Фотолиз зрительного пигмента и темновая адаптация фоторецепторов

Голобокова, Елена Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фотолиз зрительного пигмента и темновая адаптация фоторецепторов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фотолиз зрительного пигмента и темновая адаптация фоторецепторов"

Российская Академия Наук Институт Эволюционной Физиологии и Биохимии имени И.М. Сеченова

На правах рукописи

Голобокова Елена Юрьевна

ФОТОЛИЗ ЗРИТЕЛЬНОГО ПИГМЕНТА И ТЕМНОВАЯ АДАПТАЦИЯ

ФОТОРЕЦЕПТОРОВ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в лаборатории эволюции органов чувств (заведующий -доктор биологических наук В.И. Говардовский) Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Говардовский Виктор Исаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Розенгарт Евгений Викторович

кандидат биологических наук Фельдман Татьяна Борисовна

Ведущее учреждение:

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится 22 ноября 2005 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.127.01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу:

194223 Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, д. 44, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Автореферат разослан 20 октября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук С . /м.Н. Маслова

ШЛ- 11П77?

¿¿¿ль

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Зрительная система человека и животных способна функционировать в чрезвычайно широком диапазоне интенсивностей света и обеспечивать восприятие объектов в разное время суток. Одним из проявлений этой способности является феномен темновой адаптации - восстановление чувствительности зрительной системы к слабому свету после пребывания под действием высоких освещенностей. Темновая адаптация происходит как на уровне фоторецепторов и нейронных сетей сетчатки, так и на уровне центральных структур нервной системы. Однако именно изменения свойств фоторецепторов определяют поведение последующих звеньев обработки сигнала, и, следовательно, адаптация на уровне фоторецепторных клеток (палочек и колбочек) является ключевым моментом для всего процесса.

Возбуждение фоторецепторов начинается с поглощения квантов света молекулами зрительного пигмента, которые находятся в наружных сегментах этих клеток. Зрительные пигменты принадлежат к классу семиспиральных трансмембранных рецепторных белков, передающих сигнал через ГТФ-связывающие белки (G-белки) Поглощение кванта вызывает переход хромофорной группы пигмента (в качестве которой служит ретиналъ или 3,4-дегидроретиналь) из 11-г/ис-формы в транс-форму, что инициирует серию конформационных изменений, приводящих к появлению активной конформации - метапигмента II, который связывается с G-белком. Последующие превращения приводят к фотолизу зрительного пигмента - отделению транс-хромофора от апобелка опсина. При этом хромофорное место на опсине делается доступным для связывания новой молекулы 11 -г/ис-ретиналя, что обеспечивает восстановление исходной (темновой) структуры зрительного пигмента [обзоры: DeGrip & Rothschild, 2000; Hofmann, 2000].

Фотолиз зрительного пигмента палочек - фоторецепторов сумеречного зрения - изучался как в детергентных экстрактах, так и в интактных фоторецепторах Процессы фотолиза зрительных пигментов колбочек - фоторецепторов дневного зрения - исследованы значительно меньше, поскольку экспериментальные возможности ограничены трудностью получения достаточного количества колбочковых пигментов для исследований in vitro. При этом данных о фотолизе колбочковых пигментов в интактных фоторецепторах (in situ) почти нет, а имеющиеся в этом отношении немногочисленные работы выполнены с использованием методик, которые не позволяют надежно идентифицировать все продукты фотолиза в колбочках.

В настоящее время предполагается,

что в палочках процесс темновой

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.Петер|

оэ

mUltHA >

адаптации определяется течением медленных реакций, связанных с распадом долгоживущих продуктов фотолиза и регенерацией темнового зрительного пигмента. Из психофизических экспериментов известно, что в колбочках темновая адаптация происходит как минимум на порядок быстрее, чем в палочках. Возможно, что такое различие в скоростях адаптации связано с разными скоростями фотопревращений палочкового и колбочкового пигментов, но прямое подтверждение этого при анализе /и vivo пока отсутствует. Это делает актуальным сравнительное исследование процессов фотолиза зрительного пигмента в интактных палочках и колбочках сетчатки.

Цель работы

Исследование процессов фотолиза зрительных пигментов палочек и колбочек т vivo и выяснение роли продуктов фотолиза в темновой адаптации фоторецепторов.

Задачи работы

1. Исследовать последовательность и кинетику взаимопревращений долгоживущих продуктов фотолиза в интактных палочках и колбочках сетчатки.

2. Исследовать ход процесса темновой адаптации палочек и колбочек после контролируемого обесцвечивания зрительного пигмента.

3. Сопоставить отличия процессов фотолиза палочковых и колбочковых зрительных пигментов с особенностями временного хода темновой адаптации палочек и колбочек.

4. На основе проведенного анализа установить роль медленных стадий фотолиза в процессе темновой адаптации для разных типов фоторецепторов.

Научная новизна результатов исследования

Применение скоростной поляризационной микроспектрофотометрии впервые позволило надежно идентифицировать долгоживущие продукты фотолиза колбочковых зрительных пигментов in vivo и представить кинетическую схему взаимопревращений между ними.

Исследование кинетики фотопревращений зрительного пигмента позволило установить, что в палочках генерация конечного продукта фотолиза (ретинола)

лимитируется образованием ретиналя в результате распада метапродуктов, а в колбочках - реакцией восстановления ретиналя в ретинол, катализируемой ферментом ретинолдегидрогеназой.

Проведено сопоставление временного хода выключения каскада фототрансдукции в палочках и колбочках с кинетикой распада долгоживущих продуктов фотолиза в этих фоторецепторах. При этом впервые показано, что распад метапродуктов является основным фактором, контролирующим процесс темновой адаптации как в палочках, так и в колбочках, а его более быстрое течение в колбочках обеспечивает высокую скорость темновой адаптации этих фоторецепторов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Схема медленных стадий фотолиза, установленная ранее для родопсина быка и лягушки, не является универсальной, поскольку образующиеся продукта фотолиза зависят как от вида зрительного пигмента, так и от вида животного.

2. Скорость распада колбочкового зрительного пигмента в процессе фотолиза на один-два порядка выше по сравнению с палочковыми пигментами.

3. Лимитирующей стадией в генерации одного из ключевых продуктов зрительного цикла - транс-ретинола - в палочках является образование ретиналя в результате распада метапродуктов, а в колбочках - ретинолдегидрогеназная реакция.

4. Выход фоторецепторов из насыщения после действия ярких стимулов, контролирующий временной ход темновой адаптации, определяется кинетикой распада фотопродуктов.

5. Быстрый распад колбочковых зрительных пигментов по сравнению с палочковыми является одним из основных факторов, лежащих в основе быстрой темновой адаптации колбочек.

Теоретическая и практическая значимость работы

Выполненное в данной работе исследование фотолиза зрительных пигментов и процессов темновой адаптации разных типов фоторецепторов из сетчаток рыб и амфибий позволило прояснить молекулярные механизмы, лежащие в основе темновой адаптации зрения. Кроме того, оно дало возможность объяснить различия в скорости восстановления чувствительности палочек и колбочек после воздействия

света высокой интенсивности и, следовательно, различия скоростей адаптации дневного и ночного зрения.

Весьма вероятно, что полученные выводы также справедливы и для фоторецепторов млекопитающих, включая человека, поскольку принципиальное отличие между палочками и колбочками, заключающееся в более высокой скорости фотолиза зрительного пигмента и темновой адаптации последних, согласуется с физиологическим отличием дневного зрения от ночного как у холоднокровных, так и у теплокровных позвоночных. Эти результаты могут оказаться полезными и при изучении других клеточных систем передачи сигнала через в-белки, о которых известно значительно меньше, чем о передаче сигнала в каскаде фототрансдукции

Связь, установленная между определенными стадиями фотолиза и этапами темновой адаптации, позволила определить те критические стадии фотолиза, которые могут быть мишенью при различных заболеваниях сетчатки, связанных с нарушениями темновой адаптации.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на ХП Международном совещании и V школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2001); V Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2002); VI Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2002); VII Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2003); П Международном симпозиуме «ЭДвюпагшт» (Твярминне, Финляндия, 2003); VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2004); III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); 1П Международном симпозиуме <Мзюпагшт» (Твярминне, Финляндия, 2004); Международном симпозиуме по физиологии клетки (Санкт-Петербург, 2004); XXVIII Европейской конференции по зрительному восприятию (Ла Корунья, Испания, 2005); IV Международном симпозиуме <Л/Ыапапшп» (Твярминне, Финляндия, 2005).

По материалам диссертации опубликованы 4 научные статьи в рецензируемых журналах и 11 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Личный вклад автора

Все результаты, включенные в диссертацию, получены лично автором или при его непосредственном участии.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 168 страницах, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение результатов), выводов и списка литературы, включающего 210 источников. Диссертация иллюстрирована 45 рисунками и 3 таблицами.

Материалы и методы

Измерения выполнялись на разных типах фоторецепторов из сетчаток травяных лягушек Rana temporaria, озерных лягушек Rana ridibunda, обыкновенных жаб Bufo bufo и серебряных карасей Carassius auratus auratus. Перед экспериментом животные адаптировались к темноте в течение 12 часов Декапитация животного проводилась в полной темноте, чтобы избежать обесцвечивания зрительного пигмента. С той же целью все последующие операции по извлечению сетчатки и приготовлению препарата проводились при помощи инфракрасной телевизионной системы или, при работе с палочками амфибий, при слабом красном свете (А, > 650 нм).

МикроспектроФотометрия. Для исследования продуктов фотолиза зрительного пигмента в интактных фоторецепторах (палочках и колбочках) использовался скоростной микроспектрофотометр [Говардовский и Зуева, 2000; Govardovskii et al., 2000]. Существующая в настоящее время модификация прибора позволяет регистрировать спектры поглощения одиночных фоторецепторов при двух направлениях поляризации света: в плоскости мембран фоторецепторных дисков (далее обозначается Т) и перпендикулярно ей (L). Скорость сканирования составляет до 1200 юл/с.

При измерениях фоторецепторы находились в физиологическом солевом растворе, содержащем 110 мМ NaCl, 2.5 мМ КС1, 1 мМ СаС12, 1 мМ MgS04, 5 мМ NaHCCb, 10 мМ глюкозы, 50 мкМ ЭДТА. рН раствора поддерживался посредством 10 мМ Na-HEPES (рН 7.5, в большинстве случаев), 10 мМ Na-фосфатного буфера (рН < 6.5) или 10 мМ Tris-HCl (рН > 8.0).

Для исследования процессов фотолиза зрительный пигмент обесцвечивался светодиодом высокой интенсивности (Marl International Ltd., Великобритания). В зависимости от максимума поглощения зрительного пигмента использовался один из следующих диодов: излучающий свет в синей (465 нм), зеленой (525 нм) или оранжевой (615 нм) области спектра. Нужный светодиод вводился в световой путь, подавалась короткая обесцвечивающая вспышка, и записывалась серия спектров:

первый - непосредственно после вспышки, остальные - через заранее заданные интервалы времени. При этом первая запись после обесцвечивания (в дальнейшем будет обозначаться 0 с) начиналась через 0.02 с после окончания засветки.

Для вычисления концентраций продуктов фотолиза и построения временного хода концентраций использовались математические модели, специально составленные нами на основе кинетических схем.

Электрофизиологические исследования. Для исследования восстановления чувствительности палочек и колбочек в темноте после действия яркого света использовался метод всасывающей микропипетки [Baylor et al., 1979; Baylor et al., 1980], позволяющий регистрировать внеклеточный ток фоторецепторов. Клетки помещались в физиологический солевой раствор, содержащий 90 мМ NaCl (в случае работы с палочками амфибий) или 110 мМ NaCl (при работе с фоторецепторами карасей), 2 5 мМ КС1, 1 мМ CaCI2, 1 мМ MgS04, 5 мМ NaHC03, 10 мМ глюкозу, 50 мкМ ЭДТА, бычий сывороточный альбумин в количестве 100 мг/л; рН раствора поддерживался ~ 7.5 с помощью 10 MMNa-HEPES.

Отведения выполнялись от одиночных свободно плавающих палочек и колбочек, при этом внутри пипетки находился наружный сегмент фоторецептора. Для световой стимуляции фоторецепторной клетки использовалась лампа-вспышка и/или один из светодиодов: излучающий свет в оранжевой (615 нм) или в зеленой (525 нм) области спектра. Для решения систем уравнений при математическом моделировании сигнальной активности каскада фототрансдукции использовалась программа MathCad 2001/ Professional (США).

Результаты и обсуждение

Методический подход, предназначенный для исследования процессов фотолиза зрительных пигментов, был предварительно отработан на красных (родопсиновых) палочках из сетчатки амфибий, по которым в экспериментах in vitro и т vivo накоплен значительный объем литературных данных. Затем этот метод анализа in vivo был применен для исследования процессов фотолиза палочковых и колбочковых зрительных пигментов у других животных.

Фотолиз порфиоопсина палочек. На рис. 1 показана серия спектров поглощения изолированных наружных сегментов палочек серебряного карася Carassius auratus auratus, записанных при Т- и L-поляризации в темноадаптированном состоянии и через разное время после обесцвечивающей

вспышки (525 им, 1 с) при рН 7.5. Спектр поглощения порфиропсина имеет максимум при 517 нм (см. кривые «темнота» на рис. 1), а дипольный момент хромофорной группы - 3,4-дегидроретиналя (далее - ретиналь) - ориентирован преимущественно в плоскости дисков, как и у родопсина. Сразу после обесцвечивания порфиропсина образуется равновесная смесь метапорфиропсина I, максимально поглощающего около 500 нм, с метапорфиропсином П, поглощающим около 400 нм (кривая 0 с на рис. 1 Т). Дальнейшее уменьшение Т-поглощения вблизи 400 нм свидетельствует о распаде метапорфиропсина П. При изменении Т-спектров в ходе фотолиза порфиропсина не наблюдается постепенного увеличения поглощения в области 460-520 нм, характерного для фотолиза родопсина, т.е. распад метапорфиропсина II, по-видимому, не сопровождается появлением метапорфиропсина Ш.

Î 002

/о cl Темнота Т

rjm cl\

» 1800 с^^ь»

350 400 450 500 550 600 650 Длина волны, нм

450 500 550 600 Длина волны, нм

Рис. 1. Спектр поглощения порфиропсина (обозначен «темнота») и серия спектров в разные моменты времени после обесцвечивающей вспышки при двух направлениях поляризации (Т, Ь) для изолированных наружных сегментов палочек Гага.«/«.? аигаШэ аигаШя. Каждый спектр - среднее из записей от 19 клеток

На Ь-спектрах видно образование транс-ретналя при 400 нм и одновременное образование продукта с максимумом поглощения в области 450-500 нм, названного нами Р-480 (рис. 1 Ь). Р-480 представляет собой /я/югнс-ретиналь, образовавший неспецифические шиффовы основания с различными аминогруппами опсина и фосфатидилэтаноламинов липидного бислоя фоторецепторной мембраны. В зависимости от природы нового места связывания и рН могут образовываться продукты с различными спектрами поглощения, протонированные формы которых и представляет собой Р-480. Поскольку изолированные наружные сегменты палочек метаболически неактивны, то образования 3,4-дегидроретинола (далее в тексте -ретинол) не происходит, а накапливаются ретиналь и Р-480.

Зная временной ход изменения поглощения при двух направлениях поляризации, можно составить систему уравнений и определить временной ход концентрации каждого из продуктов фотолиза.

Рассчитанные кривые временного хода концентраций продуктов фотолиза порфиропсина показаны на рис. 2 А. Видно, что уменьшение концентрации метапорфиропсинов I и П в ходе фотолиза хорошо соответствует одноэкспоненциальной кинетике (гладкая кривая). Ретиналь и его неспецифические шиффовы основания (Р-480) достигают максимума к 900 с, после чего их концентрации остаются постоянными. Расчет не показал достоверного образования метапорфиропсина III: значения его концентрации варьируют вблизи нуля, оставаясь в пределах экспериментальной ошибки.

Установленная схема медленных стадий фотолиза порфиропсина (рис. 2 Б) отличается от схемы фотолиза родопсина отсутствием стадии образования мета Ш. Экспериментально наблюдаемое отсутствие этого продукта подтверждается одноэкспоненциальной кинетикой распада метапорфиропсина П, которая при 20 °С характеризуется константой скорости к = 2.110'3 с"1. Следовательно, альтернативный путь фотолиза через стадию метапигмента III, присутствующий у амфибий, не обязателен для распада зрительного пигмента до свободного ретиналя и опсина. Таким образом, схема фотолиза родопсина амфибий не универсальна и не распространяется на все зрительные пигменты.

быстрое

Мета! < > МетаII

Ретиналь + опсин < > Р-480

ЙОО 800 1200 1500

Время после ВСПЫШКИ, с

Рис. 2. Временной ход изменения относительных концентраций долгоживущих продуктов фотолиза порфиропсина палочек Сагаязш аигаШ аигаШ (А) и схема взаимопревращений долгоживущих продуктов фотолиза порфиропсина карася (Б)

Фотолиз зрительного пигмента зеленых палочек. Так называемые «зеленые» палочки, встречающиеся в сетчатках некоторых видов амфибий,

содержат колбочковый опсин [Ма е1 а!., 2001] Благодаря относительно большим размерам наружных сегментов, зеленые палочки являются хорошим объектом для изучения процессов фотолиза их колбочкоподобного зрительного пигмента.

Рассчитанный по спектрам поглощения временной ход изменения концентраций продуктов фотолиза в изолированных наружных сегментах зеленых палочек показан на рис. 3 (А, Б) заполненными символами. Видно, что концентрация метапигментов I и II непрерывно уменьшается (см. рис. 3 А). ' Продукт, предположительно названный нами метапигментом 1П, достигает

максимума примерно к 30 с и затем распадается (концентрация метапигмента Ш показана на рис. 3 А в увеличенном масштабе и должна соотноситься с правой осью 1 ординат). Ретиналь и его неспецифические шиффовы основания с опсином

(имеющие в данном случае максимум поглощения около 440 нм и названные нами Р-440) накапливаются в течение 5 минут, а затем медленно уходят из наружного сегмента, что видно по незначительному уменьшению их концентраций (рис. 3 Б).

О.

£ ф

100 200 Время после вспышки, с

00 300

300 600

Время после вспышки, с

Рис. 3. Временной ход изменения концентраций долгоживущих продуктов фотолиза зрительного пигмента зеленых палочек Rana temporaria. Заполненные символы относятся к изолированным наружным сегментам, незаполненные - к интактным клеткам; данные для метапигмента Ш на А должны соотноситься с правой шкалой ординат. Все значения концентраций - среднее от 8 клеток. Гладкие кривые -аппроксимация средних значений по всем клеткам двумя экспонентами; для изолированных наружных сегментов приведены средние значения ± ошибка среднего

В метаболически активных интактных зеленых палочках кинетика образования и распада метапигментов I, II и III (незаполненные символы на рис. 3 А) совпадает с данными для изолированных наружных сегментов. Ретиналь и Р-440

накапливаются только до 100 с, а затем их концентрации уменьшаются, поскольку они превращаются в ретинол (незаполненные символы на рис. 3 Б). Однако полного превращения ретиналя и Р-440 в ретинол не происходит, вероятно, из-за ограниченности метаболических ресурсов изолированных палочек.

Схема медленных стадий фотолиза зрительного пигмента зеленых палочек показана на рис. 4. Обратимость перехода метапигмент I - метапигмент II следует из обратимой рН-зависимости относительного количества этих продуктов. Обратные реакции из ретиналя и Р-440 маловероятны, что следует из независимости кинетики распада метапродуктов от того, происходит ли превращение ретиналя в ретинол или нет (см. рис. 3 А). Следует заметить, что небольшое количество короткоживущего продукта, который условно назван метапигментом Ш, не позволяет сделать надежные выводы относительно его свойств. Константы скорости реакций (&,) можно найти, приближая экспериментальные данные (рис. 3 А) двумя экспонентами. Значения к\ и к2 определяются достаточно надежно: к\ = 3.1-10"3 с*1; кг = 4.5-10"2 с"1. Значения к.\ и кз, характеризующие минорный компонент (метапигмент П1), очень чувствительны к погрешностям экспериментальных данных, и анализ дает для къ отрицательное значение, что, очевидно, не имеет смысла.

Рис. 4. Схема переходов между долгоживущими продуктами фотолиза зрительного пигмента зеленых палочек амфибий

Таким образом, схема медленных стадий фотолиза зрительного пигмента зеленых палочек амфибий совпадает со схемой фотолиза родопсина, но распад их пигмента происходит на порядок быстрее, чем в случае родопсина и порфиропсина. Тем не менее, пигмент зеленых палочек является достаточно специфическим примером колбочкового пигмента, и неясно, насколько его свойства характеризуют свойства «настоящих» колбочек. Для выяснения этого вопроса были исследованы зрительные пигменты красночувствительных колбочек, которые, вместе с зеленочувствительными колбочками, составляют основной процент цветоразличающих фоторецепторов и определяют свойства дневного зрения.

Мета! Ме~~тт -> ""тгаШ

быстрое л |

равновесие

Ретиналь + опсин < > Р-440

Фотолиз зрительного пигмента колбочек Спектр поглощения темнового зрительного пигмента красночувствительных колбочек карася, хромофором которого является 3,4-дегидроретиналь, характеризуется а-полосой с максимумом около 620 нм и р-полосой около 420 нм (кривые «темнота» на рис. 5). Дихроичное отношение в максимуме поглощения темноадаптированного пигмента ~ 2, следовательно, дипольный момент его хромофора преимущественно ориентирован в плоскости мембран, как и у зрительных пигментов палочек. Спектр поглощения темнового зрительного пигмента хорошо описывается стандартной кривой для пигментов на основе витамина А2 с максимумом при 617 нм [Ооуапкткп е1 а1., 2000].

® 004

002

0 00

Темюта Т

/о Д.

fjl0c\\

; 004

3 ¡

0 02

000

350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 Длине волны, и*

350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 Длина волны, нм

Рис. 5. Спектры поглощения темноадаптированного наружного сегмента и серия спектров в разные моменты времени после обесцвечивающей вспышки, при двух направлениях поляризации (Т, Ь) для красных колбочек серебряного карася Сага.ш/« амгай« аигШш; каждый спектр - среднее из записей от 13 клеток

Сразу после обесцвечивания зрительный пигмент исчезает, и появляется высокий пик на 400 нм, соответствующий метапигменту П (кривая 0 с на рис. 5 Т). Небольшой пик около 525 нм соответствует метапигменту I, находящемуся в равновесии с метапигментом II. Дальнейшие изменения Т-спекгров демонстрируют быстрый распад метапигментов I и II и появление небольшого коротковолнового пика, соответствующего ретинолу (3,4-дегидроретинолу, кривая 200 с на рис. 5 Т). В процессе распада метапигмента П не возникает даже небольшого количества метапигмента III, формирование которого должно было бы проявляться как постепенное увеличение Т-поглощения в области 460-550 нм. Поведение Ь-спектров значительно отличается от поведения Т-спектров. Низкий начальный пик на 400 нм в ходе фотолиза быстро возрастает, демонстрируя накопление ретиналя,

освобождающегося из метапигмеита П и ориентированного преимущественно перпендикулярно мембране (кривая 10 с на рис. 5 Ь). В дальнейшем ретиналь быстро превращается в ретинол с максимумом поглощения около 350 нм, также ориентированный преимущественно перпендикулярно мембране (кривая 200 с на рис. 5 Ь). Анализ спектров также показал образование короткоживущего продукта с максимумом поглощения при 450-490 нм, по-видимому, аналогичного Р-480 палочек.

Рассчитанные изменения концентраций продуктов фотолиза колбочкового зрительного пигмента показаны на рис. 6 А. Распад равновесной смеси метапигментов 1/П происходит по двухэкспоненциальной кинетике с периодом полураспада около 5 с. Концентрация ретиналя возрастает примерно до 10 с, а затем уменьшается в результате его восстановления в ретинол Образование ретинола сопровождается постепенным его уходом из наружного сегмента, поэтому кривая концентрации ретинола на конечном этапе практически горизонтальна. Временной ход концентрации метапигментов 1/П хорошо приближается суммой двух экспонент с постоянными времени ц = 5 с и = 73 с и относительными амплитудами 0.79 и 0.21, соответственно. Временной ход концентрации ретиналя - разностью двух экспонент с одинаковой амплитудой и постоянными времени т\ = 142 с и т2 = 5 с.

Рис. 6. Временной ход концентраций долгоживущих продуктов фотолиза (А) и схема переходов между долгоживущими продуктами фотолиза (Б) для зрительного пигмента красных колбочек серебряного карася Сагах.ч/ш аигаШя аигаш; образование небольшого количества короткоживущего продукта Р-480 на А не показано

Предлагаемая схема медленных стадий фотолиза зрительного пигмента красночувствительных колбочек (см. рис. 6 Б) отличается от схемы фотолиза пигментов палочек амфибий. Заложенный в данную схему прямой распад

равновесной смеси метапигментов I и П на свободный транс-реттяль и опсин не подтверждается двухэкспоненциальной кинетикой распада метапигментов, но и не противоречит ей. Распад метапигментов I/II по кинетике не первого порядка может происходить без формирования дополнительного продукта, хотя не исключено, что такой продукт все же существует, но необнаружим при микроспектрофото-метрических измерениях.

Сравнение процессов фотолиза исследованных зрительных пигментов.

Таким образом, в ходе фотолиза палочковых родопсина и порфиропсина, колбочкоподобного пигмента зеленых палочек и пигмента красночувствительных колбочек образуются следующие промежуточные состояния: мета I, мета II, транс-ретиналь и его неспецифические шиффовы основания, а также транс-ретинол. Продукт, соответствующий состоянию мета III, образуется в больших количествах только при фотолизе родопсина палочек, и в незначительных количествах - в зеленых палочках. В палочках и колбочках Carassius auratus auratus аналог мета Ш не обнаруживается, что подтверждает ранее предполагавшееся отсутствие этого альтернативного пути фотолиза в сетчатке карася [Reuter, 1973; Donner et al., 1974]. Следовательно, метапигмент III не обязателен для распада зрительного пигмента на свободный ретиналь и опсин. Следует отметить, что отличие между схемами распада основанных на витамине Ai (ретиналь) пигментами амфибий и

Время, с

Рис. 7. Сравнение кинетики распада метапродуктов в разных типах фоторецепторов 1 - порфиропсиновые палочки Carassius auratus auratus, 2 - родопсиновые палочки Bufo bufo, 3 - зеленые палочки Rana temporaria, 4 - красночувствительные колбочки Carassius auratus auratus-, по оси ординат - суммарная концентрация всех метапродуктов

содержащими витамин Аг (3,4-дегидроретиналь) пигментами карася не связано непосредственно с природой хромофора Ранее было показано, что метапигмент Ш у лягушки-быка {Капа сШехЬелапа) образуется как в палочках центральной части сетчатки, содержащих ретиналь, так и в палочках дорзальной ее части, содержащих 3,4-дегидроретиналь, при этом все палочки используют одинаковые опсины [<Зу11епЬегд с*. а1., 1974].

Качественно похожий ход процессов фотолиза во всех исследованных фоторецепторах сопровождается важным количественным отличием - существенно более высокой скоростью распада колбочковых зрительных пигментов на транс-ретиналь и опсин по сравнению с пигментами палочек. Для сравнения кинетики фотолиза на рис. 7 приведены кривые, отображающие временной ход изменения суммарной концентрации метапродукгов I, II и III в разных типах фоторецепторов. Высокую скорость распада зрительного пигмента колбочек (кривая 4) нельзя связывать с отсутствием метапигмента III, поскольку мета III отсутствует, например, и в палочках карася, порфиропсин которых показывает самую низкую скорость фотолиза (кривая 1).

Результаты нашего исследования показывают, что гидролиз связи хромофора с опсином у колбочкоподобного пигмента зеленых палочек происходит почти на порядок быстрее, чем у родопсина красных палочек той же сетчатки (ср. кривые 2 и

3 на рис. 7). Константа скорости распада суммы метапигментов I и П в зеленых палочках при 20 °С и рН 7.5 равна 4.510'2 с"1, в то время как у родопсиновых палочек она составляет 5.310"3 с*1. Кроме того, в красных палочках образуется большое количество относительно долгоживущего метародопсина П1, в котором нативное хромофорное место на опсине по-прежнему занято ретиналем и недоступно для регенерации [Коквшкоу е1 а!., 2003]. В зеленых палочках продукт, называемый нами метапигментом Ш, является минорным короткоживущим компонентом и не должен ограничивать скорость регенерации. )

В «настоящих» колбочках гидролиз связи транс-ретналя с опсином происходит почти в 70 раз быстрее, чем в палочках той же сетчатки (ср. кривые 1 и ,

4 на рис. 7). Первый протекает по двухэкспоненциальной кинетике и характеризуется периодом полураспада 5 с, а второй - по одноэкспоненциальной кинетике с периодом полураспада 338 с.

Таким образом, характерной отличительной особенностью фотолиза колбочковых зрительных пигментов является быстрый гидролиз связи транс-ретиналя с опсином. Это делает хромофорный центр на опсине доступным для рекомбинации с П-^ис-ретиналем и дает субстрат (свободный отранс-ретиналь) для

регенерации ll-i/ис-хромофора, тем самым обеспечивая быстрое восстановление темнового зрительного пигмента.

Фотолиз и темновая адаптация. Для сопоставления данных о скорости распада зрительных пигментов со скоростью темновой адаптации фоторецепторов было проведено исследование восстановления чувствительности палочек и колбочек в темноте после действия света высокой интенсивности.

Серия ответов изолированной красной палочки из сетчатки Rana ridibunda на вспышки увеличивающейся интенсивности показана на рис. 8 А. Величина темнового тока принимается за нулевой уровень, а фотоответы изображаются в виде положительных отклонений от него. До определенной интенсивности стимула амплитуда фотоответа градуально возрастает, пока не происходит насыщение Уровень насыщения фотоответа соответствует полному закрытию катионных каналов плазматической мембраны фоторецептора. Дальнейшее увеличение силы стимула приводит к тому, что ответ находится в насыщении все большее время (см. рис 8 А). Выход фотоответа из фазы насыщения отражает восстановление способности фоторецептора реагировать на свет, т.е. течение процесса темновой адаптации.

Рис. 8. Серия ответов на короткие насыщающие вспышки увеличивающейся интенсивности в состоянии темновой адаптации (А) и зависимость времени пребывания фотоответа в насыщении от относительного обесцвечивания родопсина (Б) для изолированной красной палочки Rana ridibunda. Штриховая линия на А показывает уровень восстановления темнового тока, принятый в качестве критерия выхода из насыщения

График зависимости времени пребывания фотоответа в насыщении от относительного обесцвечивания родопсина (рис 8 Б) имеет две характерные фазы. Линейный участок зависимости при достижении некоторого критического уровня яркости вспышки делает крутой изгиб, после чего восстановление темнового тока резко замедляется. Выход фотоответа из фазы насыщения происходит в тот момент, когда светоиндуцированная активность эффекторного фермента каскада фототрансдукции - фосфодиэстеразы цГМФ - падает до определенного критического уровня. Поэтому из графика зависимости времени в насыщении от относительного обесцвечивания зрительного пигмента (рис. 8 Б) можно определить временной ход выключения светоиндуцированной активности фосфодиэстеразы (см. различные символы на рис. 9 Б).

С другой стороны, временной ход выключения активности фосфодиэстеразы можно предсказать на основе построенной нами математической модели, которая описывает выключение активности каскада фототрансдукции с учетом кинетики распада продуктов фотолиза и их способностей возбуждать каскад (см. рис. 9 А).

Рис. 9. Схема выключения активности каскада фототрансдукции, направленной на гидролиз цГМФ (А) и временной ход выключения светоиндуцированной активности фосфодиэстеразы в красных палочках Rana ridibtmda (Б); разные символы на Б соответствуют разным клеткам. Mil* - метародопсин П, MII-P -фосфорилированный метародопсин П, М-P-Arr - фосфорилированные и связанные с аррестином метародопсины, Ops - опсин, Rh - родопсин, Т* - трансдуцин, РВЕ* и PDE - соответственно, активная и неактивная формы фосфодиэстеразы цГМФ; кМ1и кш р, кш, кор„ kpDE - константы скорости первого порядка для соответствующих реакций; аМц, ами г, aoPi - каталитические активности соответствующих продуктов фотолиза (относительно Mil)

102

Время, с

Подбирая параметры модели, можно хорошо воспроизвести экспериментальные данные (сплошная линия на рис. 9 Б - модельная кривая, параметры подгонки см. в табл. 1).

Снижение светоиндуцированной активности фосфодиэстеразы следует двухфазной кинетике, причем первая быстрая фаза примерно через 30 с сменяется второй более медленной фазой, продолжительность которой в палочках лягушки составляет более часа. Пунктирные и штриховые линии на рис. 9 Б отображают вклад в общую активность фосфодиэстеразы ее долевых активностей, вызванных отдельными промежуточными продуктами фотолиза. Видно, что значительный вклад в медленную фазу между 30 с и 5 мин после вспышки вносят распадающиеся метародопсины I, П и Ш. Остальная часть медленной фазы (после 5-й минуты) контролируется образованием свободного опсина из метародопсинов и его исчезновением в результате регенерации родопсина.

Аналогичный методический подход был применен к колбочкам. Они отвечают на вспышки света подобно палочкам (см. рис. 10 А), но фотоответы колбочек на порядок быстрее, а чувствительность этих фоторецепторов на два порядка ниже по сравнению с палочками. Результаты проведенного для колбочек математического моделирования показаны на рис. 10 Б и в табл. 1. Двухфазная кинетика снижения светоиндуцированной активности колбочковой фосфодиэстеразы выражена менее ярко, чем в палочках. Смена фаз происходит уже на 2-3 секунде после

И 15

Время после вспышки, с

Время, с §

Рис. 10. Серия ответов изолированной красночувствительной колбочки СапюзШ аигаш аигаШ на короткие насыщающие вспышки увеличивающейся интенсивности в состоянии темновой адаптации (А) и временной ход выключения светоиндуцированной активности фосфодиэстеразы в красночувствительных колбочках (Б)

обесцвечивания зрительного пигмента, а к 20 с происходит практически полное выключение активности. Видно, что первая фаза затухания активности фосфодиэстеразы контролируется инактивацией метапигмента П, а вторая -распадом метапигментов I и II на ретиналь и опсин. Таким образом, выключение активности каскада фототрансдукции в колбочках происходит по той же схеме, что и в палочках.

Из соответствующих математических моделей были определены константы скорости реакций и относительные каталитические активности продуктов фотолиза (см табл. 1). Величины относительных каталитических активностей продуктов для палочек и колбочек близки. Зато распад продуктов фотолиза и соответствующее выключение активности каскада фототрансдукции происходит в колбочках намного быстрее. Это и является одним из факторов, обеспечивающих более высокую скорость темновой адаптации колбочек по сравнению с палочками.

Таблица 1

Константы скорости первого порядка (к, с"1) и относительные каталитические активности (а) для продуктов фотолиза родопсина палочек лягушки и зрительного пигмента колбочек карася (также см. рис. 9 А)

кш1 кмцр кш коР1 крйЕ От о МП г Ош аорз

Палочки 1.0 0.28 1.2-10* 8-Ю"4 0.33 1 0.012 9-1С6 2.110"6

Колбочки 11 4 0.2 0.01 10 1 0.025 410'5 2.510"6

Выводы

1. При помощи скоростного дихроичного микроспектрофотометра > исследованы медленные реакции фотолиза зрительного пигмента в интактных палочках и колбочках амфибий и рыб, и установлены кинетические схемы взаимопревращений метапигментов I, П, Ш, ретинапя и ретинола.

2. Схема медленных стадий фотолиза, установленная ранее для родопсинов быка и лягушки, не является универсальной, поскольку образующиеся продукты фотолиза зависят как от вида зрительного пигмента, так и от вида животного.

3 В зависимости от вида животного, скорость распада колбочковых метапигментов в 10-70 раз выше, чем у палочковых метародопсинов/ метапорфиропсинов.

4. Лимитирующей стадией в генерации одного из ключевых продуктов зрительного цикла - транс-ретинола - в палочках является образование ретиналя в результате распада метародопсинов, а в колбочках - превращение ретин аля в ретинол, катализируемое ферментом ретинолдегидрогеназой

5. При электрофизиологическом исследовании одиночных палочек и колбочек показано, что выход фоторецепторов из насыщения после действия ярких стимулов происходит в две временные фазы. Первая фаза определяется быстрой инактивацией метапигмента П, а вторая - медленным распадом метапигментов на опсин и ретиналь и последующей регенерацией темнового пигмента.

6. Каталитические активности различных промежуточных продуктов распада зрительного пигмента по отношению к полностью активному метапигменту П у палочек и колбочек близки и составляют для фосфорилированного мета П ~ 10~2, фосфорилированных и связанных с аррестином метапродукгов ~ 10"5, свободного опсина ~ 10"6.

7. Быстрый распад колбочковых зрительных пигментов по сравнению с палочковыми является одним из основных факторов, лежащих в основе более быстрой темновой адаптации колбочек.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Голобокова Е.Ю. Кинетика медленных стадий фотолиза зрительного пигмента "зеленых" палочек лягушки // Тез. докл. ХП Международного совещания и V школы по эволюционной физиологии. - Санкт-Петербург. - 2001. - С. 32.

2. Голобокова Е.Ю., Колесников A.B. Фотолиз зрительных пигментов "красных" и "зеленых" палочек амфибий in situ II Тез. докл. 5-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей "Человек и его здоровье". - Санкт-Петербург. - 2002. - С. 55-56.

3. Голобокова Е.Ю., Колесников A.B. Медленные стадии фотолиза зрительного пигмента "зеленых" палочек лягушки in situ II Тез. докл. 6-й Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". -Пущино. - 2002. - С. 15-16.

4. Голобокова Е.Ю. Медленные стадии фотолиза зрительного пигмента колбочек // Тез. докл. 7-й Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". - Пущино. - 2003. - С. 57-58.

5. Голобокова Е.Ю., Колесников A.B., Говардовский В.И. Медленные стадии

фотолиза зрительного пигмента зеленых палочек лягушки Rana temporaria И Сенсорные системы. - 2003. - Т. 17. - С. 134-143.

6. Kolesnikov A.V., Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. The identity of metarhodopsin Ш // Visual Neuroscience. - 2003. - V. 20. - P. 249-265.

7. Golobokova E.Y., Kolesnikov A.V., Govardovskii V.I. Photolysis of cone visual pigments in situ И Abstracts of the "Visionarium П". - Tvarminne (Finland). -

2003.-P. 6-7.

8. Говардовский В.И., Шуколюков C.A., Колесников A.B., Голобокова Е.Ю. Цикл зрительного пигмента и темновая адаптация: новые подходы к исследованию // Российский физиологический журнал. - 2004. - Т. 90. - С. 1015-1025.

9. Голобокова Е.Ю. Сравнение процессов фотолиза зрительных пигментов палочек и колбочек // Тез. докл. 7-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей "Человек и его здоровье". - Санкт-Петербург. - 2004. - С. 61-62.

10. Голобокова Е.Ю. Особенности медленных стадий фотолиза зрительного пигмента колбочек II Тез. докл. Ш Съезда биофизиков России - Воронеж. - 2004. -С. 407-408.

11. Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. Slow stages of the visual pigment photolysis: rods vs. cones // Abstracts of the "Visionarium III". - Tvarminne (Finland). -

2004. - P. 7.

12. Golobokova E.Y. Signaling states of a G-protein coupled receptor: rod and cone visual pigments // Abstracts of the international workshop in cell physiology. - St. Petersburg (Russia). - 2004. - P. 33.

13. Firsov M.L., Kolesnikov A V., Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. Two realms of dark adaptation // Vision Research. - 2004. - V. 45. - P. 147-151.

14. Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. Late stages of photolysis: cone vs rod visual pigments // Perception. - 2005. - V. 34 (Supplement: Abstracts of the XXVIII European conference on visual perception). - P. 195-196.

15. Golobokova E.Y. Visual pigment photolysis and cone dark adaptation // Abstracts of the "Visionarium IV". - Tvarminne (Finland). - 2005. - P. 8.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать 19.10.2005. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,25. Тираж 70. Заказ 119Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: 550-40-14 Тел./факс: 247-57-76

•»21137

РНБ Русский фонд

2006-4 22584

/ >

ь i

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Голобокова, Елена Юрьевна

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы

Цель и задачи исследования.

Научная новизна результатов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Апробация работы и публикации результатов исследования.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

111. Строение фоторецепторов: палочки и колбочки.

1.2. Структура и свойства зрительных пигментов.

1.3. Фотолиз родопсина палочек.

1.3.1. Быстрые стадии фотолиза родопсина.

1.3.1.1. Фотородопсин.

1.3.1.2. Батородопсин.

1.3.1.3. В81-родопсин.

1.3.1.4. Люмиродопсин.

1.3.1.5. Метародопсин 1.

1.3.2. Медленные стадии фотолиза родопсина.

1.3.2.1. Метародопсин II.

1.3.2.2. Метародопсин III.

1.3.2.3. Транс-ретиналь и опсин.

1.4. Фотолиз колбочковых зрительных пигментов.

1.5. Методы исследования процессов фотолиза в интактных клеткахЗ!

1.6. Электрический ответ фоторецептора на свет

1.7. Каскад фототрансдукции.

1.7.1. Активация и выключение каскада фототрансдукции.

1.7.2. Регуляция каскада фототрансдукции.

1.8. Темновая адаптация и цикл зрительного пигмента.

1.8.1. Понятие темновой адаптации.

1.8.2. Роль медленных стадий фотолиза и других этапов зрительного цикла в темновой адаптации.

1.8.3. Реакции зрительного цикла в палочках.

1.8.3.1. Образование в фоторецепторе транс-ретинола.

1.8.3.2. Транспорт транс-ретинола в пигментный эпителий.

1.8.3.3. Образование в пигментном эпителии 11-цис-ретиналя.

1.8.3.4. Транспорт 11-цис-ретиналя в фоторецептор.

1.8.3.5. Рекомбинация 11-цис-ретиналя с опсином.

1.8.4. Реакции зрительного цикла в колбочках.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Экспериментальные животные.

2.2. Микроспектрофотометрия.

2.2.1. Приготовление препарата.

2.2.2. Процедура измерения.

2.2.3. Обработка экспериментальных данных.

2.3. Электрофизиологические исследования

2.3.1. Приготовление препарата.

2.3.2. Метод всасывающей микропипетки.

2.3.3. Процедура измерения.

2.3.4. Обработка данных и математическое моделирование.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

5.7. Фотолиз зрительных пигментов палочек.

3.1.1. Медленные стадии фотолиза родопсина палочек амфибий: пример подхода к исследованию.

3.1.1.1. Спектры поглощения наружных сегментов родопсиновых палочек.

3.1.1.2. Конечные продукты фотолиза родопсина.

3.1.1.3. Временной ход изменения концентраций фотопродуктов.

3.1.1.4. Кинетическая схема медленных стадий фотолиза родопсина

3.1.2. Медленные стадии фотолиза порфиропсина палочек карася.

3.1.2.1. Спектры поглощения наружных сегментов порфиропсиновых палочек.

3.1.2.2. Временной ход изменения концентраций фотопродуктов и кинетическая схема медленных стадий фотолиза порфиропсина.

3.2. Фотолиз колбочкоподобных и колбочковых зрительных пигментов

3.2.1. Медленные стадии фотолиза зрительного пигмента зеленых палочек лягушки.

3.2.1.1. Спектры поглощения наружных сегментов зеленых палочек.

3.2.1.2. Спектры поглощения метапигментов 1 и IIзеленых палочек

3.2.1.3. Образование в зеленых палочках метапигмента III.

3.2.1.4. Конечные продукты фотолиза пигмента зеленых палочек.

3.2.1.5. Временной ход изменения концентраций фотопродуктов.

3.2.1.6. Кинетическая схема медленных стадий фотолиза зрительного пигмента зеленых палочек.

3.2.2. Медленные стадии фотолиза зрительного пигмента красных колбочек карася.

3.2.2.1. Спектры поглощения наружных сегментов красных колбочек

3.2.2.2. Временной ход изменения концентраций фотопродуктов.

3.2.2.3. Кинетическая схема медленных стадий фотолиза зрительного пигмента красных колбочек.

3.3. Продукты фотолиза зрительных пигментов и темновая адаптация фоторецепторов.

3.3.1. Восстановление чувствительности палочек после значительного обесцвечивания.

3.3.1.1. Свойства фотоответов палочек.

3.3.1.2. Математическое моделирование сигнальной активности каскада фототрансдукции в палочках.

3.3.2. Восстановление чувствительности колбочек после значительного обесцвечивания.

3.3.2.1. Свойства фотоответов колбочек.

3.3.2.2. Математическое моделирование сигнальной активности каскада фототрансдукции в колбочках.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Поляризационная микроспектрофотометрия как метод исследования процессов фотолиза in situ.

4.2. Отличие между процессами фотолиза in vitro и in vivo.

4.3. Особенности фотолиза палочковых и колбочковых зрительных пигментов in vivo.

4.4. Образование транс-ретинола в интактных фоторецепторах: лимитирующая стадия.

4.5. Роль долгоживущих продуктов фотолиза в темновой адаптации фоторецепторов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фотолиз зрительного пигмента и темновая адаптация фоторецепторов"

Актуальность проблемы

Зрительная система человека и животных способна функционировать в чрезвычайно широком диапазоне интенсивностей света и обеспечивать восприятие объектов в разное время суток, от ночи со слабым светом звезд до яркого солнечного дня. Одним из проявлений этой способности является феномен темновой адаптации — восстановление чувствительности зрительной системы к слабому свету после пребывания под действием высоких освещенностей, характерных для дневного времени. Темновая адаптация происходит как на уровне фоторецепторов и нейронных сетей сетчатки, так и на уровне центральных структур нервной системы. Однако именно изменения свойств фоторецепторов определяют поведение последующих звеньев обработки сигнала. Таким образом, адаптация на уровне фоторецепторных клеток (палочек и колбочек) является ключевым моментом для всего процесса.

Возбуждение фоторецепторов начинается с поглощения квантов света молекулами зрительного пигмента, которые находятся в наружных сегментах этих клеток. Зрительные пигменты принадлежат к классу семиспиральных трансмембранных рецепторных белков, передающих сигнал через ГТФ-связывающие белки (в-белки), к которым также относятся рецепторные белки обонятельной системы и некоторые рецепторы гормонов и нейромедиаторов. Из всех систем сигнализации через О-белки наиболее изучен механизм фототрансдукции - процесса, путем которого квант света, поглощенный зрительным пигментом, приводит к генерации электрического ответа фоторецепторной клетки. Поглощение кванта вызывает переход хромофорной группы пигмента (11-г/мс-ретиналя) в транс-форму и инициирует серию конформационных переходов, приводящих к появлению активной конформации - метапигмента II, который связывается с в-белком.

Последующие превращения приводят к фотолизу зрительного пигмента -отделению транс-хромофора от апобелка опсина. При этом хромофорное место на опсине делается доступным для связывания новой молекулы 11 -цис-ретиналя, что обеспечивает восстановление исходной (темновой) структуры зрительного пигмента.

Фотолиз зрительного пигмента палочек - фоторецепторов сумеречного зрения - исследован достаточно хорошо как в детергентных экстрактах, так и в интактных фоторецепторах. Процессы фотолиза зрительных пигментов колбочек - фоторецепторов дневного зрения - исследованы значительно меньше, поскольку экспериментальные возможности ограничены трудностью получения достаточного количества колбочковых пигментов для исследований in vitro. При этом данных о фотолизе колбочковых пигментов в интактных фоторецепторах (in situ) почти нет, а имеющиеся в этом отношении немногочисленные работы выполнены с использованием методик, которые не позволяют надежно идентифицировать все продукты фотолиза в колбочках.

В настоящее время предполагается, что в палочках процесс темновой адаптации определяется течением медленных реакций, связанных с распадом долгоживущих продуктов фотолиза и регенерацией темнового зрительного пигмента (родопсина). Известно, что метародопсин II инактивируется за несколько секунд путем множественного фосфорилирования родопсинкиназой и последующего связывания с белком аррестином. Однако предполагается, что остаточная каталитическая активность инактивированного метародопсина II и других фосфорилированных и связанных с аррестином метапигментов (метародопсинов I и III) может стимулировать постоянное возбуждение каскада и снижать чувствительность фоторецептора. В таком случае для устранения следовой сигнальной активности, окончательного выключения каскада и достижения темноадаптированного состояния фоторецептора необходим полный распад накопившихся на свету метародопсинов на ретиналь и опсин. Из психофизических экспериментов известно, что в колбочках темновая адаптация происходит как минимум на порядок быстрее, чем в палочках. Возможно, что такое различие в скоростях адаптации связано с разными скоростями фотопревращений, палочкового и колбочкового пигментов, но прямое подтверждение этого при анализе in vivo пока отсутствует.

Наследственные или приобретенные дефекты зрительного цикла, включающего фотолиз и восстановление зрительного пигмента, приводят к нарушениям процесса темновой адаптации и являются причиной многих заболеваний сетчатки. Среди них болезнь Штаргардта - одна из распространенных причин потери зрения, в том числе и в молодом возрасте, стационарная ночная слепота, палочко-колбочковая дегенерация, различные формы возрастной макулярной дегенерации и некоторые формы пигментного ретинита [обзоры: Baehr et al., 2003; Thompson^ & Gal, 2003]. Поскольку сложные нарушения зрения на системном уровне могут вызываться одиночным молекулярным дефектом, необходимо исследовать превращения зрительного пигмента на уровне отдельных реакций в условиях in vivo. Это позволит выяснить, какие стадии определяют ход темновой адаптации фоторецепторов ночного и дневного зрения в нормальных условиях и при различных патологических состояниях.

Цель и задачи исследования

Процессы фотолиза, играющие ключевую роль в регенерации зрительного пигмента и, как предполагается, в темновой адаптации фоторецепторов, относительно хорошо изучены лишь для родопсина палочек и совершенно не исследованы в интактных колбочках. Соответственно, целью данной работы было сравнение фотолиза палочковых и колбочковых зрительных пигментов in vivo и анализ роли долгоживущих фотопродуктов в темновой адаптации палочек и колбочек.

Использованные в данной работе методы микроспектрофотометрии и электрофизиологических отведений от одиночных фоторецепторов в сочетании с математическим моделированием позволили решить следующие задачи:

3. Сопоставить отличия? процессов фотолиза палочковых и колбочковых зрительных пигментов? с особенностями временного хода темновой адаптации палочек и колбочек.

Научная новизна результатов исследования

Исследование кинетики фото превращений зрительного пигмента позволило установить, что в; палочках генерация конечного продукта фотолиза (ретинола) лимитируется образованием ретиналя в результате распада метапродуктов, а в колбочках - реакцией восстановления ретиналя в ретинол, катализируемой ферментом ретинолдегидрогеназой.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Схема медленных стадий фотолиза, установленная ранее для родопсина быка и лягушки, не является универсальной, поскольку образующиеся продукты фотолиза зависят как от вида зрительного пигмента, так и от вида животного.

3. Лимитирующей стадией в генерации одного из ключевых продуктов зрительного цикла - транс-ретинола — в палочках является образование ретиналя в результате распада метапродуктов, а в колбочках -ретинолдегидрогеназная реакция.

Теоретическая и практическая значимость работы

Выполненное в данной работе сравнительное исследование фотолиза зрительных пигментов и процессов темновой адаптации разных типов, фоторецепторов из сетчаток рыб и амфибий? позволило прояснить молекулярные механизмы, лежащие в основе темновой адаптации зрения. Кроме того, оно позволило объяснить различия в скорости восстановления чувствительности палочек и колбочек после воздействия света высокой интенсивности и, следовательно, различия скоростей адаптации дневного и ночного зрения.

Весьма вероятно,. что полученные выводы также справедливы и для фоторецепторов млекопитающих, включая человека, поскольку принципиальное отличие между палочками и колбочками, заключающееся в более высокой; скорости фотолиза зрительного пигмента и темновой адаптации последних, согласуется с физиологическим; отличием дневного зрения от ночного как у холоднокровных, так и у теплокровных позвоночных. Эти результаты могут оказаться г полезными и при изучении других клеточных систем передачи сигнала через в-белки,. о которых известно значительно меньше, чем; о передаче сигнала в каскаде фототрансдукции.

Связь, установленная между определенными, стадиями: фотолиза ш этапами темновой адаптации, позволила определить те критические стадии фотолиза, которые могут быть мишенью при; различных заболеваниях сетчатки, связанных с нарушениями темновой адаптации.

Апробация работы и публикации результатов исследования

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих научных конференциях:

XII Международном совещании и V школе по эволюционной: физиологии (Санкт-Петербург, 2001);

V Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2002);

VI Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2002);

VII Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2003);

II Международном симпозиуме '^эшпаиит" (Твярминне, Финляндия,

2003);

VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2004);

III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004);

III Международном симпозиуме "Х^юпаНит" (Твярминне, Финляндия, 2004);

Международном симпозиуме по физиологии клетки (Санкт-Петербург, 2004);

XXVIII Европейской конференции по зрительному восприятию (Ла Корунья, Испания, 2005);

IV Международном симпозиуме '^Бюпагшт" (Твярминне, Финляндия, 2005).

По материалам диссертации опубликовано 11 тезисов докладов на российских и международных конференциях и 4 научные статьи в рецензируемых журналах, 2 из которых - в международных изданиях.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Голобокова, Елена Юрьевна

выводы

1. При помощи скоростного дихроичного микроспектрофотометра исследованы медленные реакции фотолиза зрительного пигмента в интактных палочках и колбочках амфибий и рыб, и установлены кинетические схемы взаимопревращений метапродуктов I, II, III, ретиналя и ретинола.

3. В зависимости от вида животного, скорость распада колбочковых метапигментов в 10-70 раз выше, чем у палочковых метародопсинов/ метапорфиропсинов.

4. Лимитирующей стадией в генерации одного из ключевых продуктов зрительного цикла - транс-ретинола - в палочках является образование ретиналя в результате распада метародопсинов, а в колбочках - превращение ретиналя в ретинол, катализируемое ферментом ретинолдегидрогеназой.

5. При электрофизиологическом исследовании одиночных палочек и колбочек показано, что выход фоторецепторов из насыщения после действия ярких стимулов происходит в две временные фазы. Первая фаза определяется быстрой инактивацией метапигмента II, а вторая - медленным распадом метапигментов на опсин и ретиналь и последующей регенерацией темнового пигмента.

6. Каталитические активности различных промежуточных продуктов распада зрительного пигмента по отношению к полностью активному метапигменту II у палочек и колбочек близки и составляют для фосфорилированного мета II ~ 10", фосфорилированных и связанных с аррестином метапродуктов ~ 10'5, свободного опсина ~ 10"6.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Голобокова, Елена Юрьевна, Санкт-Петербург

1. Говардовский В.И. Фоторецепторы и зрительные пигменты сетчатки позвоночных: сравнительный и эволюционный аспект // Руководство по физиологии. Эволюционная физиология. Л.: Наука. - 1983. - Ч. 2. - С. 229-261.

2. Говардовский В.И., Голованевский Э.И., Зуева Л.В., Васильева И.Л. Роль клеточных органоидов в оптике фоторецепторов (исследование на СВЧ-моделях) // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1981. — Т. 17. -С.492-497.

3. Говардовский В.И., Зуева Л.В. Скоростной микроспектрофотометр для исследования фотолиза зрительных пигментов in situ Н Сенсорные системы. 2000. - Т. 14. - С. 288-296.

4. Каламкаров Г.Р., Островский М.А. Молекулярные механизмы зрительной рецепции // М.: Наука. 2002. - С. 279.

5. Кравков C.B. Глаз и его работа // М.: Медгиз. 1945. - С. 355.

6. Омельяненко В.Г., Михайлов А.И., Каламкаров Г.Р., Островский М.А., Гольданский В.И. Исследование динамических характеристик фоторецепторной мембраны рекомбинационно-кинетическим методом // ДАН СССР. 1977. - Т. 273. - С. 1498-1501.

7. Островский М.А., Говардовский В.И. Механизмы фоторецепции позвоночных // Руководство по физиологии. Физиология зрения. М.: Наука. - 1992. - С. 5-58.

8. Фельдман Т.Б., Федорович И.Б., Островский М.А. Особенности фотопревращения родопсина на ранних стадиях фотолиза // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2003. - Т. 89. - С. 113-122.

9. Фирсов М.Л., Говардовский В.И. Кинетика перехода метародопсин I -метародопсин II при фотолизе палочковых и колбочковых зрительных пигментов холоднокровных и теплокровных животных // Сенсорныесистемы. 1988. - Т. 2. - С. 10-16.

10. Фирсов M.JL, Говард овский В.И. Световая адаптация фоторецепторов: смысл и механизмы // Сенсорные системы. 2001. - Т. 15. -С. 102-115.

11. И. Хартридж Г. Современные успехи физиологии зрения // М.: Издательство иностранной литературы. 1952. - С. 326.

12. Шуколюков С.А. Ключевые реакции зрительного цикла позвоночных и беспозвоночных: активация и регенерация родопсина // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1999. - Т. 35. — С. 441-452.

13. Abrahamson E.W., Marquisee J., Gavuzzi P., Roubie J. Flash photolysis of visual pigments // Z. Electrochem. 1960. - V. 64. - P. 177-180.

14. Abrahamson E.W., Ostroy S.E. The photochemical and macromolecular aspects of vision // Review. Progress in Biophysics and Molecular Biology.-1967.-V. 17.-P. 179-215.

15. Abrahamson E.W., Wiesenfeld J. The structure, spectra and photochemistry of visual pigments // Experimental Eye Research. 1969. - V. 8. -P. 242-243.

16. Abrahamson E.W., Wiesenfeld J. The structure, spectra and reactivity of visual pigments // In Handbook of Sensory Physiology, eds. Jameson D., Hurvich L.M. Berlin: Springer-Verlag. - 1972. - V. 7/2. - Chapter 1. - P. 567-607.

17. Applebury M.L., Zuckerman D.M., Lamola A.A., Jovin T.M. Rhodopsin. Purification and recombination with phospholipids assayed by the metarhodopsin I leads to metarhodopsin II transition // Biochemistry. 1974. - V. 13. - P. 3448-3458.

18. Arshavsky V. Like night and day: rods and cones have different pigment regeneration pathways // Review. Neuron. - 2002. — V. 36. - P. 1-3.

19. Arshavsky V.Y., Lamb T.D., Pugh E.N. Jr. G proteins and phototransduction // Review. Annual Review of Physiology. - 2002. - V. 64.1. P. 153-187.to

20. Azuma K., Azuma M., Sickel W. Regeneration of rhodopsin in frog rod outer segments // Journal of Physiology (Lond.). 1977. - V. 271. - P. 747-759.

21. Baehr W., Morita E.A., Swanson R.J., Applebury M.L. Characterization of bovine rod outer segment G-protein // The Journal of Biological Chemistry. -1982. V. 257. - P. 6452-6460.

22. Baehr W., Wu S.M., Bird A.C., Palczewski K. The retinoid cycle and retina disease // Vision Research. 2003. - V. 43. - P. 2957-2958.

23. Barlow H.B. Dark and light adaptation: psychophysics // In Handbook of Sensory Physiology, eds. Jameson D., Hurvich L.M. Berlin: Springer-Verlag. -1972.-V. 7/4.-P. 1-28.9 24. Baumann C. Flash photolysis of rhodopsin in the isolated frog retina //

24. Vision Research. 1970. - V. 10. - P. 789-798.

25. Baumann C. Kinetics of slow thermal reactions during the bleaching of rhodopsin in the perfused frog retina // Journal of Physiology. 1972. - V. 222. -P. 643-663.

26. Baumann C. The equilibrium between metarhodopsin I and metarhodopsin II in the isolated frog retina // Journal of Physiology. 1978. - V. 279.-P. 71-80.

27. Baumann C. The formation of metarhodospin380 in the retinal rods of the frog // Journal of Physiology. 1976. - V. 259. - P. 357-366.

28. Baumann C., Bender S. Kinetics of rhodopsin bleaching in the isolated human retina // Journal of Physiology. 1973. - V. 235. - P. 761-773.

29. Baylor D.A., Lamb T.D., Yau K.W. Responses of retinal rods to single photons // Journal of Physiology (Lond.). 1979. - V. 288. - P. 613-634.

30. Baylor D.A., Matthews G., Yau K.W. Two components of electrical dark noise in toad retinal rod outer segments // Journal of Physiology. 1980. - V. 309. -P. 591-621.

31. Becker R.S. The visual process: photophysics and photoisomerization of model visual pigments and the primary reaction // Review. Photochemistry and Photobiology. - 1988. - V. 48. - P. 369-399.

32. Bennett N. Light-induced interactions between rhodopsin and the GTP-binding protein. Relation with phosphodiesterase activation // European Journal of Biochemistry. 1982. - V. 123. - P. 133-139.

33. Bennett N., Michel-Villaz M., Kiihn H. Light-induced interaction between rhodopsin and the GTP-binding protein. Metarhodopsin II is the major photoproduct involved // European Journal of Biochemistry. 1982. - V. 127. - P. 97-103.

34. Bennett N., Sitaramayya A. Inactivation of photoexcited rhodopsin in retinal rods: the roles of rhodopsin kinase and 48-kDa protein (arrestin) // Biochemistry. 1988.-V. 27.-P. 1710-1715.

35. Bernstein P.S., Law W.C., Rando R.R. Biochemical characterization of the retinoid isomerase system of the eye // The Journal of Biological Chemistry. -1987. V. 262. - P. 16848-16857.

36. Bonting S.L., Rotmans J.P., Daemen F.J.M. Chromophore migration after illumination of rhodopsin // In Biochemistry and Physiology of Visual Pigments, ed. Langer H. Berlin: Springer-Verlag. - 1973. - P. 39-44.

37. Bowmaker J.K. Long-lived photoproducts of the green-rod pigment of the frog, Rana temporaria II Vision Research. 1977. - V. 17. - P. 17-23.

38. Bowmaker J.K. Microspectrophotometry of vertebrate photoreceptors // Vision Research. 1984. - V. 24. - P. 1641-1650.

39. Bridges C.D.B. Studies on the flash photolysis of visual pigments. IV. Dark reactions following the flash-irradiation of frog rhodopsin in suspensions of isolated photoreceptors // Vision Research. 1962. - V. 2. - P. 215-232.

40. Bridges C.D., Alvarez R.A. The visual cycle operates via an isomerase acting on all-trans retinol in the pigment epithelium I I Science. 1987. - V. 236. -P. 1678-1680.

41. Brown P.K. Rhodopsin rotates in the visual receptor membrane // Nature " New Biology. - 1972.- V. 236. -P. 35-38.

42. Brown P.K., Wald G. Visual pigments in human and monkey retina // Nature (Lond.). 1963. - V. 200. - P. 37-43.

43. Burns M.E., Baylor D.A. Activation, deactivation and adaptation in vertebrate photoreceptor cells // Annual Review of Neuroscience. 2001. - V. 24. -P. 779-805.

44. Burns M.E., Lamb T.D. Visual transduction by rod and cone photoreceptors // In The Visual Neurosciences, eds. Chalupa L.M;, Werner L.S. Cambridge, MA: MIT Press. 2003. - Chapter 16. - P. 215-233.

45. Burns M.E., Mendez A., Chen J., Baylor D.A. Dynamics of cyclic GMP • synthesis in retinal rods // Neuron. 2002. - V. 36. - P. 81-91.

46. Calvert P.D., Govardovskii V.I., Arshavsky V.Y., Makino C.L. Two temporal phases of light adaptation in retinal rods // The Journal of General Physiology. 2002. - V. 119. - P. 129-145.

47. Calvert P.D., Govardovskii V.I., Krasnoperova N., Anderson R.E., Lem J., Makino C.L. Membrane protein diffusion sets the speed of rod phototransduction //Nature. 2001. - V. 411. - P. 90-94.

48. Calvert P.D., Makino C.L. The time course of light adaptation in vertebrate retinal rods // Review. Advances in Experimental Medicine and Biology. - 2002. - V. 514. - P. 37-60.

49. Chabre M., Breton J. The orientation of the chromophore of vertebrate rhodopsin in the "meta" intermediate states and the reversibility of the meta II -meta III transition // Vision Research. 1979. - V. 19. - P. 1005-1018.

50. Chen C.K., Burns M.E., He W., Wensel T.G., Baylor D.A., Simon M.I. Slowed recovery of rod photoresponse in mice lacking the GTPase accelerating protein RGS9-1 // Nature. 2000. - V. 403. - P. 557-560.

51. Chen Y., Noy N. Retinoid specificity of interphotoreceptor retinoid-binding protein // Biochemistry. 1994. - V. 33. - P. 10658-10665.

52. Cobbs W.H., Pugh E.N. Jr. Kinetics and components of the flash photocurrent of isolated retinal rods of the larval salamander, Ambystoma tigrinum // Journal of Physiology. 1987. - V. 394. - P. 529-572.

53. Cone R.A., Cobbs W.H. Rhodopsin cycle in the living eye of the rat // Nature (Lond.). 1969. - V. 221. - P. 820-822.

54. Cooper A. Energy uptake in the first step of visual excitation // Nature. -1979.-V. 282.-P. 531-533.

55. Cornwall M.C., Fain G.L. Bleached pigment activates transduction in isolated rods of the salamander retina // Journal of Physiology (Lond.). 1994. -V. 480/2.-P. 261-279.

56. Dartnall H.J. The visual pigment of the green rods // Vision Research. -1967.-V. 7.-P. 1-16.

57. DeGrip W.J., Daemen F.J., Bonting S.L. Enrichment of rhodopsin in rod outer segment membrane preparations. Biochemical aspects of the visual process // Vision Research. 1972. - V. 12. - P. 1697-1707.

58. DeGrip W.J., Rothschild K.J. Structure and mechanisms of vertebrate visual pigments // In Handbook of Biological Physics, eds. Stavenga D.G., DeGrip W.J., Pugh E.N. Jr. Elsevier Science B.V. - 2000. - V. 3. - Chapter 1. - P. 1-54.

59. Denton E.J. The contribution of oriented photosensitive and other molecules to the absorption of whole retina // Proceedings of the Royal Society B. 1959.-V. 150.-P. 78-94.

60. Dizhoor A.M., Olshevskaya E.V., Henzel W.J., Wong S.C., Stults J.T.,

61. Ankoudinova I., Hurley J.B. Cloning, sequencing, and expression of a 24-kDa Ca -binding protein activating photoreceptor guanylyl cyclase // The Journal of Biological Chemistry. 1995. - V. 270. - P. 25200-25206.

62. Donner K.O. Rod dark-adaptation and visual pigment photoproducts // In Biochemistry and Physiology of Visual Pigments, ed. Langer H. Berlin: Springer-Verlag. - 1973. - P. 205-209.

63. Donner K.O., Hemila S. Kinetics of long-lived rhodopsin photoproducts in the frog retina as a function of the amount bleached // Vision Research. 1975. -V. 15.-P. 985-995.

64. Donner K.O., Hemila S., Hongell K., Reuter T. Long-lived photoproducts of porphyropsin in the retina of the crucian carp (Carassius carassius) // Vision Research. 1974. - V. 14. - P. 1359-1370.

65. Donner K.O., Reuter T. Dark-adaptation processes in the rhodopsin rods of the frog's retina // Vision Research. 1967. - V. 7. - P. 17-41.

66. Donner K.O., Reuter T. The photoproducts of rhodopsin in the isolated retina of the frog // Vision Research. 1969. - V. 9. - P. 815-847.

67. Donner K.O., Reuter T. Visual pigments and photoreceptor function // In Frog Neurobiology, eds. Llinas L., Precht W. Berlin-Heidelberg: SpringerVerlag. - 1976. - Chapter 8. - P. 251-277.

68. Ebrey T.G., Yoshizawa T. The circular dichroism of rhodopsin and lumirhodopsin // Experimental Eye Research. 1973. - V. 17. - P. 545-556.

69. Edwards R.B., Adler A.J. Exchange of retinol between IRBP and CRBP // Experimental Eye Research. 1994. - V. 59. - P. 161-170.

70. Einterz C.M., Hug S.J., Lewis J.W., Kliger D.S. Early photolysis intermediates of the artificial visual pigment 13-demethylrhodopsin //

71. Biochemistry. 1990. - V. 29. - P. 1485-1491.

72. Emeis D., Kiihn H., Reichert J., Hofmann K.P. Complex formation between metarhodopsin II and GTP-binding protein in bovine photoreceptor membranes leads to a shift of the photoproduct equilibrium // FEBS Letters. -1982.-V. 143.-P. 29-34.

73. Ernst W., Kemp C.M. Studies on the effects of bleaching amphibian rod pigments in situ. III. Linear dichroism in axolotl red rods before and during bleaching // Experimental Eye Research. 1978. - V. 27. - P. 101-116.

74. Ernst W., Kemp C.M., White H.A. Studies of the effects of bleaching amphibian rod pigments in situ. II. The kinetics of slow bleaching reactions in axolotl red rods // Experimental Eye Research. 1978. - V. 26. - P. 337-350.

75. Fain G.L., Matthews H.R., Cornwall M.C. Dark adaptation in vertebrate photoreceptors // Review. Trends in Neurosciences. - 1996. - V. 19. - P. 502-507.

76. Fain G.L., Matthews H.R., Cornwall M.C., Koutalos Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors // Physiological Review. 2001. - V. 81. — P. 117-151.

77. Fesenko E.E., Kolesnikov S.S., Lyubarsky A.L. Induction by cyclic GMP of cationic conductance in plasma membrane of retinal rod outer segment // Nature. 1985. - V. 313. - P. 310-313.

78. Fung B.B.K., Stryer L. Photolyzed rhodopsin catalyzed the exchange of GTP for bound GDP in retinal rod outer segments // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1980. - V. 77. - P. 2500-2504.

79. Futterman S., Hendrickson A., Bishop P.E., Rollins M.H., Vacano E. Metabolism of glucose and reduction of retinaldehyde in retinal photoreceptors // J. Neurochem. 1970. -V. 17. - P. 149-156.

80. Godchaux W., Zimmerman W.F. Membrane-dependent guanine nucleotide binding and GTPase activities of soluble protein from bovine rod cell outer segments // The Journal of Biological Chemistry. 1979. - V. 254. - P. 7874-7884.

81. Goldstein E.B. Cone pigment regeneration in the isolated frog retina // Vision Research. 1970.-V. 10.-P. 1065-1068.

82. Goldstein E.B., Wolf B.M. Regeneration of the green-rod pigment in the isolated frog retina // Vision Research. 1973. - V. 13. - P. 527-534.

83. Gollapalli D.R., Maiti P., Rando R.R. RPE65 operates in the vertebrate visual cycle by stereospecifically binding all-trans retinyl esters // Biochemistry. — 2003. V. 42. - P. 11824-11830.

84. Gollapalli D.R., Rando R.R. All-fraws-retinyl esters are the substrates for isomerization in the vertebrate visual cycle // Biochemistry. 2003. - V. 42. - P. 5809-5818.

85. Gonzalez-Fernandez F. Evolution of the visual cycle: the role of retinoid-binding proteins // J. Endocrinol. 2002. - V. 175. - P. 75-88.

86. Govardovskii V.I., Fyhrquist N., Reuter T., Kuzmin D.G., Donner K. In search of the visual pigment template // Visual Neuroscience. 2000. - V. 17. - P. 509-528.

87. Gyllenberg G., Reuter T., Sippel H. Long-lived photoproducts of rhodopsin in the retina of the frog // Vision Research. 1974. - V. 14. - P. 1349-1357.

88. Hamdorf K., Schwemer J., Gogala M. Insect visual pigment sensitive to ultraviolet light//Nature. 1971. -V. 231. -P. 458-459;

89. Harosi F.I. Absorption spectra and linear dichroism of some amphibian photoreceptors // The Journal of General Physiology. 1975. - V. 66. - P. 357-382.

90. Harosi F.I. Polarized microspectrophotometry for pigment orientation and concentration // Methods in Enzymology. 1982. - V. 81. - P. 642-647.

91. Härosi F.I., MacNichol E.F. Jr. Dichroic microspectrophotometer: a computer-assisted, rapid, wavelength-scanning photometer for measuring linear dichroism in single cells // Journal of the Optical Society of America. —1974. V. 64.-P. 903-918.

92. Harosi F.I., Malerba F.E. Plane-polarized light in microspectrophotometry //Vision Research. 1975.-V. 15. - P. 379-388.

93. Hecht S., Haig C., Chase A.M. The influence of light adaptation on subsequent dark adaptation of the eye // The Journal of General Physiology. -1937.-V. 20.-P. 831-850.

94. Heck M., Schädel S.A., Maretzki D., Hofmann K.P. Secondary binding sites of retinoids in opsin: characterization and role in regeneration // Vision Research. 20036. - V. 43. - P. 3003-3010.

95. Henselman R.A., Cusanovich M.A. Characterization of the recombination reaction of rhodopsin // Biochemistry. 1976. - V. 15. - P. 5321-5325.

96. Hodgkin A.L., McNaughton P.A., Nunn B.J. Measurement of sodium-calcium exchange in salamander rods // Journal of Physiology. 1987. - V. 391. -P. 347-370.

97. Hofmann K.P. Late photoproducts and signaling states of bovine rhodopsin // In Handbook of Biological Physics, eds. Stavenga D.G., DeGrip W.J., Pugh, E.N. Jr. Elsevier Science B.V. - 2000. - V. 3. - Chapter 3. - P. 91-142.

98. Hofmann K.P. Photoproducts of rhodopsin in the disk membrane // Photobiochemistry and Photobiophysics. 1986. - V. 13. - P. 309-327.

99. Hofmann K.P., Jäger S., Ernst O.P. Structure and function of activated rhodopsin //Israel Journal of Chemistry. 1995. - V. 35. - P. 339-355.

100. Hofmann K.P., Pulvermüller A., Buczylko J., Van Hooser P., Palczewski

101. K. The role of arrestin and retinoids in the regeneration pathway of rhodopsin // The Journal of Biological Chemistry. 1992. - V. 267. - P. 15701-15706.

102. Hsu Y.T., Molday R.S. Modulation of the cGMP-gated channel of rod photoreceptor cells by calmodulin //Nature. 1993. - V. 361. - P. 76-79.

103. Hubbard R., Brown P.K., Bownds D. Methodology of vitamin A and visual pigments // Methods in Enzymology. 1971. - V. 18. - P. 615-653.

104. Hug S.J., Lewis J.W., Einterz C.M., Thorgeirsson T.E., Kliger D.S. Nanosecond photolysis of rhodopsin: evidence for a new, blue-shifted intermediate // Biochemistry. 1990. - V. 29. - P. 1475-1485.

105. Imai H., Imamoto Y., Yoshizawa T., Shichida Y. Difference in molecular properties between chicken green and rhodopsin as related to the functional difference between cone and rod photoreceptor cells // Biochemistry. -1995. V. 34. - P. 10525-10531.

106. Imai H., Kojima D., Oura T., Tachibanaki S., Terakita A., Shichida Y. Single amino acid residue as a functional determinant of rod and cone visual pigments // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1997. -V. 94.-P. 2322-2326.

107. Imamoto Y., Imai H., Yoshizawa T., Shichida Y. Thermal recovery of iodopsin from its meta I-intermediate // FEBS Letters. 1994. - V. 354. - P. 165-168.

108. Kandori H., Shichida Y., Yoshizawa T. Absolute absorption spectra ofbatho- and photorhodopsins at room temperature. Picosecond laser photolysis of rhodopsin in polyacrylamide // Biophysical Journal. 1989. - V. 56. - P. 453-457.

109. Kawamura S. Rhodopsin phosphorylation as a mechanism of cyclic GMP phosphodiesterase regulation by S-modulin // Nature. 1993. - V. 362. - P. 855-857.

110. Kito Y., Seki T., Suzuki T., Uchiyama I. 3-Dehydroretinal in the eye of a bioluminescent squid Watasenia scintillans II Vision Research. 1986. - V. 26. -P. 275-279.

111. Klenchin V.A., Calvert P.D., Bownds M.D. Inhibition of rhodopsin kinase by recoverin. Further evidence for a negative feedback system in phototransduction // The Journal of Biological Chemistry. 1995. - V. 270. - P. 16147-16152.

112. Kliger D.S., Lewis J.W. Spectral and kinetic characterization of visual pigment photointermediates // Israel Journal of Chemistry. 1995. - V. 35.,- P. 289-307.

113. Knowles A., Dartnall H.J.A. The photobiology of vision // In The Eye, ed. Davson H. London-New York: Academic Press. - 1977. - V. 2B. - P. 53-101.

114. Knowles A., Pepe I.M. Can metarhodopsin I activate rod outer segment phosphodiesterase? //Cell Biophysics. 1988. - V. 13. - P. 43-53.

115. Kojima D., Oura T., Hisatomi O., Tokunaga F., Fukada Y., Yoshizawa T., Shichida Y. Molecular properties of chimerical mutants of gecko blue and bovine rhodopsin // Biochemistry. 1996. - V. 35. - P. 2625-2629.

116. Kolesnikov A.V., Golobokova E.Yu., Govardovskii V.I. The identity ofmetarhodopsin III I I Visual Neuroscience. 2003. - V. 20. - P. 249-265.

117. Kuhn H., Hall S.W., Wilden U. Light-induced binding of 48-kDa protein to photoreceptor membranes is highly enhanced by phosphorylation of rhodopsin // FEBS Letters. 1984. - V. 176. - P. 473-478.

118. Kuksa V., Imanishi Y.f Batten M., Palczewski K., Moise A.R. Retinoid cycle in the vertebrate retina: experimental approaches and mechanisms of isomerization. // Vision Research. 2003. - V. 43. - P. 2959-2981.

119. Kuwayama S., Imai H., Hirano T., Terakita A., Shichida Y. Conserved proline residue at position 189 in cone visual pigments as a determinant of molecular properties different from rhodopsins // Biochemistry. 2002. - V. 41.m P. 15245-15252.

120. Kuwayama S., Imai H., Morizumi T., Shichida Y. Amino acid residues responsible for the meta-III decay rates in rod and cone visual pigments // Biochemistry. 2005. - V. 44. - P. 2208-2215.

121. Lagnado L., Cervetto L., McNaughton P.A. Calcium homeostasis in the outer segments of retinal rods from the tiger salamander // Journal of Physiology. -1992.-V. 455.-P. 111-142.

122. Lamb T.D. The involvement of rod photoreceptors in dark adaptation // Vision Research. 1981. -V. 21. - P. 1771-1782.

123. Lamb T.D., Pugh E.N. Jr. Dark adaptation and the retinoid cycle of vision // Progress in Retinal and Eye Research. 2004. - V. 23. - P. 307-380.

124. Leibrock C.S., Lamb T.D. Effect of hydroxylamine on photon-like events during dark adaptation in toad rod photoreceptors // Journal of Physiology. 1997. - V. 501.-P. 97-109.

125. Leibrock C.S., Reuter T., Lamb T.D. Dark adaptation of toad rod photoreceptors following small bleaches // Vision Research. 1994. - V. 34. - P. 2787-2800.

126. Leibrock C.S., Reuter T., Lamb T.D. Molecular basis of dark adaptationin rod photoreceptors // Eye. 1998. - V. 12. - P. 511-520.

127. Lewis J.W., Kliger D.S. Photointermediates of visual pigments // Review. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. - 1992. - V. 24. - P. 201-210.

128. Lewis J.W., Liang J., Ebrey T.G., Sheves M., Livnah N., Kuwata O., Jager S., Kliger D.S. Early photolysis intermediates of gecko and bovine artificial visual pigments // Biochemistry. 1997a. - V. 36. - P. 14593-14600.

129. Lewis J.W., Van Kuijk F.J.G.M., Carruthers J.A., Kliger D.S. Metarhodopsin III formation and decay kinetics: comparison of human and bovine rhodopsin // Vision Research. 19976. - V. 37. - P. 1-8.

130. Liebman P.A. Microspectrophotometry of photoreceptors // Handbook of Sensory Physiology. Photochemistry of Vision, ed. Dartnall H.J.A. Berlin-Heidelberg-New York: Springer-Verlag. -1972. - V. 7/1. - P. 481-528.

131. Liebman P.A., Parker K.R., Dratz E.A. The molecular mechanism of visual excitation and its relation to the structure and composition of the rod outer segment // Review. Annual Review of Physiology. - 1987. - V. 49. - P. 765-791.

132. Lin S.W., Han M., Sakmar T.P. Analysis of functional microdomains of rhodopsin // Methods in Enzymology. 2000. - V. 315. - P. 116-130.

133. Liou G.I., Geng L., Baehr W. Interphotoreceptor retinoid-binding protein: biochemistry and molecular biology // Review. Progress in Clinical and Biological Research. - 1991. - V. 362. - P. 115-137.

134. Lolley R.N., Racz E. Calcium modulation of cyclic GMP synthesis in rat visual cells // Vision Research. 1982. - V. 22. - P. 1481-1486.

135. Longstaff C., Calhoon R.D., Rando R.R. Deprotonation of the Schiff base of rhodopsin is obligate in the activation of the G protein //Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1986. - V. 83. - P. 4209-4213.

136. Lythgoe R.G., Quilliam J.P. The relation of transient orange to visual purple and indicator yellow // Journal of Physiology. 1938. - V. 93. - P. 399-410.

137. Lyubarsky A.L., Pugh E.N. Jr. Recovery phase of the murine rod photoresponse reconstructed from electroretinographic recordings // The Journal of Neuroscience. 1996. - V. 76. - P. 563-571.

138. Makino C.L., Dodd R.L., Burns M.E., Roca A., Simon M.I., Baylor D.A. Recoverin regulates light-dependent phosphodiesterase activity in retinal rods // The Journal of General Physiology. 2004. - V. 123. - P. 729-741.

139. Marks W.B., Dobelle W.H., MacNichol E.F. Jr. Visual pigments of single primate cones // Science. 1964. - V. 143. - P. 1181-1183.

140. Mata N.L., Radu R.A, Clemmons R.S., Travis G.H. Isomerization and oxidation of vitamin A in cone-dominant retinas: a novel pathway for visual pigment regeneration in daylight // Neuron. 2002. - V. 36. - P. 69-80.

141. Matthews H.R., Murphy R.L., Fain G.L., Lamb T.D. Photoreceptor light adaptation is mediated by cytoplasmic calcium concentration // Nature. 1988. -V. 334.-P. 67-69.

142. Matthews R.G., Hubbard R., Brown P.K., Wald G. Tautomeric forms of metarhodopsin // The Journal of General Physiology. 1963. - V. 47. - P. 215-240.

143. McBee J.K., Palczewski K., Baehr W., Pepperberg D.R. Confronting complexity: the interlink of phototransduction and retinoid metabolism in the vertebrate retina // Progress in Retinal and Eye Research. 2001. - V. 20. - P. 469-529.

144. Melia T.J., Cowan C.W., Angleson J.K., Wensel T.G. A comparison of the efficiency of G-protein activation by ligand-free and light-activated forms of rhodopsin // Biophysical Journal. 1997. - V. 73. - P. 3182-3191.

145. Mendez A., Burns M.E., Roca A., Lem J., Wu L.W., Simon M.I., Baylor D.A., Chen J. Rapid and reproducible deactivation of rhodopsin requires multiple phosphorylation sites // Neuron. 2000. - V. 28. - P. 153-164.

146. Nakatani K., Yau K.W. Calcium and light adaptation in retinal rods and cones //Nature. 1988. - V. 334. - P. 69-71.

147. Nathans J. The evolution and physiology of human color vision: insights from molecular genetic studies of visual pigments // Neuron. 1999. - V. 24. - P. 299-312.

148. Nikonov S., Engheta H., Pugh E.N. Jr. Kinetics of recovery of the dark-adapted salamander rod photoresponse // The Journal of General Physiology. -1998.-V. 111.-P. 7-37.

149. Okada T., Matsuda T., Kandori H., Fukada Y., Yoshizawa T., Shichida

150. Y. Circular dichroism of metaiodopsin II and its binding to transducin: a comparative study between meta II intermediates of iodopsin and rhodopsin // Biochemistry. 1994. - V. 33. - P. 4940-4946.

151. Ono T., Shichida Y., Yoshizawa T. Low temperature spectrophotometric study of cattle bathorhodopsins produced from rhodopsin and isorhodopsin in transparent medium without cracks // Photochemistry and Photobiology. 1986. -V. 43.-P. 285-289.

152. Ostroy S.E., Erhardt F., Abrahamson E.W. Protein configuration changes in the photolysis of rhodopsin. II. The sequence of intermediates in thermal decay of cattle metarhodopsin in vitro II Biochemica and Biophysica Acta. 1966. - V. 112. -P. 265-277.

153. Pepperberg D.R., Birch D.G., Hofmann K.P., Hood D.C. Recovery kinetics of human rod phototransduction inferred from the two-branched a-wave saturation function // Journal of the Optical Society of America. 1996. - V. 13. -P. 586-600.

154. Pepperberg D.R., Cornwall M.C., Kahlert M., Hofmann K.P., Jin J., Jones G.J., Ripps H. Light-dependent delay in the falling phase of the retinal rod photoresponse // Visual Neuroscience. 1992. - V. 8. - P. 9-18.

155. Pepperberg D.R., Kahlert M., Krause A., Hofmann K.P. Photic modulation of a highly sensitive, near-infrared light-scattering signal recorded from intact retinal photoreceptors // Proceedings of the National Academy of

156. Sciences of the USA. 1988. - V. 85.-P. 5531-5535.

157. Poo M., Cone R.A. Lateral diffusion of rhodopsin in the photoreceptor membrane // Nature. 1974. - V. 247. - P. 438-441.

158. Protasova T.B., Fedorovich I.B., Ostrovsky M.A. Retinal isomers in photo- and electro-induced rhodopsin intermediates // Light in Biol, and Med. -1991.-V. 2.- P. 545-556.

159. Rando R.R. The biochemistry of the visual cycle // Chemical Reviews. -2001.-V. 101.-P. 1881-1896.

160. Rebrik T.I., Kotelnikova E.A., Korenbrot J.I. Time course and Ca(2+) dependence of sensitivity modulation in cyclic GMP-gated currents of intact cone photoreceptors // The Journal of General Physiology. 2000. - V. 116. - P. 521-534.

161. Reuter T. Long-lived photoproducts in the retina of the frog and the crucian carp // In Biochemistry and Physiology of Visual Pigments, ed. Langer H. Berlin: Springer-Verlag. - 1973. - P. 83-88.

162. Reuter T. Photoregeneration of rhodopsin and isorhodopsin from metarhodopsin III in the frog retina // Vision Research. 1976. - V. 16. - P. 909917.

163. Reuter T. The synthesis of photosensitive pigments in the rods of the frog's retina // Vision Research. 1966. - V. 6. - P. 15-38.

164. Reuter T., Donner K.O. Observations on metarhodopsin I and II in theretina of the frog // Experimental Eye Research. 1969. - V. 8. - P. 245.

165. Sagoo M.S., Lagnado L. The action of cytoplasmic calcium on the cGMP-activated channel in salamander rod photoreceptors // Journal of Physiology. 1996. - V. 497. - P. 309-319.

166. Schädel S.A., Heck, M., Maretzki D., Filipek S., Teller D.C., Palczewski K., Hofmann K.P. Ligand channeling with a G protein-coupled receptor // The Journal of Biological Chemistry. 2003. - V. 278. - P. 24896-24903.

167. Schoenlein R.W., Peteanu L.A., Mathies R.A., Shank C.V. The first step in vision: femtosecond isomerization of rhodopsin // Science. 1991. - V. 254. -P. 412-415.

168. Shichida Y., Kropf A., Yoshizawa T. Photochemical reactions of 13-demethyl visual pigment analogues at low temperatures // Biochemistry. — 1981. — V. 20.-P. 1962-1968.

169. Shichida Y., Okada T., Kandori H., Fukada Y., Yoshizawa T. Nanosecond laser photolysis of iodopsin, a chicken red-sensitive cone visual pigment//Biochemistry. 1993.-V. 32.-P. 10832-10838.

170. Tang L., Ebrey T.G., Subramaniam S. Sequences and structures of retinal proteins // Israel Journal of Chemistry. 1995. - V. 35. - P. 193-209.

171. Thompson D.A., Gal A. Vitamin A metabolism in the retinal pigment epithelium: genes, mutations and diseases // Progress in Retinal and Eye Research. 2003. - V. 22. - P. 683-703.

172. Vogel R., Ludeke S., Radu I., Siebert F., Sheves M. Photoreactions of metarhodopsin III // Biochemistry. 20046. - V. 43. - P. 10255-10264.

173. Wald G. The molecular basis of visual excitation // Nature. 1968. - V. 219.-P. 800-807.

174. Wald G. Vision // Federation Proceedings. 1953. - V. 12. - P. 606611.

175. Wald G. Visual excitation and blood clotting // Science. 1965. - V. 150.-P. 1028-1030.

176. Wald G., Brown P.K., Gibbons I.R. The problem of visual excitation // Journal of the Optical Society of America. 1963. - V. 53. - P. 20-35.

177. Wald G., Brown P.K., Smith P.H. Iodopsin // The Journal of Biological Chemistry. 1955. -V. 38. - P. 623-681.

178. Wald G., Hubbard R. The reduction of retinenel to vitamin A1 in vitro II The Journal of General Physiology. 1949. - V. 32. - P. 367-389.

179. Weng J., Mata N.L., Azarian S.M., Tzekov R.T., Birch D.G., Travis G.H. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in Abcr knockout mice // Cell. 1999. - V. 98.-P. 13-23.

180. Yau K.W., Nakatani K. Electrogenic Na-Ca exchange in retinal rod outer segment // Nature. 1984. - V. 311. - P. 661-663.

181. Yokoyama S., Yokoyama R. Comparative molecular biology of visual pigments // In Handbook of Biological Physics, eds. Stavenga D.G., DeGrip W.J., Pugh E.N. Jr. Elsevier Science B.V. - 2000. - V. 3. - Chapter 6. - P. 257-296.

182. Yoshizawa T. Molecular basis for color vision // Review. Biophysical Chemistry. - 1994. - V. 50. - P. 17-24.

183. Yoshizawa T. The road to color vision: structure, evolution and function of chicken and gecko visual pigments // Review. Photochemistry and Photobiology. - 1992. - V. 56. - P. 859-867.

184. Yoshizawa T., Imamoto Y. Structure and photobleaching process of chicken iodopsin // Biophysical Chemistry. 1995. - V. 56. - P. 57-62.

185. Yoshizawa T., Kuwata O. Iodopsin, a red-sensitive cone visual pigment in the chicken retina // Review. Photochemistry and Photobiology. - 1991. - V. 54.-P. 1061-1070.

186. Yoshizawa T., Shichida Y. Low-temperature circular dichroism of intermediates of rhodopsin // Methods in Enzymology. 1982. - V. 81. - 634—641.

187. Yoshizawa T., Shichida Y., Matuoka S. Primary intermediates of rhodopsin studied by low temperature spectrophotometry and laser photolysis. Bathorhodopsin, hypsorhodopsin and photorhodopsin // Vision Research. 1984. -V. 24.-1455-1463.

188. Yoshizawa T., Wald G. Photochemistry of iodopsin // Nature. 1967. -V. 214.-P. 566-571.

189. Yoshizawa T., Wald G. Pre-lumirhodopsin and the bleaching of visual pigments // Nature. 1963. - V. 197. - P. 1279-1286.

Информация о работе

Голобокова, Елена Юрьевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Фотолиз зрительного пигмента и темновая адаптация фоторецепторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Фотолиз зрительного пигмента и темновая адаптация фоторецепторов ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фотолиз зрительного пигмента и темновая адаптация фоторецепторов"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Голобокова, Елена Юрьевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фотолиз зрительного пигмента и темновая адаптация фоторецепторов"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Голобокова, Елена Юрьевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Голобокова, Елена Юрьевна, Санкт-Петербург

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фотолиз зрительного пигмента и темновая адаптация фоторецепторов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия