Механизмы адаптации фоторецепторов позвоночных

Фирсов, Михаил Леонидович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы адаптации фоторецепторов позвоночных
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы адаптации фоторецепторов позвоночных"

На правах рукописи

005053470

ФИРСОВ МИХАИЛ ЛЕОНИДОВИЧ

МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ ФОТОРЕЦЕПТОРОВ ПОЗВОНОЧНЫХ

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 8 ОКТ 2012

Санкт-Петербург - 2012

005053470

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова Российской академии наук

Научный консультант:

доктор биологических наук Говардовский Виктор Исаевич

Официальные оппоненты:

Казначеева Елена Валентиновна

Шпаков Александр Олегович

Колесников Станислав Сергеевич

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской академии наук

доктор биологических наук, доктор биологических наук, доктор биологических наук, Ведущая организация:

Защита состоится 23 Октября 2012 года в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.127.01 по присунедению ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова Российской академии наук по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, д. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИЭФБ РАН, с авторефератом - на сайте ВАК РФ.

Автореферат разослан 21 Сентября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного Маслова Марина Николаевна совета, доктор биологических наук, /7 ,

профессор ^Ж^и^^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Зрение обеспечивает животное информацией о трехмерной структуре окружающего мира, а также о спектральном составе поверхностей окружающих его материальных объектов. Эти задачи выполняются путем регистрации зрительными сенсорами - фоторецепторами - электромагнитных волн, отраженных от окружающих объектов. Естественным источником освещения на Земле служит солнечный свет - прямой днем и отраженный от Луны ночью. В зависимости от времени суток, спектральное распределение солнечного света меняется под воздействием различных факторов. Кроме того, в течение суток очень сильно меняется интенсивность света- от 10"4 люкс безлунной ночью (свет звезд) до 1.3х105 люкс прямого полуденного солнечного света. Очевидно, что для успешного осуществления стратегии выживания зрительная система животного должна быть эффективна во всем доступном диапазоне интенсивностей и в возможно более широких спектральных границах солнечного света.

Адаптация зрительной системы подразумевает, что в ней участвуют в разной степени все её составляющие, от зрачкового рефлекса до перестроек в нервных сетях. С другой стороны, очевидно, что фоторецепторы задают пределы функционирования зрительной системы. Если фоторецептор неспособен реагировать на стимуляцию, так как а) интенсивность стимула недостаточна, или б) длина волны стимула находится за пределами спектра поглощения рецептора, или в) фоторецептор уже насыщен предыдущей стимуляцией, то такой стимул не будет воспринят и обработан зрительной системой.

управляемых каналов мембраны к своему лиганду, а также снижает удельную реакцию каскада фототрансдукции на световую стимуляцию. По современным представлениям, это происходит за счет активации гуанилатциклазы и ускорения выключения активного родопсина и активного трансдуцина.

Накопленный массив данных о каскаде фототрансдукции позволил создать несколько математических моделей его работы. При анализе их работы выяснилось, что использование только известных канонических регулировок не позволяет воспроизвести наблюдаемые в эксперименте эффекты светового фона на фотоответы. Это заставляет обратиться поискам других, пока неизвестных механизмов регулировки.

Одним из до сих пор плохо изученных аспектов G-белковой сигнализации является регулировка её выключения. Кинетика выключения каскада определяет его чувствительность и временное разрешение, и таким образом является критической для правильного функционирования. Выключение каскада должно быть направлено на инактивацию рецепторной молекулы, инактивацию эффекторного фермента и восстановление концентрации вторичного посредника. Эти процессы являются мишенью многих, пока плохо изученных, механизмов регуляции. Первой проблемой является полное понимание процесса выключения рецепторной молекулы. Резкое понижение сигнальной активности родопсина после поглощения кванта света достигается его множественным фосфорилированием родопсинкиназой и последующим связыванием со специфическим белком - аррестином. В общих чертах этот процесс считается понятным, но точный временной ход инактивации метродопсина II неизвестен. Кинетика фосфорилирования, наблюдающаяся в биохимических экспериментах in vitro (Calvert et al., 1995; Kennedy et al, 2000), кажется недостаточно быстрой, чтобы объяснить физиологический ответ. С другой стороны, данные о выключении родопсина, извлекаемые из записей электрического ответа, полагаются на сложную многопараметрическую математическую модель и поэтому неоднозначны.

Второй проблемой является выключение активированного G-белка -трансдуцина. Собственная ГТФ-азаная активность трансдуцина низка и не может обеспечить своевременное выключение каскада. Она резко увеличивается в результате связывания с эффекторным ферментом (ФДЭ) и дальнейшего образования комплекса с белком RGS9/G|35 и с якорным белком R9AP, удерживающим RGS9 на мембране. Потенциально такая сложная система выключения эффекторного фермента допускает множество путей регуляции. Показано, что введение гипотетического ускорения инактивации ФДЭ в ходе световой адаптации позволяет значительно улучшить согласие модели фототрансдукции с экспериментом. Однако даже само существование какой-то регуляции времени жизни активной ФДЭ при физиологической стимуляции не показано ни в биохимическом, ни физиологическом эксперименте.

Многочисленные экспериментальные факты свидетельствуют, что помимо трех известных кальций-зависимых регулировок каскада фототрансдукции, существует другие, медленные и глубокие регулировки, биохимический механизм и даже мишени которых неизвестны. Одним из потенциальных посредников такой регулировки мог бы служить цАМФ. Показано, что уровень цАМФ в цитоплазме фоторецепторов подвержен циркадным ритмам. Внутри каскада фототрансдукции многие белки являются мишенями для цАМФ-зависимой протеинкиназы А (РКА) - гуанилатциклаза (ГЦ), GCAP, родопсинкиназа (GRK1), фосдуцин и CNG каналы. Более того, сейчас установлено, что фосфорилирование GRK1 является светозависимым (Osawa et al., 2008; Osawa et al., 2011). Существование циркадных ритмов цАМФ и мишеней для цАМФ-зависимой регулировки в каскаде фототрансдукции позволяет предположить, что цАМФ мог бы служить еще одним регулятором каскада. Однако такая регулировка in vivo не была до сих пор никем показана, и цАМФ не входит ни в одну из современных

схем фототрансдукции.

инактивация происходит путем связывания фосфорилированного родопсина (Ш1*-р) с белком аррестина. Аррестин (Агт) блокирует сайты взаимодействия родопсина с G-белком, G, и таким образом дополнительно снижает сигнальную активность в каскаде. При относительно слабых стимулах, генерирующих небольшое количество активных молекул Mil', фосфорилирование и присоединение аррестина можно рассматривать как полное выключение каскада. В этом случае, остаточной активностью комплексов MII-p-Arr а также последующих продуктов фотолиза, можно пренебречь. При сильных стимулах, генерирующих много MI, продукты распада Mil' генерирует в совокупности достаточно большой сигнал, обеспечивающий высокий уровень возбуждения фоторецептора.

Полное выключение каталитической активности родопсина и регенерация «темнового» зрительного пигмента служит механизмом темновой адаптации -восстановления чувствительности зрения при переходе от высоких освещенностей к низким. Поэтому скорости взаимопревращений продуктов распада родопсина на поздних стадиях фотолиза, а также их относительные остаточные активности являются критичными параметрами при определении динамики темновой адаптации фоторецепторов. Однако, детальный вклад поздних продуктов фотолиза в выключение каскада in vivo до сих пор неизвестен.

назад была высказана гипотеза о том, что более длинноволновые пигменты обладают большим собственным, т.н. «темновым» шумом, и поэтому положение их максимумов поглощения в средней части спектра есть эволюционный адаптивный компромисс (Barlow, 1956). Несмотря на всю привлекательность этой концепции, она долгое время не имела экспериментальной проверки. Неясным остается также сам механизм возникновения «темнового» шума. Существует гипотеза о генерации шума нестабильной фракцией родопсина с непротонированной формой Шиффова основания, также не проверенная пока в эксперименте.

В настоящей работе будут рассматриваться две группы процессов адаптации. Одна группа включает в себя физиологические процессы световой и темновой адаптации в течение суточного цикла изменения освещенностей. Другая группа составляет эволюционные адаптации к условиям обитания, в зависимости от спектрального и яркостного диапазона естественного освещения.

Цель исследования

На примере фоторецепторов рыб и амфибий исследовать физиологические и эволюционные механизмы, обеспечивающие адаптацию зрительной системы позвоночных к работе в широком диапазоне естественных освещенностей.

Задачи исследования

1. Установить кинетику активации и инактивации эффекторного фермента каскада фототрансдукции - ФДЭ - и проанализировать ее зависимость от уровня фонового освещения.

2. Создать методику, позволяющую манипулировать уровнем цАМФ в изолированном фоторецепторе амфибии в пределах, близких к естественным колебаниям цАМФ во время циркадных ритмов. Изучить влияние изменения внутриклеточного уровня цАМФ на работу каскада фототрансдукции. Выявить молекулярные мишени воздействия цАМФ на работу каскада фототрансдукции, определить параметры этого воздействия. Оценить значение регулирующего воздействия цАМФ на каскад фототрансдукции.

3. Изучить irt vivo динамику восстановления чувствительности фоторецептора после сильного обесцвечивания зрительного пигмента. Идентифицировать механизмы, определяющие скорость восстановления чувствительности фоторецептора при разных уровнях обесцвечивания зрительного пигмента. Определить относительный вклад поздних продуктов фотолиза в степень возбуждения каскада фототрансдукции у палочек и колбочек.

4. Определить факторы, определяющие выбор спектрального положения максимума поглощения зрительного пигмента палочек позвоночных. Определить зависимость скорости спонтанной активации молекул зрительного пигмента палочек от максимума поглощения пигмента. Экспериментально проверить ранее выдвинутые гипотезы о механизмах спонтанной активации молекул зрительного пигмента палочек.

Научная новизна

В нашей работе кинетика выключения родопсина и комплекса трансдуцин-ФДЭ вычисляется при помощи новой оригинальной методики, наиболее прямым способом, позволяющим избежать влияния различных регулирующих факторов в системе in vivo. Поэтому мы полагаем, что наши результаты являются наиболее близкой оценкой истинных параметров реакций выключения родопсина и комплекса трансдуцин-ФДЭ. Нами впервые показано, что скорость выключения комплекса трансдуцин-ФДЭ зависит от уровня фонового возбуждения фоторецептора, что является существенным дополнением к классической схеме работы кальциевой обратной связи в каскаде фототрансдукции. Совершенно новым является сделанное нами обоснованное предположение о том, что ни фосфорилирование метапигмента, ни инактивация трансдуцина не являются лимитирующими процессами, определяющими время выключения каскада.

уровня цАМФ в клетке, и увеличение уровня цАМФ сопровождается увеличением чувствительности фоторецептора и может иметь существенное адаптивное значение для зрительной системы в целом.

Для описания динамики восстановления чувствительности фоторецептора после интенсивного обесцвечивания пигмента нами применена математическая модель, основанная на кинетической схеме взаимопревращений поздних продуктов фотолиза. Применение модели для описания экспериментальных данных позволяет измерить в условиях целой клетки удельные активности метапродуктов и скорости их взаимопревращений. Данные о кинетике и об удельных активностях продуктов поздних стадий фотолиза зрительного пигмента колбочек получены впервые. Впервые показано, что удельные активности фосфорилированного и аррестированного метапродукта у колбочкового пигмента примерно в 100 раз больше, чем у палочкового, а скорости взаимопревращений колбочковых метапродуктов в 4-8 раз быстрее, чем палочковых.

Нами впервые экспериментально показана зависимость частоты спонтанной активации молекул зрительного пигмента от положения его максимума поглощения, что позволило подтвердить гипотезу об адаптивном характере расположения максимумов поглощения палочковых пигментов в середине спектра видимых волн.

Научно-практическая значимость работы

Полученные данные существенно расширяют наши представления о механизмах регулирования каскада фототрансдукции. В результате появляется возможность более детального описания его работы в норме, что повышает вероятность ранней диагностики патологических состояний. Открытие роли цАМФ в регулировке чувствительности фоторецептора дает новые возможности в поиске путей коррекции патологических состояний сетчатки, - таких, например, как нарушение сумеречного зрения. Каскад фототрансдукции является во многих отношениях модельной системой для других сенсорных и несенсорных сигнальных каскадов. Поэтому, выявление в его составе новых регулирующих

механизмов может привести к интенсивному поиску аналогичных регулировок и в других каскадах.

Положения, выносимые на защиту.

1. Из двух процессов выключения активных компонентов каскада фототрансдукции - родопсина и трансдуцина - оба зависят от уровня активации каскада. Этот результат позволяет включить инактивацию трансдуцина в число реакций каскада фототрансдукции, охваченных обратной связью, зависящей от уровня фонового освещения. Инактивация родопсина и трансдуцина не являются лимитирующими процессами, определяющими время выключения каскада.

2. Внутриклеточный уровень цАМФ способен регулировать работу каскада фототрансдукции. Повышение уровня цАМФ вызывает повышение внутриклеточной концентрации кальция, уменьшение темновой активности фосфодиэстеразы и уменьшение максимальной активности гуанилатциклазы. Вместе, эти эффекты приводят к повышению чувствительности фоторецептора.

3. Каскад фототрансдукции выключается в две различающиеся временные фазы. Быстрая фаза определяется фосфорилированием Мета П и связыванием его с аррестином. Медленная фаза контролируется распадом частично инактивированных метародопсинов на ретиналь и опсин и регенерацией родопсина. Она отвечает за темновую адаптацию. В колбочках все реакции зрительного цикла происходят на порядок быстрее, чем в палочках, что и обеспечивает более быструю темновую адаптацию дневного зрения.

4. Частота спонтанной активации молекул зрительного пигмента зависит от положения его максимума поглощения, что позволяет подтвердить гипотезу об адаптивном характере расположения максимумов поглощения палочковых пигментов в середине спектра видимых волн. Механизм спонтанной (термической) изомеризации родопсина скорее всего отличается от механизма светоиндуцированной изомеризации

Апробация работы

Материалы работы были представлены на 6-ти международных конференциях по зрительной рецепции «Л^юпапит» (Финляндия) в 2004, 2006,

2007, 2009-2011 гг., на 18, 20 и 21 съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (2001, 2007 и 2010), на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино 2009, 2011 гг.); Международной конференции INMED/TINS (Франция, 2006); IV Европейском Форуме по Нейробиологии FENS (Швейцария, 2008), на V и VII Международном совещании по эволюционной физиологии в 2001 и 2011 г.

Публикации

Основные результаты диссертации представлены в печатных работах, в числе которых 13 статей в журналах, рекомендованных ВАК (в том числе 7 в международных журналах), 1 статья в сборнике и 21 тезис конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 224 страницах с использованием 48 рисунков и 8 таблиц. Работа состоит из введения, краткого общего обзора состояния проблемы, материалов и методов исследования, четырех глав, содержащих каждая обзор литературы, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, общего заключения и выводов. Список литературы содержит 234 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общие положения. В экспериментах использовались сетчатки озерной лягушки Rana ridibunda, лягушки-быка Rana catesbeiana, серой жабы Bufo bufo, золотой рыбки Carassius auratus. Перед проведением любого протокола животное адаптировалось в течение ночи. Декапитация производилась при темно-красном свете, выделение сетчатки - при инфракрасном свете с использованием ИК-чувствительной камеры.

Измерение уровня циклических нуклеотидов в фоторецепторных клетках. После выделения, сетчатка наслаивалась на подложку из фильтровальной бумаги и подвергалась затем фоновой засветке или различным фармакологическим воздействиям. Фиксация уровня циклических нуклеотидов производилась мгновенным замораживанием, после чего слой наружных сегментов фоторецепторов срезали при помощи криотома Leica. Суспензию

гомогенизировали в 0.1Н HCl и центрифугировали 15 мин при 2000 g (4°С). Концентрацию цАМФ в надосадочной жидкости определения при помощи коммерческих наборов на основе иммуноферментного анализа и нормировали на количество общего белка.

Регистрация тока одиночных (Ьотореиепторое. Фототок одиночных фоторецепторов регистрировался при помощи метода всасывающей пипетки (suction pipette, Baylor et al., 1979). Система подвижной локальной перфузии позволяла полностью заменять омывающий раствор за 100 мс. Все управление экспериментом и запись результатов осуществлялось под контролем программного комплекса, созданного на основе специализированного пакета Lab View (National Instruments, Austin, TX, USA).

Микроспектрофотометрические измерения. Спектры поглощения одиночных палочек измерялись при помощи специально сконструированного скоростного микроспектрофотометра (Govardovskii & Zueva, 2000). Родопсин обесцвечивался короткими (200 - 500 мс) импульсами света от мощного светодиода с максимумом излучения 525 нм. Измерения производились на изолированных и прикрепленных к сетчатке НСП при температуре 20 ± 0.5 °С. Полное время развертки спектра составляло 450 мс.

Статистическая обработка данных производилась при помощи пакета STATISTICA а также при помощи встроенных статистических функций EXCEL. Моделирование каскада фототрансдукции производилось при помощи пакета MathCad.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Кинетика выключения каскада фототрансдукции

1.1.Расчет кинетики активации и инактивации ФДЭ. Для извлечения формы ответа фосфодиэстеразы из формы фотоответа мы использовали метод фиксации концентрации кальция (Са2+-кламп). Вкратце, суть метода состоит в блокировании входа и откачки кальция из клетки. Для блокирования входа, содержание кальция во внеклеточной среде снижается до равновесного (около 3.5

нМ). Для прекращения откачки Са2+ через Ка7К~,Са2+ обменник, натрий в наружной среде заменялся на холин. Сравнение записей нормального и Са2+ -

клампированного ответа клетки на короткую вспышку света показывает, что фронт записи нормального ответа первоначально совпадает с фронтом клампированного, однако раньше прекращает рост и быстрее выключается (Рис. 1А). Концентрация циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), нормированная на свой темновой уровень (сС7(У), может быть выражена через ответ клетки на свет:

где г(1) — регистрируемый в эксперименте ответ палочки на свет, гтах -максимальный ответ, и ПС(~Ъ - коэффициент Хилла, отражающий кооперативный характер связывания цГМФ каналами мембраны. В условиях кальциевого клампа, в отсутствие кальциевой обратной связи светоиндуцированная активность фосфодиэстеразы (ответ ФДЭ), может быть рассчитана по формуле

где Д/агк-темновая активность ФДЭ (вывод формулы опущен). Наиболее простое описание волны активности ФДЭ представляет собой разницу двух экспонент :

где В - коэффициент пропорциональности, ¡0 — временная задержка, Т] и т2 -постоянные времени выключения родопсина и трансдуцина. Формальное двухэкспоненциальное описание ответа ФДЭ на Рис. 1В дает значения Г/ = 1.41 э, х2= 1.28.

(1)

Рр (0 = в- (ехр(-(ґ - ґ0) / г,) - ехр(-(/ - ґ0) / г2))

(3)

Такой вид описания, однако, отличается неустойчивостью, и как следствие, неоднозначностью рассчитанных параметров Г/ и т2 , особенно когда эти две величины близки по значению. Поэтому для численной характеристики мы

Рис. 1. Расчет кинетики активности ФДЭ по фотоответу, зарегистрированному в растворе Са2+-кламп. (А) Записи ответа палочки на вспышку длительностью 10 мс в нормальном растворе Рингера (кривая 1) и в Са2+ -кламп. растворе (кривая 2). Интенсивность вспышек одинаковая в обоих случаях. Величина ответа в обоих случаях нормирована на темновой ток. (В) Ответ ФДЭ, вычисленный по кривой 2 из (А). Гладкая кривая представляет экспоненциальную функцию, описывающую нисходящую фазу активности ФДЭ. Кружок на переднем фронте кривой обозначает время достижения полувысоты ответа ФДЭ.

предпочли комбинацию из двух методов. Сперва, нисходящая часть ответа ФДЭ описывается одноэкспоненциальной функцией (Рис. 1В, тонкая гладкая линия). В большинстве случает описание дает хороший результат с коэффициентом г > 0.95 . Затем, скорость нарастания ответа ФДЭ можно охарактеризовать при помощи времени достижения половины высоты, Х0,5 . Среднее значение по 7 клеткам дает величины г, = 1.8 ± 0.2 с (среднее ± СОШ) и ¿0.5 = 0.48 ± 0.06 с . Следует оговориться, что оба этих параметра являются чисто формальным описанием ответа ФДЭ и скорее всего не характеризуют по отдельности никакую из трех или более реакций, формирующих ответ ФДЭ.

1.2.Влияние Фонового освещения на кинетику выключения каскада сЬототрансдукиии. Для выявления влияния световой адаптации на кинетику ответа ФДЭ, фотоответы записывались в условиях Са2+-клампа в темноте и в условиях фонового освещения. Для расчета ответа ФДЭ в условиях фонового освещения, в формуле (2) следует заменить величину активности ФДЭ в темноте,

* 0.6

время, с

Раагк, на величину стационарной активности ФДЭ на свету, которая может быть выражена как:

А0 = А*,,* + А(0 (4)

где РсЫк - стационарная активность ФДЭ в темноте, и [Щ - активность, вызванная светом. В стационарном состоянии Д(У= Д где Д есть стационарная активность ФДЭ, вызванная фоновым светом.

Величина Д, входящая в состав Д может быть рассчитана по форме функции Д^

Т 00

Р* = (5)

1 А о

где 1/1 - интенсивность вспышки (фотонов/мкм2), и/, - интенсивность фонового освещения (фотонов/( мкм2-с)).

Фоновое освещение существенно ускоряет ответ ФДЭ на короткую световую стимуляцию (Рис. 2А). При этом, если нормировать ответы ФДЭ, полученные в темноте и в условиях фонового освещения, на соответствующую интенсивность вспышки, ответы светоадаптированной палочки возвращаются к базовой линии быстрее, чем темноадаптированной (Рис. 2В). Скорость нарастания ответа от состояния адаптации не зависит, что показывает совпадение фронтов всех трех записей. Это означает, что световая адаптация ускоряет процесс(ы) выключения, но не меняет коэффициент усиления каскада. Это утверждение верно по крайней мере для интенсивностей фона, блокирующих не более «50% темнового тока. При более интенсивных фонах, нерегулярные колебания фототока в Са2+-клампирующем растворе приводят к существенно зашумленной функции Дг(У, что делает анализ формы ФДЭ ответа недостаточно надежным. У половины клеток

Рис. 2. Влияние фонового освещения на форму ответа ФДЭ. (А) Ответы ФДЭ на короткие вспышки света в темноте (кривая 1) и при фоновом освещении, вюноченном до перемещения клетки в Са2+-кламп. раствор и закрывающем 27 % (кривая 2) и 42 % (кривая 3) темнового тока. Ответы шкалированы до совпадения максимумов для более наглядной демонстрации изменения кинетики. Интенсивности вспышек 13-Я* (в темноте), 159-Я* (на фоне 170-11* с"1) и 82-Я* (на фоне 490-Б1* с"'). (В) Те же записи, что и в (А), однако ответы на фоне шкалированы обратно

пропорционально интенсивности вспышек.

ответы ФДЭ в темноте и в условиях фонового освещения можно было совместить путем простого растяжения более быстрого (светоадаптированного) ответа по шкале X. Это свидетельствует о том, что оба процесса, определяющие выключение каскада, ускоряются под влиянием фонового освещения примерно в

Рис. 3. Световая адаптация укоряет и фронт, и спад ответа ФДЭ. Та же клетка, что на Рис. 2. Ответы, записанные при разных фоновых освещенностях, могут быть совмещены растягиванием по оси X (коэффициент растяжки показан на врезке).

одинаковой степени. Так, у палочки, показанной на Рис. 3, фон, вызывающий 27% уменьшение фототока, приводил к 2.5-кратному ускорению всей функции ßß(t)\ фон, закрывающий 42% каналов, ускорял ßfl(t) в 4.6 раз.

Однако, примерно у половины палочек шкалирование не приводило к удовлетворительному совпадению темно- и светоадаптированных ответов ФДЭ. Очевидно, это свидетельствует о том, что у этих клеток световая адаптация по-

разному влияет на восходящую и нисходящую фазы ответа ФДЭ. Поэтому, для количественной оценки влияния фонового освещения на кинетику ответа ФДЭ был использован подход, показанный на Рис. 1В, а именно — нисходящая фаза ответа ФДЭ описывалась экспоненциальной функцией, а фронт ответа характеризовался временем достижения полувысоты.

<0 к а °

т J I ]

т>°П 1 9- ± ! т ' >

/У /ч

ІЛ

Рис. 4. Зависимость ускорения кинетики ответа ФДЭ при воздействии фонового освещения от степени подавления темнового тока фоторецептора. По оси Y -кратность изменения данного параметра по сравнению с темноадаптированной клеткой, раз. По оси X - степень подавления фототока фоновым освещением, раз. Ij- темновой ток, /j - ток в условиях фонового освещения, о -to.5.\ • - Тг > среднее±СОШ. Гладкие кривые проведены в соответствии с (6), параметры уравнения даны в тексте.

Степень влияния фоновой подсветки на изменения скорости выключения каскада существенно варьировало от клетки к клетке. На Рис. 4 показаны усредненные зависимости постоянной времени спада ответа ФДЭ, тг и времени достижения полумаксимума t0 от степени подавления темнового тока. Степень подавления темнового тока, в свою очередь, отражает уменьшение внутриклеточной концентрации Са2+ (Gray-Keller and Detwiler, 1994; Gray-Keller and Detwiler, 1996; Younger et al., 1996). Максимальное ускорение спада ответа ФДЭ составило 5.5 раз при 2.4 кратном подавлении темнового тока; максимальное ускорение фронта ответа составило 7.6 раз при 3.2 кратном подавлении темнового тока. Индивидуальные данные отдельных клеток были усреднены путем линейной интерполяции, для формальной аппроксимации усредненных значений, использовалось уравнение

kff і+т"

Рис.

Демонстрация доминантной времени

независимости постоянной

У инактивации каскада гд от

к'

освещения, зависимости

интенсивности

фонового Показаны времени

пребывания в насыщении Т5а, от интенсивности вспышки света в логарифмическом масштабе, зарегистрированные в темноте и на фоне, закрывающем 45% и 72 % каналов. За момент выхода из насыщения во всех случаях

принималось преодоление критерия 1.5 пА, что соответствовало примерно 10% темнового тока. У кривых, измеренных на фонах (о и V), первые три точки исключены из описания. Числа около кривых обозначают (среднее±СОШ).

где аф - фактор ускорения г0 или т,, / = 1ДЪ - степень подавления фототока фоновой подсветкой, к - шкалирующий коэффициент, к - коэффициент Хилла и атах 1 + 1/1Ї. Начальным условием аппроксимации было прохождение через точку (1, 1). Описание методом наименьших квадратов дало атш! = 3.6, й = 5.2,к = 0.83 для тг, и атах = 5,к = 5.8, к = 0.79 для

1.3.Доминантная постоянная времени выключения не зависит от световой адаптации. Фоновое освещение, закрывающее 72% каналов, не оказывает достоверного влияния на наклон кривой Пепперберга (Рис. 5). Тот же результат был получен для шести других клеток с использованием фонов, закрывающих от 30 до 75% СШ каналов.

У темноадаптированной клетки среднее значение Гд=1.74±0.21с статистически не отличается от значения гг=1.8±0.2 с, измеренного на той же группе клеток. Как показано выше, фоновое освещение до 5 раз ускоряет тг и 105, не оказывая достоверного влияния на тр. Отсюда мы делаем вывод, что га не

может быть соотнесено ни со скоростью выключения родопсина, ни трансдуцина - по крайней мере, в светоадаптированном состоянии.

1 А.Уменыиение чувствительности при световой адаптаиии происходит не вследствие уменьшения коэффициента усиления. Горизонтальный сдвиг графиков Пепперберга на Рис. 5 отражает уменьшение чувствительности клетки при повышении интенсивности фонового освещения. В среднем, фоновый свет, закрывающий 50% каналов, уменьшает чувствительность в 41±17 раз (и=4 клетки). Максимальное зарегистрированное уменьшение чувствительности было 85 раз при 55% закрытых каналов. Для того чтобы определить, какой вклад в уменьшение чувствительности каскада вносит уменьшение коэффициента усиления, мы измерили коэффициент усиления для серии ответов на насыщающие световые стимулы, записанные в темноте и при различных световых фонах. Коэффициент усиления определялся из описания начальной фазы ответа клетки на насыщающий стимул уравнением вида

КО/Гшах =1-ехр(-^Л-Д*-('-'о)2) СО

где t- время, to - задержка, R* - интенсивность вспышки, в количестве фотоизомеризаций на клетку за вспышку, и А - коэффициент усиления в определении Pugh, Jr. и Lamb (2000). Пример такого описания приведен на Рис. 6. Фронты ответов клетки на стимулы близкой интенсивности, записанные в

Рис. 6. Световая адаптация не влияет на коэффициент усиления каскада

фототрансдукции. Показаны начальные части двух наложенных друг на друга нормированных ответов клетки на насыщающие вспышки близких

интенсивностей (указаны рядом с записями), записанных в темноте (•) и на фоне, закрывающем 45% каналов (о). Гладкая кривая - описание в соответствии с (7).

время, С

темноте (•) и на фоне, закрывающем 45% каналов (о), описаны в соответствии с (7). Почти полное совпадение кривых показывает, что изменения коэффициента усиления А не происходит.

Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что из двух процессов, определяющих светоиндуцированную активность ФДЭ, оба зависят от уровня активации каскада. Этот результат заставляет пересмотреть воззрения на инактивацию трансдуцина как на процесс, не зависящий от уровня активации каскада.

2. цАМФ регулирует каскад фототрансдукции.

2.1.Темповой уровень и светоиндуциуованные изменения уровня иАМФ. В нормальном Рингере, темновой уровень цАМФ в наружных сегментах сетчатки лягушки Я.псИЪипйа составил 7.3±0.6 пмоль/мг белка (л=31 сетчатка), что близко к другим известным значениям концентрации цАМФ в фоторецепторах. Насыщающая засветка интенсивностью 1.9 104 фотон/мкм2-с приводит к падению уровня цАМФ в 1.26±0.11 раза («=15, Р<0.025) за 1000 секунд.

В предположении, что родопсин составляет около 65% от всех белков НСП, концентрация родопсина в НСП равна 3.3 мМ и объем цитоплазмы составляет 1А объема наружного сегмента, концентрация цАМФ в цитоплазме НС составит 2.9 мкМ.

2.2.Форсколин влияет на уровень иАМФ и увеличивает чувствительность фотореиепторов. Влияние цАМФ на работу каскада фототрансдукции изучалось при помощи регистрации тока одиночной палочки в конфигурации «наружный сегмент наружу». Палочка перфузировалась нормальным раствором Рингера или Рингером, содержащим 2 мкМ форсколина (Ф-Рингер).

Инкубация сетчатки лягушки в растворе Ф-Рингера приводит к росту содержания цАМФ в слое наружных сегментов в 2.47±0.46 раза (2 мкМ форсколин; п = 6, Р<0.02) или в б.80±1.31 раза (10 мкМ форсколин; п =8, Р<0.004) за 1000

Рис. 7. Аппликация 2 мкМ форсколина увеличивает чувствительность

фоторецептора. (А) Серия ответов на короткие вспышки одинаковой

интенсивности, записанные в разные времена после начала инкубации в Ф-Рингере. Ответы 1-4 записаны через 205, 610, 940 и 1340 секунд после начала инкубации. Интенсивность вспышки во 3-е всех случаях 5.4 фотона/мкм2 на вспышку. Ответы нормированы на темновой ток, измеренный в тех же условиях. (В) Одноэкспоненциальное описание

нисходящей фазы фотоответов, записанных в нормальном Рингере и через 940 с инкубации в Ф-Рингере. Та же клетка, что и в (А). (С) Изменение чувствительности клетки при инкубации в Ф-Рингере. Чувствительность измерена по величине фотоответа на слабую вспышку света. Все фотоответы нормализованы сперва на соответствующие величины темнового тока, и затем на величину фотоответа в нормальном Рингере. Интенсивность вспышки света везде одинаковая, усреднено по 4 клеткам (среднее±СО).

секунд. Это увеличение примерно равно изменениям содержания цАМФ в сетчатке о юс 4оо^боо^8оо юоо 1200 1400 во время циркадных циклов у крысы (1.75

- 2.5 раз (Traverso et al, 2002; Fukuhara et al., 2004)), эмбрионов D.rerio (1.6 раз (Li et al., 2008)) и в культуре фоторецепторов цыпленка (1.8-2.1 раз (Ivanova and Iuvone, 2003; Chaurasia et al., 2006)). Поэтому, мы полагаем, что 2.5-кратное изменение уровня цАМФ под воздействием форсколина адекватно имитирует естественные колебания цАМФ в фоторецепторах во время циркадных циклов.

В Ф-Рингере фотоответы на вспышки ненасыщающей интенсивности увеличивались в размере за счет все более позднего времени выключения ответа. Фронт ответа при этом достоверно не менялся (Рис. 7 А). В среднем, амплитуда фотоответа, вызванного слабой вспышкой, увеличивалась у темноадаптированных палочек в 2.13±0.1 раза («=17, Р<0.0001). Рост чувствительности был медленным, время развития полуэффекта равнялось примерно 500 с (Рис. 1С).

Рост чувствительности сопровождался параллельным замедлением нисходящей фазы фотоответа. В большинстве случаев, нисходящая фаза могла быть удовлетворительно описана экспоненциальной функцией. Постоянная времени экспоненты монотонно увеличивалась по мере инкубации клетки в Ф-

forsk

Рингере. В среднем, рост ПОСТОЯННОЙ времени Tfall составлял norm = 1 -39 ± 0.09

Тfail

раз (и=13, Р<0.001). Влияние форсколина сказывалось сильнее при более сильных световых фонах. Отношение чувствительности клетки в Ф-Рингере и в норме монотонно росло по мере уменьшения процента закрытых каналов плазматической мембраны. Если в темноте разница чувствительностей составляла 2.13 раз, то на фонах, закрывающих от 60 до 80 % каналов, чувствительности росла в 4.86±0.91 раза (п=7, Р<0.025).

2.3.Высокий уровень чАМФ влияет на темновой и световой уровень активности ФДЭ. Для того, чтобы проанализировать механизмы увеличения чувствительности фоторецептора, мы измеряли стационарную активность ФДЭ, ß, на фоновых подсветках различной интенсивности, в норме и в присутствии форсколина.

Для измерения ß, был использован не расчетный (как в п.1.2.), а прямой способ измерения при помощи метода быстрой аппликации ингибитора ФДЭ, IBMX (Hodgkin et al., 1985; Hodgkin and Nunn, 1988). Клетка быстро и кратковременно вдвигалась в струю Рингера, содержащую 0.2 мМ IBMX, вызывающего быстрые и большие изменения фототока. После этого, величина

активности ФДЭ, /? могла быть вычислена из анализа крутизны фронта ответа на аппликацию 1ВМХ.

У многих клеток, р^к не могла быть уверенно измерена из-за ограничений величины темнового тока сопротивлением внутреннего сегмента у изолированной клетки. При этом, у тех же клеток ГВМХ вызывал существенный рост тока в условиях фоновой подсветки. Для разрешения этой проблемы мы провели отдельную серию экспериментов с упрощенным протоколом, в котором у большого количества палочек было измерено только рЛагк . Из этих клеток были отобраны и усреднены только те, у которых ответ на аппликацию 1ВМХ превышал 50% темнового тока. У этих клеток, под воздействием форсколина уменьшился в 1.59±0.12 раз (п=13, Р<0.0004).

В соответствии с (4), стационарная активность ФДЭ на фоне, Д определяется как разница между величиной /?, измеренной при помощи аппликации 1ВМХ, и Рлагк • У тех клеток, у которых ^¿агк не был определен непосредственно, мы принимали в качестве рЛагк среднюю величину Дм пат = 0.49±0.10 с'1, п=13 для нормального Рингера, и /»„4 = 0.49 з"'/1.59 = 0.31 с"1 для Ф-Рингера. Эти величины более чем в 10 раз меньше, чем типичная величина Р , измеренная при 50% закрытых каналов. Поэтому, некоторая неопределенность величины рЛагк у каждой отдельной клетки не может произвести заметной ошибки в определении

д.

Одновременно с ростом чувствительности ответов палочки на слабые

§- 0.8

5 08

в о

1.2 л

Рис. 8. Форсколин уменьшает долю открытых каналов при всех интенсивностях фонового света. По оси У - отношение долей открытых каналов в форсколине и в норме. Значение в нуле интенсивности фонового света соответствует темноадаптированным клеткам.

о.о —/>-г-

0.0 0.1

.1 1 10 100 1000 10000 интемс. фока, фотон/мкм'с

В 2.5

г.о •

1.5 ■

о 1.0

0.6

0.1 1 10 100 1000 интенс. фона, фотон/мкм'с

Рис.9. Форсколин влияет на стационарную светоиндуцированную активность ФДЭ, Д. (А) Д одиночной палочки в норме (о) и в форсколине (•); по оси X - интенсивность фона в логарифмической шкале. (В) Усредненное отношение Д forJfis norm , ось X как в (А). Среднее по 14 клеткам. Прямая линия проведена методом наименьших квадратов с 1ооо юооо параметрами у=0.11*1п(х)+1.56.

Описание не имеет функциональной интерпретации и служит только для демонстрации тренда в данных.

вспышки, форсколин индуцирует рост постоянной составляющей токового ответа на постоянную фоновую засветку (Рис. 8) и стационарной

юооо

активности ФДЭ на фоне, Д (Рис.9А). При этом, хотя при низких интенсивностях фона Д/^* не отличается достоверно от Д тгт , с ростом интенсивности фона отношение Д /0„</Д погт растет по логарифмическому закону (Рис.9В).

2.4. Форсколин воздействует на регулировку ГЦ кальцием. После того, как из ответа на аппликацию IBMX извлечена величина Д , активность ГЦ, as, также может быть подсчитана на основе следующих соображений:

Концентрация цГМФ на фоне, нормированная на цГМФ в темноте, равна:

_s__

J<•

ч1/л

dark

^ dark,

где ]5 - величина остаточного фототока на фоне, - величина темнового фототока той же клетки, и пс0 = 3 - коэффициент Хилла (кооперативность регулировки проводимости СЫО каналов цГМФ). С другой стороны, в стационарном состоянии

eG. =

а.

(9)

Следовательно,

"s=ßs

Ґ . \,/3 Л

J dark

(10)

Регулировка активности ГЦ кальцием может быть описана уравнением

а(Са) = amin + (amax -amin)

1--

Ca""

Ca"** + К Са"»

(И)

Здесь СХтах - максимальная активность ГЦ при нулевой концентрации кальция, ат,п - минимальная активность ГЦ при высокой концентрации кальция, КСа равен концентрации кальция при половине максимального эффекта, псус -коэффициент Хилла, отражающий кооперативный характер регулировки ГЦ кальцием (Koch and Stryer, 1988). По условиям нашего эксперимента, прямое измерение концентрации кальция в фоторецепторе не проводилось. Концентрация кальция прямо пропорциональна току, поэтому мы измеряли зависимость as от нормированного остаточного фототока, j/jdark ■ Зависимость as от j/jdark систематически сдвигается под воздействием форсколина в сторону меньших значений j/jdark (Рис. 10). Здесь, доля открытых каналов при полуэффекте, Ксус, существенно уменьшается - Кeye fonk /Ксус пот =0.73±0.05; п = 18, Р <0.0001). Максимальная активность ГЦ также снижается (armatforsk/ атах norm = 0.71± 0.07, п =

15), в то время как изменения коэффициента Хилла статистически незначимы 0Wh«™.=0.90±0.07; «=18, Р<0.15).

Рис. 10. Форсколин воздействует на кальциевую регулировку ГЦ.

Активность ГЦ в нормальном (о) и Ф-Рингере (•) как функция доли открытых каналов. За 100 % открытых каналов принята проводимость в темноте. Линии проведены в соответствии с уравнением Хилла, параметры Ксус= 24 и «=1.8 в нормальном растворе и Ксус- 20.9 и п=2.5 в Ф-Рингере.

20 40 60 80 % открыт, каналов

2.5. Форсколин влияет на гомеостаз кальция в наружных сегментах палочек. Сдвиг кривой as от j/jdark под воздействием форсколина мог бы свидетельствовать о модификации зависимости активности ГЦ от Са2+. Кинетика по крайней мере одной из нескольких реакций выключения каскада фототрансдукции, фосфорилирование активного родопсина R* родопсинкиназой, также управляется кальциевой обратной связью (Arshavsky and Burns, 2012). Поэтому, мы сочли необходимым проверить, насколько форсколин может влиять на кальциевый гомеостаз в НСП. Скорость кальциевого обмена можно охарактеризовать при помощи т.н. «обменного тока». В стационарном состоянии, вход кальция в клетку через CNG каналы уравновешивается его откачкой через электрогенный Na+/Ca2+-K+ обменник, расположенный в плазматической мембране НСП (Nakatani and Yau, 1989; Lagnado et al., 1992). После быстрого закрытия CNG каналов яркой насыщающей вспышкой обменник продолжает откачивать кальций, пока тот нет достигнет нового, более низкого уровня. На записи фотоответа на яркую вспышку, «обменный ток» выглядит как более медленное (по сравнению с фронтом), примерно экспоненциальное снижение тока к постоянному (нулевому) уровню, следующий за более быстрой фазой,

5 0.98 -

s a.

О 0.94 ■

формируемой быстрым закрытием CNG каналов (Рис. 11). Из-за стехиометрии обменника ((1 Са2+ + 1 К"): 4Na+), начальная амплитуда обменного тока равна половине кальциевого тока, протекающего через CNG каналы в пре-стимульный период. Тогда интеграл обменного тока равен Уг количества откачанного цитоплазматического Са2+. Мы обнаружили, что форсколин увеличивает амплитуду обменного тока в 1.59±0.11 раза без заметного изменения постоянной времени его спада. Интеграл тока увеличивается в 1.58±0.13 раз (п = 7), что указывает на соответствующее увеличение концентрации Са2+ в НСП.

Рис. 11. Форсколин увеличивает «обменный ток», зависящий от fJ^l^f'^^ кальция. Зашумленные кривые показывают верх фотоответа на яркую насыщающую вспышку. Каждая кривая - среднее из трех фотоответов на насыщающие вспышки близких по значению величин в нормальном (1720, 2980 и 5020 фотон/мкм2) и Ф-

п_,_, Рингере (2270, 3880 и 6610

о 2 время, с 4 в фотон/мкм2). Гладкие кривые -

экспоненциальная аппроксимация. В среднем, форсколин увеличивает амплитуду ответа в 1.59 ± 0.11 раз (7 клеток) без достоверного изменения постоянной времени экспоненты.

Хотя разнообразные биохимические данные свидетельствуют о том, что цАМФ и его эффектор РКА могут регулировать компоненты каскада фототрансдукции, экспериментальная проверка наличия влияния цАМФ на каскад фототрансдукции была предпринята лишь однажды (Jindrova and Detwiler, 2000). Авторы утверждают, что ни цАМФ, ни его аналог 8-Ьгото-цАМФ , не влияют на свойства фотоответа изолированного НС палочки геккона, диализуемого через whole-cell пипетку. Мы предполагаем, что диализуемый НС может терять важные для цАМФ-зависимой регуляции компоненты, - такие, как например РКА. Кроме того, хотя палочки геккона и выглядят таковыми по морфологическому признаку и отчасти по их физиологическим параметрам, их основные белки каскада фототрансдукции являются колбочковыми (Zhang et al., 2006). Если бы

палочковые и колбочковые белки по-разному реагировали на дАМФ, это могло бы объяснить отсутствие реакции палочек геккона на цАМФ.

Мы показали, что аппликация 2 мкМ форсколина приводит за 15 минут к 2.1-кратному повышению чувствительности фоторецептора, в то время как коэффициент усиления каскада не меняется (Рис. 7С). Форсколин также увеличивает долю закрываемых постоянным фоновым светом CGN каналов (Рис. 8). Вообще говоря, оба этих эффекта могли бы быть произведены либо ускорением выключения каскада, либо модификацией кальциевой обратной связи, или обоими эффектами вместе. Например, влияние форсколина на фотоответ напоминает эффект GCAP-нокаута, устраняющего кальциевую обратную связь на гуанилатциклазу (Fig. 2А в (Burns et al., 2002)). Для того, чтобы разграничить два этих объяснения, мы измерили активность ФДЭ в темноте и при различных фоновых освещенностях, а также активность ГЦ как функции доли закрытых каналов. Эти измерения показали, что форсколин воздействует на оба этих белка. Для ФДЭ, воздействие выражается в снижении темновой активности Pdark и в увеличении стационарной светоиндуцированной активности Д. Для ГЦ, кривая зависимости ее активности от величины (f/jdart) сдвигается к более низким значениям ]J]^.

Механизм, при помощи которого цАМФ регулирует Pdark > ® настоящее время неизвестен. Показано, что у-субъединица ФДЭ может фосфорилироваться по ПКА-специфичному сайту треонин 35 (Thr35) (Xu et al., 1998; Paglia et al., 2002; Janisch et al., 2009), и замена Thr35 аланином у палочек мыши уменьшает чувствительность фоторецептора и его темновой ток (Tsang et al., 2007). Наш результат о том, что высокий уровень цАМФ (следовательно, предполагаемое фосфорилирование Thr35) производит противоположный эффект и уменьшает Pdark, находится в хорошем согласии с вышеприведенными данными.

Стационарная активность ФДЭ, вызванная фоновым светом (Д), увеличивается из-за задержки в выключении фотоответа. Вообще говоря, задержанное выключение фотоответа и сдвиг кривой активности ГЦ по оси

(¡/¡¿агк) в сторону более НИЗКИХ значений М'&гк могло бы иметь единое объяснение, а именно - повышение концентрации цитоплазматического кальция. Вопрос, повышается Са2+ или нет в реальности можно проверить например при помощи измерения обменного тока фоторецептора. Как видно из Рис. 11, форсколин приводит к ~ 1.5-кратному повышению амплитуды «обменного тока». Если предположить, что форсколин не меняет свойства обменника, увеличение тока должно означать приблизительно 1.5-кратное повышение [Са2+]1п при той же величине ЦДаагк)- Это повышение должно привести к наблюдаемому сдвигу кривой регулировки активности ГЦ влево (Рис. 10) без необходимости предположения о модификации взаимодействия ГЦ с кальцием. Аналогично, увеличение [Са2+]„ должно замедлить фосфорилирование активного родопсина родопсинкиназой без предположений о модификации регулировки Й1К через [Са2+] ¡„/рековерин.

Для того, чтобы проверить предположение о том, что большинство обнаруженных нами эффектов цАМФ могло бы быть объяснено изменением кальциевого гомеостаза, мы проанализировали фотоответы при помощи полной модели фототрансдукции. Модель предсказывает, что эффект форсколина может быть достигнут -1.5-кратным увеличением фракции кальциевого тока и соответствующим увеличением темновой концентрации цитоплазматического кальция. Кроме того, для воспроизведения эффекта форсколина необходимо уменьшить в 2.1 раза темновую активность ФДЭ, замедлить выключение активной ФДЭ в 1.54 раза и уменьшить максимальную активность ГЦ в 1.33 раза. Все остальные параметры, характеризующие ФДЭ активацию, обмен кальция и кальциевую регулировку ГЦ и ОКК1, не менялись. Следует заметить, что четыре из пяти переменных параметров (увеличение Са2+ тока, подавление Рс1агк и уменьшение атш) являются прямыми экспериментальными данными. Поэтому, единственный параметр, скорость выключения ФДЭ*, была оставлена для произвольного подбора. Замедление выключения ФДЭ* (уменьшение к£) при увеличении [Са2+]!п , которое следует из модели, подтверждается предыдущими

находками о том, что световая адаптация (то есть, уменьшение [Ca2+]j„) ускоряет

выключение ФДЭ* (Astakhova et al., 2008; Woodruff et al., 2008).

Рис. 12. Математическая модель фототрансдукции хорошо воспроизводит эффект форсколина. Параметры модели опущены. Коэффициент корреляции между экспериментальными и модельными кривыми Г2 > 0.995.

Таким образом, увеличение внутриклеточной концентрации • Са2+ представляется вполне удовлетворительным объяснением для большинства эффектов форсколина. Механизм, при помощи которого цАМФ мог бы регулировать [Ca2+]¡n , остается пока неизвестным. Изменение амплитуды «обменного тока», при практически неизменном темновом токе, показывает, что ионная селективность CNG каналов сдвигается в сторону большей проницаемости для кальция. В настоящее время единственными факторами, могущими регулировать селективность CNG каналов, считаются трансмембранное напряжение и ионный состав по обеим сторонам мембраны (Lagnado et al., 1992; Sheng et al., 2000). Маловероятно, что эти факторы изменяются под воздействием форсколина, так как темновой ток практически не меняется. Более вероятно, что форсколин модифицирует селективность CNG каналов при помощи цАМФ-зависимого фосфорилирования.

Объяснение большинства эффектов форсколина изменениями , Са2+ гомеостаза кажутся достаточными. В то же время, в каскаде фототрандукции показаны и другие мишени для регулирующего воздействия цАМФ через РКА. Например, РКА-зависимое фосфорилирование in vitro палочковой и колбочковой родопсинкиназ замедляет фосфорилирование ими родопсина (Horner et al., 2005).

Более того, in vivo показано, что уровень фосфорилирования GRK1 (мышь (Osawa et al., 2011)) и GRK7 (Xenopus laevis (Osawa et al., 2008)) зависит от света, повышаясь в темноте и снижаясь на свету. Это делает цАМФ-зависимое

фосфорилирование GRK возможным новым способом регулирования выключения родопсина, в дополнение к хорошо известному контролю через рековерин/ Са2+. Неизвестно также, насколько показанная ранее регулировка выключения ФДЭ фоновым светом (Astakhova et al., 2008; Woodruff et al., 2008) зависит от кальция, а не от каких-либо других механизмов, включая цАМФ.

Но, независимо от деталей молекулярного механизма, наши данные свидетельствуют о том, что разнообразные эффекты от повышения уровня цАМФ работают синергично, увеличивая чувствительность фоторецептора. Увеличение уровня цАМФ при переходе от дневных к ночным условиям освещения, возможно, имеет адаптивное значение, улучшая чувствительность зрения в условиях пониженной освещенности.

3. Переход от обратной световой к темповой адаптации.

Под световой адаптацией обычно понимают совокупность процессов, позволяющих фоторецептору избежать насыщения и сохранить возможность реагировать на изменения интенсивности светового стимула в условиях постоянно действующего светового фона. Под темновой адаптацией, напротив, понимают процесс, начинающийся после выключения света, и заключающийся в восстановлении абсолютной чувствительности клетки, характерной для темноадаптированного состояния. Хотя эти два процесса и сопровождают клетку в ее переходе в разные стороны между двумя состояниями, темновую адаптацию нельзя считать инвертированной во времени световой адаптацией. В настоящем разделе мы покажем, что переход фоторецептора к темноадаптированному состоянию происходит в две существенно различающиеся временные фазы, из которых только быстрая фаза является обращением процессов световой адаптации, а медленная определяется временем распада нескольких долгоживущих форм частично инактивированного метародопсина и регенерацией родопсина.

3.1. Две фазы восстановления чувствительности палочек. Короткие и яркие вспышки света приводят к полному закрытию на какое-то время всех CNG каналов плазматической мембраны фоторецептора. В этот период клетка остается

в насыщении и неспособна отвечать на новую стимуляцию. Время пребывания в насыщении увеличивается с увеличением силы стимула (Рис. 13А). Примечательно, что адаптация палочки отчетливо делится на две фазы. При низких и умеренных интенсивностях световых стимулов, время пребывания в насыщении, tsat, приблизительно линейно растет с увеличением логарифма интенсивности стимула Я * (здесь Л * выражает долю обесцвеченного пигмента)

Ю-« 10' ю-" удепьн.обесцвечивание

Рис. 13. Двухфазное

восстановление чувствительности палочки после насыщающей вспышки света. (А) примеры одиночных записей ответов палочки на вспышки

увеличивающейся интенсивности 2 1 02, 1.3 103, 1.65 104, 1.65 1 05, 2.1 106, 6.2106, 1.9107 Д*.(В) зависимость времени пребывания в насыщении от интенсивности вспышки, выраженной в виде удельного обесцвечивания

пигмента. Время пребывания в насыщении определяется по пересечению критерия 20% от максимального тока (штриховая линия в А. Прямая линия -линейное описание первых пяти точек зависимости от 1п(ЫеАЦЬ) . Константа Пепперберга (см. текст) равна 3.5 с.

(Рис. 13В, прямая линия; cf. Pepperberg, Cornwall, Kahlert et al., 1992; Nikonov, Engheta & Pugh, 1998). При превышении некоторого значения интенсивности темновая адаптация резко замедляется, так что зависимость tsat от ln(R*) делает резкий изгиб (штриховая линия на Рис. 13В). Очевидно, что причиной такого резкого замедления выключения каскада фототрансдукции должна быть смена механизмов, ответственных за ход восстановления чувствительности.

Анализ зависимости от Л* позволяет вычислить кинетику выключения активности ФДЭ. Для полной активации кальциевой обратной связи в условиях всех закрытых СЫв каналов необходимо не более нескольких секунд. Тогда, одна и та же величина фототока, восстановившегося после насыщения, будет соответствовать одной и той же концентрации цГМФ. Эта концентрация цГМФ достигается, когда активность ФДЭ после стимуляции вспышкой света падает до определенного фиксированного уровня, определяемого скоростью работы полностью активированной гуанилат циклазы:

К* ■]**«*) = с (12)

Рис. 14. Выключение

светоиндуцированной активности ФДЭ. Отдельные серии символов соответствуют данным пяти клеток, рассчитанным в соотв. с (13). Данные клетки с Рис. 13 обозначены (•). Толстая гладкая линия проведена в на основании кинетической схемы на Рис. 15.Параметры, использованные при подсчете, приведены в Табл 1. Штриховая линия — то же,что сплошная при условии аМА=0. Тонкая сплошная линия - без учета регенерации родопсина.

где p(t) - ответ ФДЭ, вызванный единичной (однофотонной) стимуляцией, и с = const - критерий выхода из насыщения. Поэтому график в координатах (1/R' - tsa, ) представляет собой функцию выключения ФДЭ (с поправкой на коэффициент с).

= Ji (13)

На Рис. 14 показана такая функция, рассчитанная для пяти палочек. Индивидуальные кривые для каждой клетки были на самом деле смещены

относительно друг друга. Для того, чтобы их совместить, их необходимо было сдвинуть параллельно вдоль вертикальной оси. Такой сдвиг соответствует варьированию критерия с, который в свою очередь имеет смысл максимальной активности гуанилатциклазы). Для того, чтобы совместить пять клеток на Рис. 14, критерий с у каждой клетки был изменен не более чем на 20%.

3.2.Анализ выключения ФДЭ при помощи кинетической схемы фотолиза. С другой стороны, форма функции выключения светоиндуцированной ФДЭ может быть предсказана на основании анализа кинетической схемы выключения родопсина (Рис. 15). Скорость, с которой фотоактивированный родопсин в конформации Метародопсин II (Ml/) активирует трансдуцин, существенно уменьшается после фосфорилирования МП родопсинкиназой (образование MII-P). Дальнейшее уменьшение активности происходит после присоединения к фосфорилированному родопсину специального белка аррестина (MII-P- Агг). Последнее выражение можно переписать как М-Р- Агг , где М обозначает все виды метародопсинов (MI, Mil и МИГ), которые могут вносить вклад в активацию трансдуцина (Leibrock, Reuter & Lamb, 1994, 1998; Leibrock & Lamb, 1997; Kolesnikov, Golobokova & Govardobskii, 2003). В конечном счете, M распадается до all-trans ретиналя и опсина (Ops), который затем регенерирует обратно в родопсин (Rh) после присоединения 11-цис ретиналя.

Константы первого порядка соответствующих реакций обозначены на Рис. 15 как кмн — kops (с'1), и относительные (по отношению к Mil*) каталитические активности продуктов, Эми - aRh. Кинетическая схема с добавлением реакции инактивации трансдуцин/ФДЭ с константой к рое, позволяет предсказывать временной ход каталитической активности ФДЭ после обесцвечивания определенного количества родопсина. Параметры реакций могут быть взяты из литературных данных, и позднее подстроены для улучшения согласия экспериментальных данных и модельного предсказания.

Толстая гладкая линия на Рис. 14 показывает пример хорошего описания моделью экспериментальных данных. Параметры описания даны в Табл. 1. Хорошо видно, что снижение активности ФДЭ происходит в две фазы. Первая

фаза заканчивается приблизительно за первые 30 секунд, после чего наступает вторая, существенно более медленная фаза, которая у палочки лягушки может длиться более часа. Если активность М-Р-Агг (Эщ) принять за ноль, функция p(t) изменит свой вид (обозначено на Рис. 14 штриховой линией). Отсюда видно, что существенную часть активности ФДЭ в период 30 с - 10 мин обеспечивают распадающиеся метародопсины. После 10 минут, оставшуюся часть медленной фазы формирует опсин, возникающий после распада метародопсинов с высвобождением all-trans ретиналя, и расходующийся на обратную регенерацию родопсина с присоединением 11-сis ретиналя. В изолированных палочках, используемых в наших экспериментах, регенерация родопсина невозможна из-за отсутствия экзогенного 11-cis ретиналя, поэтому можно принять kops = 0. Модельная кривая с соответствующей поправкой показана как тонкая гладкая линия на Рис. 14.

Некоторые параметры, используемые в модели, довольно хорошо определены в независимых экспериментах. Так, кров например есть величина, обратная наклону графика Пепперберга при низких интенсивностях (прямая линия на Рис. 13), a km известна из микроспектрофотометрических измерений (Kolesnikov et al., 2003). Константа скорости регенерации родопсина в интактном глазу, kops , была опубликована Рейтером (Reuter, 1964). С другой стороны, качество описания малочувствительно к величинам кмнр и Эмир, которые характеризуют свойства фосфорилированного родопсина без аррестина (ШІ-Р). Увеличение кмпр может до некоторой степени быть скомпенсировано увеличением Эщр , и наоборот. Однако, задание ам//р < 0.002 или аМцр > 0.05 приводит к достоверному расхождению модели и экспериментальных данных, которое уже не может быть скомпенсировано вариациями кмир. Очевидно, эти значения и задают границы возможных значений а?. Точно так же, границами допустимых значений кМцр являются 0.25 и 0.8 с"1.

Для других форм частично инактивированного родопсина трудно найти литературные данные об их относительной активности для сравнения с параметрами, указанными в Табл. 1. Данные об активности Mil*, полученные in

vitro, плохо согласуются со скоростями процессов, происходящих в живой клетке

и единственным возможным источником данных такого рода остается

физиологический эксперимент. Параметр аМА, относительная активность

фосфорилированного и связанного с аррестином метародопсином (М-Р-Агг■), был

оценен для палочек жабы в работе Лейброк (Leibrock et al., 1994, 1998), которая

потерю чувствительности от обесцвечивания ~0.02 - 3% родопсина выразила в

терминах «эквивалентного фона». Полная активность всех выключенных

метародопсинов (в данном исследовании, их способность генерировать псевдо-

Рис. 15. Кинетическая схема выключения активности ФДЭ. * обозначают полностью

активированные формы МП, Т, и ФДЭ. Объяснения в тексте.

одноквантовые волны), была определена как ~5'10'6 10 s активности Mil*. Эти цифры находятся в хорошем согласии в

величинами в Табл.1. Точно также, активность опсина была определена по его влиянию на потерю чувствительности палочкой саламандры (Cornwall & Fain, 1994). Результат ~10'6 также находится в хорошем согласии с данными Табл.1. Наконец, величина активности невозбужденного родопсина (а^,) ниже предела графика на Рис. 14 и поэтому несущественна для рассмотрения.

Таким образом, реальная кинетическая схема выключения каскада фототрансдукции, включающая в себя все известные пути взаимопревращений поздних продуктов фотолиза и их относительные активности, обеспечивает хорошее объяснение двухфазного характера восстановления чувствительности палочек после сильного обесцвечивания. При относительно низких уровнях обесцвечивания клетка восстанавливает свою чувствительность при помощи тех

МП* км

м"р М-Р-Агт кМА

Ops k0ps

PDE

же механизмов, которые обеспечивают выключение ответа на единичные фотоны (фосфорилирование МП*, присоединение аррестина и кальциевая обратная связь). Отсюда, эта фаза восстановления может быть обозначена как «обратная световая адаптация». Механизмы, характерные для этой фазы, актуальны в пределах шести порядков интенсивности стимула, от одного до приблизительно 3106 фотонов/вспышку. При более высоких интенсивностях (> 0.1% обесцвечивания пигмента) процессы, обеспечивающие быстрое выключение ФДЭ, характерное для первой фазы, заканчивается, когда клетка все еще пребывает в насыщении. После этого восстановление чувствительности определяется медленным распадом долгоживущих поздних продуктов фотолиза - фосфорилированного и аррестированного метародопсинов и свободного опсина. Существенная разница во временах жизни коротко- и долгоживущих продуктов фотолиза делает зону перехода от одного режима восстановления чувствительности к другому, достаточно резкой - в пределах двух-трехкратного увеличения интенсивности стимула (Рис. 14). Этот переход обозначает границу между обратной световой адаптацией и истинной темновой адаптацией.

3.3. Двухфазное выключение колбочек. Для анализа кинетики выключения ФДЭ у колбочковых фоторецепторов были использованы зеленочувствительные колбочки золотой рыбки Сагазйж аигаЫз. Основная идея эксперимента и способ анализа данных были практически теми же, что использовались для палочек лягушки Кп<ИЪипйа (см. пп. 3.1.-3.5.). В согласии с более низкой чувствительностью колбочек, переход от быстрой к медленной фазе восстановления происходит при более высоких уровнях обесцвечивания -примерно при ~3% против -0.1% в случае палочек лягушки (Рис. 16). Перестроив по аналогии с палочками зависимость в координатах 1/7 от /за1 (п. 3.1) получаем функцию активности ФДЭ от времени,р(г), шкалированную фактором с (см. (13)). Данные для пяти зеленых колбочек показаны на Рис. 17. Как и на Рис. 14, индивидуальные наборы данных отдельных клеток сдвигались по вертикали для достижения лучшего наложения. Размер сдвига не превышал ~40% величины

®10

Рис. 16. Зависимость времени пребывания в насыщении от доли обесцвеченного пигмента для зеленочувствительной колбочки золотой рыбки.

0.001 0.01 0.1 удельн. обесцвечивание

критерия с (активности

гуанилатциклазы). Как видно из Рис. 17, выключение активности ФДЭ у колбочек, как и палочек, происходит в две различные временные фазы, хотя и не так резко отличающиеся, как на Рис. 14. Первая фаза заканчивается приблизительно за 1 с и занимает 2 лог. единицы активности ФДЭ. Вторая фаза длится около 30 с и составляет уменьшение активности ФДЭ еще на один

Рис. 17. Зависимость активности ФДЭ от времени. Данные для пяти зеленых колбочек. Гладкая кривая проведена в соответствии с кинетической схемой на (Рис. 15) с использованием параметров, указанных в Табл. 1.

порядок. Модельное описание экспериментальных данных производилось в соответствии с кинетической схемой на (Рис. 15). Некоторые параметры модели были взяты из результатов независимых экспериментов. Так, константа скорости распада пула метародопсинов кмА = 0.1 б" 1 была получена в спектрофотометрических измерениях (Оо1оЬокоуа & ОоуагёоуБкп, 2006). Параметры кМц и кР0Е были получены из описания

время, о

ненасыщенного колбочкового ответа при помощи полной модели фототрансдукции. Оставшиеся три параметра, кШр, аШр и аМА были определены путем подгонки кинетической модели к экспериментальным данным. Степень влияния этих трех варьируемых параметров на качество подгонки было существенно различным. Параметр аш, определяющий кинетику медленной фазы выключения ФДЭ, подбирается практически однозначно. Активность фосфорилированного Мета II, аШР, и скорость инактивации Мета П-Р при связывании аррестина (кШР) в некоторых пределах взаимозависимы - примерно двукратное изменение одного параметра может быть скомпенсировано соответствующим изменением второго. Поэтому, неопределенность в определении этих двух параметров мы оцениваем примерно в 50%.

Таблица 1. Константы скоростей взаимопревращений поздних продуктов фотолиза (к, с'1) и их удельные активности (по отношению к MIT), (а) . н/о - не определено.

Продукт фотоли за Mil' MII-P М-Р-Агг Opsin Крое Rh

км/,/ с1 Змп кмпр, с"1 Эмир кмА, с"1 ЗМА kops, с"1 3ops

Cones 10 1 1 0.0065 0.1 810"4 н/о н/о 8 н/о

Rods 1 1 0.28 0.012 0.012 П1Г* 810"4 2.110"" 0.33 10*

Наши результаты показывают, что все три реакции инактивации Метародопсина II - фосфорилирование Mil родопсинкиназой, присоединение аррестина к MII-P и распад MII-P-Arr, - происходят примерно на порядок быстрее в колбочках, чем в палочках. Быстрый распад колбочковых метапродуктов был показан ранее (Yoshizawa & Imamoto, 1995; Golobokova & Govardovskii, 2006; Ala-Laurila et al., 2006) и является, по-видимому, специфической особенностью колбочковых опсинов. Быстрое фосфорилирование колбочкового Метародопсина II вероятно объясняется наличием колбочко-специфической родопсинкиназы GRK7 (Hisatomi et al., 1998), чья активность in vitro на порядок выше, чем у

палочковой родопсинкиназы GRK1 (Tachibanaki et. al., 2005). Наконец, GRK7 присутствует в колбочках в большей концентрации, чем GRK1 в палочках (Tachibanaki et. al., 2006; Wada et al., 2006). Вместе, эти два перечисленных выше фактора способны объяснить быстрое выключение колбочкового ответа.

Детали связывания аррестина с колбочковым метапигментом известны значительно хуже, чем у палочек. Показано лишь, что это связывание происходит (Zhu et. al., 2003), хотя и с существенно меньшей аффинностью, что выявлено из анализа кристаллической структуры колбочкового аррестина (Sutton et al., 2005). Эти данные согласуются с нашим наблюдением о том, что удельная активность колбочкового Mll-P-Arr примерно в 100 раз больше, чем у палочкового.

4. Эволюционная адаптация спектра поглощения палочкового пигмента к низким условиям освещенности.

4.1. Частота спонтанной активаиии молекул родопсина и порфиропсина папочек лягушки-быка. Сетчатка лягушки-быка предоставляет редкую возможность сравнить темновой шум у палочек, у которых зрительные пигменты отличаются хромофорной группой и соответственно максимумом поглощения (^шах), однако имеют идентичный опсин (Reuter, White & Wald, 1971). Палочки в дорзальной области сетчатки содержат преимущественно порфиропсин (Хтах= 523 нм), а палочки вентральной части - родопсин (Хтах= 502 нм). Соотношение порфиропсина/родопсина в палочках определялось при помощи описания спектра поглощения суммой номограмм для родопсина-502 и порфиропсина-523 (Dawis, 1981). У палочек из дорзальной части сетчатки молярное содержание порфиропсина составило 74 ±3 % (п = 38), в палочках из вентральной части сетчатки порфиропсина не было. Учитывая разницу в поглощении между родопсином (40600 см^м"1) и порфиропсином (30000 см''м"') (Dartnall, 1972), мы вывели соотношение 0.8/0.2 порфиропсин/родопсин для подсчета числа молекул

VI-

Рис. 18. Записи тока порфиропсиновой палочки,

сделанные в темноте (А-С). В каждой паре записей, нижняя является фильтрованной версией верхней. (Б) форма одной из спонтанных волн тока (обозначена на А стрелкой) с наложенным на нее усредненным фотоответом (гладкая линия) с номинальной интенсивностью 1 Я*/вспышку.

пигмента каждого типа в наружном сегменте палочки из дорзальной части. На Рис. 18 показаны несколько записей тока порфиропсиновой палочки, сделанные в полной темноте.

Амплитуда насыщенного ответа палочек лягушки-быка варьировала в пределах 8-55 пА, интенсивность полунасыщающей вспышки составила примерно 20 Л' и амплитуда однорангового ответа была в пределах 0.4-3.5 пА. колебания (так называемый «непрерывный шум»), на который наложены нерегулярно происходящие негативные отклонения тока, напоминающие по размеру и форме (см. Рис. 180) ответы палочки на одиночные кванты света - «дискретный шум». Для определения частоты встречаемости «дискретных» событий мы использовали

Рис. 19. Амплитудная гистограмма темнового тока порфиропсиновой палочки (та же клетка, что на Рис. 18) с наложенной теоретической функцией распределения вероятности (гладкая кривая). Штриховая линия -симметричное (относительно 0) изображения правой ветви гауссианы, описывающей распределение

«непрерывного шума». Теретическая функция - сумма распределения тока для одноквантового ответа с амплитудой 1.2 пА и частотой 0.024 с , и «непрерывного шума». Точечные кривые обозначают ту же функцию, рассчитанную с частотой одноквантовых событй на 10% больше и меньше оптимальной.

метод построения и анализа формы гистограммы амплитуд темнового тока палочки. Вкратце, идея анализа такова — симметричный относительно своего среднего уровня «непрерывный шум» должен давать симметричную гистограмму амплитуд тока приблизительно гауссиановского вида. Если в записи тока дополнительно присутствуют однополярные волны — такие, как дискретные псевдо-одноквантовые события, они должны создавать несимметричное «плечо» на гистограмме (см. Рис. 19). Размер и форма этого плеча позволяют рассчитать частоту дискретных событий за время записи. Усредненный результат по шести порфиропсиновым палочкам дает частоту дискретных темновых событий 0.057 палочку'1-е'1 , что дает константу скорости термической активации порфиропсина 1.2-10"11 с"1 . У родопсиновых палочек ввиду очень низкой скорости термической активации пигмента, удалось определить только верхнюю границу частоты дискретных событий - 0.005 палочку''-c'1 , что соответствует константе скорости термической активации родопсина приблизительно 10'12 с"1.

4.2.Механизмы генерации темнового шума. В соответствии с гипотезой Барлоу (1993), темновой шум зрительного пигмента, проявляющийся в виде спонтанных, псевдо-одноквантовых ответов палочки, генерируется за счет нестабильной фракции пигмента с непротонированным Шиффовым основанием. Фракция с протонированным Шиффовым основанием является стабильной и не подвержена спонтанному тепловому распаду. рК Шиффова основания родопсина позвоночных велика и составляет по оценкам рКр > 15 (Steinberg et al., 1993; также обзор Ebrey, 2000). Отсюда следует, что подавляющее большинство молекул пигмента находятся в протонированном состоянии. Концентрация небольшой фракции непротонированного Шиффова основания обратно пропорциональна внутриклеточной концентрации [Н*]. Увеличение рН должно увеличивать долю пигмента с непротонированным Шиффовым основанием, и, следовательно, увеличивать частоту спонтанного распада пигмента.

рН внутри фоторецептора изменялся путем изменения рН в растворе Рингера. Для того, чтобы оценить пределы изменения рН в цитоплазме клетки, мы

использовали спектрофотометрические измерения взаимопревращений продуктов

фотолиза родопсина - метародопсинов I, II и III при помощи высокоскоростного

микроспектрофотометра. Результат показал, что при изменении наружного рН от

6.5 до 9.3, рН внутри клетки изменялся от 7.6 до 8.5 .

Рис. 20. Скорость спонтанной активации родопсина как функция рН. Количество клеток и количество зарегистрированных событий показаны в скобках около каждой экспериментальной точки. Толстая гладкая линия -параболическое описание точек. Тонкая ломаная линия - измеренная средняя относительная

концентрация непротонированной формы Шиффова основания. Штриховая линия ("макс, регулировка") - нижняя граница относительной концентрации непротонированной формы

Шиффова основания.

!-ми кратное увеличение частоты спонтанных изомеризаций родопсина при таком изменении рН. На самом деле, мы получили небольшое, но достоверное уменьшение частоты темновых событий (Рис.20). Таким образом, результат этих экспериментов свидетельствует, что собственный темновой шум зрительных пигментов позвоночных не происходит из-за распада молекул пигмента с непротонированным Шиффовым основанием.

Заключение.

У фоторецепторов позвоночных способность к восприятию света в большом диапазоне интенсивностей обеспечивается разнообразными регуляторными механизмами. Одни их них позволяют в короткое время существенно изменить параметры биохимического каскада фототрансдукции, отвечающего за преобразование светового стимула в электрический сигнал. Они подстраивают чувствительность зрительной системы в соответствии с изменениями

РНо

Гипотеза предсказывает примерно 8

освещенности в течение суточного цикла. В рамках настоящей работы мы называем эти механизмы механизмами физиологической адаптации.

По современным представлениям, основным механизмом физиологической адаптации фоторецептора является кальциевая обратная связь, зависящая от степени возбуждения фоторецептора и воздействующая на три мишени в каскаде фототрансдукции - родопсинкиназу, гуанилатциклазу и СЫй каналы. В настоящей работе мы показали существование еще одной регулировки, также зависящей от степени возбуждения фоторецептора и управляющей скоростью выключения комплекса трансдуцин-фосфодиэстераза. Кроме того, мы показали, что работа каскада может регулироваться уровнем внутриклеточного цАМФ. Величина этой регулировки сопоставима с размером кальций-зависимой регулировки. Непосредственные детали работы этого механизма пока во многом непонятны; мы привели веские доводы в пользу того, что цАМФ модулирует работу кальциевой регулировки каскада.

После достаточно сильных световых стимулов, обесцвечивающих большое количество зрительного пигмента, механизм кальциевой обратной связи уже не справляется с восстановлением чувствительности фоторецептора, и кинетику восстановления чувствительности начинают определять другие, гораздо более медленные процессы. Мы назвали это переходом от обратной световой к темновой адаптации. Этими процессами являются появление и распад фосфорилированных и аррестин-связанных метапродуктов. Мы показали, что у колбочек распад этих продуктов происходит на порядок быстрее, чем у палочек, что тоже можно отнести к адаптивным приспособлениям, так как колбочки оперируют при высоких по сравнению с палочками уровнях освещенности и нуждаются в более быстрой темновой адаптации.

Спонтанная тепловая изомеризация зрительного пигмента создает темновой шум, который и определяет нижнюю границу диапазона зрительного восприятия. Молекулярный механизм генерации этого шума пока неясен, однако наши данные свидетельствуют, что он отличается от механизма светоиндуцированной изомеризации пигмента. Мы показали, что положение максимума поглощения палочкового зрительного пигмента является адаптационным компромиссом между необходимостью двигаться в красную область спектра, где больше фотонов, и необходимостью двигаться в обратную сторону, чтобы уменьшить темновой шум.

ВЫВОДЫ

1. Скорость выключения активности трансдуцина зависит от степени активации каскада фототрансдукции. Таким образом, оба процесса, определяющие форму ответа ФДЭ на световой стимул - выключение родопсина и выключение трансдуцина - находятся под адаптационным контролем.

2. Доминантная постоянная времени выключения каскада фототрансдукции у палочки лягушки не зависит от уровня активации каскада и, следовательно, не может быть соотнесена ни с выключением родопсина, ни с выключением трансдуцина. Возможно, ее формирует реакция присоединения аррестина к фосфорилированому Метародопсину II.

3. Повышение внутриклеточной концентрации цАМФ в пределах, близких к его естественным колебаниям в цикле день/ночь, приводит к существенному увеличению чувствительности палочки, что может иметь значение для адаптивного приспособления зрительной системы животного к суточным колебаниям освещенности.

4. Механизм воздействия цАМФ на каскад фототрансдукции заключается в изменении внутриклеточной концентрации кальция, а также в регулировке базальной (темновой) активности фосфодиэстеразы и максимальной активности гуанилатциклазы.

5. Восстановление чувствительности фоторецептора после обесцвечивания части зрительного пигмента обеспечивается двумя существенно различающимися временными фазами. Быстрая фаза определяется обращенными во времени процессами световой адаптации. Медленная фаза определяется совокупной активностью долгоживущих поздних продуктов фотолиза и может быть названа темновой адаптацией.

6. Удельные активности фосфорилированного и аррестин-связанного метапродукта у колбочкового пигмента примерно в 100 раз выше, чем у палочкового, а скорости взаимопревращений колбочковых метапродуктов в 4-8 раз быстрее, чем палочковых.

7. Частота спонтанной активации молекул палочкового зрительного пигмента повышается со сдвигом его максимума поглощения в длинноволновую часть спектра. Это поддерживает гипотезу об адаптивном характере расположения максимумов поглощения палочковых пигментов в середине спектра видимых длин волн.

8. Частота спонтанной активации молекул зрительного пигмента не зависит от pH цитоплазмы. Таким образом, гипотеза о генерации спонтанной активации пигмента нестабильной фракцией родопсина с непротонированным Шиффовым основанием не находит подтверждения.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ Список опубликованных статей.

1. Фирсов М.Л., Говардовский В.И. Темновой шум зрительных пигментов с различным положением максимума поглощения// Сенсорные Системы. 1990. Т. 4. С. 25-34.

2. Donner К., Firsov M.L., Govardovskii V.l. The frequency of isomerization-like 'dark' events in rhodopsin and porphyropsin rods of the bull-frog retina // J. Physiol. 1990. Vol. 428. P. 673-692.

3. Firsov M.L., Govardovskii V.l., Donner. K. Response univariance in bull-frog rods with two visual pigments // Vision Res. 1994. Vol. 34. P. 839-847.

4. Firsov M.L., Green D.G. Photoreceptor coupling in turtle retinaJ ¡Vis Neurosci. 1998. Vol. 15 N. 4. P. 755-64.

5. Фирсов M.JI., Говардовский В.И. Световая адаптация фоторецепторов: смысл и механизмы//Сенсорные Системы. 2001. Т. 15 № 2. С. 102-115.

6. Firsov M.L., Donner К., Govardovskii V.I. рН and rate of "dark" events in toad retinal rods: test of a hypothesis on the molecular origin of photoreceptor noise. HJ. Physiol. 2002. Vol. 539. P. 837-846.

7. Кузьмин Д.Г., Травников C.B., Фирсов М.Л., Говардовский В.И. Математическое моделирование фототрансдукдии и световой адаптации в палочках сетчатки лягушки//Сенсорные Системы. 2004. Т. 18. № 4. С. 305-316.

8. Firsov M.L., Kolesnikov A.V., Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. Two realms of dark adaptation. Vision Res. 2005. Vol. 45. P. 147-151.

9. Firsov M.L., Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. Two-stage quenching of cone phototransduction cascade/1Сенсорные Системы. 2007. Т. 21. № 1. С. 55-59.

10. Astakhova L. A., Firsov M.L., Govardovskii V.I. Kinetics of turn-offs of frog rod phototransduction cascade// J. Gen. Physiol. 2008. Vol. 132. P. 587-604.

11. Говардовский В.И., Фирсов М.Л. Неизвестные механизмы регуляции GPCR-сигнального каскада в фоторецепторах позвоночны-¡¿/Российский физиологический журнал. 2010. Т. 96. № 9. С. 861-879.

12. Астахова Л.А., Капицкий С.В., Фирсов М.Л. Измерение уровня цАМФ в наружных сегментах палочек лягушки R.ridibunda// Сенсорные системы, 2010. Т. 24. №2. С. 99-103.

13. Astakhova, L.A., E.V. Samoiliuk, V.I. Govardovskii, M.L. Firsov.. cAMP controls rod photoreceptor sensitivity via multiple targets in the phototransduction cascade// J. Gen. Physiol, 2012. Vol.140. P.421-433.

Статьи в сборниках.

1. Астахова Л. А., Самойлюк Е.В., Фирсов МЛ. цАМФ и каскад фототрансдукции// Сборник статей «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» 2011.Т.1.С. 221-226.

Список опубликованных тезисов.

1. Donner, К., Firsov, М. L., Govardovskii, V. I. No significant effect of external pH on rates of isomerization-like "dark" events in toad rods.// Proceedings of the XXXIII International Congress of Physiological Sciences. St.-Petersburg. 1997. P. 082.07.

2. Фирсов М.Л., Говардовский В.И. Собственный шум фоторецепторов -источники и функциональное значение//18-ый съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. Тезисы докладов. 2001. С. 252.

3. Фирсов М.Л., Говардовский В.И. Световая адаптация фоторецепторов: смысл и механизмы// Материалы XII международного совещания и V школы по эволюционной физиологии. С.-Петербург. 19-25 ноября 2001 г. С.152-153.

4. M.L.Firsov, A.V.Kolesnikov, E.Yu.Golobokova, V.I.Govardovskii. Two realms of dark adaptation // Proceedings of Visionarium III Conference, Tvarminne, Finland, Sept. 2004. P.4

5. Firsov M.L., Donner К., Govardovskii V.I. Dark noise of photoreceptors, -spontaneous oscillations of photoreceptor cascade// Proceedings of 5th INMED/TINS Conference "Physiogenic and pathogenic oscillations: the beauty and the beast". La Ciotat, France. 2006. P. 18.

6. Firsov M.L., Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. Two-phase quenching of cone phototransduction cascade// Proceedings of Visionarium V Conference, Tvarmine, Finland. 2006. P. 7.

7. Astakhova L.A., Firsov M.L., Govardovskii V.I. Rhodopsin phosphorylation and transducin shut-off rates: do they limit the quenching of the phototransduction cascade?// Proceedings of Visionarium V Conference, Tvarmine. Finland. 2006. P. 4.

8. Астахова Л.А., Фирсов М.Л., Говардовский В.И. Кинетика инактивации родопсина и трансдуцина in vivo в палочках лягушки R. ridïbunda!/Материалы Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация". Пущино. 5-7 июня 2007 г. С.147-149.

9. Astakhova L.A., Firsov M.L, Govardovskii V.I. Kinetics of rhodopsin and transducin shut-off in frog rods in vivo// Proceedings of Visionarium VI Conference,.Tvarmine, Finland. 2007. P.4

10. Фирсов M.Л. Выключение каскада фототрансдукции и темновая адаптация фоторецепторов//20-ый съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. Тезисы докладов. 2007. С.

11. Firsov M.L. Phototransduction cascade shut-offs: reactions and proteins// Proceedings of Visionarium VI Conference. Tvarmine. Finland. 2007. P.8.

12. Astakhova L.A., Firsov M.L, Govardovskii V.I. Both Rhodopsin and transdusin shut-offs are under light adaptation control in frog rods.// 6th FENS Meeting, Geneva (Switzerland). 2008. V.4 abstr. # 054.2

13. Astakhova L.A., Firsov M.L цАМФ Dynamics in Photoreceptor// Proceedings of Visionarium VIII Conference. Tvarmine. Finland. 2009. P.5

14. Astakhova L.A., Poloskin E.D., Firsov M.L. cAMP impact on phototransduction// Proceedings of Visionarium VIII Conference. Tvarmine. Finland. 2009. P. 10.

15. Фирсов М.Л., Астахова Л.А., Говардовский В.И. Неизвестные механизмы регулировки каскада фототрансдукции// 21-ый съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. Тезисы докладов. 2010. С. 644.

16. Astakhova L.A., Firsov M.L. Effects of cAMP analogs on photoresponse properties. // Proceedings of Visionarium IX Conference, Tvarmine, Finland. 2010. P.2

17. Samoyluk E.V., Astakhova L.A., Firsov M.L. Localization of cAMP-dependent regulation in photoreceptor // Proceedings of Visionarium IX Conference. Tvarmine. Finland. 2010. P. 17

18. Астахова JI.А., Самойлюк E.B., Михайлова H.B., Фирсов М.Л. Поиск и локализация ферментов синтеза и гидролиза цАМФ в палочках лягушки сетчатки лягушки// Тезисы докладов и лекций XIV международного совещания и VII школы по эволюционной физиологии. С.-Петербург. 24-29 октября 2011 г. С.20-21

19. Астахова Л.А., Самойлюк Е.В., Фирсов М.Л. Неканонические механизмы регулировки каскада фототрансдукции. //Тезисы докладов 7-ой международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак. Украина. 3-13 июня 2011 г. С.69-70.

20. Astakhova L.A., Samoiliuk E.V., Govardovskii V.I. Firsov M.L. How does cAMP regulates the phototransduction cascade ? // Proceedings of Visionarium X Conference, Tvarmine, Finland. 2011. P.3

21. Астахова Л.А., Самойлюк E.B., Говардовский В.И., Фирсов М.Л. Модулирующая роль цАМФ в световой и темновой адаптации фоторецепторов сетчатки позвоночных// Тезисы докладов Междисциплинарной научной конференции «Адаптационные стратегии живых систем». Новый Свет, Украина, 11-16 июня 2012 г., С. 7-8.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

цГМФ- циклический гуанозинмонофосфат

ФДЭ - фосфодиэстераза 6 типа

ГЦ - гуанилат циклаза

АЦ - аденилат циклаза

CNGC, CNG - каналы, управляемые цГМФ

GRK1- родопсинкиназа 1 типа

IBMX - З-изобутил-1-метилксантин, ингибитор ФДЭ

НСП - наружный сегмент палочки, наружные сегменты палочек

Подписано в печать 19.09.2012. Формат 60x84/16 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ № 1/0919. П. л. 3.0. Уч.-изд. л. 3.0. Тираж 120 экз.

ЗАО «КопиСервис» Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 3. тел.: (812) 327 5098

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Фирсов, Михаил Леонидович

Введение.

Глава 1. Общий обзор современных представлений о работе каскада фототрансдукции.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Кинетика выключения каскада фототрансдукции.

Глава 4. сАМР как регулятор каскада фототрансдукции.

Глава 5. Переход от обратной световой к темновой адаптации.

Глава 6. Темновой шум и механизмы его генерации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы адаптации фоторецепторов позвоночных"

Актуальность проблемы.

Зрение обеспечивает животное информацией о трехмерной структуре окружающего мира, а также о спектральном составе поверхностей окружающих его материальных объектов. Эти задачи выполняются путем регистрации зрительными сенсорами - фоторецепторами электромагнитных волн, отраженных от окружающих объектов. Естественным источником освещения на Земле служит солнечный свет -прямой днем и отраженный от Луны ночью. В зависимости от времени суток, спектральное распределение солнечного света меняется под воздействием различных факторов. Кроме того, в течение суток очень сильно меняется интенсивность света - от 10"4 люкс безлунной ночью (свет звезд) до 1.3x105 люкс прямого полуденного солнечного света. Очевидно, что для успешного осуществления стратегии выживания зрительная система животного должна быть эффективна во всем доступном диапазоне интенсивностей и в возможно более широких спектральных границах солнечного света.

Палочки позвоночных обладают уникальной способностью работать в режиме счета отдельных квантов при очень низких освещенностях и не насыщаться при интенсивностях до 104 квантов/секунду. Достигается это благодаря комплексу регулирующих воздействий, основой которых является кальциевая обратная связь. Смысл кальциевой обратной связи состоит в противодействии насыщению фоторецептора высокими уровнями фоновой стимуляции. Для этого кальциевая обратная связь увеличивает сродство цГМФ-управляемых каналов мембраны к своему лиганду, а также снижает удельную реакцию каскада фототрансдукции на световую стимуляцию. По современным представлениям, это происходит за счет активации гуанилатциклазы и ускорения выключения активного родопсина и активного трансдуцина.

Одним из до сих пор плохо изученных аспектов й-белковой сигнализации является регулировка её выключения. Кинетика выключения каскада определяет его чувствительность и временное разрешение, и таким образом является критической для правильного функционирования. Выключение каскада должно быть направлено на инактивацию рецепторной молекулы, инактивацию эффекторного фермента и восстановление концентрации вторичного посредника. Эти процессы являются мишенью многих, пока плохо изученных, механизмов регуляции. Первой проблемой является полное понимание процесса выключения рецепторной молекулы. Резкое понижение сигнальной активности родопсина после поглощения кванта света достигается его множественным фосфорилированием родопсинкиназой и последующим связыванием со специфическим белком -аррестином. В общих чертах этот процесс считается понятным, но точный временной ход инактивации метродопсина II неизвестен. Кинетика фосфорилирования, наблюдающаяся в биохимических экспериментах in vitro (Calvert et al., 1995; Kennedy et al, 2000), кажется недостаточно быстрой, чтобы объяснить физиологический ответ. С другой стороны, данные о выключении родопсина, извлекаемые из записей электрического ответа, полагаются на сложную многопараметрическую математическую модель и поэтому неоднозначны.

Второй проблемой является выключение активированного G-белка -трансдуцина. Собственная ГТФ-азаная активность трансдуцина шзка и не может обеспечить своевременное выключение каскада. Она резко увеличивается в результате связывания с эффекторным ферментом (ФДЭ) и дальнейшего образования комплекса с белком RGS9/Gp5 и с якорным белком R9AP, удерживающим RGS9 на мембране. Потенциально такая сложная система выключения эффекторного фермента допускает множество путей регуляции. Показано, что введение гипотетического ускорения инактивации ФДЭ в ходе световой адаптации позволяет значительно улучшить согласие модели фототрансдукции с экспериментом. Однако даже само существование какой-то регуляции времени жизни активной ФДЭ при физиологической стимуляции не показано ни в биохимическом, ни физиологическом эксперименте.

Многочисленные экспериментальные факты свидетельствуют, что помимо трех известных кальций-зависимых регулировок каскада фототрансдукции, существует другие, медленные и глубокие регулировки, биохимический механизм и даже мишени которых неизвестны. Одним из потенциальных посредников такой регулировки мог бы служить цАМФ. Показано, что уровень цАМФ в цитоплазме фоторецепторов подвержен циркадным ритмам. Внутри каскада фототрансдукции многие белки являются мишенями для цАМФ-зависимой протеинкиназы А (ПКА) -гуанилатциклаза (ГЦ), GCAP, родопсинкиназа (GRK1), фосдуцин и CNG каналы. Более того, сейчас установлено, что фосфорилирование GRK1 является светозависимым (Osawa et al., 2008; Osavva et al., 2011). Существование циркадных ритмов цАМФ и мишеней для цАМФ-зависимой регулировки в каскаде фототрансдукции позволяет предположить, что цАМФ мог бы служить еще одним регулятором каскада. Однако такая регулировка in vivo не была до сих пор никем показана, и цАМФ не входит ни в одну из современных схем фототрансдукции.

Выключение активной формы родопсина, Метародопсина II, происходит путем его фосфорилирования родопсинкиназой (GRK1). Фосфорилирование не подавляет каталитическую активность родопсина полностью, и дальнейшая инактивация происходит путем связывания фосфорилированного родопсина {Mema II -р) с белком аррестина. Аррестин (Atr) блокирует сайты взаимодействия родопсина с G-белком, Gt и таким образом дополнительно снижает сигнальную активность в каскаде. При относительно слабых стимулах, генерирующих небольшое количество активных молекул Mema II*, фосфорилирование и присоединение аррестина можно рассматривать как полное выключение каскада. В этом случае, остаточной активностью комплексов MemaII-p-Агг а также последующих продуктов фотолиза, можно пренебречь. При сильных стимулах, генерирующих много Mema II*, продукты распада Mema II* генерирует в совокупности достаточно большой сигнал, обеспечивающий высокий уровень возбуждения фоторецептора.

Полное выключение каталитической активности родопсина и регенерация «темнового» зрительного пигмента служит механизмом темповой адаптации - восстановления чувствительности зрения при переходе от высоких освещенностей к низким. Поэтому скорости взаимопревращений продуктов распада родопсина на поздних стадиях фотолиза, а также их относительные остаточные активности являются критичными параметрами при определении динамики темновой адаптации фоторецепторов. Однако, детальный вклад поздних продуктов фотолиза в выключение каскада in vivo до сих пор неизвестен.

Диапазон видимого света - примерно от 380 до 750 нм, - определяется разнообразием колбочковых пигментов. Зрительная система, обладающая несколькими типами колбочек с разными спектрами поглощения зрительных пигментов, позволяет хорошо различать цвета в условиях достаточного освещения. Удельное количество фотонов в солнечном спектре повышается с увеличением длинны волны. Для палочек, чья задача состоит в рецепции слабых стимулов, в том числе и одиночных фотонов, было бы выгодно иметь спектр поглощения ближе к длинноволновой границе спектра излучения солнца. Тем более странно, что подавляющее большинство известных палочковых зрительных пигментов позвоночных животных имеют максимумы поглощения отнюдь не в длинноволновой, а в узкой средней области спектра, в районе 500 им. Полвека назад была высказана гипотеза о том, что более длинноволновые пигменты обладают большим собственным, т.н. «темповым» шумом, и поэтому положение их максимумов поглощения в средней части спектра есть эволюционный адаптивный компромисс (Barlow, 1956). Несмотря на всю привлекательность этой концепции, она долгое время не имела экспериментальной проверки. Неясным остается также сам механизм возникновения «темнового» шума. Существует гипотеза о генерации шума нестабильной фракцией родопсина с непротонированной формой Шиффова основания, также не проверенная пока в эксперименте.

В настоящей работе будут рассматриваться две группы процессов адаптации. Одна группа включает в себя физиологические процессы световой и темновой адаптации в тече1ше суточного цикла изменения освещенностей. Другая группа составляет эволюционные адаптации к условиям обитания, в зависимости от спектрального и яркостного диапазона естественного освещения.

Цель исследования

Задачи исследования

1. Установить кинетику активации и инактивации эффекторного фермента каскада фототранедукции - ФДЭ - и проанализировать ее зависимость от уровня фонового освещения.

2. Создать методику, позволяющую манипулировать уровнем цАМФ в изолированном фоторецепторе амфибии в пределах, близких к естественным колебаниям цАМФ во время циркадных ритмов. Изучить влияние изменения внутриклеточного уровня цАМФ на работу каскада фототранедукции. Выявить молекулярные мишени воздействия цАМФ на работу каскада фототранедукции, определить параметры этого воздействия. Оценить значение регулирующего воздействия цАМФ на каскад фототранедукции.

3. Изучить in vivo динамику восстановления чувствительности фоторецептора после сильного обесцвечивания зрительного пигмента. Идентифицировать механизмы, определяющие скорость восстановления чувствительности фоторецептора при разных уровнях обесцвечивания зрительного пигмента. Определить относительный вклад поздних продуктов фотолиза в степень возбуждения каскада фототранедукции у палочек и колбочек.

Научная новизна

В нашей работе кинетика выключения родопсина и комплекса трансдуцин-ФДЭ вычисляется при помощи новой оригинальной методики, наиболее прямым способом, позволяющим избежать влияния различных регулирующих факторов в системе in vivo. Поэтому мы полагаем, что наши результаты являются наиболее близкой оценкой иститпгых параметров реакций выключения родопсина и комплекса трансдуцин-ФДЭ. Нами впервые показано, что скорость выключения комплекса трансдуцин-ФДЭ зависит от уровня фонового возбуждения фоторецептора, что является существенным дополнением к классической схеме работы кальциевой обратной связи в каскаде фототрансдукции. Совершенно новым является сделанное нами обоснованное предположение о том, что ни фосфорготирование метапигмента, ни инактивация трансдуцина не являются лимитирующими процессами, определяющими время выключения каскада.

Нами впервые показано существование в фоторецепторе дополнительной цепи регулировки каскада фототрансдукции, управляемой внутриклеточной концентрацией цАМФ. Определены мишени регулирующего воздействия цАМФ и высказаны обоснованные предположения о механизмах этого воздействия. Показано, что эта регулировка работает в пределах естественных колебаний уровня цАМФ в клетке, и увеличение уровня цАМФ сопровождается увеличением чувствительности фоторецептора и может иметь существенное адаптивное значение для зрительной системы в целом.

Для описания динамики восстановления чувствительности фоторецептора после интенсивного обесцвечивания пигмента нами применена математическая модель, основанная на кинетической схеме взаимопревращений поздтшх продуктов фотолиза. Применение модели для описания экспериментальных данных позволяет измерить в условиях целой клетки удельные активности метапродуктов и скорости их взаимопревращений. Данные о кинетике и об удельных активностях продуктов поздних стадий фотолиза зрительного пигмента колбочек получены впервые. Впервые показано, что удельные активности фосфорилированного и аррестированного метапродукта у колбочкового пигмента примерно в 100 раз больше, чем у палочкового, а скорости взаимопревращений колбочковых метапродуктов в 4-8 раз быстрее, чем палочковых.

Научно-практическая значимость работы

Полученные данные существенно расширяют наши представления о механизмах регулирования каскада фототрансдукции. В результате появляется возможность более детального описания его работы в норме, что повышает вероятность ранней диагностики патологических состояний. Открытие роли цАМФ в регулировке чувствительности фоторецептора дает новые возможности в поиске путей коррекции патологических состояний сетчатки, - таких, например, как нарушение сумеречного зрения. Каскад фототрансдукции является во многих отношениях модельной системой для других сенсорных и песенсорных сигнальных каскадов. Поэтому, выявление в его составе новых регулирующих механизмов может привести к интенсивному поиску аналогичных регулировок и в других каскадах.

Положения, выносимые на защиту.

3. Каскад фототрансдукции выключается в две различающиеся временные фазы. Быстрая фаза определяется фосфорилированием Мета II и связыванием его с аррестином. Медленная фаза контролируется распадом частично инактивированных метародопсинов на ретиналь и опсин и регенерацией родопсина. Она отвечает за темновую адаптацию. В колбочках все реакции зрительного цикла происходят на порядок быстрее, чем в палочках, что и обеспечивает более быструю темновую адаптацию дневного зрения.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Фирсов, Михаил Леонидович

ВЫВОДЫ

4. Механизм воздействия цАМФ на каскад фототрансдукции заключается в изменении внутриклеточной концентрации кальция, а также в регулировке базалыюй (темновой) активности фосфодиэстеразы и максимальной активности гуанилатциклазы.

8, Частота спонтанной активации молекул зрительного пигмента не зависит от рН цитоплазмы. Таким образом, гипотеза о генерации спонтанной активации пигмента нестабильной фракцией родопсина с непротонированным Шиффовым основанием не находит подтверждения.

Синеок публикации по теме диссертации. Список опубликованных статей.

1. Фирсов M.JL, Говардовский В.И. Темновой шум зрительных пигментов с различным положением максимума поглощения// Сенсорные Системы. 1990. Т. 4. С. 25-34.

2. Donner К., Firsov M.L., Govardovskii V.I. The frequency of isomerization-like 'dark' events in rhodopsin and porphyropsin rods of the bull-frog retina // J. Physiol. 1990. Vol. 428. P. 673-692.

3. Firsov M.L., Govardovskii V.I., Donner. K. Response univariance in bullfrog rods with two visual pigments // Vision Res. 1994. Vol. 34. P. 839-847.

4. Firsov M.L., Green D.G. Photoreceptor coupling in turtle retina//Fw Neurosci. 1998. Vol. 15 N. 4. P. 755-64.

5. Фирсов M.JL, Говардовский В.И. Световая адаптация фоторецепторов: смысл и механизмы// Сенсорные Системы. 2001. Т. 15 № 2. С. 102-115.

6. Firsov M.L., Donner К., Govardovskii V.I. рН and rate of "dark" events in toad retinal rods: test of a hypothesis on the molecular origin of photoreceptor noise. IIJ. Physiol. 2002. Vol. 539. P. 837-846.

7. Кузьмин Д.Г., Травников С.В., Фирсов МЛ., Говардовский В.И. Математическое моделирование фототранедукции и световой адаптации в палочках сетчатки лягушки// Сенсорные Системы. 2004. Т. 18. № 4. С. 305316.

8. Firsov M.L., Kolesnikov A.V., Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. Two realms of dark adaptation. Vision Res. 2005. Vol. 45. P. 147-151.

9. Firsov M.L., Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. Two-stage quenching of cone phototransduction cascadd/Сенсорные Системы. 2007. Т. 21. № 1. С. 5559.

10. Astakhova L.A., Firsov M.L., Govardovskii V.I. Kinetics of turn-offs of frog rod phototransduction cascade// J. Gen. Physiol. 2008. Vol. 132. P. 587-604.

11. Говардовский В.И., Фирсов M.JL Неизвестные механизмы регуляции GPCR-сигнального каскада в фоторецепторах позвоночныхИРоссийский физиологический эюурнал. 2010. Т. 96. № 9. С. 861-879.

12. Астахова Л.А., Капицкий С.В., Фирсов МЛ. Измерение уровня цАМФ в наружных сегментах палочек лягушки R.ridibunda// Сенсорные системы, 2010. Т. 24. №2. С. 99-103.

13. Astakhova, LA., E.V. Samoiliuk, V.I. Govardovskii, M.L. Firsov. cAMP controls rod photoreceptor sensitivity via multiple targets in the phototransduction cascade// J. Gen. Physiol, 2012. Vol.140. P.421-433.

Статьи в сборниках.

1. Астахова Л.А., Самойлюк Е.В., Фирсов М.Л. цАМФ и каскад фототрансдукции// Сборник статей «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» 2011. Т.1. С. 221-226.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

По современным представлениям, основным механизмом физиологической адаптации фоторецептора является кальциевая обратная связь, зависящая от степени возбуждения фоторецептора и воздействующая на три мишени в каскаде фототрансдукции - родопсинкиназу, гуанилатциклазу и СЫО каналы. В настоящей работе мы показали существование еще одной регулировки, также зависящей от степени возбуждения фоторецептора и управляющей скоростью выключения комплекса трансдуцин-фосфодиэстераза. Кроме того, мы показали, что работа каскада может регулироваться уровнем внутриклеточного цАМФ. Величина этой регулировки сопоставима с размером кальций-зависимой регулировки. Непосредственные детали работы этого механизма пока во многом непонятны; мы привели веские доводы в пользу того, что цАМФ модулирует работу кальциевой регулировки каскада.

Наконец, существуют процессы адаптации, происходящие в эволюционной временной шкале. Они обеспечивают приспособление зрительной системы к световой среде обитания данного вида. К таким процессам относится, в частности, спектральная адаптация, устанавливающая видимый диапазон длин волн и нижнюю границу диапазона интенсивностей, доступных для зрения. Спонтанная тепловая изомеризация зрительного пигмента создает темновой шум, который и определяет нижнюю границу диапазона зрительного восприятия. Молекулярный механизм генерации этого шума пока неясен, однако наши данные свидетельствуют, что он отличается от механизма светоиндуцированной изомеризации пигмента. Мы показали, что положение максимума поглощения палочкового зрительного пигмента является адаптационным компромиссом между необходимостью двигаться в красную область спектра, где больше фотонов, и необходимостью двигаться в обратную сторону, чтобы уменьшить темновой шум.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Фирсов, Михаил Леонидович, Санкт-Петербург

1. Говардовский В.И. 1972. О возможном приспособительном значении положения максимума поглощения зрительного пигмента. Журнал эволюционной физиологии и биохимии. Т.8(1):8-17

2. Говардовский В.И., Зуева JI.B. 2000. Скоростной микроспектрофотометр для исследования фотолиза зрительных пигментов in situ. Сенсорные системы. Т. 14(4): 288-296.

3. Говардовскии В.И., Кузьмин Д.Г. 1999. Светоиндуцированный выход ионов Са2+ и кинетика кальциевой обратной связи в палочках сетчатки. Сенсорные системы. Т. 13(3):206-215.

4. Каймачников Н.П., Колесников С.С., Мякишев А.С. 1992. Модельное исследование регуляции фототрансдукции внутриклеточным кальцием. Сенсорные системы. Т.6(4): 13-17.

5. Каймачников Н.П., Колесников С.С., Мякишев А.С. 1993. Роль Са2+-зависимой деактивации родопсина в адаптации фоторецепторов. Модельное исследование. Сенсорные системы. Т.7(3):79-92.

6. AmesJ.B. and M.Ikura. 2002. Structure and membrane-targeting mechanism of retinal Ca2+-binding proteins, recoverin and GCAP-2. Adv. Exp. Med. Biol. 514:333-348.

7. Ames,J.B., K.Levay, J.N.Wingard, J.D.Lusin, and V.Z.Slepak. 2006. Structural basis for calcium-induced inhibition of rhodopsin kinase by recoverin. J. Biol. Chem. 281(48):37237-37245.

8. Angleson,J.K. and T.G.Wensel. 1993. A GTPase-accelerating factor for transducin, distinct from its effector cGMP phosphodiesterase, in rod outer segment membranes. Neuron ll(5):939-949.

9. Arimoto,R., O.G.Kisselev, G.M.Makara, and G.R.Marshall. 2001. Rhodopsin-transducin interface: studies with conformationally constrained peptides. Biophys. J. 81(6):3285-3293.

10. Arshavsky,V.Y. and M.D.Bownds. 1992. Regulation of deactivation of photoreceptor G protein by its target enzyme and cGMP. Nature 357(6377):416-417.

11. Arshavsky,V.Y. 2002. Rhodopsin phosphorylation: from terminating single photon responses to photoreceptor dark adaptation. Trends Neurosci. 25(3): 124-126.

12. Arshavsky,V.Y., T.D.Lamb, and E.N.Pugh, Jr. 2002. G proteins and phototransduction. Annu. Rev. Physiol 64:153-187.

13. Arshavsky,V.Y. and M.E.Burns. 2012. Photoreceptor Signaling: Supporting Vision across a Wide Range of Light Intensities. J. Biol. Chem. 287(3): 1620-1626.

14. Artemyev,N.O., V.Y.Arshavsky, and R.H.Cote. 1998. Photoreceptor phosphodiesterase: interaction of inhibitory gamma subunit and cyclic GMP with specific binding sites on catalytic subunits. Methods 14(1):93-104.

15. Ashmore,J.F. and G.Falk. 1977. Dark noise in retinal bipolar cells and stability of rhodopsin in rods. Nature 270(5632):69-71.

16. Astakhova,L.A., M.L.Firsov, and V.I.Govardovskii. 2008. Kinetics of turn-offs of frog rod phototransduction cascade. J. Gen. Physiol 132(5):587-604.

17. Barlow,H.B. 1956. Retinal noise and absolute threshold. J. Opt. Soc. Am. 46(8):634-639.

18. Barlow,H.B. 1957. Purkinje shift and retinal noise. Nature 179(4553):255-256.

19. Barlow,R.B., R.R.Birge, E.Kaplan, and J.R.Tallent. 1993. On the molecular origin of photoreceptor noise. Nature 366(6450):64-66.

20. Bauer,P. J. 1996. Cyclic GMP-gated channels of bovine rod photoreceptors: affinity, density and stoichiometry of Ca(2+)-calmodulin binding sites. J. Physiol 494 (Pt 3):675-685.

21. Baylor,D.A., T.D.Lamb, and K.W.Yau. 1979. The membrane current of single rod outer segments. J. Physiol 288:589-611.

22. Baylor,D.A., G.Matthews, and K.W.Yau. 1980. Two components of electrical dark noise in toad retinal rod outer segments. J. Physiol 309:591-621.

23. Baylor,D.A., B.J.Nunn, and J.L.Schnapf. 1984. The photocurrent, noise and spectral sensitivity of rods of the monkey Macaca fascicularis. J. Physiol 357:575-607.

24. Birnbaumer,L. 2007. The discovery of signal transduction by G proteins: a personal account and an overview of the initial findings and contributions that led to our present understanding. Biochim. Biophys. Acta 1768(4):756-771.

25. Bitensky,M.W., R.E.Gorman, and W.H.Miller. 1971. Adenyl cyclase as a link between photon capture and changes in membrane permeability of frog photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 68(3):561-562.

26. Brown,M.F. 1994. Modulation of rhodopsin function by properties of the membrane bilayer. Chem. Phys. Lipids 73(1-2): 159-180.

27. Burke,Z., T.Wells, D.Carter, D.Klein, and R.Baler. 1999. Genetic targeting: the serotonin N-acetyltransferase promoter imparts circadian expression selectively in the pineal gland and retina of transgenic rats. J. Neurochem. 73(4): 1343-1349.

28. Burns,M.E. and D.A.Baylor. 2001. Activation, deactivation, and adaptation in vertebrate photoreceptor cells. Annu. Rev. Neurosci. 24:779-805.

29. Burns,M.E., A.Mendez, J.Chen, and D.A.Baylor. 2002. Dynamics of cyclic GMP synthesis in retinal rods. Neuron 36(1):81-91.

30. Burns,M.E. and V.Y.Arshavsky. 2005. Beyond counting photons: trials and trends in vertebrate visual transduction. Neuron 48(3):387-401.

31. Burns,M.E. 2010. Deactivation mechanisms of rod phototransduction: the Cogan lecture. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 51(3): 1282-1288.

32. Burns,M.E. and E.N.Pugh, Jr. 2010. Lessons from photoreceptors: turning off g-protein signaling in living cells. Physiology. (Bethesda.) 25(2): 72-84.

33. Burnside,B., M.Evans, R.T.Fletcher, and G.J.Chader. 1982. Induction of dark-adaptive retinomotor movement (cell elongation) in teleost retinal cones by cyclic adenosine 375-monophosphate. jm Gen. Physiol 79(5).

34. Bush,R.A. and C.L.Makino. 2007. Recoverin shapes the photoresponse of retinal rods. In Neuronal Calcium Sensor Proteins. P.P.Philippov and K.W.Koch, editors. Nova Science Publishers, NY. 153-180.

35. Cahill,G.M. and J.C.Besharse. 1992. Light-sensitive melatonin synthesis by Xenopus photoreceptors after destruction of the inner retina. Vis. Neurosci. 8(5):487-490.

36. Calvert,P.D., T.W.Ho, Y.M.LeFebvre, and V.Y.Arshavsky. 1998. Onset of feedback reactions underlying vertebrate rod photoreceptor light adaptation. J. Gen. Physiol 111(1):39-51.

37. Calvert,P.D., V.I.Govardovskii, V.Y.Arshavsky, and C.L.Makino. 2002. Two temporal phases of light adaptation in retinal rods. J. Gen. Physiol 119(2): 129-145.

38. Caruso,G., P.Bisegna, L.Shen, D.Andreucci, H.E.Hamm, and E.DiBenedetto. 2006. Modeling the role of incisures in vertebrate phototransduction. Biophys. J. 91(4): 1192-1212.

39. Cervetto,L., L.Lagnado, R.J.Perry, D.W.Robinson, and P.A.McNaughton. 1989. Extrusion of calcium from rod outer segments is driven by both sodium and potassium gradients. Nature 337(6209):740-743.

40. Chabre,M. and P.Deterre. 1989. Molecular mechanism of visual transduction. Eur. J. Biochem. 179(2):255-266.

41. Chaurasia,S.S., R.Haque, N.Pozdeyev, C.R.Jackson, and P.M.Iuvone. 2006. Temporal coupling of cyclic AMP and Ca/calmodulin-stimulated adenylyl cyclase to the circadian clock in chick retinal photoreceptor cells. J. Neurochem. 99(4): 1142-1150.

42. Chen,C.K„ M.E.Burns, W.He, T.G.Wensel, D.A.Baylor, and M.I.Simon. 2000. Slowed recovery of rod photoresponse in mice lacking the GTPase accelerating protein RGS9-1. Nature 403(6769):557-560.

43. Chen,C.K. 2002. Recoverin and rhodopsin kinase. Adv. Exp. Med. Biol. 514:101-107.

44. Chen,C.K. 2005. The vertebrate phototransduction cascade: amplification and termination mechanisms. Rev. Physiol Biochem. Pharmacol. 154:101-121.

45. Chong,N.W., M.Bernard, and D.C.Klein. 2000. Characterization of the chicken serotonin N-acetyltransferase gene. Activation via clock gene heterodimer/E box interaction. J. Biol. Chem. 275(42):32991-32998.

46. Cobbs,W.H. 1991. Light and dark active phosphodiesterase regulation in salamander rods. J. Gen. Physiol 98(3): 575-614.

47. Cohen,A.I. 1982. Increased levels of 3',5'-cyclic adenosine monophosphate induced by cobaltous ion or 3-isobutylmethylxanthine in the incubated mouse retina: evidence concerning location and response to ions and light. J. Neurochem. 38(3):781-796.

48. Collery,R.F. and B.N.Kennedy. 2010. Photoreceptor guanylate cyclases and cGMP phosphodiesterases in zebrafish. Adv. Exp. Med. Biol 664:5561.

49. Cornwall,M.C. and G.L.Fain. 1994. Bleached pigment activates transduction in isolated rods of the salamander retina. J. Physiol 480 ( Pt 2):261-279.

50. Cote,R.H. 2004. Characteristics of photoreceptor PDE (PDE6): similarities and differences to PDE5. Int. J. Impot. Res. 16 Suppl 1:S28-S33.

51. Dartnall,H.J.A. 1972. Photosensitivity. In Photochemistry of vision.

52. H.J.A.Dartnall, editor. Springer, 122-145.

53. Dawis,S.M. 1981. Polynomial expressions of pigment nomograms. Vision Res. 21(9): 1427-1430.

54. Demontis,G.C., G.M.Ratto, S.Bisti, and L.Cervetto. 1995. Effect of blocking the Na+/K+ ATPase on Ca2+ extrusion and light adaptation in mammalian retinal rods. Biophys. J. 69(2):439-450.

55. Dizhoor,A.M., E.V.Olshevskaya, W.J.Henzel, S.C.Wong, J.T.Stults,

56. Ankoudinova, and J.B.Hurley. 1995. Cloning, sequencing, and expression of a 24-kDa Ca(2+)-binding protein activating photoreceptor guanylyl cyclase. J. Biol Chem. 270(42):25200-25206.

57. Dizhoor,A.M. 2000. Regulation of cGMP synthesis in photoreceptors: role in signal transduction and congenital diseases of the retina. Cell Signal 12(11-12):711-719.

58. Dizhoor,A.M., E.V.Olshevskaya, and I.V.Peshenko. 2010. Mg2+/Ca2+ cation binding cycle of guanylyl cyclase activating proteins (GCAPs): role in regulation of photoreceptor guanylyl cyclase. Mol Cell Biochem. 334(1-2):117-124.

59. Du,K. and M.Montminy. 1998. CREB is a regulatory target for the protein kinase Akt/PKB. J. Biol. Chem. 273(49):32377-32379.

60. Dubocovich,M.L. 1983. Melatonin is a potent modulator of dopamine release in the retina. Nature 306(5945):782-784.

61. Ebrey,T. and Y.Koutalos. 2001. Vertebrate photoreceptors. Prog. Re tin. Eye Res. 20(l):49-94.

62. Fesenko,E.E., S.S.Kolesnikov, and A.L.Lyubarsky. 1985. Induction by cyclic GMP of cationic conductance in plasma membrane of retinal rod outer segment. Nature 313(6000):310-313.

63. Fesenko,E.E., S.S.Kolesnikov, and A.L.Lyubarsky. 1986. Direct action of cGMP on the conductance of retinal rod plasma membrane. Biochim. Biophys. Acta 856(3):661-671.

64. Forti,S., A.Menini, G.Rispoli, and V.Torre. 1989. Kinetics of phototransduction in retinal rods of the newt Triturus cristatus. J. Physiol 419:265295.

65. Fukuhara,C., C.Liu, T.N.Ivanova, G.C.Chan, D.R.Storm, P.M.Iuvone, and G.Tosini. 2004. Gating of the cAMP signaling cascade and melatonin synthesis by the circadian clock in mammalian retina. J. Neurosci. 24(8): 18031811.

66. Golobokova,E. Y. and V.I.Govardovskii. 2006. Late stages of visual pigment photolysis in situ: cones vs. rods. Vision Res. 46(14):2287-2297.

67. Golombek,D.A. and R.E.Rosenstein. 2010. Physiology of circadian entrainment. Physiol Rev. 90(3): 1063-1102.

68. Gorczyca,W.A., M.P.Gray-Keller, P.B.Detwiler, and K.Palczewski. 1994. Purification and physiological evaluation of a guanylate cyclase activating protein from retinal rods. Proc. Nail. Acad. Sci. U. S. A 91(9):4014-4018.

69. Gorodovikova,E.N., A.A.Gimelbrant, I.I.Senin, and P.P.Philippov.1994. Recoverin mediates the calcium effect upon rhodopsin phosphorylation and cGMP hydrolysis in bovine retina rod cells. FEBS Lett. 349(2): 187-190.

70. Guo,L.W. and A.E.Ruoho. 2008. The retinal cGMP phosphodiesterase gamma-subunit a chameleon. Curr. Protein Pept. Sci. 9(6):611-625.

71. Hackos,D.II. and J.I.Korenbrot. 1999. Divalent cation selectivity is a function of gating in native and recombinant cyclic nucleotide-gated ion channels from retinal photoreceptors. J. Gen. Physiol 113(6):799-818.

72. Hagins,W.A. 1972. The visual process: Excitatory mechanisms in the primary receptor cells. Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 1:131-158.

73. Hamer,R.D. and C.W.Tyler. 1995. Phototransduction: modeling the primate cone flash response. Vis. Neurosci. 12(6): 1063-1082.

74. Hamer,R.D. 2000a. Computational analysis of vertebrate phototransduction: combined quantitative and qualitative modeling of dark- and light-adapted responses in amphibian rods. Vis. Neurosci. 17(5):679-699.

75. Hamer,R.D. 2000b. Analysis of Ca++-dependent gain changes in PDE activation in vertebrate rod phototransduction. Mol. Vis. 6:265-286.

76. Hamer,R.D., S.C.Nicholas, D.Tranchina, P.A.Liebman, and T.D.Lamb. 2003. Multiple steps of phosphorylation of activated rhodopsin can account for the reproducibility of vertebrate rod single-photon responses. J. Gen. Physiol 122(4):419-444.

77. Hamer,R.D., S.C.Nicholas, D.Tranchina, T.D.Lamb, and J.L.Jarvinen. 2005. Toward a unified model of vertebrate rod phototransduction. Vis. Neurosci. 22(4):417-436.

78. Hamm,H.E. 2001. How activated receptors couple to G proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98(9):4819-4821.

79. Hargrave,P.A., J.H.McDowell, D.R.Curtis, J.K.Wang, E.Juszczak, S.L.Fong, J.K.Rao, and P.Argos. 1983. The structure of bovine rhodopsin. Biophys. Struct. Meek 9(4):235-244.

80. Hayashi,F., G.Y.Lin, H.Matsumoto, and A.Yamazaki. 1991. Phosphatidylinositol-stimulated phosphorylation of an inhibitory subunit of cGMP phosphodiesterase in vertebrate rod photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 88(10):4333-4337.

81. Haynes,L.W., A.R.Kay, and K.W.Yau. 1986. Single cyclic GMP-activated channel activity in excised patches of rod outer segment membrane. Nature 321(6065):66-70.

82. Haynes,L.W. and K.W.Yau. 1990. Single-channel measurement from the cyclic GMP-activated conductance of catfish retinal cones. J. Physiol 429:451481.

83. He,W., C.W.Cowan, and T.G.Wensel. 1998. RGS9, a GTPase accelerator for phototransduction. Neuron 20(1):95-102.

84. Hecht,S., C.Haig, and A.M.Chase. 1937. THE INFLUENCE OF LIGHT ADAPTATION ON SUBSEQUENT DARK ADAPTATION OF THE EYE. J. Gen. Physiol 1-850.

85. Hodgkin,A.L., P.A.McNaughton, B.J.Nunn, and K.W.Yau. 1984. Effect of ions on retinal rods from Bufo marinus. J. Physiol 350:649-680.

86. Hodgkin,A.L., P.A.McNaughton, and B.J.Nunn. 1985. The ionic selectivity and calcium dependence of the light-sensitive pathway in toad rods. J. Physiol 358:447-468.

87. Hodgkin,A.L. and B.J.Nunn. 1988. Control of light-sensitive current in salamander rods. J. Physiol 403:439-471.

88. Hofmann,K.P. 1999. Signalling states of photoactivated rhodopsin. Novartis. Found. Symp. 224:158-175.

89. Hsu,Y.T. and R.S.Molday. 1993. Modulation of the cGMP-gated channel of rod photoreceptor cells by calmodulin. Nature 361(6407):76-79.

90. Hsu,Y.T., S.Y.Wong, G.J.Connell, and R.S.Molday. 1993. Structural and functional properties of rhodopsin from rod outer segment disk and plasma membrane. Biochim. Biophys. Acta 1145(l):85-92.

91. Hu,G., G.F.Jang, C.W.Cowan, T.G.Wensel, and K.Palczewski. 2001. Phosphorylation of RGS9-1 by an endogenous protein kinase in rod outer segments. J. Biol. Chem. 276(25):22287-22295.

92. Huang,C.C. and J.J.Tesmer. 2011. Recognition in the face of diversity: interactions of heterotrimeric G proteins and G protein-coupled receptor (GPCR) kinases with activated GPCRs. J. Biol. Chem. 286(10):7715-7721.

93. Hubbard,R. 1966. The stereoisomerization of 11-cis-retinal. J. Biol. Chem. 241(8):1814-1818.

94. Ishii,M. and Y.Kurachi. 2003. Physiological actions of regulators of G-protein signaling (RGS) proteins. Life Sci. 74(2-3): 163-171.

95. Iuvone,P.M., C.L.Galli, C.K.Garrison-Gund, andN.H.Neff. 1978. Light stimulates tyrosine hydroxylase activity and dopamine synthesis in retinal amacrine neurons. Science 202(4370):901-902.

96. Jackson,C.R., S.S.Chaurasia, C.K.Hwang, and P.M.Iuvone. 2011. Dopamine D(4) receptor activation controls circadian timing of the adenylyl cyclase 1/cyclic AMP signaling system in mouse retina. Eur. J. Neurosci. 34(l):57-64.

97. Karan,S., J.M.Frederick, and W.Baehr. 2010. Novel functions of photoreceptor guanylate cyclases revealed by targeted deletion. Mol. Cell Biochem. 334(1-2): 141-155.

98. Kawamura,S. 1993. Rhodopsin phosphorylation as a mechanism of cyclic GMP phosphodiesterase regulation by S-modulin. Nature 362(6423):855-857.

99. Kefalov,V., Y.Fu, N.Marsh-Armstrong, and K.W.Yau. 2003. Role of visual pigment properties in rod and cone phototransduction. Nature 425(6957):526-531.

100. Kennedy,M.J., M.E.Sowa, T.G.Wensel, and J.B.Hurley. 2003. Acceleration of key reactions as a strategy to elucidate the rate-limiting chemistry underlying phototransduction inactivation. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 44(3):1016-1022.

101. Kisselev,O.G. and M.A.Downs. 2003. Rhodopsin controls a conformational switch on the transducin gamma subunit. Structure. ll(4):367-373.

102. Kisselev,O.G., M.A.Downs, J.H.McDowell, and P.A.Hargrave. 2004. Conformational changes in the phosphorylated C-terminal domain of rhodopsin during rhodopsin arrestin interactions. J. Biol. Chem. 279(49):51203-51207.

103. Kisselev,O.G. and M.A.Downs. 2006. Rhodopsin-interacting surface of the transducin gamma subunit. Biochemistry 45(31):9386-9392.

104. Klenchin,V.A., P.D.Calvert, and M.D.Bownds. 1995. Inhibition of rhodopsin kinase by recoverin. Further evidence for a negative feedback system in phototransduction. J. Biol Chem. 270(27): 16147-16152.

105. Ko,G.Y., M.L.Ko, and S.E.Dryer. 2001. Circadian regulation of cGMP-gated cationic channels of chick retinal cones. Erk MAP Kinase and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. Neuron 29(l):255-266.

106. Ko,G.Y., M.L.Ko, and S.E.Dryer. 2003. Circadian phase-dependent modulation of eGMP-gated channels of cone photoreceptors by dopamine and D2 agonist J. Neurosci. 23(8):3145-3153.

107. Ko,M.L., Y.Liu, S.E.Dryer, and G.Y.Ko. 2007. The expression of L-type voltage-gated calcium channels in retinal photoreceptors is under circadian control. J. Neurochem. 103(2):784-792.

108. Ko,M.L., L.Shi, K.Grushin, F.Nigussie, and G.Y.Ko. 2010. Circadian profiles in the embryonic chick heart: L-type voltage-gated calcium channels and signaling pathways. Chronobiol. Int. 27(9-10): 1673-1696.

109. Koch,K.W. and U.B.Kaupp. 1985. Cyclic GMP directly regulates a cation conductance in membranes of bovine rods by a cooperative mechanism. J. Biol Chem. 260(11):6788-6800.

110. Koch,K.W. and L.Stryer. 1988. Highly cooperative feedback control of retinal rod guanylate cyclase by calcium ions. Nature 334(6177):64-66.

111. Kolesnikov,A.V., E.Y.Golobokova, and V.I.Govardovskii. 2003. The identity of metarhodopsin III. Vis. Neurosci. 20(3):249-265.

112. Koskelainen,A., P.Ala-Laurila, N.Fyhrquist, and K.Donner. 2000. Measurement of thermal contribution to photoreceptor sensitivity. Nature 403(6766):220-223.

113. Koutalos,Y., K.Nakatani, and K.W.Yau. 1995a. The cGMP-phosphodiesterase and its contribution to sensitivity regulation in retinal rods. J. Gen. Physiol 106(5):891-921.

114. Koutalos,Y., K.Nakatani, T.Tamura, and K.W.Yau. 1995b. Characterization of guanylate cyclase activity in single retinal rod outer segments. J. Gen. Physiol 106(5):863-890.

115. Kramer,R.H. and E.Molokanova. 2001. Modulation of cyclic-nucleotide-gated channels and regulation of vertebrate phototransduction. J. Exp. Biol 204(Pt 17):2921-2931.

116. Kramer,S.G. 1971. Dopamine: A retinal neurotransmitter. I. Retinal uptake, storage, and light-stimulated release of H3-dopamine in vivo. Invest Ophthalmol 10(6):438-452.

117. Krispel,C.M., C.K.Chen, M.I.Simon, and M.E.Burns. 2003. Novel form of adaptation in mouse retinal rods speeds recovery of phototransduction. J. Gen. Physiol 122(6):703-712.

118. Krispel,C.M., D.Chen, N.Melling, Y.J.Chen, K.A.Martemyanov, N.Quillinan, V.Y.Arshavsky, T.G.Wensel, C.K.Chen, and M.E.Burns. 2006. RGS expression rate-limits recovery of rod photoresponses. Neuron 51(4):409-416.

119. Kuhn,M. 2003. Structure, regulation, and function of mammalian membrane guanylyl cyclase receptors, with a focus on guanylyl cyclase-A. Circ. Res. 93(8):700-709.

120. Kuhn,M. 2009. Function and dysfunction of mammalian membrane guanylyl cyclase receptors: lessons from genetic mouse models and implications for human diseases. Handb. Exp. Pharmacol(\9V)Al-69.

121. Lagnado,L., L.Cervetto, and P.A.McNaughton. 1992. Calcium homeostasis in the outer segments of retinal rods from the tiger salamander. J. Physiol 455:111-142.

122. Lamb,T.D. and E.N.Pugh, Jr. 1992. A quantitative account of the activation steps involved in phototransduction in amphibian photoreceptors. J. Physiol 449:719-758.

123. Lamb,T.D. and E.N.Pugh, Jr. 2006. Phototransduction, dark adaptation, and rhodopsin regeneration the proctor lecture. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 47(12):5137-5152.

124. Lamb,T.D. 2009. Evolution of vertebrate retinal photoreception. Philos. Trans. R. Soc. LondBBiol. Sci. 364(1531):2911-2924.

125. Lewis, J. W. and D.S.Kliger. 1992. Photointermediates of visual pigments. J. Bioenerg. Biomembr. 24(2):201-210.

126. Li,P., S.S.Chaurasia, Y.Gao, A.L.Carr, P.M.Iuvone, and L.Li. 2008. CLOCK is required for maintaining the circadian rhythms of Opsin mRNA expression in photoreceptor cells. J. Biol. Chem. 283(46):31673-31678.

127. Liu,Q., G.Tan, N.Levenkova, T.Li, E.N.Pugh, Jr., J.J.Rux, D.W.Speicher, and E.A.Pierce. 2007. The proteome of the mouse photoreceptor sensory cilium complex. Mo I. Cell Proteomics. 6(8): 1299-1317.

128. Lolley,R.N. and E.Racz. 1982. Calcium modulation of cyclic GMP synthesis in rat visual cells. Vision Res. 22(12): 1481-1486.

129. Lomonosova,E., A.V.Kolesnikov, V.J.Kefalov, and O.G.Kisselev. 2012. Signaling States of Rhodopsin in Rod Disk Membranes Lacking Transducin betagamma-Complex. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 53(3): 1225-1233.

130. Lowe,D.G., A.M.Dizhoor, K.Liu, Q.Gu, M.Spencer, R.Laura, L.Lu, and J.B.Hurley. 1995. Cloning and expression of a second photoreceptor-specific membrane retina guanylyl cyclase (RetGC), RetGC-2. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A 92(12):5535-5539.

131. Luo,D.G., W.W.Yue, P.Ala-Laurila, and K.W.Yau. 2011. Activation of visual pigments by light and heat. Science 332(6035): 1307-1312.

132. Lyubarsky,A., S.Nikonov, and E.N.Pugh, Jr. 1996. The kinetics of inactivation of the rod phototransduction cascade with constant Ca2+i. J. Gen. Physiol 107(1): 19-34.

133. Lyubarsky,A.L. and E.N.Pugh, Jr. 1996. Recovery phase of the murine rod photoresponse reconstructed from electroretinographic recordings. J. Neurosci. 16(2):563-571.

134. Maeda,T., Y.Imanishi, and K.Palczewski. 2003. Rhodopsin phosphorylation: 30 years later. Prog. Retin. Eye Res. 22(4):417-434.

135. Makino,C.L., M.Groesbeek, J.Lugtenburg, and D.A.Baylor. 1999. Spectral tuning in salamander visual pigments studied with dihydroretinal chromophores. Biophys. J. 77(2): 1024-1035.

136. Manthorpe,M. and D.G.McConnell. 1974. Adenylate cyclase in vertebrate retina. Relationship to specific fractions and to rhodopsin. J. Biol. Chem. 249(14):4608-4613.

137. Martemyanov,K.A. and V.Y.Arshavsky. 2009. Biology and functions of the RGS9 isoforms. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 86:205-227.

138. Masseck,O.A., J.M.Rubelowski, K.Spoida, and S.Herlitze. 2011. Light- and drug-activated G-protein-coupled receptors to control intracellular signalling. Exp. Physiol96(X).5\-56.

139. Matthews,G. 1984. Dark noise in the outer segment membrane current of green rod photoreceptors from toad retina. J. Physiol 349:607-618.

140. Matthews,G. and S.Watanabe. 1988. Activation of single ion channels from toad retinal rod inner segments by cyclic GMP: concentration dependence. J. Physiol 403:389-405.

141. Matthews,H.R., R.L.Murphy, G.L.Fain, and T.D.Lamb. 1988. Photoreceptor light adaptation is mediated by cytoplasmic calcium concentration. Nature 334(6177):67-69.

142. Matthews,H.R. 1995. Effects of lowered cytoplasmic calcium concentration and light on the responses of salamander rod photoreceptors. J. Physiol 484 (Pt 2):267-286.

143. Matthews,H.R. 1996. Static and dynamic actions of cytoplasmic Ca2+ in the adaptation of responses to saturating flashes in salamander rods. J. Physiol 490 (Pt 1): 1-15.

144. Matthews,H.R. 1997. Actions of Ca2+ on an early stage in phototransduction revealed by the dynamic fall in Ca2+ concentration during the bright flash response. J. Gen. Physiol 109(2): 141-146.

145. McCarthy,S.T., J.P.Younger, and W.G.Owen. 1994. Free calcium concentrations in bullfrog rods determined in the presence of multiple forms of Fura-2. Biophys. J. 67(5):2076-2089.

146. Mitchell,C.K. and D.A.Redburn. 1991. Melatonin inhibits ACh release from rabbit retina. Vis. Neurosci. 7(5):479-486.

147. Muradov,H., K.K.Boyd, and N.O.Artemyev. 2004. Structural determinants of the PDE6 GAF A domain for binding the inhibitory gamma-subunit and noncatalytic cGMP. Vision Res. 44(21):2437-2444.

148. Muradov,H., K.K.Boyd, and N.O.Artemyev. 2010. Rod phosphodiesterase-6 PDE6A and PDE6B subunits are enzymatically equivalent. J. Biol Chem. 285(51):39828-39834.

149. Murnick,J.G. and T.D.Lamb. 1996. Kinetics of desensitization induced by saturating flashes in toad and salamander rods. J. Physiol 495 ( Pt 1): 113.

150. Nakatani,K. and K.W.Yau. 1988a. Guanosine 3',5'-cyclic monophosphate-activated conductance studied in a truncated rod outer segment of the toad. J. Physiol 395:731-753.

151. Nakatani,K. and K.W.Yau. 1988b. Calcium and light adaptation in retinal rods and cones. Nature 334(6177):69-71.

152. Nakatani,K., Y.Koutalos, and K.W.Yau. 1995. Ca2+ modulation of the cGMP-gated channel of bullfrog retinal rod photoreceptors. J. Physiol 484 ( Pt l):69-76.

153. Nekrasova,E.R., D.M.Berman, R.R.Rustandi, H.E.Hamm, A.G.Gilman, and V.Y.Arshavsky. 1997. Activation of transducin guanosine triphosphatase by two proteins of the RGS family. Biochemistry 36(25):7638-7643.

154. Nikonov,S., N.Engheta, and E.N.Pugh, Jr. 1998. Kinetics of recovery of the dark-adapted salamander rod photoresponse. J. Gen. Physiol lll(l):7-37.

155. Nikonov,S., T.D.Lamb, and E.N.Pugh, Jr. 2000. The role of steady phosphodiesterase activity in the kinetics and sensitivity of the light-adapted salamander rod photoresponse. J. Gen. Physiol 116(6):795-824.

156. Nowak,J.Z., Z.Urawska, and J.Zawilska. 1989. Melatonin and its generating system in vertebrate retina: circadian rhythm, effect of environmental lighting and interaction with dopamine. Neurochem. Int. 14(4):397-406.

157. Ohyama,T., D.H.Hackos, S.Frings, V.Hagen, U.B.Kaupp, and J.I.Korenbrot. 2000. Fraction of the dark current carried by Ca(2+) through cGMP-gated ion channels of intact rod and cone photoreceptors. J. Gen. Physiol 116(6).

158. Orr,H.T., O.H.Lowry, A.I.Cohen, and J.A.Ferrendelli. 1976. Distribution of 3':5'-cyclic AMP and 3':5'-cyclic GMP in rabbit retina in vivo: selective effects of dark and light adaptation and ischemia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 73(12):4442-4445.

159. Osawa,S., R.Jo, and E.R.Weiss. 2008. Phosphorylation of GRK7 by PKA in cone photoreceptor cells is regulated by light. J. Neurochem. 107(5): 13141324.

160. Osawa,S. and E.R.Weiss. 2012. A tale of two kinases in rods and cones. Adv. Exp. Med. Biol. 723:821-827.

161. Ovchinnikov,Y. 1982. Rhodopsin and bacteriorhodopsin: structure-function relationships. FEBSLett. 148(2):179-191.

162. Pang,S.F. and D.T.Yew. 1979. Pigment aggregation by melatonin in the retinal pigment epithelium and choroid of guinea-pigs, Caviaporcellus. Experientia 35(2):231-233.

163. Peng,C., E.D.Rich, and M.D.Varnum. 2004. Subunit configuration of heteromeric cone cyclic nucleotide-gated channels. Neuron 42(3):401-410.

164. Pepe,I.M., A.Boero, L.Vergani, I.Panfoli, and C.Cugnoli. 1986. Effect of light and calcium on cyclic GMP synthesis in rod outer segments of toad retina. Biochim. Biophys. Acta 889(3):271-276.

165. Pepperberg,D.R., M.C.Cornwall, M.Kalilert, K.P.Hofmann, J.Jin, G.J.Jones, and H.Ripps. 1992. Light-dependent delay in the falling phase of the retinal rod photoresponse. Vis. Neurosci. 8(1):9-18.

166. Pepperberg,D.R., J.Jin, and G.J.Jones. 1994. Modulation of transduction gain in light adaptation of retinal rods. Vis. Neurosci. ll(l):53-62.

167. Peshenko,I.V., E.V.Olshevskaya, and A.M.Dizhoor. 2004. Ca(2+)-dependent conformational changes in guanylyl cyclase-activating protein 2 (GCAP-2) revealed by site-specific phosphorylation and partial proteolysis. J. Biol. Chem. 279(48):50342-50349.

168. Pierce,M.E. and J.C.Besharse. 1985. Circadian regulation of retinomotor movements. I. Interaction of melatonin and dopamine in the control of cone length. J. Gen. Physiol 86(5):671-689.

169. Pugh,E.N., Jr., S.Nikonov, and T.D.Lamb. 1999. Molecular mechanisms of vertebrate photoreceptor light adaptation. Curr. Opin. Neurobiol. 9(4):410-418.

170. Rebrik,T.I. and J.I.Korenbrot. 1998. In intact cone photoreceptors, a Ca2+-dependent, diffusible factor modulates the cGMP-gated ion channels differently than in rods. J. Gen. Physiol 112(5):537-548.

171. Rebrik,T.I., E.A.Kotelnikova, and J.I.Korenbrot. 2000. Time course and Ca(2+) dependence of sensitivity modulation in cyclic GMP-gated currents of intact cone photoreceptors. J. Gen. Physiol 116(4):521-534.

172. Reuter,T. 1964. KINETICS OF RHODOPSIN REGENERATION IN THE EYE OF THE FROG. Nature 202:1119-1120.

173. Reuter,T.E., R.H.White, and G.Wald. 1971. Rhodopsin and porphyropsin fields in the adult bullfrog retina. J. Gen. Physiol 58(4):351-371.

174. Sagoo,M.S. and L.Lagnado. 1996. The action of cytoplasmic calcium on the cGMP-activated channel in salamander rod photoreceptors. J. Physiol 497 ( Pt2):309-319.

175. Sagoo,M.S. and L.Lagnado. 1997. G-protein deactivation is rate-limiting for shut-off of the phototransduction cascade. Nature 389(6649):392-395.

176. Senin,I.I., K.W.Koch, M.Akhtar, and P.P.Philippov. 2002. Ca2+-dependent control of rhodopsin phosphorylation: recoverin and rhodopsin kinase. Adv. Exp. Med. Biol. 514:69-99.

177. Sheng,J.Z., C.F.Prinsen, R.B.Clark, W.R.Giles, and P.P.Schnetkamp. 2000. Na(+)-Ca(2+)-K(+) currents measured in insect cells transfected with the retinal cone or rod Na(+)-Ca(2+)-K(+) exchanger cDNA. Biophys. J. 79(4): 19451953.

178. Shi,L., M.L.Ko, and G.Y.Ko. 2009a. Rhythmic expression of MicroRNA-26a (mir-26a) regulates the L-type voltage-gated calcium channel {alpha} 1C subunit (VGCC{alpha} 1C) in chicken cone photoreceptors. J. Biol. Chem. 284(38):25791-25803.

179. Shi,L., M.L.Ko, and G.Y.Ko. 2009b. Rhythmic expression of microRNA-26a regulates the L-type voltage-gated calcium channel alphalC subunit in chicken cone photoreceptors. J. Biol. Chem. 284(38):25791-25803.

180. Shichida,Y. and T.Matsuyama. 2009. Evolution of opsins and phototransduction. Philos. Trans. R. Soc. LondBBiol. Sci. 364(1531):2881-2895.

181. Shyjan,A.W., FJ.de Sauvage, N.A.Gillett, D.V.Goeddel, and D.G.Lowe. 1992. Molecular cloning of a retina-specific membrane guanylyl cyclase. Neuron 9(4):727-737.

182. Singh,P., B.Wang, T.Maeda, K.Palczewski, and J.J.Tesmer. 2008. Structures of rhodopsin kinase in different ligand states reveal key elements involved in G protein-coupled receptor kinase activation. J. Biol. Chem. 283(20): 14053-14062.

183. Smith,N.P. and T.D.Lamb. 1997. The a-wave of the human electroretinogram recorded with a minimally invasive technique. Vision Res. 37(21):2943-2952.

184. Sokal,I., A.Alekseev, and K.Palczewski. 2003a. Photoreceptor guanylate cyclase variants: cGMP production under control. Acta Biochim. Pol. 50(4):1075-1095.

185. Sokal,I., G.Hu, Y.Liang, M.Mao, T.G.Wensel, and K.Palczewski. 2003b. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. J. Biol. Chem. 278(10):8316-8325.

186. Stella,S.L., Jr. and W.B.Thoreson. 2000. Differential modulation of rod and cone calcium currents in tiger salamander retina by D2 dopamine receptors and cAMP. Eur. J. Neurosci. 12(10):3537-3548.

187. TanakaJ.C., R.E.Furman, W.H.Cobbs, and P.Mueller. 1987. Incorporation of a retinal rod cGMP-dependent conductance into planar bilayers. Proc. Natl. Acad. Set. U. S. A 84(3):724-728.

188. Terakita,A., T.Yamashita, N.Nimbari, D.Kojima, and Y.Shichida. 2002. Functional interaction between bovine rhodopsin and G protein transducin. J. Biol. Chem. 277(l):40-46.

189. Tomita,T. 1965. Electrophysiological study of the mechanisms subserving color coding in the fish retina. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 30:559-566.

190. Tosini,G., N.Pozdeyev, K.Sakamoto, and P.M.Iuvone. 2008. The circadian clock system in the mammalian retina. Bioessays 30(7):624-633.

191. Toyoda,J., H.Hashimoto, H.Anno, and T.Tomita. 1970. The rod response in the frog and studies by intracellular recording. Vision Res.10(11):1093-1100.

192. Tranchina,D. and C.S.Peskin. 1988. Light adaptation in the turtle retina: embedding a parametric family of linear models in a single nonlinear model. Vis. Neurosci. l(4):339-348.

193. Traverso,V., R.A.Bush, P.A.Sieving, and D.Deretic. 2002. Retinal cAMP levels during the progression of retinal degeneration in rhodopsin P23H and S334ter transgenic rats. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 43(5): 1655-1661.

194. Trudeau,M.C. and W.N.Zagotta. 2002. Mechanism of calcium/calmodulin inhibition of rod cyclic nucleotide-gated channels. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99(12):8424-8429.

195. Tsang,S.H., M.L.Woodruff, K.M.Janisch, M.C.Cilluffo, D.B.Farber, and G.L.Fain. 2007. Removal of phosphorylation sites of gamma subunit of phosphodiesterase 6 alters rod light response. J. Physiol 579(Pt 2):303-312.

196. Udovichenko,I.P., J.Cunnick, K.Gonzales, and D.J.Takemoto. 1993. Phosphorylation of bovine rod photoreceptor cyclic GMP phosphodiesterase. Biochem. J. 295 ( Pt l):49-55.

197. Udovichenko,I.P., J.Cunnick, K.Gonzalez, and D.J.Takemoto. 1994. Functional effect of phosphorylation of the photoreceptor phosphodiesterase inhibitory subunit by protein kinase C. J. Biol. Chem. 269(13):9850-9856.

198. Vaquero,C.F., A.Pignatelli, G.J.Partida, and A.T.Ishida. 2001. A dopamine- and protein kinase A-dependent mechanism for network adaptation in retinal ganglion cells. J. Neurosci. 21(21):8624-8635.

199. Voisin,P. and M.Bernard. 2009. Cyclic AMP-dependent activation of rhodopsin gene transcription in cultured retinal precursor cells of chicken embryo. J. Neurochem. 110(1):318-327.

200. Wensel,T.G. 2002. RGS9-1 phosphorylation and Ca2+. Adv. Exp. Med. Biol. 514:125-129.

201. Wensel,T.G. 2008. Signal transducing membrane complexes of photoreceptor outer segments. Vision Res. 48(20):2052-2061.

202. Whitaker,C.M. and N.G.Cooper. 2010. Differential distribution of exchange proteins directly activated by cyclic AMP within the adult rat retina. Neuroscience 165(3):955-967.

203. Wiechmann,A.F., X.L.Yang, S.M.Wu, and J.G.Hollyfield. 1988. Melatonin enhances horizontal cell sensitivity in salamander retina. Brain Res. 453(l-2):377-380.

204. Wilden,U., S.W.Hall, and H.Kuhn. 1986a. Phosphodiesterase activation by photoexcited rhodopsin is quenched when rhodopsin is phosphorylated and binds the intrinsic 48-kDa protein of rod outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 83(5): 1174-1178.

205. Wilden,U., E.Wust, I.Weyand, and H.Kuhn. 1986b. Rapid affinity purification of retinal arrestin (48 kDa protein) via its light-dependent binding to phosphorylated rhodopsin. EEBSLett. 207(2):292-295.

206. Willardson,B.M., J.F.Wilkins, T.Yoshida, and M.W.Bitensky. 1996. Regulation of phosducin phosphorylation in retinal rods by Ca2+/calmodulin-dependent adenylyl cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 93(4): 1475-1479.

207. Wolbring,G. and P.P.Schnetkamp. 1996. Modulation of the calcium sensitivity of bovine retinal rod outer segment guanylyl cyclase by sodium ions and protein kinase A. Biochemistry 35(34): 11013-11018.

208. Woodruff,M.L. and M.D.Bownds. 1979. Amplitude, kinetics, and reversibility of a light-induced decrease in guanosine 3',5'-cyclic monophosphate in frog photoreceptor membranes. J. Gen. Physiol 73(5):629-653.

209. Woodruff,M.L., K.M.Janisch, I.V.Peshenko, A.M.Dizhoor, S.H.Tsang, and G.L.Fain. 2008. Modulation of phosphodiesterase6 turnoff during background illumination in mouse rod photoreceptors. J. Neurosci. 28(9):2064-2074.

210. Yamazaki,A., V.A.Bondarenko, I.Matsuura, M.Tatsumi, S.Kurono, N.Komori, H.Matsumoto, F.Hayashi, R.K.Yamazaki, and J.Usukura. 2010a.

211. Mechanism for the regulation of mammalian cGMP phosphodiesterase6. 1: identification of its inhibitory subunit complexes and their roles. Mol. Cell Biochem. 339(l-2):215-233.

212. Yamazaki,A.3 F.Hayashi, I.Matsuura, and V.A.Bondarenko. 2011. Binding of cGMP to the transducin-activated cGMP phosphodiesterase, PDE6, initiates a large conformational change involved in its deactivation. FEBS J. 278(11):1854-1872.

213. Yang,R.B„ D.C.Foster, D.L.Garbers, and H.J.Fulle. 1995. Two membrane forms of guanylyl cyclase found in the eye. Proc. Nail. Acad. Sci. U. S. A 92(2): 602-606.

214. Yau,K.W. and R.C.Hardie. 2009. Phototransduction motifs and variations. Cell 139(2):246-264.

215. Yokoyama,S., T.Tada, and T.Yamato. 2007. Modulation of the absorption maximum of rhodopsin by amino acids in the C-terminus. Photochem. Photobiol. 83(2):236-241.

216. Yoshizawa,T., Y.Shichida, and S.Matuoka. 1984. Primary intermediates of rhodopsin studied by low temperature spectrophotometry and laser photolysis. Bathorhodopsin, hypsorhodopsin and photorhodopsin. Vision Res. 24(11): 1455-1463.

217. Younger,J.P., S.T.McCarthy, and W.G.Owen. 1996. Light-dependent control of calcium in intact rods of the bullfrog Rana catesbeiana. J. Neurophysiol. 75(l):354-366.

218. Zimmerman,A.L. and D.A.Baylor. 1986. Cyclic GMP-sensitive conductance of retinal rods consists of aqueous pores. Nature 321(6065):70-72.

Информация о работе

Фирсов, Михаил Леонидович
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.03.01

Диссертация

Механизмы адаптации фоторецепторов позвоночных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы