Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Осцилляция содержания ЦГМФ при различных инотропных состояниях изолированного сердца морской свинки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Осцилляция содержания ЦГМФ при различных инотропных состояниях изолированного сердца морской свинки"

министерство 3£РП300ХРЙКЕН.« рф сибирский гась'ДйРстзннкнг межйкс:ш университет

па правах рукописи

БйРДАМиВй ИРИНА БЗРИСОЗНй ОСиИЛьйЦИИ ССДЕРНЙКЙЯ цГ*0

при рйз';:чних инот;опних ссстозниях изолированного сердца морской свинки

03.00.04 - биохикиа

автореферат д:?:сертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск - 1993

Работа выполнена в отделе экспериментальной кардиологии научно-исследовательского института кариологии Томского научного центра ран-: /директор - академик ракн р. с. карпов/.

нзучний руководитель:

доктор медицинских наук, профессор н.П. Ларионов Научный консультант:

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник с,А.Афанасьев

официальные оппоненты:

доктор медицинских на/к. просессор в. и. кулинский кандидат биологических наук, доцент г. А. Суханова

Ведущее учреждение:.Ин-титут биохимик сибирского отдолс-н.п Российской академии медицинских ¡пук (Нсвосиеиг-" к)

Зашита состоится ______________1993 года в_____часов

на заседании специализированного совета Д 084.28.01 при Сибирском государственном медицинском университете по лдгесу: 634050. г.Томск. московский тр., 2.

с диссертацией можно ознакомиться в библиотеках томского медицинского университета и нии кардиологии тни рани.

Автореферат разослан *___"______________1993 года.

Ученый секретарь специализированного Совета.

- 3 -

0б5пя характеристика работы

Актуальность проблемы. Изучение закономерностей формирования инотропнсго ответа сердца является одной из актуальных задач кардиологии. Реализация инотропной реакции миокарда на действие гормонов, неяротрансмиттеров. лекарственных препаратов обеспечивается, как известно, согласованным взаимодействием всех вторичных посредников, включая циклические нуклеотиды - циклический аденозин-3'. 5'-монофосфат (ЦАНФ) и гуанозин-з*. 5'-моноФосФат (ЦГНФ). Роль цапф в опосредовании эффектов множества медиаторов и лекарственных соединений исследована за последние годы достаточно детально СБатанабе и др.. 1968. üurray et al..19691. в частности, оспилляторный характер изменения уровня ЦАМФ позволил ряду авторов предположить возможность участия этого чиклонуклеотида в быстрой, реализующейся в течение одиночного сердечного цикла, регуляиии работы сердца [Лаптев и др..1990. 1991. Krause et a;..i969J.

однако, «о настоящего времени нет однозначной трактовки значения другого пиклонуклеотида - цгкф в инотропных реакциях сердца. Возможное участка в инотропном ответе на действие нитратов. атриального натрийуретического Фактора и других медиаторов trischmeister et ai..i989. MacLeod et al..1966. waidman et al. .1981. veishaar et al.. 19901 и известный Факт активации гуаиилатииклазы при интенсификации процессов перекисного окисления [Schubert et al..1990. White et al..1982] привлекают в последние годы большое внимание к изучению роли цгмф. по мнению некоторых авторов, изменение баланса цамф и цгмф в миокарде может лежать в основе развития электрической и механической нестабильности сердечной мышцы и. следовательно, быть причиной возникновения аритмий ЕСелявика т.в..1991. капе et al..1990]. кроме того, активный поиск и исследование новых кардиотоников. в частности, перспективного класса препаратов -ингибиторов ФосФодиэстеразы. повышают интерес к данному цикло-нуклеотиду как возможному мессенджеру их эффектов [Leveft et al..1989. Luenier et al.. 19861. . эти и другие данные стимулировали наш интерес к исследованию взаимодействия циклических нуклеотидов и вклада цгмф во внутриклеточную регуляцию инотропных эффектов.

Цель работы: изучение закономерностей динамики концентрации цГНФ в течение цикла сокрашения-расслабления изолированного сердца морской свинки и роли изменений цгмф в Формировании инотг-оаного ответа сердца.

- * -

для достижения выдвинутой пели были поставлены следуйте задачи:

1. р опктах на изолированных сердцах морских свинок исследовать изменения содержания в течение одиночного

цикла сокращения•расслабления в контроле и в условиях реализации преимущественно кальциевой регуляии'л функции с орд па.

й. Изучить динамику иГН« в ходе одиночного кардиопикла при изменении инстройного состояния изолированных сердец. активируемых иэалриис-м.

г. проанализировать взаимосвязь параметров сократительной 4-уикиии изолированного сердпа с изменениями уровня ииклонухле-отидоз в ходе сердечного цикла при различных инотропных воздействиях. оценить роль осцилляция цапф и игкф в нормировании инотропного ответа сердца.

ч. Исследовать роль изменения соотношения ииклонуклотидов в механизме действия антагонистов кальция.

Кзучная__нсвизна__рабо_тн. ьпервые исследованы изменения концентрации с течение цикла сокрашения-гасслабления изо-

лированных сердец при изменении инотрог.ного состояния сердечной мизаы. изучены закономерности возникновения осцилляции циклического нуклеотида и их зависимость от кальциевого гоме-остаза. Полученные данные позволяют предположить, что кальциевая рогулчсия уровня ига* в миокарде реализуется преимущественно посредством изменения активности, са-хк-зависимой фдэ.

Изучены взаимосвязи быстрых изменений концентраций цпм> и паиф друг с другом и с параметрами сократительной функции изолированного сердца в условиях активации изадрином. предложена гипотеза, согласно которой существование осцилляции циклических нуклеотидов обеспечивает точную регуляшго их среднего уровня в сердце в каждый момент времени, но. вероятно, не участвует в регуляции одиночного сердечного пикла.

получены результаты. свидетельстЕущие о том. что инот-ропние эффекты антагонистов кальция, в частности верапамила. помимо блокады медленного кальциевого тока могут реализоваться посредством изменения соотношения чакф и «ГКФ в миокарде.

теоретическое и практическое значение работы. Настоящая работа вносит вклад в развитие фундаментальных представлений о механизмах изменения уровня игк® в миокарде. Результаты работы расширяют представление о разнообразии мессенджерных путей реализации эФ4ектоа кардиотропных веществ. их взаимодействии и вносят вклад в понимание закономерностей Формирования инотропного ответа сердиа. полученные данные могут быть использованы

- 5 -

при скрининге новых кардиотгопных соединений.

Проведенные исследования показали. что антагонисты кальция (верапамил» значительным образом изменяют соотношение пай» и ШТ.« в миокарде. эти данные, очевидно, необходимо учитывать при проведении соответствующей терапии, и частности, при комбинировании антагонистов кальция с другими препаратами.

Основные положения работы могут бить использованы в курсе лекиий по физиологии и биохимии.

Основные положения, выносимые на защиту 1. содержание иш и его динамика в течение одиночного цикла сокрашения-расслабления сердца изменяется, при инотропных воздействиях на миокард. Зависимость уровня ст ин:трспно-

го состояния сердца реализуется, очевидно, посредством изменения активности са-кальмодулин-зав'.гимси «осгодиэстеразы при воздействиях, влияющих на внутриклеточный кальциевый гомесетаэ г. осиилляпки цГМ5 в течение одиночного сердечного никла не участвуют э поиикловой регуляции сократительной активности сердечной мьпиы. Бозникн;вение осииллчкия ииклснуклеотида обеспечивает. пс-видиу:«>'. возможность регуляции среднего уровня ЦГК'5' при действии различных инотропных агентов, влиявших на процессы синтеза и гидролиза цнклонуклеотидов

3. Антагонист кальция рераг.лмил изменяет сос-тнссение иик-локуклеотидсв в активируемых иэадрином сердцах, снижая ре;:еп-торэавнеимыя прирост и увеличивая содегжакие . изменения среднего уровня циклических куклестидсз. а также их соотношения являются одним из Факторов, спределяюсшх характер реакции сердечной ккгаиы на инотропное воздействие.

Апробация работы, материалы диссертапии докладывали-:ь и обсуждались на всесоюзном рабочем совеланин "Антагонисты и агонисть; кальция: перспектив:! исследования". Рига. :959; рабочем совещании по программе АН СССР "Сократимость миокарда". Ялта. 1989; IV отчетной сессии нии кардиологии тип акн ссс?. Томск.1989; на заседании биохимического общества. Томск. 1992.

Публикации. По тепе диссертации опубликовано ю работ.

Объем и_структура работы, диссертация изложена на :сг

стг-аницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы методов исследования., собственны;-: результатов и их осуждения, заключения и выводов. Список литературы включает 21 г источников. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 15 таблип?,ми.

- G -

мйтшг.п а методы исследования

В работе представлены основные результаты 9 серпа опытов, проведенных на <;56 животных.

3 качестве объекта исследования служил» изолированные сердца морских свинск. перс/зкруе-мые по /мнгеняогфу раствором Крсбса-хензелайта при г5»0. 5°с и частоте стимуляции 2 гп. Пер-«ys/.ю се'рд^ проводили по открытому контуру в изотоническом режиме при постоянном давлении (00 мм. рт. ст. ). продолжительность периода адаптации сердца после начала перфузии Физиологическим раствором составляла 15 мин.

В течение эксперимента проводили регистрацию кривых сокращения и ее первой производной для последующего расчета величин амплитуды сокращения (ЛС. мм) и максимальных скоростей развития сокращения (ксс. мм/с! и расслабления ШСР. км/с). используя эти значения в кладом опыте рассчитывали также величины индекса сокращения 1ИС). как отношение максимальной скорости сокращения к амплитуде сокращения, индекса расслабления (ИР), как отношение максимальной скорости расслабления к максимуму силы, и отношения скоростных параметров юсп ксс/кср. рис. 1).

для определения содержания быстро метаболизируших внутриклеточных соединений в отдельные Фазы цикла сокраше-ния-расслабления использовали метод быстрого замораживания изолированного сердца синхронно с сердечным циклом. Устройство для быстрого замораживания было изготовлено по описанию в работе с. I. Thompson et al. H9S0). Оно включало в себя электронный блок синхронизации с Фазами сердечного цикла и спеииальн-.:? алюминиевые шипиы с механическим затвором, управляемые электронным- блоком, дипиы. часки которых предварительно охлаждали з жидком азоте. Фиксировали з настороженном состоянии в камер с для "Перфузии сердца. Блок синхронизации давал возможность изменять длительность промежутка времени от стимулируюес*го импульса до срабатывания затвора и - захлопывания чашек сиг.цоз, позволяя тем самым производить замораживание з выбранной -:азэ сердечного цикла. Предварительно с использованием термочувствительных электродов было установлено, что рромя охлаждения нейтральной части замораживаемого участка до 6"с не пгевк-шало 150 мсек.

Замораживание проводили в пяти точках сердечного цикла. При этом 1-я точка соответствовала началу цикла до разм. ;пч сокращения, г-я - максимуму скорости разлития оекга^ени-а (рис.1). 3-я приходилась на пик изотонического сокгашения. ч л 5-я точки характеризовали процесс- расслабления: '¿-я - ¡мчало расслабления и 5-я - его коней.

Pili". !. Схематическое изображение кривой сокращения тонированного сердца (А) и ее первой производной tбз. Показаны регистрируемые параметры сократимости, пиарами \ - 5 обозначены точки, в которых производили замораживание сердца

оси - мсс/MCP

i i_i_i_i_i

1 2 3 4 5 1

Сердца замораживали по окончании воздействия, на Фене развившегося икотропного эффекта, при срабатывании шиппов развиваемая сила сжатия позволяла получать участки миокарда толщиной менее одного миллиметра . (О. 5 мм и меньше), замераживани») подвергали желудочки сердца; ткань предсердия, а также участки ткани толщиной более о. 5 мм отбрасывали, сердиа хранили и обрабатывали в жидком азоте.

Зкстракшж циклонуклеотидоз из ткани проводили по методике íI'.pmh "Air,ercham". Применяемые радиоиммунные наборы для определения содержания ииклонуклеотидов с использованием 1251"cAHF(cGHFi имели чувствительность (нижний предел определения) - 0. 5 0 ПМС'ЛЬ UAH-!' на Г.р06у и 0. 01 ПМОЛЬ ЦГ^^'/ПРОбУ. з пересчете на вес сырой ткани (при использовании навески ткани бо-юо мг) эти значения соответствую" приблизительно ю-го пмоль nAHí'/r сыр. веса и о. i-o. £ пмоль urní/r сыр. веса, это составляет менее 5'/ от обшего уровня пиклокуклеотидов в миокарде. то есть ошибка измерения содержания данных метаболитов используемым методом не превышала 5'/.

Б работе были использованы следующие в^шества: изздрин, тр;кторпе?азин, милгинон фирмы "Sisma" (USA), верапамил «гирмы "Orion"' (препарат "¿иноптин". Finland), пропрлнолол '!ирмы "Germed" (препарат "обзидан",. Germany).

Статистическая обработка результатов пгоьсднл.зсь на iem-pc с помочь;- пакета стандартных подпрограмм "STATGxAPHICS".

ИР = МСР.'ЛС

РЕЗЗЯЬТАТН ИССЛЕДОВАНИЯ И^Х ОБС'ЛДЕНИЕ Динамика цГНФ в изолированном со;;;цс морской свинки при различных инотропмых воздействиях

Исследования. проведенные к а изолированных сердиах морских свинок, показывают. чтс содержание циклического гуанозин-моно4ос$ата в ткани кискаг.-.а различным обгазек изменяется при инотгспных зсздействиях (табл. !). положительные инотг-опные агенты гг.ему?ич раствором с увеличенным »двес- содержанием хлорида кальния. изадгин б концентрации t н"). приводя в среднем к зо'-нсму приг>сту силы сокрасенич. лтаь недостоверно снижали уро-и'НЬ ц""-: в сердце, в то же брс-мя. изадгин в концентрации 1е. им. увеличивая сократительную активность сордна на 60'/, вызывал значительный прирост содержания ::;;кло«уклеоти-да. действие антагскистсв кальния. вегаг.амила и тригтсрпег-ази-на. препятствовало развитию положительного инстрошюго эМекта изалрика на изолированнее сорт:? и одновременно сопгоис-ждлг.ссь увеличением урсиня пгк1-, более выраженным, чем при действии

ОДНОГО ИЗаДРИНа.

Та б л;', л а !.

Амплитуда сокращения (АС. в '>■ к iva мин адаптации) и содержание аГ'/.-i (пмоль/г сыр. веса! в изолированном сердце морской свинки ПРИ раЗЛИЧНЫХ инотрсг.кых бсздойствкях

воздействие п ас нгкф

контроль 74 100 б. 10*0. 74

чм" сасо. *мик 36 I 31 59i 0. '¡6

изаярин ¡нх. гмин зт : 29 5. 52iO. 54

изадгин гмин чь 151 13. гч» i. ьг

милгинсн 1С мку. 5мин

•изадгин тнм. гмин 39 1 чч 14. 50 i г. го

вер.апамил !5мин

•нзадрин !5км. гмин 4% 90 17. 79:2. се

верапамил зон::. 15мин -

♦изадрин зону., гмин 49 94 17. 9912. го

тфп гмкм. гсмин

♦изадрин зонм. гмин 39 69 гч. ЕЫ4. 81

п'рсг.ранслол 1МКК. 5 ми и

*изадгин зонм. гмин 61 ег б. £8iO. зг

Примечание: в этой и последующих таблицах - п - количество опытов в серии

зависимость содержания пгкф в миокарде от ннетрспного состояния сердечной мышцы свидетельствует о рол;: ионизирован-

ного кальция в регуляции уровня ииклонуклеотида. судя по литературным данным, полученным m vitro, ионизированный кальций может ге-гулировать активность как гуанилатциклазы. так и <Юс$одиэстеразы ялз& 1Севегика, 1 мт, .реутсв и др,. 1993. Ткачук к др. . 1978. но et. ai.. 1969, civir. et al.. 1965. weishaar et al. . 1990. white 6' a;., 19823. характер изменений урсрия urxi при использованных воздействиях на внутриклеточный кальпиевкй гомеостаз позволил предположить, что зависимость содержания цгн1' от инотропного состояния сердца реализуется скорее всего посредством кальциевой регуляции активности са-кальмодулин-эа-висимой формы сосФодиэстераэы.

лля дальнейшего изучения механизмов изменений уровня игг.5 в миокарде был проведен анализ динамики ииклскуклеотида в течение одиночного цикла сокрашенич-раослабления изолированного сердца в контроле и при различных инотропкых воздействиях, в контрольных условиях не было обнаружено каких-либо различии в концентрации метаболита между отдельными точками сердечного цикла (табл. 2). В то же время, инотрог.ные воздействия, для которых характерно изменение внутриклеточного ьэпъпиевого го-меостаза. . сопровождались возникновением осцилляция вгж>. Так. перфузия изолированных сердец раствором с увеличенным вдвое

таблдоа 2.

динамика ал» в течение цикла сокращения-расслабления изолированного сердца морской свинки в условиях контрольной перфузии и г.гг инотропкых воэдейсгаих.

точки сердечного цикла

1 г 3 4 5

контроль 6. 35+1. 19 5. 50i2. 40 6. 56t 1. £9 5. 19Ü.60 б. 89+1.65

п 14. 15 15 15 15

ч мм саси 4. 39 tO. Ы* 6.40+0.71 Ч. ЗЕ+О. 67 ♦ б. 5Ш.05 7. 63+0. 92

п 9 е 8 9 6

юадин 1нм 5. 02+0. 99 б. 69+0. 31 4. e9i0. 50 б. 78il. 11 5. 23il. 61

п 9 8 9 8 7

иэадрин 15НМ 1% 36+4. 66 16. 25+2. бб 12. 2712. 55 7. 0413. 34* 15. 90+3. 27

п 10 10 И б 8

пропранолол 1мнИ

+изадрин зонм Г 6- 05+0. 40 б. 58+0. 50« 5. Е5+0. 43 8. 10il. 38» 7. 25 ±0. 75»

п 14 13 16 10 8

Обозначения показывают значимо различающиеся величины «ц» по отког«йк>: * - ко г-й точке (р<о. 05) « - -: 3-й точке (р<0.05). ♦ - к 5-й точке (Р<0.05)

содержанием хлорида кальция приводила к появлению осцилляция циклонуклеотила в ходе одиночного сердечного цикла с максимумом его содержания в период расслабления и минимумом, приходящимся на пик изотонического сокращения

Изадрин в ;:онцентрашш 1 ни не вызывал значительных изменений метаболита, тогда как увеличение дозы препарата до 15 нН сопровождалось появлением осиилляний. Причем максимум urni при данном воздействии приходился на период пика скорости развития сокращения, з минимум - на начало процесса расслабления, следует заметить, что предварительное введение в перфузионный раствор бета-блокатора пропранолола не только эффективно блокировало влияние последующего добавления изадрина на уровень памф и сократительную активность сердца, но и устраняло его влияние на динамику игкф (табл. г), при этом характер изменений уровня циклонуклеотила з ходе сердечного цикла был аналогичен наблюдаемому в серии с перфузией сердец гиперкалькпевым раствором. Учитывая, что в условиях блокады haüv-зависимых процессов в сердце пропганололон реализовалась преимущественно кальций-зависимая регуляция миокарда. можно заключить, что возникновение осиилдяниа нп» при киотропвых воздействиях связано с изменением динамики кальция в клетках.

В дальнейшем мы анализировали динамику ц[Тл в сердца;;, активируемых изадрином на Фоне различных инотролных воздействии (табл. 3). Вета-агоннст в данных ситуациях использовался для активапии системы цакф. Это было сзязано с необходимость» решения поставленной нами задачи изучения возможной роли цгкф в Формировании сократительного ответа сердца, а как известно из литературных источников, большинство swCktob unio реализуется посредством регуляции либо непосредственно уровня илм-. либо отдельных процессов, им регулируемых iCuppoietti et al.. 3987. Fischmeiater et al.. 1907, 1989. Horowitz. vinesratf. 19(53. 196t. Sinmons et a)..!9S8. vahier et a:..i990. etc) .

На Фоне блокатора медленных потенииалзавнсимых кальциевых каналов сарколеммы введение изадрина также сопровождалось развитием осцилляции нгиф в течение одиночного сердечного цикла, характерной особенность» динамики ииклонуклеотида в этих условиях был сдвиг его максимума вправо, то есть, наибольшее содержание ЦШФ приходилось на пик изотонического сокращения, тогда как минимум по-прежнему определялся в период начала расслабления. Необходимо отметить, что динамика циклокуклеоти-да была одинакова при использовании двух различных концентраций верапамила. При действии ингибитора кальмодулина ТФП или ингибитора цАМФ-спечиФичноя ФДЭ-III милринона добавление изадрина не вызывало появления осцилляция (табл. 3). эти результа-

- и -

табдкна з.

Изменения клнцапкшии игга> (пмоль/г сыр. их а. м * и) в течение сердечного никла изолированного сердца морской свинки при действии изодаа'л на других инотропных агентов

воздействие 1 ТОЧИ! г сердечного 3 цикла^ ч 5

милршон 1СМКМ

♦изадгин тнм 13. 5316. 02 7. 72+г. 87 11. 10*3. ад 15. 1814. 82 14. 10*3. 17

п 8 7 7 7 6

Еогапамип 15нм ♦

♦изадш! 15131 17. 5514. 62 19. 0713. 74 20. 90*2. 73 10. 39 ±3. 07 16. 28*5. 93

п 8 9 7 6 8

вераиамип ЗОКМ ♦ ♦

*ИЗаДРИН ЗОКМ 17.01*5. 25 19.6715. гг 23. 40*4. 17 ю. £0*з. ад 10. 36+4.08

п 11 10 8 7 9

тчп гмкя

♦изатин зат го. ге±7.93 15. «18. 37 32. 77*12. 9 29. 73±10. в 29. 40110. 9

п в 9 9 в 6

♦ - обозначены достоверно отличаисиеся величины в даггых точках. р<0. 05

ты подчеркивают важную роль ФосФодиэстераз в регуляции уровня цп-н> в течение одиночного цикла сокращения-расслабления. по-видимому, основное значение имеет активность са-ки-зависи-мон фдэ. способной реагировать на изменения уровня ионизированного кадьиия в миоплазме кардиомиоиитов в ходе кардиоиикла.

Анализируя характер изменений концентрации цги^ в.миокарде при различных инотропных воздействиях, можно, на наш взгляд, заключить следушее: специфический ответ системы пгнф на действие инотропных агентов, изменявших уровень ионизированного кальиия, обеспечивается гидролизушими Ферментами. Гу-лнплатдиклаза же. по-видимому, ответственна за неспецифическую ре.':.г.ни» содержания цгИФ при сдвиге окислительного потенциала клеток.

несомненно, подобное заключение не является исчерпывающи. поскольку и гп может обеспечивать специфический инотроп-к;>:Г! отпет системы ЦГКФ на действие некоторых агентов, в част-н-:..•ти, препаратов класса китросоединения. кроме того, не сле-исключать возможности активапки ги при значительном уве-личеннн уровня ионизированного кальиия э миокарде, подобный может, очевидно, участвовать в увеличении содержания ц!/;::' при действии 15 км изадрина.

При анализе осцилляция игк> на Фоне различных инотропных воздействия можно выделить два максимума, характерных для его динамики в течение одиночного цикла сокрашэния-расслабления (рис. г), первый соответствует Ьо времени пику скорости развития сокращения и отмечен в наибольшей степени при действии изадрина в концентрации 15 нм. аз серии с действием изадрина на Фоне верапамила этот максимум сдвинут вправо, второй приходится на период расслабления и хорошо выражен в сериях с перфузией сердец гиперкальциевым раствором или пропрзнололом. то есть з условиях са-зависимой регулядии метаболизма сердца.

а. Опрлщгти?

I I Г

20»,

д.

ц.

с]

X

пр^п/злналчл Со*'

1 1 I

1

Рис.2. динамика цгкф в течение одиночного цикла сокращения -расслабления изолированного сердца при действии: пропрано-лола (1 мкМ) и изадрина (30 нМ). повышенной знеклеточной концентрации кальция (4 ми), изадрина (15 кк>. верапанила (15 нт и изадрина (30 ни), на данном рисунке вверху - схематическое изображение кривых сокращения, внизу - уровень ЦПК> в пяти точках сердечного цикла при соответствующих инотропных воздействиях. цифрами 1 - 5 обозначены точки сердечного цикла.'в которых провод;",ли замораживание: звездочками И) показаны максимумы цгкф в сериях, достоверно отличающиеся от минимальных значения !р<о. 05)

I

- 13 -

Следует отметить, что для последних воздействия (прог.ра-нолол и гиперкальяиевыя раствор) также было характерно увеличение уровня цгнф в период максимума первой производной аналогично изадрин-активируемым сердцам, однако статистически этот прирост был недостоверен. Б то же время, при действии бе-та-агониста как одного, так и на Фоне вераламила отмечалось выраженное (хотя статистически не значимое) повышение содержания цмклонуклеотида в конце сердечного цикла, в период конца расслабления (рис. е). То есть, в целом, для осцилляции игкф характерно существование двух максимумов, что. по-видимому, является отражением динамики ионизированного кальиия в клрдно-ниоиитах.

таким образом, в миокарде млекопитающих, наряду с осиил-ляииями ионизированного кальция и цлМФ. зарегистрированными ранее, наблюдаются осцилляции в,течение одиночного сердечного цикла еше одного вторичного посредника - циклического гуано-зинмоноФосФата. изменения содержания нгкф в сердце являются, очевидно, кальций-зависимыми. Кальциевая регуляция уровня ::;:х-лонуклеотида реализуется преимущественно -посредством изменения активности са-км-зависимой с-дэ-i, по-видимому. ФосФодиэстераз-а дГМФ более чувствительна к изменениям внутриклеточного уровня ионизированного кальция по сравнению с гуакклатииклазой.

Роль цГйФ в инотропнох ответе сердца. Воэиоеность участия .

осциллаций цАНФ и цГНФ в регуляции одиночного сокращения.

Результаты проведенных исследовании показывают, что существующие в миокарде механизмы регуляции содержания unw обеспечивают связь его изменений с инотропным состоянием сердечной мышцы.1 иначе говоря, с этой точки зрения, ttrm- способен выполнять мессенджерную функцию при целом ряде инотрсшшх воздействий. влияющих на динамику ионизированного кальция, однако. закономерен вопрос: на регуляцию каких именно процессов, функций клетки направлено действие цгмч>. каково значение изменений содержания никлонуклеотида в сократительной активности и метаболизме миокарда, ответу на этот вопрос посвяшена вторая часть работы, как уже говорилось вше. судя по литературным данным, полученным в основном m vitro, большинство эффектов «ГИФ направлено на регуляцию системы цлмф. так. в ряде работ было показано, что цгиф может регулировать ряд цлм-зависимых процессов в условиях m vitro: кальциевый ток через медленные потенниалэависимые каналы сарколеммы, сродство тропоникового комплекса к кальцию., активность ФосФодиэстераз п и ш типа IBHailY et ai.. 1985. Horowitz et ai.,i9&3. Fischineister et ai.. 1987, Levi et al. . 1969. Sirrmons et ai..i9se, silver. 1969.

vahler et al.. 1989. Vineerad. 19841. Поэтону изучение роли агнф проводилось в условиях активации изолированных сердец иэадринон.

ныла проанализирована вэа^освязь изменения игнф в течение одиночного цикла сокрашения-расслабления с подобными изменениями цапф, оказалось, что изадрин вызывал появление значительных колебаний цапф в ходе кардиоиикла только в тех сериях, где были обнаружены осцилляции ПГКФ: а именно, при действии бета-блокатора пропранолола и в присутствии антагониста кальциевых каналов верапамила (табл. 4). Ранее ухе говорилось о том. что цгнф регулирует активность ФосФодиэстераз нам» in vitro, а также, по данный некоторых авторов, может влиять на уровень цаиф in vivo tsilver. 1989. зимпопз et al.. 19881. в связи с этим закономерно было предположение: не связано ли

Таллина 4.

изменения концентрации ПА1» (нмоль/г сыр. веса) в течет» цикла со№атения-расслабления сердца морской свинка активируемого гоадрином на Фоне различных инотропных воздействия

воздействие точья сердечного цикла

1 г .3 4 5

изадим 15НМ 1. 98±а 50 г. З5±а « 2. 5ÓiO. 04 г. 13*а4в 1.92±а 51

п 9 10 ' 11 в 9

мипринон 1СНКЙ

♦изаясин 7нн 1. 89+0. 45 1. 49 ta 47 1. 55±0. 29 1. 67 ta 23 г. 27 ta 45

п в "в 8 0 7

верапамип 15нм > «

♦изадй« 15нн 1.79 iO. 13 i. зв±а 31 I, 51 ±0.27 г. 2010.42 1.09±0. 15

п 9 • 9 в т 8

верапамип зет ♦ ♦.И

♦изадим зонм 1. Тс+О. 37 1. 53±0. 37 а 79 tO. 10 о. wto. is ага±о.оз

п 11 11 9 в 10

•топ гния

♦изадрин зеш a76íO. и i. teto, гг a 89ta is i. оо±а ie а б5±а 14

п в 8 9 в б

пропранолол 1MW1 ♦♦ • ♦♦

♦изадим зонм 0. 55 tO. 02 0. 65tO. 05 0. 51±0.04 0. 5510. Об ачею. 04

п 14 13 16 10 в

Обозначены значения, достовегио различающиеся. р<о. 05: » - между собой

♦ - по сравкеию с 1-я wscofl данной сея« ♦♦ - то же по ставней» со г-а точно»

возникновение осцилляция цапф с регулирующим воздействием ИГИФ. Ведь как было показано ранее Кгаузе на сердце собаки, изменения содержания иГНФ в течение одиночного сердечного цикла. хотя и незначительные, в целом происходят в пготивоФаэе изменениям паиф [Krause et al..19893. Кы также наблюдали подобные взаимоотношения диклонуклеотидов в' миокарде морской свинки в условиях блокады бета-адреноредептороз.

использование статистических нетодов анализа позволило обнаружить взаимосвязь изменений циклонуклеотидов только при действии иэадрина на Фоне неизмененного кальциевого гомеостаза ниокарда. уравнение регрессии цгпф на памф имело вид Y ; 1.50 ♦ o.osxtp<o. 05). При введении же инотропных агентов эта связь не была статистически значимой.

Б.ниокарде. как известно, существует ряд внутриклеточных регуляторов уровня цапф, среди которых выделяют как наиболее важные - ионы кальния и циклический ГКФ. вероятно, при активации сердец иэадрином на Фоне неизмененного метаболизма кальция оба этих регулятора реализуют свое действие в отношении цамф, Причем, если кальций, по-видимому, в основном влияет на активность аденилатциклазы, то цгкф - ФосФодиэстеразы. в присутствии же других инотропккх агентов изменение динамики ионизированного кальпия и. как результат, изменение взаимодействия посредников могут наруиать существующие в обычных условиях взаимосвязи. То есть, при сдвиге инотропного статуса клетки основным (более мощным по сравнению с цгг.Ф) регулятором уровня цапф становятся ионы кальаия.

Также была предпринята попытка выяснить возможность участия осцилляции цГИФ в Формировании сократительной реакции сердпа ка инстропкые воздействия, до настоящего времени в литературе нет однозначного мнения относительно участия осцилляция в быстрой регуляции работа сердца, поскольку um», вероятно. выполняет в миокарде мессекджерную функцию, следовательно, его действие может проявляться изменением активности или скорости каких-либо внутриклеточных процессов в ходе сердечного цикла.

- в литературе имеются данные в пользу участия осцилляция иакф в пошшювоп регуляции функции сердца. Так. Е.-G.Krause показал, что активность некоторых са- и иакф-зависимых Ферментов (киназа а, пируватдегидрогенаэа. ФосФоламбан) изменяется на протяжении систолы-диастолы сердца tKrause et al..19893. в работе Б. И. Лаптева была показана связь между изменениями осиилляаия цамф и сократительной функцией миокарда i/lan-тез. 199 и.

С другой стороны, анализ экспериментальных данных показы-

вает. что иАМФ-зависимая регуляиия внутриклеточных процессов посредством ФосФорилнрования-деФосФорилирования является относительно медленной и реализуется в течение десятков секунд или даже минут [Ыгиепапп ег а1..Юб5]. Значение цГМФ-зависи-мого фосфорилирования-дефосфорилирования в обеспечении циклической инотропнон роакиии сердечной мышцы на воздействие в настоящее время также не ясно, однако, в последние годы появились сообщения о возможности осуществления быстрой регуляпии (не включавшей фссфорилирование) ряда внутриклеточных реакция, например, прямая регуляция циклическим ГМФ. а также, возможно, и цапф, са-тока через плазматические мембраны клеток [Солнцева. 1991 ¡.

Нами для изучения возможного участия осцилляция цнклонук-лестидов в регуляции Функции сердечной мышцы был проведен анализ корреляционных отношений между параметрами сократительной функиии и соответствующими величинами концентрация игмф и намф и их отношением в сердце при отдельных инотропных воздеястви-ях. коэффициент линейной корреляции (Иху) рассчитывали для каждой из пяти точек в течение сердечного цикла, характеризующих процесс сокращения сердца при данном воздействии, а также для совокупности этих точек, в таблице 5 суммированы результаты проведенного анализа, в данной таблице приведены те параметры сократительной функции, для которых выявлена достоверная корреляция с уровнем игнФСдАМФ) в данной точке и соответствующее значение кху. прочерк в какой-либо из колонок означает, что при этом воздействии для данной точки не обнаружена корреляция метаболита ни с одним из показателей сократимости.

При интерпретации Результатов корреляционного анализа мы рассматривали два возможных, на наш взгляд, варианта: 1. один и тот же параметр сокращения или расслабления должен коррелировать с уровнем цамф или цГКФ в одной и той же точке по крайней мере в нескольких сериях, это означало бы. что мессенджер в данный момент времени реализует свое регулирующее воздействие на данный процесс, при этом не имеет значения, максимально или минимально значение циклонуклеотида в этой точке.

г.. пара;- <етгы с ократител ьной функции должны коррелировать с

максима."; уровнем иV • или агкФ при каждом воздействии или

хотя бы при нескольких. это основано на предположении, что

связывание циклического нуклеотида с его эФФектором пропорционально уровню нуклеотида и. очевидно, при увеличении содержания иА1'Л или цгМФ регулируемый процесс будет активироваться и корреляция будет положительной, либо ингиои^озаться с соответствующим отрицательным коэффициентом корреляции, при снижении же уровня циклонуклеотида должны наблюдаться обратные от-

ношения.

та&лиод 5.

Величины статистически значимых коэффициентов кс-гтсляют между параметрами сокюттгельной суикшм и уровнем игто. иля}

воздействие Ц ГИФ -1 ц а к ■ 1 *

1 г 3 % 5 1 г 3 4 5

иэадим 15нМ - - - ОСП их ис -

0. 76-0. 60 -о. 86

И?

. -0.67

нилринон ютм - - - _ АС _

иэадим 7нм о. ее

«X

0. ЬЧ

ГЕР

о. ее

вегапамип !5нм осп - га ИХ -

♦иэадрин 15нм 0.14 -0. 78 0. 82

ГС?

/ 0. 76

ис

0. 80

К? '

0. 89

верапамип зонн - - ГЕР - - . - -

♦изадгин зонн О. 83

ИЗ

0.76

У?

0.66

топ £нкм ЯГ -

♦изадрад зснм 0. 72

ОСП

¡-1 0.72

нропранолол 1мй1 осп - АС -

♦изакии зонк —1 0. 56 0.67

К

-0. 68

и?

-0.78

обобшая результаты корреляционного анализа, можно отме-

тить следуюшее: корреляция цамф с параметрами сократимости отсутствовала при действии одного иэадрина и появлялась при его действии на Фоне других инотропнык соединений, для иГНФ. так же как и для отношения цГНФ/иАКФ че было выявлено какой-либо закон; ;ерной связи с параметрами сократительной Функции. отсутствие закономерности в корреляционных отношения* не позволило сделать о г. .означный вывод о возможности регуляции процессов сокращения и расслабления циклическими нуклеотидами в течение одиночного сердечного цикла, сложность интерпретации при использованном подходе состоит в том. что роль циклических нуклестидоз в поцикловой регуляции работы сердпа оценивалась по таким показателям, как амплитуда сокращения и скоростные параметры. Величины этих показателей зависят в значительной степени от уровня ионизированного кальция а миокарде, от пред-зествуюиего механического состояния мышцы и могут лишь регулироваться циклическими нуклеотидами.

Очевидно, возникновение осиилляиий циклонуклеотидов в сердце может быть связано с необходимостью точного и быстрого изменения среднего уровня метаболита, очевидно, именно подобное неравновесное состояние процессов синтеза и распада легче регулируется различными факторами, а значит, быстрее реагирует на изменение вне- или внутриклеточных условий увеличением или снижением среднего уровня метаболита, поэтому- анализ роли цгмф в инотропии миокарда следует, вероятно, основывать на изучении-изменений среднего уровня иГНФ.

в связи с зтим. заслуживают внимания, на наш взгляд, из-, менения содержания сгн-}, а также и цапф, в активируемых сердцам на Фоне антагонистов кальция. Шло обнаружено, что блока-то? медленных кальииовйх каналов сарколеммы верапамил яозоэа-висимо снижает рецептер-зависимый прирост уровня наиф в миокарде и увеличивает уровень цгмф в одинаковой степени при использовании двух концентраций препарата (рис. 3). то- .есть, верапамил сдвигает соотношение циклонуклеотидов в сердце в польз:- агк-;-. причем более значительно при действии зо нм вера-памила.

при анализе данных сок.ратительнои функции и уровней нук-леотидсв в изолированных сердцах, активируемых изадрином на Фоне разных концентрации кальциевого блокатора. оказалось, что при действии 15 ни препарата скорости сокращения и расслабления после добавления иэадрина увеличивались в равной степени, тогда как в присутствии зо нм'--кср не отличалась от исходной величины, а мсс превышала ее на. 50^ (рис. 3!. отсутствие люзит-ропного эффекта иза^рина на Фоне зо ни верапамила. вероятно, связано с отсутствием прироста цАКФ в сердцах, одновременно.

1|Ш.

кмоль/г

2.01

1.0

цШЭ

пмоль/г

%

150, 100

50

цШ

. 1 р-н

-

—

Рис. з. содержание панф 20.0 и цпИ'. параметры сократительной функции изолированного сердиа морской свинки -10.0 при действии

1 1 - ни верапамила и 15 им изадгина Е23 - зо нН верапамила и 30 нк изадрина • - обозначены достоверно различающиеся средние 1Р'0. 05)

АС ЫСС МСР

повышение содержания ЦГТТФ и. вероятно, провоцируемое им увеличение чувствительности тропонинового комплекса к кальщ!». могло быть причиной, с одной стороны, дальнейшего ухудшения процесса расслабления и. с другой, - роста скорости сокращения. То есть, сдвиг соотношения циклонуклеотидов приводит к измене. нию соотношения скоростных параметров сердца, что выражается изменением формы сократительного ответа, в то же время, амплитуда сокращения оставалась на прежнем уровне, то есть, вероятно. изменения насосной функции сердца будут при этом не столь значительными, таким образом, вероятно, одним из механизмов действия верапамила является изменение соотношения циклонуклеотидов за счет снижения рецептор-зависимого прироста цамф и увеличения содержания цГНФ.

следует эанетить. что подобный сдвиг соотношения циклонуклеотидов в активируемых иэадрином сердцах наблюдался и в присутствии внутриклеточного кальциевого антагониста трифтор-перазина. вероятно, это также могло быть причиной большего прироста лес при добавлении бета-агокиста по сравнению с другими параметрами сократимости. То есть, явление изменения соотноиения шшюнуклеотидов может быть . характерной особенностью действия антагонистов кальция как вне-, так и внутриклеточных.

Таким образом, анализ изменений цгиф и цакф в изадрик-ак-

- го -

тивируеиых серяиах на Фоне различных инотропных воздействия позволил сделать следующее заключение. Осцилляции «ГИФ. также как и как<5. по-видимому, не принимают участия в подикловоя регуляции функции сердца, очевидно, их существование связано с необходимость» быстрой, и точной регуляции среднего уровня пик-лонуклеотидов, обеспечивающего реализацию эффектов посредников. Изменения среднего уровня циклических нуклеотидов. а также их соотношения является важным Фактором, определяющим характер реакции сердечной мшды на инотропное воздействие. При определенных условиях цГМФ. очевидно, может выполнять модулирующую функцию по отношению к пакф-зависиной регуляции.

ВЫВОДЫ

1. осцилляции цгмф в течение одиночного цикла сокрашения-расслабления изолированного сердца морской свинки, сокращающегося в изотоническом режиме, возникают на Фоне перфузии проп-ранололом или гиперкальциевым раствором, для действия которых характерна преимущественная са-зависимая регуляпия внутриклеточного метаболизма,

2. Блокатор кальциевых каналов сарколеммы верапамил не влияет на осцилляции циклонуклеотида в течение цикла сокраше-ниярасслабления в сердцах, активируемых изадрином. ингибитор кальмодулина тфп или ингибитор фдэ милринон устраняют иэад-рин-индуцируемые осиилляиии в ходе одиночного сердечного цикла.

3. изменения содержания иГНФ в сердце, в том числе на протяжении цикла сокрашения-расслабления. являются кальния-за-висимыми. Кальциевая регуляция уровня циклонуклеотида. вероятно. реализуется преимущественно посредством .изменения активности са-кальмодулин-зависимой ФосФодиэстеразы.

<ь Осцилляции иГНФ и нАНФ в течение одиночного цикла сок-рашения-расслабления изолированных сердец, активируемых изадрином. не связаны друг с другом и не участвуют в поиикловой регуляции сократительной активности сердечной мышцы.

5. Антагонист кальния верапамил изменяет соотношение пик. ..

лонуклеотидов в активируемых изадрином сердцах, снижая репеп-торзависимыя прирост цанф и увеличивая содержание аГНФ. иэме-некия среднего уровня циклических н/клеотидов. а также их соотношения являются одним из Факторов, определяющих характер реакции сердечной мышцы на инотропное воздействие.

список работ. опубликованных по теме диссертации 1. влияние трифторперазина на содержание гликогена и креатин-ФосФата в ткани миокарда крысы // Обмен кальция в Физиологии и патологий сердечно-сосудистой системы, тез. докл. Всесоюэ.

- El -

конФ. - Томск. 1968.- с. 166-167 (соавт. В. Д. Прокопьева. ю. С. Свирко. Н.И.Лаптев).

г. влияние обзидана и Финотина на содержание макроэргических Фосфатов в ходе сердечного цикла // Акт. вопр. кли". и тео-рет. медицины. тез. докл. I научн. -практ. конф. мол. ученых. - Томск. 1989. - с. 5-6 (соавт. в.и.лаптев. с. А. Афанасьев. Е. ю. Талас ва).

3. влияние внеклеточного са** на изменение сократительной функций и концентрации цанф сердца морской свинки при активации бета-адренореиепторов // синтез и исследование биол. актив, соед. тез. докл. ю конф. мол. ученых, ан латв. сср. Ин-т орг. синт. - Рига, 1989. - С. 109 (соавт. С.А.Афанасьев. Е. Д. Алексеева).

4. Особенности изменения параметров сократительной функции изолированного сердца морской свинки при действии изадрина и милринона // Поиск новых лек. средств и их испол. в клинике, тез. докл. науч. -практ. конф. - Чита. 1590. - с. ¿гэ - 130. (соавт. С.А.Афанасьев, е. ¡о. талаева. Б. и. Лаптев).

5. Роль кальций-зависимой рагуляиии обмена нам* в сокгатитель-нс-й функции миокарда // Акт. вопр. патсфиэиол. в совр. медицине. тез. докл. респ. научн. конф, - Алма-Ата. 1990..- с. 66 (соавт. Б.И.Лаптев, с. А. Афанасьев, Е. ¡0. талаева).

6. действие обзидана, Финоптина и са + + на содержание цАгл в процессе сокраления-расслабления изолированного сердца морской свинки, активированного изадрином // укр. биохим. журн. - 1990. - т. 62. к. 3. - с. 111-115 (соавт. Б.К.Лаптев. В. Д. прокопьева, с. А. Афанасьев, н. и. кених, ю. а. травкоз).

7. действие Финоптина на динамику иамф в изолированном сердце морской свинки в процессе его сокращения-расслабления // Бюлл. эксперим. биол. мед. - 1990. - N. 11. - С. <455 - 457 (соавт. Е.И.Лаптев. С.А.Афанасьев. Е. ю. талаева).

8. влияние бета-агониста на изолированное сердце морской свинки в условиях ишемии // Фармакол. коррекция гипокс. состояний. натер. II всесоюз, конф. - Гродно, 1991. - с. 193 - 194 «соавт. с. А. Афанасьев).

9. Calcium antagonist finoptlne chanee3 beta-mediated cyclonucieotlde oscillations during cardiac cycle // calcium antagonists in Cardiovascular care. Second Internat. Svep. -Basel. 1991 tcoworK. s. a. Afanasyev. B.I.Laptev).

10. Роль взаимодействия цгнф и цалф в инотропнон ответе изолированного сердпа морской свинки // современные вопросы экспериментальной и клинической кардиологии. - Томск. 1992.-ВЫП. 1. - С. 10-11. ^^

//