Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Осцилляции содержания цАМФ при различных инотропных состояниях изолированного сердца морской свинки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Осцилляции содержания цАМФ при различных инотропных состояниях изолированного сердца морской свинки"

РГО ОД

. МИНИСТЕРСТВО ЭДРйЗССХРйНЕН« РФ 1 СИБИРСКИЙ ГОСЧДЙРСТЗЕКНМ Ш'ЮЖШ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

БЙРДЙМОЗЙ ИРИНА БЭРИССЗКЙ осиилпяиуи с0дерейнй5 цг«0

при рйз:;;чш ино^опнх состояниях

н30г.йр23йнн0г0 серд'дй морской свинки 03 .00.04 - биохикия

АВТОРЕФЕРАТ. Я1?:сертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск - 1993

Работа выполнена в отделе экспериментальной кардиологии научно-исследовательского института кзраиологки томского научного центра раи-; /директор - академик раня р.с.Карпов/.

научный руководитель:.

доктор медицинских наук.' профессор н. Л. Ларионов научный консультант:

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник с. а. Афанасьев

официальные оппоненты;

доктор медицинских наук, профессор в. и. ;{улинскнй кандидат биологических наук, докент г. д. Суханова

Ведущее учреждение: институт биохимик Сибиг-ского отделения Российской академии медицине кик ¡пук

(н с т} о с и б и 7'к)

Запита состоится ______________1993 года в_____часоя

на заседании специализированного совета д 034.28.о: при Сибирском государственном медицинском университете, со адгес/: 6 34050. г.томск, московский тр., г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках томского медицинского университета и кии кардиологии тип РАЖ!.

Автореферат разослан *___"______________1993 года.

Учения секретарь специализированного совета.

д. и. н.. профессор ЛдГ , , Пл _ нелобородсва э. И.

- 3 -

ОБДО ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ»

Актуальность проблемы. Изучение закономерностей Формирования инотропиого ответа сердца является одноя из актуальных задач кардиологии. Реализация инотрспной реакции миокарда на действие гормонов, неяротранскиттеров. лекарственных препаратов обеспечивается, как известно, согласованным взаимодействием всех вторичных посредников, включая, циклические нуклеотиды - циклический адонозин-3'. 5'-монофосфат (uA!tJ>> й гуанозин-3'. 5'-монофосфат (игМФ). Роль иамф в опосредовании эффектов множества медиаторов и лекарственных соединения исследована за последние годы достаточно детально сватанабе и др..1968. Murray et al..19691. В частности, осиилляторныл характер изменения уровня какф позволил ряду авторов предположить возможность участия этого ииклонуклеотида в быстрой, реализующейся в течение одиночного сердечного цикла, регуляции работы сердца [Лаптев и др. .1990. 1991. Krause et ai.. 19891.

однако, ¿.о настоящего времени нет однозначной трактовки значения другого аиклокуклеотида - пгкф в инотропных реакциях сердца, зозможное участие в инотропном ответе на действие нитратов. атриального натрипуретического Фактора и других медиаторов CFischmeister et ai. . 1969, MacLeod et al.. 1966. waldman et аь.198^. veishaar et al.,i990] и известный Факт активации гуаьилатииклазы при интенсификации процессов перекисного окисления [Schubert et al. .1990. White et al.. 19821 привлекают в последние годы большое внимание к изучению роли цгпф. По мнению некоторых авторов, изменение баланса пАМФ и ЦГМФ в миокарде может лежать в основе развития электрической и механической нестабильности сердечной мышцы и. следовательно, быть причиной возникновения аритмия сселявина т.в..1991, Капе et al..1990). кроме того, активный поиск и исследование новых кардиотоников. в частности, перспективного класса препаратов -ингибиторов ФосФодиэстеразы. повышают интерес к данному пикло-нуклеотйду как возможному кессенджеру их эффектов CLereft et аь.1969, Lusnier et al., 19661. Эти и другие данные стимулировали наш интерес к исследованию взаимодействия циклических нуклеотидов и вклада цгмф во внутриклеточную регуляцию инотропных эффектов.

Цель работа: изучение закономерностей динамики концентрации цгнф в течение иикла сокрашения-расслабления изолированного сердца морской свинки и роли изменений иГМФ в Формировании инотланого ответа сердца.

. .. . • - ----- - ч -

для достижения выдвинутой пел« были поставлены следующие задачи:

j. в опытах из нзолшоваиных сердцах морских свинок исследовать изменения содержания urns в течение одиночного никла сокращения-расслабления d контроле и й условиях реализации преимущественно кальциевой гегуляиик Г/шииш сердца.

Изучить динамику иГКФ э ходе одиночного кдрлиопиклл при изменении инстропного состояния изолированных серпои, ах-типнгоч-кыл изалгинс н.

проанализировать взаимосвязь параметров сократительной Функции изолированного сердца с изменениями уровня пиклонухле-отияез в хсле сердечного цикла при различных инотропных воздействиях. оиенить роль осцилляция цаяф.и «гнф в Формировании инотролного ответа сердца.

ч. Исследовать роль изменение соотношений «иклонуклотидов в механизме действия антагонистов кальки*.

Научная н чшзнд работ». Впервые исследованы изменения ксниеитрлгии ц""-: в течение никла с:крашекич-гасслабления изолированных сердец при изменении инотрог.нсго состояния серлеч-н'.а му^иы. Изучены закономерности возникновения осцилляции циклического н'/клеотида и их зависимость от кальциевого гоме-остаза. полученные данные позволяют предположить, что кальциевая рогулчпич уровня ury.v в миокарде реализуется преимущественно посредством изменения активности са-кк-зависимой ФДЭ.

изучены взаимосвязи быстрых изменений концентраций иГИФ и пАЯФ друг с другом и с параметрами сократительной функции изолированного сердца в условиях активации иэадринон. предложена гипотеза, согласно которой существование осцилляция циклических нуклеотидов обеспечивает точную регуляшпо их среднего уровня в сердце в каждый момент времени, но, вероятно, не участвует в регуляции одиночного сердечного цикла.

Получены результаты, свидетельствуглие о том. что инот-ропные э««екты антагонистов кальция. в частности верапанила. помимо блокады медленного кальциевого тока могут реализоваться посредством изменения соотношения накф и «гиф в миокарде.

Теоретическое и практическое значение работы, настоящая работа вносит вклад в развитие фундаментальных представлений о механизмах изменения уровня нгкф в миокарде. Результаты работа расширяют представление о разнообразии мессеняжеркых путей реализации эмехтов кардиотропккх вепеств. их взаимодействии и вносят вклад в понимание закономерностей Формирования инотроп-ного ответа сердца. Полученные данные могут быть использованы

- 5 -

при скрининге новых кардиотропных соединения.

Проведенные исследования покатли. что антагонисты кальция (вегапаикл) значительным образом изнен«>/г соотношение ЦАИФ и ОГК« в миокарде. Эти данные, очевидно, необходимо учитывать при проведении соответствуюшеп тегаг.ии. с частности, при комбинировании антагонистов кальция с другими препаратами.

Основные положения работы могут быть использованы в курс? яекаиа по Физиологии и биохимии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. содержание пГМФ и его динлникл в течение одиночного цикла сокращения-расслабления сердца изменяется при инотрог.ных воздействиях на миокагд. Зависимость уровня иг>^ ст инстрспно-го состояния сердца реализуется, очевидно, посредством изменения активности Са-кальмодулик-зависимой $ос?одизстер.ззы при воздействиях, влияших на внутриклеточный кальциевый гомесстаэ

2. осцилляции ц??!'} в течение одиночного сердечного цикла не участвуют э попикловоп регуляции сократительной активности сердечной мышиы. возникновение осцилляция цикленуклеотида обеспечивает. пс-видку:му, возможность регуляции среднего уровня цгк* при действии различных инотР'опных агентов, влиявших на процессы синтеза и гидролизз кикленуклеотидов. .

3. Антагонист кальция верапзмил изменяет соотношение аик-лонуклеотидов в активируемых изадриком сердцах, снижая реиеп-торзависимыи прирост на4.;- и увеличивая содегжание цГ"-:. изменения среднего уровня циклических нуклеотндез. а также их сс-отнояения являются одним из Факторов, определяющих характер реакции сердечной кьпвиы на инстропное во-здепствие.

материалы диссертации докладывали-: ь и обсуждались на Всесоюзном рабочей совещании "Антагонисты и агоннстн кальция: перспективы исследования". Рига. ¡989; рабочей совещании по программе АН СССР "Сократимость миокарда". Ялта. 1969; IV отчетной сессии НИИ кардиологии тки аг.к ссср. Томск.1909: на заседании биохимического обпества. Томск. 1992.

Публикации, по теме диссертации опубликовано ю работ,

Объем и_структура работы, диссертация изложена на юг

стланиках машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы методов исследования, собственны*: результатов и их осуждения, заключения и выводов. Список литературы вклгочает 21 £ источников. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 15 таблицами.

МАТЕРИЯ/! Я МЕТОДЫ ИССЛЕДОВМШ

В работе представлены основные и-зультаты 9 серий опытов, пг-оведенних т Ч5в животных.

3 качестве объекта исследования служили изолированные сердиа морских свинск. перфузируекые по /:ангендорФУ растворен Кребса-хеизелалта при £5to.5*С и частоте стимуляции 2 Га. Перфузию сердц~ проводили по открытому контуру в изотоническом режиме при постоянной давлении ¡СО мм. рт. ст. 1. Продолжительность периода адаптации сегдиа после начала перфузии Физиологическим раствором составляла 5 5 мин.

В течение эксперимента проводили регистрацию кривых сок-рашения и ее первой производной для последующего расчета величин амплитуды сокращения (АС. мм) и максимальных скоростей развития сокращения (ксс, мм/сi и расслабления ШСР. мм/с). Используя эти значения в каждой опыте рассчитывали также величины индекса сокращения (ИСК как отношение максимальной скорости сокращения к амплитуде сокращения, индекса расслабления (и?). как отнесение максимальной скорости расслабления к максимуму силы, и стног^иия скоростных параметров (осп = ксс/кср. рис. п.

для определения содержания быстро метаболизируюших внутриклеточных соединении в отдельные Фазы никла сокраше-ння-расслабления использовали метод быстрого замораживания изолированного сег-дпа синхронно с сердечным циклом. Устройство для быстрого замораживания было изготовлено по описанию в работе с. I. Thompson et a! uvso). оно включало в себя электроника блок синхронизации с «азами сердечного цикла и специальное алюминиевые шипик с механическим затвором, управляемые электронным блоком. Еилод. чашки которых предварительно охлаждали з жидком азоте. Фиксировали в настороженном состоянии в камере для перфузии сердца. Блок синхронизации давал возможность изменять длительность промежутка времени от стимулирукщого импульса до срабатывания затвора и захлопывания чакек снг.::с я, позволяя тем самым производить замораживание в выбран:;:.:: ;азг сердечного иикла. Предварительно с использованием термочувствительных электродов было установлено, что время охлаждения нейтральной части замораживаемого участка до о"с ;:е г:гевы-шало 150 мсек.

Замораживание проводили в пяти точках сердечного пикла. при этом 1-я точка соответствовала началу цикла го г-азкитич сокращения, г-я - максимуму скорости разиатия • сскмгпенич (рис. п. 3-я приходилась на пик изотонического сскгагс-ния. 'i л 5-я точки характеризовали процесс- расслабления: 't-я - начало расслабления и 5-я - его конец.

Рис. !. Схематическое- изображение конвои сокращения изолированного сердца (А) н ее пегвоп производной (Б). Показаны регистрируемы!? параметры сократимости. Цифрами 1 - 5 обозначены точки, в которых производили замораживание сердца

IOCW

осп= мсс'мср I__I-«-1-1-«

I 2 3 4 5 1

С^рдиа замораживали по окончании воздействия, ка »оке развившегося ннотропного эффекта. При срабатывании гиписв развиваемая ста сжатия позволяла получать участки миокарда тол-пикен менее одного миллиметра . ¡0. 5 мм и меньше). Замсраживанию подвергали желудочки сердца; ткань предсердии, а также участки ткани толиинои более с." мм отбрасывали, сердца хранили и обрабатывали в жидком азоте.

Экстракт® чиклокуклеотндов из ткани проводили по методике спрмы "Arcercham". применяемые радиоиммуннке наборы для определения содержания ииклонуклеотидсв . с использованием 125г-санрícGHPi имели чувствительность (нижний предел определения) - 0.10 пмоль UAIM- на г.робу и 0. 01 пмоль ЦГМ2/ПР06У. 3 пересчете на вес скрой ткани (при использовании навески ткани 50-100 кг) эти значения соответствует приблизительно ю-го пмоль панф/г сыр. веса и о. i-o. г пмоль urns/г сыр. веса, это составляет менее 5И. от общего уровня ник.лонуклеотидов в миокарде. то есть оапбка измерения содержания данных метаболитов используемым методом не превышала 5*.

В работе были использованы следующие вс-шестеа: изадрин. трп4торперазин. килгинон фирмы "slema" (u£a)<. верапзмил <;ирмы "Orion" (препарат "Финоптин". Finland), пропранолол 1ирмы "Gern,eti" (препарат "обзидан", Germany).

стзти-тическая обработка результатов проводилась на IBM-PC с Г.0.Ч0Е1Д пакета стандартный подпрограмм "STAtgxaphics".

ир = мср.мс

РЕЗЗЛЫЙТИ «ССЛЕДОВАНИЯ Лх ОБСУЖДЕНИЕ Диилмика цГНФ о изолированном се;:;.це морской свинки при различных инотропнкх воздействиях

Исслепорл'-пя, проведении* па изолированных сердцах морских свинок, коказквак'т. чтс содержание циклического гуаноэин-коно4ос'5ата в ткани миокарда различным обгаз о к изменяется при кнотрог.нкх воздействие 1та^л. тз. положительные инотх-опнке агеитн 'пс-Пузи--! гастз:ром с увелнчекнкн вдвое- содержанием хлорида кальция, изадгия в концентрации i нм) . приводя в среднем к зо;'-ному пригосту силы сокращения. лгаь недостоверно снижали уровень и гг.: в сердце. 3 то же время, изадгин в концентрации п нМ. увеличивая сократительную активность сердца на е>о-л вничвал значительный прирост содержания цикг.онуклооти-да. Действие антагонистов кальция. вегапакила и триотсгг.ерази-на. препятствовало развитию положительного ин-.тройного эмекта изадрика на изолированнее сердце и еяновг.; !'.«:«-:> сспгсгк ждалось

уп^личениои урокня чгк1. болоо рыр'а.ош'.им. чем при яеис'п'.ии

одисго изадгина.

Таблица 1.

Амплитуда сокгакения в у. к 1' а кии адаптации! и содержание цгм-:- ¡пмсль/г сыр. веса; в изелиго?гнкск сердце морской свинки при различных инотрсппкх боздояствиял

воздействие и АС .ЦГКФ

контроль 74 100 6. 1010. 74

гас;,. 5мин I 5. 59гО. 46

изадрин Iнк. гмин гт 129 5. 5210. 54

изадрин ; гнин . 46 " 154 13. ЕЧИ. 62

милринон :омкм. 5мик

♦нзздгин 7и". гмин 1 44 14. 00??.. го

вера па мил ^н . 1 5уин

♦изадрин 5ни. гмин ч: 90 17. 79:2. с е

вега.-амил зонм. ¡'мин

♦изадрин зенк. гмин 49 94 17. 99*2. го

тог. гмкм. гонин

♦изадрин зон«, гмин 39 69 25, с&Л'е. в!

прспранолол '.мкм. 5мин

♦изадрин зоня, гмин 61 82 6. 28 Ю. 32

Примечание: в этой и последующих таблицах - п количество опытов в серии . зависимость содержания пГМФ з миокарде от инстропного состояния сердечной юдакы свидетельствует о роли иокнзнровак-

ного кальиия в регуляции уровня циклонуклеотида. судч по литературным данным, полученным ш vit.ro. ионизированный кальция может регулировать активность как гулнилатииклазы. так и ФосФодиэстеразы игис- 1сеаегина. 1937. ?еутсв и др. . 1993. Ткачук к др. .1976. но м а!.. 1969. с;и:г. ег а1.,19б5. Уеюьааг «г а1.. 1990, Уыге ег -а!.. 19823. Характер изменений урсрня игкф при использованных • воздействиях на внутшклеточный калюиевкй гомеостаз позволил предположить, что зависимссть содержания апм- от инотропного состояния сердца реализуется скорее в<:его посредством кальциевой регуляции активности са-ка.-.ьмодулин-эа-внсимоя Формы «осФоди^стеразы.

лля дальнейшего изучения механизмов изменения урозня цгу.ф в~ миокарде был проведен анализ динамики цикдснуилеотияа в течение одиночного цикла сокрашения-расслабления изолированного сердца в контроле и при различных инотропкых воздействиях, в контрольных условиях не было обнаружено каких-либо различия в концентрации .метаболита между отдельными точками сердечного никла (табл. г), в то же время, икотрог.ные воздействия, для которых характерно изменение внутриклеточного кэльниевого го-меостаэа. . сопровождались возникновением осцилляция ПГМФ. так. перфузия изолированных сердеа раствором с увеличенным вдвое

Таблица 2.

динамика «гта в течение цикла сокращения-расслабления изолированного сегта морской саоки в условиях ксштольноя перфузии и г.тг инотропных воздействиях.

точки сердечного цикла

1 2 3 * 5

КОНТРОЛЬ б. 35+1. 19 5.50»г. ад б. 5611. £9 5. 1541.60 6. 6911. 65

п 14' 15 15 15 15

4 км саси Ч. 3910.67« б. вдго! 71 4. 3210. 87* 6. 5111.05 7. 63*0. 92

п 9 8 6 9 6

изадим 1НН 3. 02Ю. 99 б. 69 10. 31 % е9!0. 50 6. 7811. 11 5. 2311.61

п 9 8 9 8 7

юадрин 15нМ 14. 3614. 66 16. 2512. 66 12. 27*2. 55 7.0413. 34* 15. 9013. 27

п 10 10 И 6 8

ПРОЕРаНОЛОЛ 1№<И

♦изапгда зонм г 05*0. ад б. 5610. 50« 5. 2510.13 6. ЮН. 38« 7. 2510.75»

п 11 13 16 10 6

обозначения показывают значимо различаться величины ал»

по о'кх^кя-о: * - ко г-й точке (р<о. 05)

<. - з-й точке (р<0,05). ♦ - к 5-й точке <р<0.05)

содержанием Хлорида кальция приводила к появлению осцилляции ииклонуклеотида в у.од« одиночного сердечного цикла с максимумом его содержания в период расслабления и минимумом, приходящимся на пик изотонического сокращения

изадрик в .онцентраиии 1 ни не вызывал значительных изменении метаболита, тогда как увеличение дозы препарата до ни сопровождалось появлением- осахляясиА. причем макгнм'/м и гг.* при данном воздействии'приходился на период пика скорости развития сокращения, з минимум - на качало процесса расслабления, следует заметить, что предварительное введение в перфузионный раствор бета-блокатора пропранолола не только эффективно блокировало влияние последующего добавления изадрина на уровень паи* и сократительную активность сердца, но и устраняло его влияние на динамику цгк* (табл. 2). При этом характер изменении уровня ииклонуклеотида в ходе сегг.о"п"го цикла бт:п .им логичен наблюдаемому в с«::н с пс-гоузией сердец пних-калькис-е:::' раствором. Учитывая, что- в условиях ол-оклди иАК-:--злвноп:;:,.-; процессов в сердие пю-пганололом г-еалнзовалаоь преимупн- ;т7<'.-:::-:о к^льиий - зависимая регуляция миокарда. можно заклк-чить. что возник:-:?:::-,:!; осцилляция аг:::- г.':-. инотгопнпх ро^лей-тгнях '-рч-зано с изменением динамики кальция в клетках.

В дальнейшем кы анализировали динамику агк* в серди.;::, активируемых изадр-ином на Фоне различных инотропных воздс-п-ствия (табл. 3). Бета-агонпст в данных ситуациях использовался для активации системы пак*, это было связано с необходимость» решения поставленной нами задачи изучения возможней роли иг;:* в Формировании сократительного ответа сердца, а как известно из литературных источников, большинство э: :-ектов игк* реализуется посредством регуляции либо непосредственно уровня пак*. либо отдельных процессов, им регулируемы:: гсирго!еи 1 сч а1. , 1987, гмзеьюетег а1.. 1967. 1959. ногоипг. У1ко»га4. 1983. 1964. гигаопз <н аь.19во. иаыег ег а;.. ¡990. его .

31а Фоне блокатора медленных потешшалзарисимых калыню-вых каналов сарколеммы введение изадрина также сопровождалось развитием осцилляции игл* а течение одиночного сердечного цикла. Характерной особенность»-динамики чиклонуклеотида в этих условиях был сдвиг его максимума вправо, то есть, наибольшее содержание дгк* приходилось на пик изотонического сокращения, тогда как минимум по-прежнему определялся в период начала расслабления. Необходимо отметить, что динамика циклокуклеоти-да была одинакова при использовании двух различных концентрации верапанила. при действии ингибитора кальмодулина т*п или ингибитора цам*-специфичной фдэ-ш милринона добавление изадрина не вызывало появления осцилляция (табл. 3). эти результа-

- и -

таблица 3.

шиш шменпкшии ттн> (пмоль/г сыр. веса. н 1 ш) в течеше сердечного никла изолированного сердца морской свинки, при дейстам изадгина на ч'оне друпи инотропных агентов

воздействие тсчга сердечного цикла.

1 2 3 5

миллион 10МС5

■»•.вакрин 71 и 13. 531&. 02 7. 7212. 67 11. 1013. зд 15. 181«Ьв2 14. 10*3. 17

п в 7 7 7 б

крзпамил. 151« * *

ПОЗЛИ 31 15131 1Т. 5б1Ъ 62 19. ОТ13.74 20. 9012. 73 10. 3913. ОТ 16. 2815. 93

п 8 9 7 а

верапамил зонн ♦ ♦

♦изадим ЗОкМ 17.01*5. 25 19. ВТ 15. 22 23. <Ю14. 17 10. £013. 40 18. ЗОН. 08

п И 10 в 7 9

теп ■

+изатам зокл 20. 2017. 98 15. 4318. 37 32. ТШ2.9 29. 73ИО. в 29. 40110.9

п е 9 9 в б

♦ - обозначены достоверно отличаишеся велдешны в данных точках, р<0.05

ты подчеркивают важную роль фосфодиэстераз в регуляции уровня цгиф б течение одиночного цикла сокрашения-расслабления. по-видимому, основное значение имеет активность са-ки-зависимой -1'ДЭ. способной реагировать на изменения уровня ионизированного кальция в миоплазме кардиомиоцитов в коде кагдиоиикла.

Анализируя характер изменений концентрации дгиф в миокарде при различных инотропных воздействиях, можно, на наш взгляд, заключить следующее: специфический ответ системы игиф па действие инотропных агентов, изменявших уровень ионизированного кальния. обеспечивается гидролизушими Ферментами, гу-анплатпиклаза же, по-видимому, ответственна за неспешкическую реакцию содержания игнф при сдвиге окислительного потенциала клеток.

несомненно, подобное заключение не является исчерпываю-п,-«. поскольку и гц может обеспечивать специфический инотроп-ответ системы цгкф ка действие некоторых агентов, в част-¡;:ст;:, препаратов класса китросоединений. кроме того, не сле-исключать возможности активации гц при значительном уве~ личоннн уровня ионизированного кальиия в миокарде, подо-онкй ::е:-:анпзь может, очевидно, участвовать в увеличении содержания при действии 15 им изадрина.

- 12 -

При анализе осцилляция иГКФ на «он© различных инотропных воздействия можно выделить два максимума, характерных для его динамики в течение одиночного цикла сокрашения-расслабления (рис. 2>. Первый соответствует fio времени пику скорости развития сокращения и отмечен в наибольшей степени при действии изадрина в концентрации 15 ни. а в серий с действием изадрина на Фоне верапаиила этот максимум сдвинут вправо, второй приходится на пемюд расслабления и хорошо выражен в сериях с перфузией сердец гиперкальциевым раствором или пропрэнололон. то есть в условиях са-зависимой регуляции метаболизма сердца.

100, %

¡ м г

20 Oí

юо

«пм,

rl

U,

д.

JP

JL

-1, 1 i

ПрОП,)Лн&ЛО\ int/t Со'*

1

1

рис.2. динамика цгкф в течение одиночного цикла сокгаше-кия-расслабления изолированного сердца при действии: пропрано-лола <1 мкН) и изадрина (30 нм>. повышенной знеклеточной концентрации кальция (4 ни). изадрина (15 кН). зерапамила (15 ню и изадрина (30 нш. На данном рисунке вверху- схематическое изображение кривых сокращения, внизу - уровень вито в пяти точках сердечного цикла при соответствующих инотропных воздействиях. цифрами 1-5 обозначены точки сердечного цикла,' в которых проводили замораживание: звездочками (■*) показаны максимумы цгнф в сериях, достоверно отличавшиеся от минимальных значений (р<о. 05)

- 15 -

следует отметить, что для последних воздействии (пропра-иолол и гиперкальииевкй раствор) также было характерно увеличение уровня цш в период максимума первой производной аналогично изадрин-активируемым сердиам. однако статистически этот прирост был недостоверен. б то же время, при действии бе-та-агониста как одного, так и на Фоне верапамила отмечалось выраженное (хотя статистически не значимое) повышение содержания никлонуклеотида в кокие сердечного цикла, в период кониа расслабления {рис. Z). то есть, в целом, для осцилляция пгкф характерно сушествование двух максимумов, что. по-видимому, является отражением динамики ионизированного кальния в клрдио-миопитах.

Таким образом, в миокарде млекопитающих, наряду с осипл-ляииями ионизированного кальния и цапф, зарегистрированными ранее, наблюдается осаилляиии в течение одиночного сердечного цикла епе одного вторичного посредника - циклического гуако-зинмоноФосФата. Изменения содержания кгкф з сердце является, очевидно. кальций-зависимыми. кальциевая регуляция уровня нпк-лонуклеотида реализуется преимущественно -посредством изменения активности са-км-зависимой одз-i. по-видимому. ФосФодиэстераз-а пГНФ более чувствительна к изменениям внутриклеточного уровня ионизированного кальния по сравнению с гуанилатииклазой.

Роль цГК® в иногропном ответе сердца, Возиожность участка .

осцилляций цАНФ и цГМФ в регуляции одиночного сокращения.

Результата проведенных исследований показывают, что су-пествушие в миокарде механизмы регуляции содержания unw обеспечивают связь его изменении с инотрог.ным состоянием сердечной мышцы.! Иначе говоря, с этой точки зрения, ппк- способен выполнять мессенджернэто функцию при делом ряде инотропкых воздействий. влияющих на динамику ионизированного кальния. однако. закономерен вопрос: на регулянию каких именно процессов. функций клетки направлено действие цгнф. каково значение изменений содержания никлонуклеотида в сократительной активности и нетаболизме ниокарда. ответу на этот вопрос посвязека вторая часть работы, как уже говорилось выше, судя по литературным данным, полученным в основном m. vitro, большинство эффектов кгмф направлено на регуляцию системы цапф, так, в ряде работ было показано, что нгн$ может регулировать ряд цапф-зависимых процессов в условиях m vitro: кальаиезып ток через медленные потенциалзависимые каналы сарколеммы, сродство тропонинового комплекса к кальцию. - активность фосфодиэстераз п и in типа ГВНаНу et al..i9B5. Horowitz et al..i9S3. Fischnwister ei ai..l967. Levi et ai..i9e9. simoons et a;..iss5. silver.1969.

______ - - - И --------

Vahier et ai., 5969. vmeerad. i9ssj. поэтому изучение роли urns проводилось в условиях активации изолированных сердец изадринон.

Была проанализирована взаимосвязь изменений цгкф в течение одиночного аикла сокрашения-расслабления с подобными изменениями «аиф. Оказалось, что изадрин вызывал появление значительных колебаний камф в ходе кардионикла только 8 тех сериях, где были обнаружены ссаилляпии пгнф; а именно, при действии бета-блокатэра аропранолола и в присутствии антагониста кальциевых каналов верапамила (табл. 4». Ранее ухе говорилось о том. что нгмф регулирует активность ФосФодиэстераз «амф in vitro, а также, по данным некоторых авторов, может влиять на уровень цанф in vivo (Silver. 1989. Simona et al.. 19881. в связи с этим закономерно было предположение: не связано ли

Таблица ft

Изменения концентрации (нмолъ/г сын веса) в течение цикла сокракния-расслабления серша морской сеинюь активируемого изадрином на «оке различных инотропкьк воздейстнс*

воздействие точки сердечного пикла

1 2 3 4 5

изадрин 15нм 1. 98±0. 50 г. 35 to. 48 г. 5010. 64 г. i3ta48 1.92±0. 51

п 9 10 п 8 8

мигсшнон 1СМИК

♦изадрин тнм 1. 89+0. 45 1, 49t0. 47 1. 53*0. 29 1.67to. 23 2.27*0.45

п 8 8 Ь 8 т

верзшнил 15НИ « «

♦гоадии 15нМ 1. T9íO. 43 1. 3810. 31 1. 51 íO. 27 2.2010.42 1.09Ю. 1С

г> 9 * 9 8 7 8

верапамип зонм • ♦. И

♦изадгин зон« i. тг-о. 37 1. 53±0. 37 a-79tO. 10 абв±а is агаю.оз

п и И 9 8 10

ТОТ 2MW1

♦изадрин зсш 0. 76*0. 11 i. íeta гг 0. 89ta 13 1. OOíO. 18 а 6510. 14

п 8 8 9 8 б

пропрэнолол 1ю <И ♦♦ ♦ ♦♦

♦изаддм зонн 0. 55tO. ог 0. 65*0. 05 0.51 tO. 04 a 55i0. Об a46iao4

п 11 13 18 10 8

обозначены значения, достоверно различающее я. р<о. 05: ■ - между собой

♦ - по сгавнегаю с 1-я тс««ой данной сени ♦♦ - то же по сравнен» со 2-я точкой

возникновение осцилляция цапф с регулирующим воздействием ВГКФ. Ведь как било показано ранее кгаизё" на сердце собаки, изменения содержания иГМФ в течение одиночного сердечного цикла. хотя и незначительные, в целом происходят в пготивоФазе изменениям оАМФ [Krause et al., 19893. иы также наблюдали подобные взаимоотношения аиклонуклестидов в' миокарде морской свинки в условиях блокады бета-адреноревдпторов.

Использование статистических методов анализа позволило обнаружить взаимосвязь изменений ииклонуклеотидов только при действии иэадрииа на Фоне неизмененного кальциевого гомеостаза миокарда. Уравнение регрессии нгиф на намф имело вид Y -- 1.50 ♦ 0. 05Х(р<0. 05). При введении же инотропиых агентов эта связь не! выла статистически значимой.

В миокарде, как известно, существует ряд внутриклеточных регуляторов уровня какф, среди которых выделяют как наиболее важные - ионы кальсия и циклический гнф. вероятно, при активации сердец иэадринон на Фоне неизмененного метаболизма кальция оба этих регулятора реализуют свое действие в отнесении нам*. причем, если кальция, по-видимому, в основном влияет на активность аденилатаиклазы, то игнф - «осФодиэстеразы. в присутствии же других инотролнкх агентов изменение динамики ионизированного кальция и. как результат, изменение взаимодействия посредников могут нарушать существующие в обычных условиях взаимосвязи. То есть, при сдвиге инотропного статуса клетки основным (более мойным по сравнению с ЦГКФ) регулятором уровня «аиф становятся ионы кальпия.

Также была предпринята попытка выяснить возможность участия осцилляция вГНФ в Формировании сократительной реакции сердва ка инстропкке воздействия. До настоящего времени в литературе нет однозначного мнения относительно участия осиилля-пий в быстрой регуляции работы сердца. Поскольку игнф. вероятно. выполняет в миокарде мессенджерну» функцию, следовательно, его действие может проявляться изменением активности или скорости каких-либо внутриклеточных процессов в ходе сердечного яихла.

В литературе имеются данные в пользу участия осцилляция saйф в поцикловол регуляции функции сердца. Так. е. -g. Krause показал, что активность некоторых са- и кайф-зависимых Ферментов (кинаэа А. пируватдегидрогеназа. ФосФоламбан) изменяется на протяжении систолы-диастолы сердаа [Krause et ai..i9ö9J. в работе Б.И.Лаптева была показана связь между изменениями оспйяеяцкй • «акф и сократительной функцией миокарда [Лап-тез. 199 П.

с другой стороны, анализ экспериментальных данных показы-

зает. что цамф - зависимая регуляция внутриклеточных процессов посредством ФссФорилированич-де'ЮсФорилирования является относи. г.-льно медленней и реализуется в течение десятков секунд или даже минут [1лпяепагтле». а1.. 1985 3. значение игиф-зависи-мого 4'ОСФорилйРоэания-де-:-ос<-оРйлирования в обеспечении циклической л.чотропнои реакции сердечной мышцы на воздействий а настоящее время также не ясно, однако, в последние годы появились ссобшения о. возможности осуществления быстрой регуляаии 1не вклгчаксеа »осФорклирсвание» Ряда внутриклеточных реакций, например, прямая регуляпич циклическим гиф. а также, возможно, и са-тока через плазматические мембраны клеток [Солнце-

ва. 1991}.

нами для изучения возможного участия осцилляция пиклонук-лс-стидов в регуляции функции сердечной мьшшы был проведен анализ корреляционных отношения между параметрами сократительной функции и соответствующими величинами концентрация агяФ'и данф и их отношением в сердце при отдельных инотропных воздействиях. коэффициент линеяноп корреляции (иху) рассчитывали для каждой из пяти точек в течение сердечного цикла, характеризующих процесс сокрапенич сердца при данном воздействии, а также для совокупности этих точек, в таблице 5 суммированы результаты проведенного анализа, в данной таблице приведены те параметры сократительной функции, для которых выявлена достоверная корреляция с уровнем ;:Г1»(ДАКФ) в данной точке и соответствующее значение кху. Прочерк в какой-либо из колонок означает, что при этом воздействии для данной точки не обнаружена корреляция метаболита ни с одним из показателей сократимости.

при интерпретации результатов корреляционного анализа мы рассматривали два возможных, на наш взгляд, варианта: 1. один и тот же параметр сокраиения или расслабления должен коррелире вать с уровнем цамф или цгко в одной и ток же точке по крзй-кей мере з нескольких сериях, это означало бы. что мессенджер в данный момент времени реализует свое регулирующее воздействие на данный процесс. При этом не имеет значения, макси-м.;льн; или минимально значение ииклокуклеотида в этой точке, г. пагаметги сократительной функции должны коррелировать с максимальным уровнем ца^? или агКФ при каждом воздействии или хотя бц при нескольких." это основано на предположении, что связывание циклического нуклеотида с его эффектором пропорционально уровню нуклеотида и. очевидно, при увеличении содержания или иггл регулируемый процесс будет активироваться и корреляция будет положительной, либо ингибирозаться с соот-2етст1'У.спим отрицательным коэффициентом корреляции., при снижении же уровня циклонуклеотида должны наблюдаться обратные от-

ношения.

Таблица 5.

Величины статастачесю! значимых коэффициентов корголяиш между параметрами сокраиггельноп «лекции и уровнем ю:. ц/го

воздепстше В Г И Ф Ц А « Ф

1 - г з 4 5 1 г 3 4 5

изадни 15)31 - ссп же - ис

0. 76-0. 80 0. 86

И?

. -0. в7

НИЛГМНОН 10КМ1 - ■ - к - -

изадпи 7нн 0. 88

«X

0. 64

ГС?

0. 88

верапамип 15Ш ОСП - ССП -

♦иэадии 15нм 0. 7 ч -0. 78 0. 62

гс?

0. 76

ис

0. во

И? •

0.89

верапамип зонм - мз> - - - -

*изадгмн зонн О. 88

ГС

0.76

ИР

0.86

тиз гмин мх -

♦изади« зонн 0.72

- ОСП

олг -

пропранолол 1мкм - - - ОСП АС -

♦изадрин зони 0. 56 о. 67 :

ис

-0. 68

И?

-0. 78

Обобшая результаты корреляционного анализа, можно отме-

тить следующее: корреляция или* с параметрами сократимости отсутствовала при действии одного изадрина и появлялась при его действии на Фоне других инотропных соединений. Для игмф. так же как и для отношения игМФ/цАНФ 1е было выявлено какой-либо закон : :егной связи с параметрами сократительной функции. отсутствие закономерности в корреляционных отношениях н? г.-.-ззолило сделать с г :оэначный- вывод о возможности регуляции процессов сокращения и расслабления циклическими нуклеотидами в течение одиночного сердечного цикла, сложность интерпретации г.ри использованном подходе состоит в том. что роль циклических нуклестидоз в поцикловоя регуляции работы сердца оценивалась по таким показателям, как амплитуда сокращения и скоростные параметры. Неличины этих показателей зависят в значительной степени от уровня ионизированного кальция в миокарде, от предшествующего механического состояния мыааы и могут лиаь регулироваться циклическими нуклеотидами.

очевидно, возникновение осцилляции ииклонуклеотидов з сердце может быть связано с необходимостью точного и быстрого изменения среднего уровня метаболита, очевидно, именно подобное неравновесное состояние процессов синтеза и распада легче регулируется различными Факторами, а значит, быстрее реагирует на изменение вне- или внутриклеточных условии увеличением или снижением среднего /ровня метаболита. Поэтому- анализ роли цгкф в иногрог.ии миокарда следует, вероятно, основывать на изучении-изменения среднего уровня иГМФ.

В связи с этим, заслуживают внимания, на каш взгляд, изменения содержания цгя*. а также и цамф. в активируемых сердцах на Фоне антагонистов кальция. Было обнаружено, что блока-тор медленных кальциевых каналов сарколеммы верапамил доэоэа-висимо снижает рецептор-зависимый прирост уровня цакф в миокарде и увеличивает уровень агмФ в одинаковой степени при использовании двух концентраций препарата (рис. 3). То есть, верапамил сдвигает соотношение аиклонуклеотидов в сердие в пользу агкф. причем более значительно при действии 30 нм вера-памила.

При анализе данных сократительной Функции и уровней нук-леотидов в изолированных сердцах, активируемых изадрином на Фоне разных концентраций кальциевого блокатора. оказалось, что пги действии 15 нн препарата скорости сокращения и расслабления после добавления изадрика увеличивались в равной степени, тогда как в присутствии зо ни -кс? не отличалась от исходной величины, а мсс превышала ее на 50/. (рис. 3). Отсутствие люзит-ропного эффекта иза^рина на Фоне зо ни верапамила. вероятно, связано с отсутствием прироста «акф в сердцах. Одновременно.

нмоль/г 2.01

1.0

%

150. 10050

дШ

--

цОД

Л

- 19 -и№»

пмоль/г

Рис. 3. содержание' панф 20.0 и иГМФ. параметры сократительной функции изолирсванного сердиа морской свинки -10.0 при действии

ГТ.И - 15 нН вераг.анила и 15 ни изадгина Е223 - зо ни верапамила и 30 ни изадрина • - обозначены достоверно раэличашиеся средние (р*0. 05)

АС МСС МСР

повышение содержания цгкф и. вероятно, провоцируемое им увеличение чувствительности тропоншового комплекса к кальил». могло быть причиной, с одной стороны, дальнейшего ухудшения процесса расслабления и. с другой. - роста скорости сокращения. То есть, сдвиг соотношения ииклонуклеотидов приводит к измене-кию соотношения скоростных параметров сердца. что выражается изменением формы сократительного ответа, в то же время, амплитуда сокращения оставалась на прежнем уровне, то есть, вероятно. изменения насосной функции сердца будут при этом не столь значительными, таким образом, вероятно, одним из механизмов действия верапамила является изменение соотношения циклонукле-отидов за счет снижения рецептор-зависимого прироста цаяф и увеличения содержания пгмф.

Следует заметить, что подобный сдвиг соотношения цикло-нуклеотидов в активируемых изадрином сердцах наблюдался и в присутствии внутриклеточного кальциевого антагониста трифтор-перазина. вероятно, это также могло быть причиной большего прироста мсс при добавлении бета-агокиста по сравнению с другими параметрами сократимости. То есть, явление изменения соотношения виклонуклеотидов может быть характерной особенностью Г.51СТВИЯ антагонистов кальиия как вне-, так и внутриклеточных.

таким образом, анализ изменений сгнф ,и-дакф в изадрин-ак-

тивируекых сердцах на Фоне различных инотролных воздействия позволил сделать следующее заключение. Осцилляции ¿ГИФ. также как и цапф, по-видимому, не принимают участия в поиикловои регуляции функции сердца, очевидно, их существование связано с необходимость» быстрой, и точной регуляции среднего уровня пик-лонуклеотидоз. обеспечивающего реализацию эффектов посредников. Изменения среднего уровня циклических нуклеотидов, а также их соотношения является важным Фактором, определяющим характер реакции сердечной мышцы на инотропное воздействие, при определенных условиях цгмф. очевидно, может выполнять модулирующую функцию по отношению к нАКФ-зависимой регуляции.

выводы

1. осцилляции цгнф в течение одиночного цикла сокрашения-расслабления изолированного сердпа морской свинки, сокращавшегося в изотоническом режиме, возникают на Фон? перфузии проп-ранололом или гиперкальииевым раствором, для действия которых характерна преимущественная са-эависимая регуляния внутриклеточного метаболизма.

2. влокатор кальциевых каналов сарколеммы верапамил не влияет на осцилляции ииклонуклеотида в течение цикла сокраше-ниярасслабления в сердцах, активируемых изадрином. ингибитор кальмодулина ТФП или ингибитор 4>яэ милринон устраняют изад-рин-индуцируемые осцилляции в ходе одиночного сердечного цикла.

3. изменения содержания пгт :в сердце, в том числе на протяжении цикла сокрашения-расслабления. являются кальпип-зависимыми. кальциевая регуляция уровня ииклонуклеотида. вероятно. реализуется преимущественно посредством изменения активности са-кальмодулин-зависимой ФосФодиэстеразы.

осцилляции цгнф и ианф в течение одиночного цикла сокрашения-расслабления изолированных сердец, активируемых изадрином. не связаны друг с другом и не участвуют в поникловой регуляции сократительной активности сердечной мыпши.

5. Антагонист кальция верапамил изменяет соотношение пик-лонуклеотидов в активируемых изадрином сердцах, снижая реиеп-торзависимый прирост цаиф и увеличивая содержание иГНФ. Изменения среднего уровня циклических нуклеотидов, а также их соотношения являются одним из факторов, определяющих характер реакции сердечной мышцы на инотропное воздействие.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. влияние триФторперазина на содержание гликогена и креатин-ФосФата в ткани миокарда крысы // Обмен кальция в физиологии и патологии сердечно-сосудистой системы. Тез. докл. всесоюз.

конФ. - Томск. 1988.- с. 166-167 (соавт. в. д. прокопьеэа. ю. С. свирко. Б. та. Лаптев».

Е. влияние обзияана и Финоптина на содержание макроэргических Фосфатов в ходе сердечного никла // Акт. вопр. кли». и тео-рет. медииинк. тез. докл. X научн. -практ. конФ. кол. ученых. - Тонек. 1989. - С. 5-6 (соавт. Б.И.Лаптев, с. А. Афанасьев. Е. ю. Талаева).

3. Влияние внеклеточного Са* + на изменение сократительной функции и концентрации наиф сердца морской свинки при активации бета-адреноренепторов О/ синтез и исследование биол. актив, соед. Тез. докл. ю конФ. мол. ученых. АН Латв. сср. Ин-т орг. синт. - Рига. 1989. - С. 109 (соавт. С.А.Афанасьев. е. д. Алексеева).

4. особенности изменения параметров сократительной функции изолированного сердца морской свинки при действии излдрты и милринона // Поиск новых лек. средств и их испол. в клинике. Теэ. докл. науч. -практ. кокф. - Чита. 1990. - с. 129 - 130. (соавт. С. А.Афанасьев. Е. ю. талаева. к. й. Лаптев).

5. роль кальций-зависимой регуляции обмена намф в сократительной функции миокарда // Акт. вопр. патоФизиол. в совр. медицине. тез. докл. респ. научн. конФ, - Алма-Ата. 1990. - с. ,86 (соавт. Н.И.Лаптев. С.А.Афанасьев. Е. ¡0. Талаева).

6. действие обзидана. Финоптина и са** на содержание цайф в процессе сокрашения-расслабления изолированного сердца морской свинки, активированного изадрином // укр. биохим. журн. - 1990. - т. бг. N. 3. - С. 111-П5 (соавт. Б. И. Лаптев. в. д. прокопьева. с. а. Афанасьев, н. и. кених. ¡о. а. травкоа).

7. действие Финоптина на динамику цамф в изолированном сердце морской свинки в процессе его сокрашения-расслабления // Бюлл. эксперим. биол. мед. - 1990. - N. 11. - С. 455 - 457 (соавт. Б.И.Лаптев. С.А.Афанасьев. Е. ю. талаева).

8. влияние бета-агониста на изолированное сердце морской свинки в условиях ишемии // Фармакол. коррекция гипокс. состояний. Матер. II Всесоюз. конФ. - Гродно. 1991. - с. 193 - 194 (соавт. с. А. Афанасьев).

9. calcium , antagonist finoptme changes beta-mediated cyclomicleotlde oscillations during cardiac cycle // calcium antagonists in cardiovascular Care, second Internat. 5уер. -Basel, 1991 (coworh. S. A. Afanasyev. В. I. Laptev).

10. Роль взаимодействия цгнф и цамф в инотропном ответе изолированного сердпа морской свинки // современные вопросы экспериментальной и клинической кардиологии. - Томск, i 992.-Вып. 1.-е. ю-11.