А): Спектры поглощения метародопсинов Ш В. bufo (тонкая шумная кривая, среднее из спектров, определенных при рН 7.5 и 9.0) и R temporaria (толстая кривая, полученная приближением двумя гауссианами, рН 7.5). Б): Спектры поглощения конечных продуктов фотолиза в изолированных НСП В. bufo. Т- и L- спектры, записанные через 45 минут после обесцвечивания родопсина (рН 5.0), можно разложить на "ретинальный" компонент (тонкие гладкие кривые) и Р-440 (толстые шумные кривые). Количество образованного ретинола в конечной смеси продуктов незначительно.

Итак, основные продукты фотолиза имеют максимумы поглощения при »380 нм (метародопсин П и "ретинальный" компонент "индикатора желтого") и » 475 нм (метародопсины I и Ш). Кроме того, в поглощение на 475 нм вносит вклад и Р-440. Поскольку метародопсины I и П находятся в быстром равновесии (время перехода ~ 1 мс), то с кинетической точки зрения их сумму можно рассматривать как единый продукт. Таким образом, в любой момент времени после вспышки имеется четыре

продукта - метародопсины I/П, метародопсин Ш, "ретинальный" компонент и Р-440. Зная временной ход изменения поглощения на двух длинах волн при двух направлениях поляризации, можно составить систему из четырех уравнений и определить вклад каждого из продуктов в общее поглощение. Найденные поглощения пересчи-тываются затем в относительные концентрации продуктов с учетом молярных экс-тинкций.

В ходе фотолиза концентрации продуктов изменяются следующим образом (рис. 3). Распад метародопсинов I и П происходит по двухэкспоненциальной кинетике, что предполагает существование обратимого равновесия между метародопси-нами П и Ш. Такое равновесие было действительно установлено в прямых экспериментах с быстрой сменой рН среды, что подтверждает результаты более ранних исследований (Chabre & Breton, 1979). Концентрация метародопсина Ш достигает максимума к 200 с и затем медленно уменьшается. "Ретинальный" компонент и Р-440 накапливаются вплоть до 45 минуты.

| 0.8

:х

I 06

к (0

1 0.4

ф £

^ 0.2 О

0.0 1 0 300 600 900 1800 2100 2400 2700

Время после вспышки, с

Рис. 3. Временной ход изменения относительных концентраций поздних продуктов фотолиза родопсина в НСП В. Ьи/о. Гладкие кривые - двухэкспоненциальные подгонки к экспериментальным точкам для суммы метародопсинов I и II и метародопсина Ш, основанные на предложенной кинетической схеме (см. ниже), г2 - коэффициент корреляции.

В отличие от изолированных НСП, в метаболически активных палочках, прикрепленных к сетчатке, ретиналь быстро восстанавливается в ретинол. Это видно по исчезновению пика ретиналя при 380 нм и появлению острого пика короче 330 нм (рис. 4). Молекулы ретинола также ориентированы преимущественно поперек плоскости фоторецепторной мембраны (дихроизм » 0.5). Количество ретинола к 30 минуте после вспышки достигает 80-85% от исходного родопсина.

Длин« волш, нн Длина волны, нн

Рис. 4. Т- и I- спектры поглощения фотопродуктов в интактных палочках жабы. Кривые 1 (0 с после обесцвечивания пигмента) и 2 (300 с) показывают образование метародопсинов 1/11 и Ш, соответственно, а кривые 3 (1800 с) и 4 (2700 с) демонстрируют эффективное восстановление ре-таналя в ретинол. Каждая кривая - среднее из 8 клеток.

Временной ход изменения концентраций метародопсинов П и Ш в интактных палочках оказался практически таким же, как и в изолированных НСП (рис. 5 А). Это говорит о необратимости распада метапродуктов.

Для выяснения вопроса о том, какой процесс лимитирует скорость образования ретинола в интактных палочках, необходимо рассмотреть две крайние ситуации. Если бы ретинолдегидрогеназа была полностью неактивна, то в интактных клетках вообще не происходило бы образование ретинола из полностью-транс ретиналя, который бы накапливался в значительном количестве в виде "индикатора желтого", как это происходит в изолированных НСП (рис. 1). С другой стороны, при очень высокой активности ретинолдегидрогеназы ретиналь не появлялся бы в заметном ко-

отчестве из-за быстрого восстановления в ретинол. В интактных палочках, исследованных в данной работе, концентрация "индикатора желтого" быстро достигает стационарного уровня, который не превосходит 15% от обесцвеченного родопсина, в то время как ретинол накапливается в значительном количестве (рис. 5 В). Это гораздо ближе ко второй крайней ситуации, при которой временной ход реакции определяется только скоростью образования ретиналя при распаде метапродуктов. Таким образом, именно гидролиз нативной связи ретиналя с опсином при распаде метародопсинов, а не собственная активность ретинолдегидрогеназы, лимитирует скорость образования ретинола в интактных палочках.

Рис. 5. Сравнение временного хода изменения относительных концентраций продуктов фотолиза в изолированных НСП (заполненные символы), образующих ретиналь и его Шиффовы основания, и палочках сетчатки (пустые символы), в которых происходит образование ретинола. А): Распад метародопсинов I + П и ГО не ускоряется при восстановлении ретиналя в ретинол. Б): "Ре-тинальный" компонент и Р-440 накапливаются в значительных количествах в изолированных НСП, в то время как ретинол образуется в интактных палочках.

На основе анализа экспериментальных данных была установлена следующая кинетическая схема медленных стадий фотолиза (рис. 6). Свободный ретиналь образуется двумя путями - при распаде метародопсинов П и Ш, которые находятся в рН-зависимом равновесии. При этом доля ретиналя, образующегося из метародоисина III, у разных видов амфибий составляет 25-50%. Далее ретиналь может образовать протонированную (Р-440) и непротонированную формы Шиффовых оснований "ин-

дикатора желтого", между которыми также существует pH-зависимое равновесие (время перехода ~ 1 мин). Подбор параметров двухэкспоненциальных функций, описывающих временной ход изменения концентраций метародопсинов II и Ш, позволил определить 4 константы скорости первого порядка.

к,

быстрое 5.6-10"3 с'1

Мета Т < > Мета TT < > Мета III

равновесие

50-75% к

$3' Ю-3 с1

"Ретиналь" + опсин < > Р-440

Рее. 6. Кинетическая схема взаимопревращений поздних продуктов фотолиза. "Ретиналь" включает в себя как свободный ретиналь, освобожденный из метародопсинов, так и его непрото-нироваяные Шиффовы основания, т.е. "ретинальный" компонент. Константы скорости реакций первого порядка обозначены kj-k3.

В предыдущих исследованиях, выполненных на сетчатке лягушки, было обнаружено, что после вспышек, обесцвечивающих менее 10% родопсина, образование метародопсина III не происходит (Donner & Hemilä, 1975). Если бы это было так, то любая линейная схема фотолиза была бы изначально неверной. Однако мы показали, что этот результат является артефактом, по-видимому, связанным со светоинду-цированным расширением межфоторецепторного пространства и увеличением доли света, проходящего между фоторецепторами. Это вызывает уменьшение оптической плотности в области поглощения родопсина и маскирует образование метародопсина Ш. В данной работе было установлено, что в действительности образование метародопсина III в палочках сетчатки амфибий происходит и при обесцвечивании до 3-4% родопсина (рис. 7).

0 2

• Сетчатке нсп

/Г

2 ""о.о

0.2 0 4 0.6 0.8

Степень обесцвечивания родопсина

1.0

Рис. 7. Зависимость относительной доли образованного метародопсина III от степени обесцвечивания родопсина. Измерения выполнены на кусочках сетчатки (точки) или изолированных НСП В. bufo (кружки и крестики, данные получены в разных экспериментах). Каждый символ соответствует измерению на отдельно взятой области сетчатки (точки) или среднему из измерений на 12-16 отдельных НСП при обесцвечиваниях до 30% родопсина и 2-3 НСП при больших степенях обесцвечивания пигмента (кружки и крестики).

Еще более 70 лет назад было предположено, что восстановление чувствительности палочкового зрения может быть связано с постепенным уменьшением интенсивности так называемого "эквивалентного фонового света", который ♦ десенситизирует палочки так же, как реальный свет (Stiles & Crawford, 1932). Этот "темновой свет" создается какими-то долгоживущими продуктами фотолиза родоп-« сина, способными с низкой эффективностью возбуждать каскад фототрансдукции.

Было предположено, что такими продуктами являются инактивированные фосфори-лированием и связыванием с аррестином метапродукты (и свободный опсин), а также активный метародопсин П, повторно образующийся из какого-то малоактивного продукта своего распада (ЪеШгоск е1 а1.,1998).

Сопоставление измеренной Лейброк с соавторами кинетики затухания "эквивалентного фона" при небольших уровнях обесцвечивания родопсина с кинетикой

распада метапродуктов показывает, что источниками возбуждения каскада являются как метародопсины I и II, так и, вероятно, метародопсин Ш (рис. 8). Видно, что распад одних только метародопсинов I и П, без учета образования и распада метаро-допсина П1, значительно хуже описывает экспериментальные данные по затуханию "эквивалентного фона", чем распад всех трех метапродуктов. Таким образом, именно распад всех метапродуктов может являться фактором, контролирующим темно-вую адаптацию палочек, по крайней мере при обесцвечивании до нескольких процентов родопсина.

I-

л о.

Ё ф =г

-е-

ф §

0,1

0.01

х ^ М + М// + М///

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Время после вспышки, мин

, Рис. 8. Сравнение временного хода распада метапродуктов (кривые) со спаданием "эквивалентного фона" (символы, взяты из ЬиЬгоск е( а1., 1998) в ходе темновой адаптации палочек жабы. Горизонтальная пунктирная линия показывает среднюю интенсивность "эквивалентного фона" в темноте.

Помимо реакций фотолиза и восстановления пошостъю-транс ретиналя в ретинол, в наружном сегменте палочек происходит еще одна ключевая стадия зрительного цикла - рекомбинация 11 -цис ретиналя, поступившего из клеток пигментного эпителия, с опсином. Она обеспечивает восстановление темнового состояния родопсина. Для изучения этой стадии был использован процесс фотореге-

нерации зрительного пигмента из "индикатора желтого". Такой подход имеет преимущество перед исследованиями in vitro, в которых скорость регенерации зависит главным образом от скорости проникновения экзогенного 1 \-цис ретиналя в наружный сегмент и липидную фазу мембраны из водной фазы. Фотоизомеризация полно-стью-транс ретиналя, который после распада метапродуктов изначально находится в липидной фазе мембраны, в 11 -цис ретиналь позволяет мгновенно ввести известное количество II-цис хромофора в наружный сегмент.

Фотоизомеризация достигалась путем освещения Шиффовых оснований, накопившихся при рН 6.0, с помощью ярких светодиодов 465 или 380 нм (2 с). Свет 465 нм поглощается только протонированными Шиффовыми основаниями ретиналя (Р-440). Свет 380 нм поглощается в основном "ретинальным" компонентом, т.е. свободным ретиналем и его непротонированными Шиффовыми основаниями.

На рис. 9 А показана последовательность спектров, записанных при поляризации света в плоскости мембран дисков после фотоизомеризующей вспышки 465 нм. Через 30 минут после обесцвечивания родопсина зеленым светом в наружных сегментах палочек происходит накопление Р-440 (толстая кривая 0). Последующее освещение его синей вспышкой вызывает немедленную фотоизомеризацию части потостыо-транс ретиналя главным образом в 11 -цис ретиналь, имеющий более низкий коэффициент молярной экстинкции (кривая I на рис. 9 А и разностный спектр 1-0 на рис. 9 Б показывают уменьшение поглощения в области 400-570 нм). О дальнейшей рекомбинации 11 -цис хромофора с опсином свидетельствует увеличение поглощения в области 500 нм, т.е. в районе максимума темнового пигмента (кривые 2-5 на рис. 9 А). Более наглядно это видно на разностных спектрах (рис. 9 Б). К 30 минуте регенерирует примерно 25% от исходного уровня родопсина. Последовательность спектров, записанных после фотоизомеризующей вспышки 380 нм, принципиально не отличается от показанной на рис. 9 А.

О том, что регенерирует именно зрительный пигмент, свидетельствует сравнение нормированных разностных спектров исходного родопсина и фоторегенериро-ванного пигмента после их обесцвечивания зеленым светом. Эти разностные спектры практически совпадают (не показано).

-001

350 400 450 300 550 600 650

350 400 450 500 550 600 650

Длина волны км

Длина волны ни

Рис. 9. Фоторегенерация родопсина из Р-440 в изолированных НСП R temporaria. А): Абсолютные Г-спектры. В течение 30 мин после обесцвечивания родопсина накапливается Р-440 (толстая кривая 0). Немедленно После вспышки светом 465 нм поглощение в области 400-570 нм уменьшается, отражая переход части етранс-ретиналя в составе Р-440 в 11 -цис ретиналъ (кривая ]). Появляющийся в дальнейшем пик на 500 нм демонстрирует регенерацию родопсина из 1 \-цис ре-тиналя и опсина (кривые 2,10 с после изомеризующей вспышки; 3,100 с; 4, 300 с; 5,1800 с). Каждая кривая - среднее из 10 клеток. Б): Разностные спектры между указанными кривыми, более отчетливо показывающие образование родопсина.

На рис. 10 А показана кинетика регенерации зрительного пигмента после освещения Шиффовых оснований светом 465 или 380 нм. Время полурегенерации (ъл) составляет всего 2.5-2.8 минут, по сравнению с« 14 минутами в интактном глазу, как было определено ранее (Reuter, 1964). Это означает, что стадия рекомбинации 11 -цис ретиналя с опсином в нормальных условиях не может лимитировать скорость работы зрительного цикла.

Две другие стадии зрительного цикла, протекающие в наружном сегменте палочки (распад метапродуктов и генерация ретинола), также не являются лимитирующими в цикле, поскольку они также происходят значительно быстрее, чем регенерация родопсина в интактном глазу (рис. 10 5). х% этих реакций составляют 4.3 минуты (для распада метародопсинов) и 3.3 минуты (для образования ретинола).

'> Таким образом, в нормальных условиях скорость регенерации родопсина и, соответственно, скорость темновой адаптации палочек после интенсивных засветок, определяются реакциями зрительного цикла, протекающими за пределами наружно-

го сегмента - либо на этапах доставки ретиноидов в клетки пигментного эпителия и из них, либо на этапах процессинга ретиноидов внутри пигментного эпителия.

15 30

Время, шн

Рис. 10. Кинетика стадий зрительного цикла, протекающих в наружном сегменте палочки. А): Рекомбинация 11 -цис ретиналя с опсином при фоторегенерации зрительного пигмента из двух компонентов "индикатора желтого" - Р-440 (сплошная кривая 465 им) и "ретинального" компонента (пунктирная кривая 380 нм). Б): Распад суммарного количества метародопсинов (сплошная кривая) и образование ретинола (пунктирная кривая). Указаны процессов.

Выводы

1. В интактных палочках амфибий существует рН-зависимое обратимое равновесие между метародопсинами I и П. Переход метародопсина П в метародопсин Ш также обратим.

2. Хромофорная группа в метародопсине Ш, как и в темновом родопсине и в метародопсине П, ориентирована преимущественно параллельно плоскости фоторе-цепторной мембраны.

3. Кинетика распада метародопсинов не зависит от наличия или отсутствия дальнейшего восстановления ретиналя в ретинол. В совокупности с пунктами 1 и 2 это означает, что в метародопсине Ш хромофор остается ковалентно связанным с исходным местом на молекуле опсина - остатком лизина-296.

4. В процессе фотолиза происходит параллельный распад метародопсинов П и Ш на иотостью-транр ретиналь и опсин. При этом доля ретиналя, образующегося из метародопсина Ш, у трех исследованных видов амфибий составляет 25-50%.

5. Ретиналь, освободившийся в результате распада метародопсинов П и Ш, находится в обратимом рН-зависимом равновесии с продуктами своего неспецифического связывания с аминогруппами белков и фосфатидилэтаноламинов фоторецепторной мембраны. Совокупность этих продуктов и свободного ретиналя составляет "индикатор желтый".

6. Ретиналь в "индикаторе желтом" ориентирован преимущественно поперек плоскости мембраны дисков. Это означает, что протонированная форма Шиффовых оснований ретиналя (Р-440) и метародопсин Ш являются совершенно разными продуктами фотолиза, хотя л обладают сходными спектрами поглощения.

7. Метародопсин III образуется даже при низких (до 3-4%) уровнях обесцвечивания родопсина. Прк этом временной ход распада всех метапродуктов, включая метародопсин П1, хорошо коррелирует с временным ходом затухания "эквивалентного фонового света". Следовательно, распад метародопсинов может быть фактором, контролирующим темновую адаптацию палочек, по крайней мере при обесцвечивании нескольких процентов родопсина.

8. При высоких уровнях обесцвечивания родопсина распад метапродуктов в палочках амфибий происходит намного быстрее, чем регенерация пигмента в ин-тактном глазу, и, следовательно, не является лимитирующим этапом в зрительном цикле. Однако именно он, а не ретинолдегидрогеназная реакция, лимитирует скорость Образования полностью-транс ретинола в наружном сегменте, который далее служит субстратом для ресинтеза 1 \-цис ретиналя в клетках пигментного эпителия.

9. Скорость зрительного цикла также не лимитируется скоростью реакции рекомбинации 11-цис ретиналя с опсином, исследованной с помощью фоторегенерации зрительного пигмента из "индикатора желтого".

клетки пигментного эпителия и из них, либо на этапах процессинга ретиноидов внутри пигментного эпителия.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Голобокова Е.Ю., Колесников А.В. Фотолиз зрительных пигментов "красных" и "зеленых" палочек амфибий in situ II Тез. докл. 5-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей "Человек и его здоровье". -Санкт-Петербург. - 2002. - С. 55-56.

2. Колесников А.В., Голобокова Е.Ю. Медленные стадии фотолиза зрительного пигмента палочек амфибий in situ И Тез. докл. 6-й Путинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". - Пущино. - 2002. - С. 15-16.

3. Kolesnikov A.V., Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. The identity of metar-hodopsin in // Visual Neuroscience. - 2003. - V. 20. - P. 249-265.

4. Kolesnikov A.V., Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. Slow stages of photolysis of amphibian rhodopsin in situ II Abstract of the "Visionarium II". - Tv§rminne (Finland). -2003.-P. 6.

5. Говардовский В.И., Шуколюков C.A., Колесников A.B., Голобокова Е.Ю. Цикл зрительного пигмента и темновая адаптация: новые подходы к исследованию // Российский Физиологический Журнал. - 2004. - V. 90. - Р. 1015-1025.

6. Колесников А.В. Фоторегенерация зрительного пигмента палочек из Р-440 // Тез. докл. Ш Съезда биофизиков России. - Воронеж. - 2004. - С. 425-426.

7. Kolesnikov A.V., Shukolyukov S.A., Govardovskii V.I. Where lies the rate-limiting step(s) in rhodopsin regeneration? // Abstract of the XVI International Congress of Eye Research. - Sydney (Australia). - 2004. - P. 34.

8. Kolesnikov A.V., Shukolyukov S.A., Govardovskii V.I. Photoregeneration of rhodopsin from "Indicator Yellow" // Abstract of the "Visionarium HI". - Tvarminne (Finland).-2004.-P. 5.

9. Firsov M.L., Kolesnikov A.V., Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. Two realms of dark adaptation // Vision Research. - 2005. -V. 45. - P. 147-151.

Подписано в печать 21.12.2004. Формат 60x84/16. Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ № 1/2112. П. л. 1.5. Уч.-изд. 1.5. Ъфаж70экз.

ЗАО «КопиСервис», 194017, Санкт-Петербург, Скобелевский пр., д. 16 тел.: (812) 234 4333

РНБ Русский фонд

2005-4 26844

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колесников, Александр Викторович

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.—.------.—.—.------.

Цель и задачи исследования.™^

Научная новизна результатов исследования —.-------.—.------.

Основные положения, выносимые на защиту.—.-------.—.

Теоретическая и практическая значимость работы---------.-------.--------.

Апробация работы и публикациирезулыпатов исследования.—.-------.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение палочек и колбочек.—.-------.—.-------.—

1.2. Структура и свойства зрительных пигментов.-------.------.

1.3. Реакции фотолиза зрительного пигмента.--------.-------.

1.3.1. Быстрые стадии фотолиза родопсина.

1.3.1.1. Фотородопсин.

1.3.1.2. Батородопсин.

1.3.1.3. Синий продукт (Blue-shifted intermediate, BSI).

1.3.1.4. Люмиродопсин.

1.3.1.5. Метародопсин I.

1.3.2. Медленные стадии фотолиза родопсина.

1.3.2.1. Метародопсин II.

1.3.2.2. Метародопсин III.

1.3.2.3. Полностъю-транс ретиналь и опсин.

1.4. Механизм возбуждения каскада фототрансдукции.

1.5. Инактивация каскада фототрансдукции и его регуляция.-------.---------.

1.6. Реакции зрительного цикла и темновая адаптация фоторецепторов

1.6.1. Роль медленных стадий фотолиза в темновой адаптации.

1.6.2. Образование полностъю-транс ретинола в наружном сегменте.

1.6.3. Транспорт ретинола в клетки пигментного эпителия.

1.6.4. Образование 11 -цис ретиналя в пигментном эпителии.

1.6.5. Транспорт 11-цис ретиналя в наружный сегмент.

1.6.6. Рекомбинация 1 l-цис ретиналя с опсином в наружном сегменте.

1.7. Лимитирующая стадия (стадии) зрительного цикла в норме и при патологиях.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД

2.1. Экспериментальные животные....

2.2. Микроспектрофотометрия.....

2.2.1. Приготовление препарата.

2.2.2. Микроспектрофотометр.

2.2.3. Процедура измерения.

2.2.4. Обработка результатов.

2.2.4.1. Процедура коррекции базовой линии.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Поздние стадии фотолиза родопсина в интактных палочках амфибий.

3.1.1. Изменения спектров поглощения изолированных НСП в ходе медленных стадий фотолиза.

3.1.2. Спектры поглощения метародопсинов I и II.

3.1.3. Спеетр поглощения метародопсина Ш.

3.1.4. Спектры конечных продуктов фотолиза в изолированных НСП.

3.1.5. Ориентация хромофорной группы в поздних продуктах фотолиза.

3.1.6. Временной ход изменения концентраций продуктов фотолиза.

3.1.7. Образование ретинола в интактных палочках.

3.1.8. Независимость кинетики распада метародопсинов II и III от активности пошостыо-транс ретинолдегидрогеназы.

3.1.9. Существование рН-зависимого равновесия между метародопсинами П и III.

3.1.10. Кинетическая схема медленных стадий фотолиза.

3.1.11. Образование метародопсина III при небольших степенях обесцвечивания родопсина.

3.2. Фоторегенерация родопсина из "индикатора желтого".,.—.

3.2.1. Фоторегенерация зрительного пигмента из Р

3.2.1.1. Временной ход фоторегенерации.

3.2.1.2. Устойчивость фоторегенерированного пигмента к гидроксиламину.

3.2.1.3. Состав фоторегенерированного пигмента.

3.2.1.4. Источники цис-хромофоров.

3.2.1.5. Состав конечной смеси продуктов после завершения фоторегенерации.

3.2.2. Фоторегенерация зрительного пигмента из "ретинального" компонента "индикатора желтого".

3.2.2.1. Временной ход фоторегенерации и состав регенерированного пигмента.

3.2.2.2. Источники образования цис-хромофоров.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Характеристика метода исследования....

4.2. Поздние стадии фотолиза родопсина в интактных палочках..—.

4.2.1. Номенклатура и характеристика поздних продуктов фотолиза.

4.2.2. Кинетическая схема медленных стадий фотолиза.

4.2.3. Роль поздних продуктов фотолиза родопсина в темновой адаптации палочек.

4.3. Стадии, лимитирующие скорость работы зрительного цикла.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Реакции зрительного цикла в палочках сетчатки амфибий"

Поглощение квантов света молекулами зрительного пигмента, находящегося в наружных сегментах фоторецепторных клеток сетчатки — палочек и колбочек - является первой стадией процесса зрительного возбуждения. Зрительные пигменты позвоночных и беспозвоночных принадлежат к семейству трансмембранных рецепторных белков, аминокислотные остатки которых образуют семь спиральных участков. К данному семейству относятся также рецепторные белки обонятельной и вкусовой систем и некоторые рецепторы гормонов и нейромедиаторов. Их общей особенностью является дальнейшая передача сигнала через ГТФ-связывающие белки.

Наиболее исследованным представителем этого семейства рецепторов является зрительный пигмент палочек - родопсин. Поглощение им кванта света вызывает немедленную изомеризацию его хромофорной группы — 11-цис ретиналя — в полностью-тяранс форму, которая инициирует серию кон-формационных изменений в белковой части молекулы (опсине), приводящих в итоге к гидролизу связи Шиффова основания ретиналя. Этот процесс получил название фотолиза. Серия быстрых стадий фотолиза, хорошо изученных как в детергентных экстрактах родопсина, так и в интактных фоторецепторах, заканчивается появлением относительно долго живущей конформации — метародопсина П, которая запускает внутриклеточный каскад фототрансдукции, в ходе которого свет, поглощенный зрительным пигментом, вызывает электрический ответ фоторецепторной клетки. За последние 20 лет механизмы работы этого каскада основательно изучены, и сейчас можно представить детальную схему процессов, связывающих поглощение кванта и генерацию физиологического ответа (Фирсов и Говардовский, 2001; Каламкаров и Островский, 2002; Pugh & Lamb, 2000; Burns & Baylor, 2001; Burns & Lamb, 2003).

Значительно меньше известно о реакциях, которые происходят после появления метародопсина II. Эти медленные стадии фотолиза играют важную роль в выключении каскада и приводят в конце концов к восстановлению исходного темнового состояния фоторецептора, что обеспечивает темновую адаптацию — процесс, в результате которого клетки восстанавливают свою чувствительность при переходе от высоких освещенностей к низким.

Известно, что метародопсин П инактивируется путем его множественного фосфорилирования родопсинкиназой и последующего связывания с аррестином всего за несколько секунд. Однако предполагается, что это не обеспечивает полного выключения каскада фототрансдукции, поскольку остаточная каталитическая активность инактивированного метародопсина II может стимулировать постоянное возбуждение каскада и тем самым понижать чувствительность фоторецептора. Следовательно, для полного выключения каскада необходим распад метародопсина II, который приводит к снижению уровня возбуждения и этим определяет временной ход темновой адаптации. Еще одним важным фактором темновой адаптации является распад следующего продукта фотолиза - метародопсина III, также обладающего некоторой каталитической активностью. Природа и свойства этого продукта до конца не выяснены и активно обсуждаются в современной литературе. Помимо устранения их каталитической активности, распад метапродуктов на полностью-транс ретиналь и опсин необходим для того, чтобы освободить хромофорное место на белке и сделать его доступным для связывания новой молекулы 11 -цис ретиналя, что обеспечивает полное восстановление темнового состояния зрительного пигмента.

Совокупность реакций, обеспечивающих регенерацию родопсина, принято называть зрительным циклом. Однако до недавнего времени стадии фотолиза рассматривались отдельно от остальных реакций цикла, приводящих непосредственно к регенерации зрительного пигмента. Лишь в последних обзорах они были включены в общую последовательность реакций зрительного цикла (Kuksa et al., 2003; Lamb & Pugh, 2004).

На конечном этапе распада метародопсинов образуется свободный оп-син и полностью-тяранс ретиналь. Свободный полностыо-транс ретиналь восстанавливается в попностью-транс ретинол в ходе ретинолдегидрогеназ-ной реакции. Образующийся ретинол связывается с транспортным белком и переносится из палочек в клетки пигментного эпителия, где он может храниться в виде ретиниловых эфиров. Затем он изомеризуется в 1 \ -цис ретинол и окисляется до 1 \-цис ретиналя с помощью специфичной к нему ретинолде-гидрогеназы. В дальнейшем 11 -цис ретиналь переносится обратно в наружные сегменты палочек и рекомбинирует с опсином, регенерируя родопсин.

Поскольку зрительный цикл представляет в основном неразветвленную последовательность реакций, он может быть прерван на любом этапе (как экспериментально, так и в реальных патологических условиях). Сейчас известен ряд наследственных или приобретенных дефектов цикла, которые приводят к нарушению темновой адаптации и являются причиной многих заболеваний сетчатки. Среди этих болезней можно выделить болезнь Штар-гардта (Weng et al., 1999), стационарную ночную слепоту (Jang et al., 2001), палочко-колбочковую дегенерацию, различные формы возрастной макуляр-ной дегенерации и, возможно, некоторые формы пигментного ретинита (Maugeri et al., 2000). Все эти сложные нарушения зрения на системном уровне могут вызываться одиночной мутацией. Следовательно, для полного понимания процессов, лежащих в основе зрительного цикла, необходимо исследовать его как в целом, так и на уровне клеток и отдельных реакций.

До последнего времени стадии зрительного цикла исследовались преимущественно in vitro — на биохимических препаратах изолированных фоторецепторных мембран, в детергентных экстрактах родопсина и с использованием выделенных ферментов. Такой аналитический подход может дать лишь ограниченную информацию о полной картине цикла, поскольку параметры отдельных реакций и возможные регуляторные механизмы могут критически зависеть от морфологической целостности клетки и нативности окружения реагирующих молекул. Таким образом, процессы, происходящие в интактных клетках, могут существенно отличаться от тех, которые исследуются в биохимических экспериментах. Следует отметить, что общим недостатком имеющихся работ, посвященных изучению медленных стадий фотолиза родопсина и реакций зрительного цикла в палочках (Donner & Reuter, 1969; Baumann, 1972; Reuter, 1973; Baumann, 1978; Donner & Hemila, 1975; Chabre & Breton, 1979), является то, что они выполнены с использованием методик, обладающих низким временным разрешением и при этом не позволяющих надежно идентифицировать все продукты.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было исследование медленных стадий фотолиза и других реакций зрительного цикла, протекающих в интактных наружных сегментах палочек сетчатки амфибий. Примененный в работе метод скоростной поляризационной микроспектрофотометрии позволил решить следующие задачи:

1. Определить природу метародопсина III и его положение в общей кинетической схеме взаимопревращений долгоживущих интермедиатов фотолиза.

2. На основе знаний структуры и взаимопревращений продуктов, образующихся в ходе медленных стадий фотолиза, оценить их возможную роль в процессе тем новой адаптации палочек амфибий.

3. Выяснить, может ли какая-либо из реакций зрительного цикла, происходящих в наружном сегменте палочки (распад метапродуктов, образование полностъю-транс ретинола и рекомбинация 11 -цис ретиналя с опсином), лимитировать скорость работы цикла в нормальных условиях.

Научная новизна результатов исследования

Применение скоростной поляризационной микроспектрофотометрии впервые позволило надежно идентифицировать все долгоживущие продукты фотолиза в интактных палочках, определить природу этих продуктов и установить кинетическую схему взаимопревращений между ними.

Оказалось, что в состоянии метародопсина III хромофорный центр оп-сина по-прежнему занят полностью-шранс ретиналем, в отличие от спектрально неотличимого от него в предыдущих исследованиях продукта (Р-440), представляющего собой протонированную форму Шиффовых оснований уже освобожденного ретиналя с различными неспецифическими сайтами * фоторецепторной мембраны.

В работе впервые удалось сопоставить временной ход распада метаро-допсинов с кинетикой затухания "эквивалентного фонового света", вызывающего десенситизацию палочек. На основе этого был сделан вывод о том, что по крайней мере при низких уровнях обесцвечивания родопсина распад метапродуктов может являться фактором, контролирующим процесс темно-вой адаптации палочек.

Исследование кинетики распада метародопсинов, образования ретинола и рекомбинации 11 -цис ретиналя с опсином, т.е. стадий зрительного цикла, протекающих в наружных сегментах палочек, позволило установить, что при высоких уровнях освещенности все они не являются лимитирующими в работе цикла в нормальных условиях, поскольку происходят в несколько раз быстрее, чем регенерация пигмента в интактном глазу.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В процессе фотолиза родопсина в интактных палочках происходит параллельный распад метародопсинов II и III на полностью-трянс ретиналь и опсин. При этом хромофорный центр белка становится доступным для последующей регенерации пигмента с \ \-цис ретиналем.

3. Именно распад метапродуктов, а не активность ретинолдегидрогена-зы, определяет скорость образования ретинола в наружном сегменте.

5. В нормальных условиях скорость работы зрительного цикла палочек при высоких уровнях обесцвечивания определяется какой-то стадией (стадиями), протекающей за пределами наружного сегмента — при транспорте ретиноидов через межфоторецепторное пространство или ферментативном ресинтезе 11 -цис ретиналя в пигментном эпителии.

Теоретическая и практическая значимость работы

Подробное исследование медленных стадий фотолиза, проведенное в данной работе, позволило приблизиться к пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе процесса темновой адаптации фоторецепторов -восстановления их абсолютной чувствительности после освещения.

Следует отметить, что результаты исследований, полученные на палочках амфибий, могут быть справедливы и для палочек млекопитающих, включая палочки человека, поскольку в настоящее время предполагается, что процесс фотолиза родопсина у холоднокровных и теплокровных позвоночных во многом сходен (Hofmann, 2000; De Grip & Rothschild, 2000). Они также могут оказаться полезными при изучении других клеточных сигнальных систем, о которых известно значительно меньше, чем о передаче сигнала при зрительном возбуждении.

Кроме того, в результате работы был сделан шаг к выяснению вопроса о том, где лежит лимитирующая стадия (стадии) зрительного цикла позвоночных в нормальных условиях. Полученные данные необходимы для дальнейшего изучения механизмов функционирования зрительного цикла при различных заболеваниях сетчатки, связанных с нарушениями темновой адаптации.

Апробация работы и публикации результатов исследования

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на следующих научных конференциях:

V Всероссийской медико-биологической конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2002);

VI Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2002);

II Международном симпозиуме "Visionarium II" (Твярминне, Финляндия, 2003);

III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004);

XVI Международном конгрессе по исследованию зрения (ICER) (Сидней, Австралия, 2004);

III Международном симпозиуме "Visionarium III" (Твярминне, Финляндия, 2004).

По материалам диссертации опубликовано 6 тезисов докладов на российских и международных конференциях и 3 научные статьи в рецензируемых журналах, 2 из которых - в международных. Еще одна статья подготовлена к публикации, также в международном журнале.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Колесников, Александр Викторович

выводы

1. В интактных палочках амфибий существует рН-зависимое обратимое равновесие между метародопсинами I и II. Переход метародопсина II в метародопсин III также обратим.

2. Хромофорная группа в метародопсине III, как и в темновом родопсине и в метародопсине П, ориентирована преимущественно параллельно плоскости фоторецепторной мембраны.

3. Кинетика распада метародопсинов не зависит от наличия или отсутствия дальнейшего восстановления ретиналя в ретинол. В совокупности с пунктами 1 и 2 это означает, что в метародопсине III хромофор остается ковалентно связанным с исходным местом на молекуле опсина — остатком лизина-296.

4. В процессе фотолиза происходит параллельный распад метародопсинов II и Ш на потюстыо-транс ретиналь и опсин. При этом доля ретиналя, образующегося из метародопсина III, у трех исследованных видов амфибий составляет 25—50%.

5. Ретиналь, освободившийся в результате распада метародопсинов II и III, находится в обратимом рН-зависимом равновесии с продуктами своего неспецифического связывания с аминогруппами белков и фосфатидилэтаноламинов фоторецепторной мембраны. Совокупность этих продуктов и свободного ретиналя составляет "индикатор желтый".

6. Ретиналь в "индикаторе желтом" ориентирован преимущественно поперек плоскости мембраны дисков. Это означает, что протонированная форма Шиффовых оснований ретиналя (Р-440) и метародопсин III являются совершенно разными продуктами фотолиза, хотя и обладают сходными спектрами поглощения.

7. Метародопсин III образуется даже при низких (до 3—4%) уровнях обесцвечивания родопсина. При этом временной ход распада всех метапро-дуктов, включая метародопсин III, хорошо коррелирует с временным ходом затухания "эквивалентного фонового света". Следовательно, распад метародопсинов может быть фактором, контролирующим темновую адаптацию палочек, по крайней мере при обесцвечивании нескольких процентов родопсина.

8. При высоких уровнях обесцвечивания родопсина распад метапродук-тов в палочках амфибий происходит намного быстрее, чем регенерация пигмента в интактном глазу, и, следовательно, не является лимитирующим этапом в зрительном цикле. Однако именно он, а не ретинолдегидрогеназная реакция, лимитирует скорость образования полностью-транс ретинола в наружном сегменте, который далее служит субстратом для ресинтеза 11 -цис ретиналя в клетках пигментного эпителия.

9. Скорость зрительного цикла также не лимитируется скоростью реакции рекомбинации 11 -цис ретиналя с опсином, исследованной с помощью фоторегенерации зрительного пигмента из "индикатора желтого".

10. Таким образом, в нормальных условиях скорость темновой адаптации палочек после интенсивных засветок определяется реакциями зрительного цикла, протекающими за пределами наружного сегмента — либо на этапах доставки ретиноидов в клетки пигментного эпителия и из них, либо на этапах процессинга ретиноидов внутри пигментного эпителия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колесников, Александр Викторович, Санкт-Петербург

1. Говардовский В.И. Фоторецепторы и зрительные пигменты сетчатки позвоночных: сравнительный и эволюционный аспект // Руководство по физиологии. Эволюционная физиология. — JL: Наука. 1983. - Ч. 2. - С. 229-261.

2. Говардовский В.И., Зуева JI.B. Скоростной микроспектрофотометр для исследования фотолиза зрительных пигментов in situ // Сенсорные Системы. 2000. - Т.14. - С. 288-296.

3. Каламкаров Г.Р., Островский М.А. Молекулярные механизмы зрительной рецепции // М.: Наука. 2002. - С. 279.

4. Кронгауз В.А., Федорович И.Б., Шифрина P.P., Островский М.А. Фотохромия зрительных пигментов. 1. Образование изохромных продуктов при обратимых превращениях родопсина лягушки // Биофизика. 1975. - Т. 20. -С. 219-224.

5. Овчинников Ю.А., Абдуллаев Н.Г., Фейгина Н.Ю., Артамонов И.Д., Золотарев А.С. Полная аминокислотная последовательность зрительного родопсина// Биоорганическая Химия. 1982. - Т. 8. - С. 1224-1227.

6. Омельяненко В.Г., Михайлов А.И., Каламкаров Г.Р., Островский М.А., Гольданский В.И. Исследование динамических характеристик фоторецепторной мембраны рекомбинационно-кинетическим методом // ДАН СССР. 1977. - Т. 273. - С. 1498-1501.

7. Островский М.А., Говардовский В.И. Механизмы фоторецепции позвоночных // Руководство по физиологии. Физиология зрения. М.: Наука. -1992.-С. 5-58.

8. Фельдман Т.Б., Федорович И.Б., Островский М.А. Особенности фотопревращения родопсина на ранних стадиях фотолиза // Российский Физиологический Журнал им. И.М. Сеченова. 2003. - Т. 89. - С. 113-122.

9. Фирсов M.JL, Говардовский В.И. Световая адаптация фоторецепторов: смысл и механизмы // Сенсорные Системы. 2001. - Т. 15. - С. 102-115.

10. Хартридж Г. Современные успехи физиологии зрения // М.: Издательство иностранной литературы. 1952.

11. Шуколюков С.А. Ключевые реакции зрительного цикла позвоночных и беспозвоночных: активация и регенерация родопсина // Журнал Эволюционной Биохимии и Физиологии. 1999. - Т. 35. - С. 441-452.

12. Amis S., Fahmy К., Hofmann К.Р., Sakmar Т.Р. A conserved carboxylic acid group mediates light-dependent proton uptake and signaling by rhodopsin // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 23879-23881.

13. Amis S., Hofmann K.P. Two different forms of metarhodopsin II: Schiff base deprotonation precedes proton uptake and signaling state // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 7849-7853.

14. Arshavsky V.Y., Lamb T.D., Pugh E.N. Jr. G proteins and phototransduc-tion // Review. Ann. Rev. Physiol. - 2002. - V. 64. - P. 153-187.

15. Azuma K., Azuma M., Sickel W. Regeneration of rhodopsin in frog rod outer segments // Journal of Physiology. 1972. - V. 271. - P. 747-759.

16. Bartl F.J., Ritter E., Hofmann K.P. Signaling states of rhodopsin: absorption of light in active metarhodopsin II generates an all-trans retinal bound inactive state // Journal of Biological Chemistry. 2001. - V. 276. - P. 30161-30166.

17. Baumann C. Flash photolysis of rhodopsin in the isolated frog retina // Vision Research. 1970. - V. 10. - P. 789-798.

18. Baumann C. Kinetics of slow thermal reactions during the bleaching of rhodopsin in the perfused frog retina II Journal of Physiology. 1972. - V. 222. -P. 643-663.

19. Baumann C. The equilibrium between metarhodopsin I and metarhodopsin II in the isolated frog retina // Journal of Physiology. 1978. - V. 279. - P. 71-80.

20. Baumann C., Bender S. Kinetics of rhodopsin bleaching in the isolated human retina // Journal of Physiology. 1973. - V. 235. - P. 761-773.

21. Baumann C., Zeppenfeld W. Effect of pH on the formation and decay of the metarhodopsins of the frog // Journal of Physiology. 1981. - V. 317. - P. 347-364.

22. Becker R.S. The visual process: photophysics and photoisomerization of model visual pigments and the primary reaction // Review. Photochem. Photo-biol. - 1988. - V. 48. - P. 369-399.

23. Bonting S.L., Rotmans J.P., Daemen F.J.M. Chromophore migration after illumination of rhodopsin // In Biochemistry and Physiology of Visual Pigments, ed. Langer H. Berlin: Springer. - 1973. - P. 39-44.

24. Borggreven J.M., Daemen F.J., Bonting S.L. Biochemical aspects of the visual process. VI. The lipid composition of native and hexane-extracted cattle rod outer segments // Biochim. Biophys. Acta. 1970. - V. 202. - P. 374-381.

25. Bowmaker J.K. The photoproducts of retinal-based visual pigments in situ: a contrast between Rana pipiens and Gecko gecko II Vision Research. — 1973. -V. 13.-P. 1227-1240.

26. Bridges C.D.B. Studies on the flash photolysis of visual pigments. IV. Dark reactions following the flash-irradiation of frog rhodopsin in suspensions of isolated photoreceptors // Vision Research. 1962. - V. 2. - P. 215-232.

27. Briggs C.E, Rucinski D., Rosenfeld P.J., Hirose Т., Berson E.L., Dryja T.P. Mutations in ABCR (ABCA4) in patients with Stargardt macular degeneration or cone-rod degeneration // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001. - V. 42. - P. 2229-2236.

28. Brin K.P., Ripps H. Rhodopsin photoproducts and rod sensitivity in skate retina // Journal of General Physiology. 1977. - V. 69. - P. 97-120.

29. Brown P.K. Rhodopsin rotates in the visual receptor membrane // Nature- New Biology. 1972. - V. 236. - P. 35-38.

30. Burns M.E., Baylor D.A. Activation, deactivation and adaptation in vertebrate photoreceptor cells // Ann. Rev. Neurosci. 2001. - V. 24. - P. 779-805.

31. Burns M.E., Lamb T.D. Visual transduction by rod and cone photoreceptors // In The Visual Neurosciences, eds. Chalupa L.M., Werner L.S. Cambridge, MA: MIT Press. - 2003. - Chapter 16. - P. 215-233.

32. Burstedt M.S.I., Sandgren O., Holmgren G., Forsman-Semb K. Bothnia dystrophy caused by mutations in the cellular retinaldehyde-binding protein gene (RLBP1) on chromosome 15q26 // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1999. - V. 40. -P. 995-1000.

33. Calvert P.D., Govardovskii V.I., Arshavsky V.Y., Makino C.L. Two temporal phases of light adaptation in retinal rods // J. Gen. Physiol. 2002. - V. 119.- P. 129-145.

34. Calvert P.D., Govardovskii V.I., Krasnoperova N., Anderson R.E., Lem J., Makino C.L. Membrane protein diffusion sets the speed of rod phototransduc-tion // Nature. 2001. - V. 411. - P. 90-94.

35. Chabre M., Breton J. The orientation of the chromophore of vertebrate rhodopsin in the "meta" intermediate states and the reversibility of the meta II -meta П1 transition // Vision Research. 1979. - V. 19. - P. 1005-1018.

36. Chen J., Makino C.L., Peachey N.S., Baylor D.A., Simon M.I. Mechanisms of rhodopsin inactivation in vivo as revealed by a COOH-terminal truncation mutant // Science. 1995. - V.267. - P. 374-377.

37. Chen Y., Noy N. Retinoid specificity of interphotoreceptor retinoid-binding protein // Biochemistry. 1994. - V. 33. - P. 10658-10665.

38. Cone RA. Rotational diffusion of rhodopsin in the visual receptor membrane // Nat. New. Biol. 1972. - V. 236. - P. 39-43.

39. Cooper A. Energy uptake in the first step of visual excitation // Nature. -1979. V. 282. - P. 531-533.

40. Cooper A., Converse C.A. Energetics of primary processes in visula excitation: photocalorimetry of rhodopsin in rod outer segment membranes // Biochemistry. 1976. - V. 15. - P. 2970-2978.

41. Daemen F.J. Vertebrate rod outer segment membranes // Review. Bio-chim. Biophys. Acta. - 1973. - V. 300. - P. 255-288.

42. Dartnall HJ.A. The visual pigments. Chapter II: The visual pigments and their photoproducts // London: Methuen & Co. 1957. - P. 25-59.

43. De Grip W.J., Daemen F.J., Bonting S.L. Enrichment of rhodopsin in rod outer segment membrane preparations. Biochemical aspects of the visual process // Vision Research. 1972. - V. 12. - P. 1697-1707.

44. De Grip W.J., Rotschild K.J. Structure and mechanisms of vertebrate visual pigments // In Handbook of Biological Physics, eds. Stavenga D.G., De Grip

45. W.J., Pugh E.N. Jr. Elsevier Science B.V. - 2000. - V. 3. - Chapter 1. - P. 1-54.

46. De Pont J.J., Daemen F.J., Bonting S.L. Biochemical aspects of the visual process. 8. Enzymatic conversion of retinylidene imines by retinoldehydrogenase from rod outer segments // Arch. Biochem. Biophys. 1970. - V. 140. - P. 275-285.

47. Denton E.J. The contribution of orientated photosensitive and other molecules to the absorption of whole retina // Proceedings of the Royal Society B. -1959.-V. 150.-P. 78-94.

48. Donner K.O. Rod dark-adaptation and visual pigment photoproducts // In Biochemistry and Physiology of Visual Pigments, ed. Langer H. Berlin: Springer. - 1973. - P. 205-209.

49. Donner K.O., Hemila S. Dark-adaptation of the aspartate-isolated receptor potential of the frog retina: threshold measurements // Journal of Physiology. -1979.-V. 287.-P. 93-106.

50. Donner K.O., Hemila S. Kinetics of long-lived rhodopsin photoproducts in the frog retina as a function of the amount bleached // Vision Research. 1975. -V. 15.-P. 985-995.

51. Donner K.O., Reuter T. Dark-adaptation processes in the rhodopsin rods of the frog's retina // Vision Research. 1967. - V. 7. - P. 17-41.

52. Donner K.O., Reuter T. The photoproducts of rhodopsin in the isolated retina of the frog // Vision Research. 1969. - V. 9. - P. 815-847.

53. Doukas A.G., Junnarkar M.R., Alfano R.R., Callender R.H., Kakitani Т., Honig B. Fluorescence quantum yield of visual pigments: evidence for subpico-second isomerization rates // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V. 81. - P. 4790-4794.

54. Ebrey T.G., Yoshizawa T. The circular dichroism of rhodopsin and lumir-hodopsin // Experimental Eye Research. 1973. - V. 17. - P. 545-556.

55. Edwards R.B., Adler A.J. Exchange of retinol between IRBP and CRBP И Experimental Eye Research. 1994. - V. 59. - P. 161-170.

56. Einterz C.M., Hug S.J., Lewis J.W., Kliger D.S. Early photolysis intermediates of the artificial visual pigment 13-demethylrhodopsin // Biochemistry. 1990. - V. 29. - P. 1485-1491.

57. Ernst W., Kemp C.M. Studies on the effects of bleaching amphibian rod pigments in situ. HI. Linear dichroism in axolotl red rods before and during bleaching // Experimental Eye Research. 1978. - V. 27. - P. 101-116.

58. Ernst W., Kemp C.M., White H.A. Studies of the effects of bleaching amphibian rod pigments in situ. II. The kinetics of slow bleaching reactions in axolotl red rods // Experimental Eye Research. 1978. - V. 26. - P. 337-350.

59. Fahmy K., Siebert F., Sakmar T.P. Photoactivated state of rhodopsin and how it can form //Review. Biophys. Chem. - 1995. -V. 56. -P. 171-181.

60. Fain G.L., Matthews H.R., Cornwall M.C., Koutalos Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors // Physiological Review. 2001. -V. 81.-P. 117-151.

61. Fesenko E.E., Kolesnikov S.S., Lyubarsky A.L. Induction by cyclic GMP of cationic conductance in plasma membrane of retinal rod outer segment // Nature. 1985. - V. 313. - P. 310-313.

62. Filipek S., Stenkamp R.E., Teller D.C., Palczewski K. G protein-coupled receptor rhodopsin: a prospectus // Review. Ann. Rev. Physiol. - 2003. — V. 65. -P. 851-879.

63. Firsov M.L., Donner K., Govardovskii V.I. pH and rate of "dark" events in toad retinal rods: test of a hypothesis on the molecular origin of photoreceptor noise // Journal of Physiology. 2002. - V. 539. - P. 837-846.

64. Firsov M.L., Kolesnikov A.V., Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. Two realms of dark adaptation // Vision Research. 2005. - V. 45. - P. 147-151.

65. Frank R.N. Photoproducts of rhodopsin bleaching in the isolated, perfused frog retina // Vision Research. 1969. - V. 9. - P. 1415-1433.

66. Futtennan S., Hendrickson A., Bishop P.E., Rollins M.H., Vacano E. Metabolism of glucose and reduction of retinaldehyde in retinal photoreceptors // J. Neurochem. 1970. - V. 17. - P. 149-156.

67. Gollapalli D.R., Maiti P., Rando R.R. RPE65 operates in the vertebrate visual cycle by stereospecifically binding all-trans retinyl esters // Biochemistry. -2003. -V. 42. -P. 11824-11830.

68. Gonzalez-Fernandez F. Evolution of the visual cycle: the role of retinoid-binding proteins // J. Endocrinol. 2002. - V. 175. - P. 75-88.

69. Gorodovikova E.N., Gimelbrant A.A., Senin I.I., Philippov P.P. Recov-erin mediates the calcium effect upon rhodopsin phosphorylation and cGMP hydrolysis in bovine retina rod cells // FEBS Letters. 1994. - V. 349. - P. 187-190.

70. Govardovskii V.I., Fyhrquist N., Reuter Т., Kuzmin D.G., Donner K. In search of the visual pigment template // Visual Neuroscience. 2000. - V. 17. - P. 509-528.

71. Grabowski S.R., Рак W.L. Intracellular recordings of rod responses during dark adaptation // Journal of Physiology. 1975. - V. 247. - P. 363-391.

72. Grabowski S.R., Pinto L.H., Рак W.L Adaptation in retinal rods of axo-lotl: intracellular recordings // Science. 1972. - V. 176. - P. 1240-1243.

73. Gribakin F.G., Govardovskii V.I. The role of the photoreceptor membrane in photoreceptor optics // In Photoreceptor optics, eds. Snyder A.W., Menzel R. -Berlin-Heidelberg-New York: Springer-Verlag. 1975. - P. 526.

74. Gyllenberg G., Reuter Т., Sippel H. Long-lived photoproducts of rhodopsin in the retina of the frog // Vision Research. 1974. - V. 14. - P. 1349-1357.

75. Hargrave P.A, McDowell J.H., Curtis D.R., Wang J.K., Juszczak E., Fong S.L., Rao J.K., Argos P. The structure of bovine rhodopsin // Biophys. Struct. Mech. 1983. - V. 9. - P. 235-244.

76. Harosi F.I. Absorption spectra and linear dichroism of some amphibian photoreceptors // Journal of General Physiology. 1975. - V. 66. - P. 357-382.

77. H&rosi F.I., MacNichol E.F. Jr. Dichroic microspectrophotometer: a computer-assisted, rapid, wavelength-scanning photometer for measuring linear dichroism in single cells // Journal of the Optical Society of America. 1974. - V. 64.-P. 903-918.

78. Harosi F.I., Malerba F.E. Plane-polarized light in microspectrophotometry // Vision Research. 1975. - V. 15. - P. 379-388.

79. He W., Cowan C.W., Wensel T.G. RGS9, a GTPase accelerator for photo-transduction // Neuron. 1998. - V. 20. - P. 95-102.

80. Hecht S., Schlaer S., Pirenne M.H. Energy, quanta, and vision // J. Gen. Physiol. 1942. - V. 25. - P. 819-840.

81. Heck M., Schadel S.A., Maretzki D., Hofinann K.P. Secondary binding sites of retinoids in opsin: characterization and role in regeneration // Vision Research. 20036. - V. 43. - P. 3003-3010.

82. Henselman R.A., Cusanovich M.A. Characterization of the recombination reaction of rhodopsin // Biochemistry. 1976. - V. 15. - P. 5321-5325.

83. Hodgkin A.L., McNaughton P.A., Nunn B.J. Measurement of sodium-calcium exchange in salamander rods // Journal of Physiology. 1987. - V. 391. -P. 347-370.

84. Hofinann K.P. Late photoproducts and signaling states of bovine rhodopsin // In Handbook of Biological Physics, eds. Stavenga D.G., De Grip W.J., Pugh, E.N. Jr. Elsevier Science B.V. - 2000. - V. 3. - Chapter 3. - P. 91-142.

85. Hofinann K.P. Photoproducts of rhodopsin in the disk membrane // Photobiochemistry and Photobiophysics. 1986. - V.l 3. - P. 309-327.

86. Hofinann K.P., Jager S., Ernst O.P. Structure and function of activated rhodopsin // Israel Journal of Chemistry. 1995. - V. 35. - P. 339-355.

87. Hofinann K.P., Pulvermiiller A., Buczylko J., Van Hooser P., Palczewski K. The role of arrestin and retinoids in the regeneration pathway of rhodopsin // Journal of Biological Chemistiy. 1992. - V. 267. - P. 15701-15706.

88. Hsu Y.T., Molday R.S. Modulation of the cGMP-gated channel of rod photoreceptor cells by calmodulin // Nature. 1993. - V. 361. - P. 76—79.

89. Huang В., Karwoski C.J. Light-evoked expansion of subretinal space volume in the retina of the frog // Journal of Neuroscience. 1992. - V. 12. - P. 4243-4252.

90. Hubbard R. Geometrical isomerization of vitamin A, retiene and retiene oxime // J. Amer. Chem. Soc. 1956. - V. 78. - P. 4662-4667.

91. Hubbard R., Brown P.K., Bownds D. Methodology of vitamin A and visual pigments II Methods Enzymol. 1971. - V. 18. - P. 615-653.

92. Hug S.J., Lewis J.W., Einterz C.M., Thorgeirsson Т.Е., Kliger D.S. Nanosecond photolysis of rhodopsin: evidence for a new, blue-shifted intermediate // Biochemistry. 1990. - V. 29. - P. 1475-1485.

93. Isono K., Tanimura Т., Oda Y., Tsukahara Y. Dependency on light and vitamin A derivatives of the biogenesis of 3-hydroxyretinal and visual pigment in the compound eyes of Drosophila melanogaster II J. Gen. Physiol. 1988. — V. 92.-P. 587-600.

94. Jager F., Fahmy K., Sakmar T.P., Siebert F. Identification of glutamic acid 113 as the Schiff base proton acceptor in the metarhodopsin II photointerme-diate of rhodopsin// Biochemistry. 1994. - V. 33. - P. 10878-10882.

95. Kandori H., Shichida Y., Yoshizawa T. Absolute absorption spectra of ba-tho- and photorhodopsins at room temperature. Picosecond laser photolysis of rhodopsin in polyacrylamide // Biophys. J. 1989. - V. 56. - P. 453-457.

96. Kawamura S. Rhodopsin phosphorylation as a mechanism of cyclic GMP phosphodiesterase regulation by S-modulin // Nature. 1993. - V. 362. - P. 855-857.

97. Kennedy M.J., Lee K.A., Niemi G.A., Craven K.B., Garwin G.G., Saari J.C., Hurley J.B. Multiple phosphorylation of rhodopsin and the in vivo chemistryunderlying rod photoreceptor dark adaptation // Neuron. 2001. - V. 31. - P. 87-101.

98. Kito Y., Seki Т., Suzuki Т., Uchiyama I. 3-Dehydroretinal in the eye of a bioluminescent squid Watasenia scintillans II Vision Research. 1986. — V. 26. -P. 275-279.

99. Klenchin V.A., Calvert P.D., Bownds M.D. Inhibition of rhodopsin kinase by recoverin. Further evidence for a negative feedback system in photo-transduction // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 16147-16152.

100. Kliger D.S., Lewis J.W. Spectral and kinetic characterization of visual pigment photointermediates // Israel Journal of Chemistry. 1995. - V. 35. - P. 289-307.

101. Knowles A., Dartnall H.J.A. The photobiology of vision // In The Eye, ed. Davson H. London-New York: Academic Press. - 1977. - V. 2B. - P. 53-101.

102. Kochendoerfer G.G., Lin S.W., Sakmar T.P., Mathies R.A. How color visual pigments are tuned // Review. Trends in Biochem. Sci. - 1999. - V. 24. -P. 300-305.

103. Kropf A. The structure and reactions of visual pigments // In Handbook of Sensory Physiology. Physiology of Photoreceptor Organs, ed. Fuortes M.G.F. -New York-Heidelberg-London: Springer. 1972. - V. 7/2. - P. 239-278.

104. Kuhn H., Bennett N., Michel-Villaz M., Chabre M. Interactions between photoexcited rhodopsin and GTP-binding protein: kinetic and stoichiometric analyses from light-scattering changes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - V. 78.-P. 6873-6877.

105. Kuksa V., Imanishi Y., Batten M., Palczewski K., Moise A.R. Retinoid cycle in the vertebrate retina: experimental approaches and mechanisms of isom-erization. // Vision Research. 2003. - V. 43. - P. 2959-2981.

106. Lagnado L., Cervetto L., McNaughton P.A. Calcium homeostasis in the outer segments of retinal rods from the tiger salamander // Journal of Physiology. -1992.-V. 455.-P. 111-142.

107. Lamb T.D. The involvement of rod photoreceptors in dark adaptation // Vision Research. 1981. - V. 21. - P. 1771-1782.

108. Lamb T.D., Pugh E.N. Jr. Dark adaptation and the retinoid cycle of vision // Progress in Retinal and Eye Research. 2004. - V. 23. - P. 307-380.

109. Leibrock C.S., Lamb T.D. Effect of hydroxylamine on photon-like events during dark adaptation in toad rod photoreceptors // Journal of Physiology. 1997. - V. 501. - P. 97-109.

110. Leibrock C.S., Reuter Т., Lamb T.D. Dark adaptation of toad rod photoreceptors following small bleaches // Vision Research. 1994. - V. 34. — P. 2787-2800.

111. Leibrock C.S., Reuter Т., Lamb T.D. Molecular basis of dark adaptation in rod photoreceptors // Eye. 1998. - V. 12. - P. 511-520.

112. Lewis J.W., Kliger D.S. Photointermediates of visual pigments // Review. J. Bioenerg. Biomembr. - 1992. - V. 24. - P. 201-210.

113. Lewis J.W., Liang J., Ebrey T.G., Sheves M., Livnah N., Kuwata O., Jager S., Kliger D.S. Early photolysis intermediates of gecko and bovine artificial visual pigments // Biochemistry. 1997a. - V. 36. - P. 14593-14600.

114. Lewis J.W., Van Kuijk F.J.G.M., Carruthers J.A., Kliger D.S. Metar-hodopsin III formation and decay kinetics: comparison of human and bovine rhodopsin // Vision Research. 1997b. - V. 37. - P. 1-8.

115. Li J-D., Gallemore R.P., Dmitriev A.V., Steinberg R.H. Light-dependent hydration of the space surrounding photoreceptors in chick retina // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 1994a. - V. 35. - P. 2700-2711.

116. Li J-D., Govardovskii V.I., Steinberg R.H. Light-dependent hydration of the space surrounding photoreceptors in the cat retina // Visual Neuroscience. -1994b. V. 11. - P. 743-752.

117. Liebman P. A. Microspectrophotometry of photoreceptors // Handbook of Sensory Physiology. Photochemistry of Vision, ed. Dartnall H.J.A. Berlin-Heidelberg-New York: Springer-Verlag. -1972. - V. 7/1. - P. 481-528.

118. Lin S.W., Sakmar T.P. Colour tuning mechanisms of visual pigments // Review. -Novartis Found Symp. 1999. - V. 224. - P. 124-135.

119. Liou G.I., Geng L., Baehr W. Interphotoreceptor retinoid-binding protein: biochemistry and molecular biology // Prog. Clin. Biol. Res. 1991. - V. 362. P. 115-137.

120. Lolley R.N., Racz E. Calcium modulation of cyclic GMP synthesis in rat visual cells // Vision Research. 1982. - V. 22. - P. 1481-1486.

121. Lythgoe R.G., Quilliam J.P. The relation of transient orange to visual purple and indicator yellow // Journal of Physiology. 1938. - V. 93. — P. 399-410.

122. Mathies RA., Lugtenburg J. The primary photoreaction of rhodopsin // In Handbook of Biological Physics, eds. Stavenga D.G., De Grip W.J., Pugh, E.N. Jr. Elsevier Science B.V. - V. 3. - Chapter 2. - 2000. - P. 55-90.

123. Matthews H.R., Murphy RL., Fain G.L., Lamb T.D. Photoreceptor light adaptation is mediated by cytoplasmic calcium concentration // Nature. — 1988. — V. 334.-P. 67-69.

124. Matthews R.G., Hubbard R., Brown P.K., Wald G. Tautomeric forms of metarhodopsin // Journal of General Physiology. 1963. - V. 47. - P. 215-240.

125. McBee J.K., Palczewski K., Baehr W., Pepperberg D.R. Confronting complexity: the interlink of phototransduction and retinoid metabolism in the vertebrate retina // Prog. Retinal Eye Res. 2001. - V. 20. - P. 469-529.

126. Mendez A., Burns M.E., Roca A., Lem J., Wu L.W., Simon M.I., Baylor D.A., Chen J. Rapid and reproducible deactivation of rhodopsin requires multiple phosphorylation sites //Neuron. 2000. - V. 28. - P. 153-164.

127. Nakatani K., Yau K.W. Calcium and light adaptation in retinal rods and cones // Nature. 1988. - V. 334. - P. 69-71.

128. Nathans J. The evolution and physiology of human color vision: insights from molecular genetic studies of visual pigments // Neuron. 1999. - V. 24. - P. 299-312.

129. Okada Т., Palczewski K. Crystal structure of rhodopsin: implications for vision and beyond // Review. Curr. Opin. Struct. Biol. - 2001. - V. 11. - P. 420-426.

130. Ono Т., Shichida Y., Yoshizawa T. Low temperature spectrophotometric study of cattle bathorhodopsins produced from rhodopsin and isorhodopsin in transparent medium without cracks // Photochem. Photobiol. 1986. - V. 43. - P. 285-289.

131. Ostroy S.E., Erhardt F., Abrahamson E.W. Protein configuration changes in the photolysis of rhodopsin. II. The sequence of intermediates in thermal decay of cattle metarhodopsin in vitro II Biochemica and Biophysica Acta. 1966. - V. 112.-P. 265-277.

132. Palczewski K., Jager S., Buczylko J., Crouch R.K., Bredberg D.L., Hof-mann K.P., Asson-Batres M.A., Saari J.C. Rod outer segment retinol dehydrogenase: substrate specificity and role in phototransduction // Biochemistry. 1994. -V. 33.-P. 13741-13750.

133. Palczewski K., Kumasaka Т., Hon Т., Behnke C.A., Motoshima H., Fox B.A., Le Trong I., Teller D.C., Okada Т., Stenkamp R.E., Yamamoto M., Miyano M. Crystal structure of rhodopsin: a G protein-coupled receptor // Science. 2000. - V. 289. - P. 739-745.

134. Pellicone C., Nullans G., Virmaux N. Localization of light-induced conformational changes in bovine rhodopsin // FEBS Letters. 1985. - V. 181. - P. 179-183.

135. Poo M, Cone R.A. Lateral diffusion of rhodopsin in the photoreceptor membrane // Nature. 1974. - V. 247. - P. 438-441.

136. Protasova T.B., Fedorovich I.B., Ostrovsky M.A. Retinal isomers in photo- and electro-induced rhodopsin intermediates // Light in Biol, and Med. — 1991.-V. 2.-P. 545-556.

137. Rando R.R. The biochemistry of the visual cycle // Chem. Rev. 2001. -V. 101.-P. 1881-1896.

138. Reuter T. 1964. Kinetics of rhodopsin regeneration in the eye of the frog // Nature. 1964. - V. 202. - P. 1119-1120.

139. Reuter T. Long-lived photoproducts in the retina of the frog and the crucian carp // In Biochemistry and Physiology of Visual Pigments, ed. Langer H. -Berlin: Springer. 1973. - P. 83-88.

140. Reuter T. Photoregeneration of rhodopsin and isorhodopsin from metarhodopsin III in the frog retina // Vision Research. 1976. - V. 16. - P. 909-917.

141. Reuter Т., Donner K.O. Observations on metarhodopsin I and II in the retina of the frog // Experimental Eye Research. 1969. - V. 8. - P. 245.

142. Rodieck R.W. The First steps in seeing // Sunderland, MA: Sinaeur Associates, Inc. Publishers. 1998.

143. Rotmans J.P., Daemen F.J., Bonting S.L. Biochemical aspects of the visual process. XIX. Formation of isorhodopsin from photolyzed rhodopsin by bacterial action // Biochimica and Biophysica Acta. 1974. - V. 267. - P. 583587.

144. Saari J.C., Garwin G.G., Van Hooser J.P., Palczewski K. Reduction of all-trans retinal limits regeneration of visual pigment in mice // Vision Research. — 1998. V. 38. - P. 1325-1333.

145. Sagoo M.S., Lagnado L. The action of cytoplasmic calcium on the cGMP-activated channel in salamander rod photoreceptors // Journal of Physiology. 1996. - V. 497. - P. 309-319.

146. Sakmar T.P. Rhodopsin: a prototypical G protein-coupled receptor // Review. Prog. Nucleic. Acid. Res. Mol. Biol. - 1998. - V. 59. - P. 1-34.

147. Sasaki N., Tokunaga F., Yoshizawa T. The formation of two forms of bathorhodopsin and their optical properties // Photochem. Photobiol. 1980. - V. 32.-P. 433—441.

148. Schadel S.A., Heck, M., Maretzki D., Filipek S., Teller D.C., Palczewski K., Hofmann K.P. Ligand channeling with a G protein-coupled receptor // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 24896-24903.

149. Schoenlein R.W., Peteanu L.A., Mathies R.A., Shank C.V. The first step in vision: femtosecond isomerization of rhodopsin // Science. 1991. - V. 254. — P. 412-415.

150. Shichida Y., Kropf A., Yoshizawa T. Photochemical reactions of 13-demethyl visual pigment analogues at low temperatures // Biochemistry. 1981. — V. 20.-P. 1962-1968.

151. Skiba N.P., Hopp J.A., Arshavsky V.Y. The effector enzyme regulates the duration of G protein signaling in vertebrate photoreceptors by increasing theaffinity between transducin and RGS protein // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. -P. 32716-32720.

152. Sun H., Molday R.S., Nathans J. Retinal stimulates ATP hydrolysis by purified and reconstituted ABCR, the photoreceptor-specific ATP-binding cassette transporter responsible for Stargardt disease // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. -P. 8269-8281.

153. Szundi I., Lewis J.W., Van Kuijk F.J.G.M., Kliger D.S. Effect of NADPH on formation and decay of human metarhodopsin III at physiological temperatures // Vision Research. 2000. - V. 40. - P. 3039-3048.

154. Tachibanaki S., Imai H., Mizukami Т., Okada Т., Imamoto Y., Matsuda Т., Fukada Y., Terakita A., Shichida Y. Presence of two rhodopsin intermediates responsible for transducin activation // Biochemistry. — 1997. V. 36. - P. 14173— 14180.

155. Thompson D.A., Gal A. Vitamin A metabolism in the retinal pigment epithelium: genes, mutations and diseases // Progress in Retinal and Eye Research.- 2003. V. 22. - P. 683-703.

156. Thorgeirsson Т.Е., Lewis J.W., Wallace-Williams S.E., Kliger D.S. Photolysis of rhodopsin results in deprotonation of its retinal Schiff s base prior to formation of metarhodopsin II // Photochem. Photobiol. 1992. - V. 56. - P. 1135-1144.

157. Ujj L., Jager F., Atkinson G.H. Vibrational spectrum of the lumi intermediate in the room temperature rhodopsin photo-reaction // Biophysical Journal.- 1998. -V. 74. — P. 1492-1501.

158. Vogel R., Ludeke S., Radu I., Siebert F., Sheves M. Photoreactions of metarhodopsin III // Biochemistry. 20046. - V. 43. - P. 10255-10264.

159. Vogel R., Siebert F., Zhang X.Y., Fan G., Sheves M. Formation of Meta III during the decay of activated rhodopsin proceeds via Meta I and not via Meta II // Biochemistry. 2004a. - V. 43. - P. 9457-9466.

160. Wald G. The molecular basis of visual excitation // Nature. — 1968. — V. 219.-P. 800-807.

161. Wald G. Vision // Fed. Proc. 1953. - V. 12. - P. 606-611.

162. Wald G., Brown P.K. The molar extinction of rhodopsin // J. Gen. Physiol. 1953. -V. 37. P. 189-200.

163. Wald G., Brown P.K., Gibbons I.R. The problem of visual excitation // J. Opt. Soc. Amer. 1963. - V. 53. - P. 20-35.

164. Wald G., Hubbard R. The reduction of retinenel to vitamin Al in vitro II J. Gen. Physiol. 1949. - V. 32. - P. 367-389.

165. Weng J., Mata N.L., Azarian S.M., Tzekov R.T., Birch D.G., Travis G.H. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in Abcr knockout mice // Cell. — 1999. V. 98.-P. 13-23.

166. Williams T.P. Photolysis of metarhodopsin II: rates of production of P470 and rhodopsin // Vision Research. 1968. - V. 8. - P. 1457-1466.

167. Xu J., Dodd R.L., Makino C.L., Simon M.I., Baylor D.A., Chen J. Prolonged photoresponses in transgenic mouse rods lacking arrestin // Nature. — 1997. -V.389.-P. 505-509.

168. Yau K.W., Nakatani K. Electrogenic Na-Ca exchange in retinal rod outer segment // Nature. 1984. - V. 311. - P. 661-663.

169. Yokoyama S. Molecular evolution of vertebrate visual pigments // Progress in Retinal and Eye Research. 2000. - V. 19. - P. 385-419.

170. Yokoyama S. Molecular genetic basis of adaptive selection: examples from color vision in vertebrates // Ann. Rev. Genet. — 1997. — V. 31. — P. 315—336.

171. Yokoyama S., Yokoyama R. Adaptive evolution of photoreceptors and visual pigments in vertebrates // Ann. Rev. Ecol. Syst. — 1996. V. 27. — P. 543— 567.

172. Yoshizawa Т., Shichida Y., Matuoka S. Primary intermediates of rhodopsin studied by low temperature spectrophotometry and laser photolysis. Bathorhodopsin, hypsorhodopsin and photorhodopsin // Vision Research. — 1984. -V. 24. 1455-1463.

173. Young R.W., Droz B. The renewal of protein in retinal rods and cones // J. Cell Biol. 1968. - V. 39. - P. 169-184.

Информация о работе

Колесников, Александр Викторович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Реакции зрительного цикла в палочках сетчатки амфибий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы