Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм действия окиси азота на кальциевые и калиевые каналы электровозбудимой мембраны гладкомышечных клеток

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Механизм действия окиси азота на кальциевые и калиевые каналы электровозбудимой мембраны гладкомышечных клеток"

РГ 6 од

1 6 ЦЕН 1955

1 и н НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

На правах рукопису

ЗИМА Олексій Валентинович

МЕХАНІЗМ ДІЇ ОКИСУ АЗОТУ НА КАЛЬЦІЄВІ ТА КАЛІЄВІ КАНАЛИ ЕЛЕКТРОЗБУДЛИВОЇ МЕМБРАНИ ГЛАДЕНЬКОМ’ЯЗОВИХ КЛІТИН

03.00.05 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня каїщидата біологічних наук

КИЇВ - 1996

Дисертація є рукопис.

Роботу виконано у відділі нервово-м’язової фізіології Інституту

фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік Шуба Михайло Федорович

Офіційні опоненти: академік Магура Ігор Сільвестрович,

кандидат біологічних наук Лук’янець Олена Олександрівна. Провідна установа: Інститут фізіології Національного університету ім.Тараса Шевченка.

Захист відбудеться “ р. на засіданні

Спеціалізованої ради Д-01.13.01 при Інституті фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою:

252004, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

Автореферат розісланий “-2-Ь ” 1996 р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук

Сорокіна-Маріна 3.0.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність проблеми. Встановлення факту про те, що клітини живих організмів здатні синтезувати окис азоту (N0), обумовило великий інтерес дослідників, оскільки, як згодом пияпилось, ней неорганічний газ бере участь, як регуляторна і сигнальна молекула, у різноманітних біологічних процесах. До його фізіологічних функцій відносять нейропередачу в різних ділянках нервової системи, контроль тонусу кровоносних судин і клітинної адгезії, регуляцію імунних відповідей та інші.

Утворення NO в ендотеліальних клітинах і деяких нейронах з L-аргініну каталізується родиною специфічних ферментів - NO-синтаз (Palmer 19S8, Moncada 1991, Calver 1993). Основним “рецептором” для N0 в гладеньком’язозих клітинах (ГМК) є залізо активного центру гуанілатциклази (Rapoport 1983, Murad 1986, Moncada 1991). Внаслідок активації цього ферменту відбувається підвищення рівня циклічного 3’,5-

гуанозшімонофосфату (цГМФ) в клітині. Припускається, що в основі NO/цГМФ-залежного пригнічення скорочення гладеньких м’язів лежить зменшення внутрішньоклітинної концентрації Са2+ ([Са2+]*) внаслідок підсилення активного мембранного транспорту цих іонів та зниження чутливості скоротливого апарату до Са2+ (Morgan 1984, Nishimura 1989, Magliola 1990, McCaniel 1992). Проте до сьогодні відсутні переконливі дані про роль іонних (головним чином кальцієвих) каналів в розслаблюючій дії N0 на гладенькі м’язи. Хоча добре відомо (Шуба 1981, Somlyo 1989), що активація скорочення ГМК обумовлена збудженням їх плазматичної мембрани і збільшенням входу Са2+ через потенціалкеровані Са2+ канали.

Більшість досліджень, в яких вивчався ефект N0 на збудження і скорочення гладеньких м’язів, виконано на багатоклітинних препаратах з

використанням методу сахарозного містка і мікроелектродної техніки. Але ці методи мають ряд обмежень. Зокрема, вони не дають відповіді на запитання про те, які внутрішньоклітинні молекулярні механізми зміни іонної провідності мембрани ГМК. На наш погляд, найбільш адекватним підходом для вивчення механізмів дії N0 на збудження гладеньких м’язів є дослідження іонних каналів мембрани ізольованої ГМК за допомогою методу фіксації потенціалу (“patch-clamp”).

Мста і завдання роботи. Мета роботи - дослідити можливі механізми дії N0 на іонні канали електрозбудливої мембрани ГМК taenia coli і мезентеріальної артерії морської свинки.

Для досягненя цієї мети були поставлені такі завдання:

1. Розробити методику виділення функціонально повноцінних ГМК taenia coli і мезентеріальної артерії морської свинки та застосувати до них метод фіксації потенціалу “patch-clamp”.

2. Дослідити дію N0 на високопороговий Са2+ струм L-типу Са2+ каналів мембрани ГМК taenia coli і мезентеріальної артерії морської свинки.

3. Визначити можливі внутрішньоклітинні молекулярні механізми дії N0 на Са2+ струм мембрани ГМК.

4. Дослідити дію NO на К+ канали мембрани ГМК taenia coli морської свинки. Наукова новизна роботи. 1. Вперше в дослідах на поодиноких ізольованих ГМК taenia coli і мезентеріальної артерії морської свинки детально досліджено механізм дії N0, що вивільнюється з нітрогліцерину внутрішньоклітинно, на потенціалкеровані Са2+ канали. Показано, що NO інгібує високопороговий Са2+ струм L-типу Са2+ каналів завдяки активації цГМФ-залежної протеїнкінази.

з

2. Виявлено, що NO вивільнюваний в позаклітинне середовище (донор NO нігропрусид натрію), в залежності від концентрації викликає цГМФ-залежне інгібування або цГМФ-незалсжну активацію Са2+ струму струму L-типу Са2+ каналів мембрани ГМК taenia coli морської свинки.

3. Показано, що N0 вивільнюваний з обидвох донорів викликав тільки цГМФ-залежне інгібування високопорогового Са2+ струму L-типу Са2+ каналів мембрани ГМК мезентеріальноі артерії морської свинки.

4. Встановлено, шо NO вивільнюваний з обидвох донорів викликав цГМФ-залежне зростання активності Са2+-залежних К+ каналів великої провідності мембрани ГМК taenia coli морської свинки. Цей ефект N0 не вимагав вивільнення Са2+ із внутрішньоклітинних депо або надходження Са2+ до ГМК з позаклітинного середовища.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані результати досліджень дозволяють зробити припущення про існування двох механізмів NO-залежного пригнічення скорочення гладеньких м’язів, викликаного деполяризацією клітинної мембрани. Один із них пов’язаний з інгібуванням входу Са2+ через L-тии Са2+ каналів мембрани ГМК, другий - з активацією Са2+-залежних К+ каналів, що буде приводити до гіперполяризації мембрани ГМК і як наслідок цього - до інактивації входу Са2+ до клітини.

З'ясування молекулярних механізмів дії донорів N0 (нітрогліцерину і нітропрусиду натрію) має не тільки фундаментальне, але і прикладне значення в розумінні синтезу нового класу нітросполук з заданою вазодилаторною дією та розробки більш ефективних методів лікування цими сполуками судинних захворювань.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались і обговорювались: на міжнародному симпозіумі “Biology of Nitric Oxide” (Кьольн, Німеччина,

1993), на 1-ому з’їзді Українського біофізичного товариства (Київ, 1994), на ХІІ-ому міжнародному фармакологічному коЕігресі (Монреаль, Канада, 1994), на щорічній конференції Англійського фізіологічного товариства (Оксфорд, Великобританія, 1995), на 1-ому конгресі FEPS (Маастріхт, Нідерланди, 1995), на 40-ому конгресі Американського біофізичного товариства (Балтімор, СІЛА, 1996), на семінарах Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАНУ (Київ, 1993, 1994, 1995). За матеріалами роботи опубліковано 8 статей.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку літератури з 233 найменувань. Робота викладена на 145 сторінках та ілюстрована 32 малюнками.

Декларація конкретного особистого внеску дисертанта в розробку наукових результатів. 1. Розроблена методика виділення функціонально повноцінних ГМК taenia coli і мезентеріальної артерії морської свинки.

2. Досліджена дія N0 на вксокопороговий Са2+ струм L-типу Са2+ каналів мембрани ГМК taenia coli і мезентеріальної артерії морської свинки.

3. Досліджена дія NO на К4 канали мембрани ГМК taenia coli морської свинки.

МЕТОДИКА

Дослідження проводились на свіжоізольованих поодиноких ГМК taenia coli і мезентеріальної артерії морської свинки. Для виділення ГМК, смужку з taenia coli клали в безкальцієвий розчин Кребса, в якому була колагеназа (тип XI) 0.2% і бичачий сироватковий альбумін 0.3%. Ферментативна обробка тканини тривала 30-40 хв при температурі 34°С. Для отримання ізольованих клітин тканина розрізувалась на дрібні шматочки і багаторазово пропускалась через отвір пастерівської піпетки в безкальцієвому розчині Кребса. Процедура

виділення ГМК з мезентеріальноі артерії суттєво не відрізнялась від наведеної вище для taenia coli. Тканина іккубупалась на протязі 50-60 хв в безкальцієвому розчині Кребса, який містив колагеназу (тип XI) 0.2%, еластазу 0.05% і бичачий сироватковий альбумін 0.3%.

Дослідження трансмембранних іонних струмів здійснювалось за допомогою методу фіксації потенціалу - “patch-clamp” в конфігурації “wholecell” (НашіИ 1981). Мікропілетки виготовляли з м’якого молібденового скла. Опір піпеток складав 2-3 МОм, коли вони були заповнені піпеточним розчином. Зовнішній розчин мав такий склад (мМ/л): NaCl 135; CsCl 6; СаС12 2.5; MgCl2 1.2; TEA 5; d-глюкоза 5; HEPES 10; pH 7.4 (NaOH). Піпеточний розчин містив (мМ/л): CsCl 140;MgSC>4 2;Ка2АТФ 2;Na2lT® 0.2;EGTA

0.5;HEPES 10; pH7.3 (CsOH).

Дослідження струмів поодиноких іонних каналів здійснювалось методом patch-damp в конфігураціях “cell-attached”, “inside-out” і “outside-out”. Мікроиіпетки виготовляли з тонкостінного боросилікатного скла. Опір піпеток складав 5 МОм, коли вони були заповнені піпеточним розчином. Для дослідження К+ каналів використовувався симетричний розчин такого складу (мМ/л): КС1 140; СаС12 0.1; EGTA 0.6; HEPES 10; рН7.3 (КОН); рСа 7. В дослідженнях Са2+-каИалів піпеточний розчин містив (мМ/л): ВаС12 0.1; TEA 30; ВауК 0.0001; HEPES 10; pH 7.3 (КОН).

Підсилення іонних струмів здійснювалось за допомогою підсилювача PATCH-CLAMP L/M ЕРС-5 з опором зворотнього зв’язку перетворювача струм-наируга 10 ГОм. Сигнал з виходу перетворювача надходив через фільтр низьких частот (частота зрізу 1 кГц) на аналого-цифровий перетворювач і далі в комп’ютер ІВМ PC/AT. Дані аналізувались за допомогою програм “Screen”, “DataseF, “pClamp 5.5”. Для аналізу активності поодиноких іонних каналів

використовувались параметри “імовірність відкритого стану каналу (Р0)”-nP0-CEto)/Г та “середній час відкритого стану каналу (то)”: to=(£to)/N, де и -число каналів під мікропіпеткою, tg - час відкритого стану канала, Т -загальний час реєстрації активності каналів, N - число відкривань каналу.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Дія окису азоту на Са2'ь струм мембрани гладеньком’язових клітин taenia coli морської свишш Проведені дослідження показали, що в мембрані ГМК taenia coli морської свинки вхідний Са2+ струм (їси) переноситься через високопорогові Са2+ канали L-типу. Це підтверджують наступні факти: 1) струм мав поріг активації при -40...-ЗО мВ і максимум вольт-амперної характеристики при +10 мВ; 2) потенціал половинної інактивації струму становив -31 мВ; 3) провідність поодинокого кальцієвого каналу становила 27 пСм (носієм струму через Са2+ канал були іони Ва2+ 80мМ); 4) струм ефективно блокувався ніфедшііном (К<]=0.05 мкМ), відомим блокатором L-типу Са2+ каналів.

Як донор NO, використовували відомий вазодилатор нітрогліцерин (НГ). Виявлено, що НГ викликав дозо-залежне і зворотне інгібування Іса з концентрацією половинного інгібування (ІС50) 1 мкМ і максимальним ефектом 38% для 100 мкМ НГ (мал. 1,А). НГ блокував 1Са без зміни порогу активації і максимуму вольт-амперної характеристики струму (мал. 1,Б). НГ також не приводив до зсуву кривої стаціонарної інактивації /<> Отже дія НГ на Іса не була зв’язана зі зміною потенціалзалежних властивостей Са2+ каналу.

Аналіз активності поодиноких Са2+ каналів (конфігурація “cell-attached”) показав, що НГ викликає значне зменшення частоти відкривання Са2+ каналу, хоча амплітуда струму, що проходив через канал, не зазнавала зміни. Розрахунки показали, що імовірность відкритого стану Са2+ каналу

(пР0) зменшувалась в присутності НГ (100 мкМ) приблизно в 3 рази (мал.

1,В). НГ викликав інгібування Ва2+ струму (!/>„) подібне до того, яке спостерігається у випадку /<>■ Пригнічення Іцг. під впливом НГ було зворотнім і не залежало від рівня деиолярізації мембрани.

Як відомо, НГ зазнає біотрансформації в молекулу N0 усередині ГМК. Для перевірки, чи інгібуюча дія НГ на І£а пов'язана з позаклітинним виділенням N0, в зовнішній розчин додавався оксигемоглобін (50 мкМ), який специфічно зв’язує N0. Нами було встаношіено, що інгібуючий ефект

А

■і ——і

0.01 5-1 І 10 100 1000 Концентрация НГ (мкМ)

Ет(мВ)

В

контроль

НГ ЮОмкМ

Тт

Ж'

2пА

Г

Рис. 1. Інгібуюча дія нітрогліцерину (НГ) на Іс> мембрани гладеньком’язовнх хлітвн taenia coli морської свинки:

А - зміна Іса під дією НГ (1 і 100 мхМ) і крива доза-ефскт блокування Іса ПІД лісю НГ. ЕкСПерИМеНТаЛЬНІ ТОЧКИ ВІДПОВІДаЮТЬ ВІДНОСНОМУ ефеКТУ НГ (Іконтр-ІНгЛконтр)-Теоретична крива побудована за рівнянням Міхаеліса-Ментен (Е=Етах[НГ]/(1С5о+1НГ]) з ic50=l мкМ і £„^=38%. Б - вольт-амперні характеристики Іса в контролі (О) і при дії НГ (100 мкМ) (•). Підтримуваний потенціал -60 мВ. В - зміна активності Са2+ каналів при дії НГ (100 мкМ) (конфігурація “cell-attached”).

НГ (100 мкМ) на Іса, як в контрольних умовах (38%), так і при наявності оксигемоглобіну (35%), суттєво не відрізняється. Це свідчить на користь внутрішньоклітинного виділення N0 і викликаного ним інгібування струму.

Відомо (Rapoport 1983, Murad 1986, Moncada 1991), що NO і нітросполуки, активуючи гуанілатциклазу, підвищують рівень цГМФ усередині клітини. В наступних експериментах була досліджена можлива участь цГМФ в інгібуючому ефекті НГ на /<> Так, додавання в піпеточний розчин метиленового синього (20 мкМ), відомого блокатора гуанілатциклази, суттєво блокувало (в 4 рази) дію НГ на Іса (мал. 2,А). З іншого боку, аналоги цГМФ (дібутирші-цГМФ і 8-бром-цГМФ), які проникають через клітинну мембрану, викликали інгібування !са подібне до того, яке спостерігалося при дії НГ. Додавання НГ до звніншього розчину, на фоні дії 8-бром-цГМФ, не спричиняло суттєвої зміни амплітуди і форми 1са (мал. 2,Б). Слід відзначити, що в тих випадках, коли аналоги цГМФ не викликали інгібування стуму, НГ також був не ефективним. Ці факти переконливо свідчать, що інгібуюча дія НГ на Іса мембрани ГМК taenia coli морської свинки пов'язана з активацією гуанілатциклазного шляху.

Метиленовий синиО

Рис. 2. Механізм інгібуючої дії нітрогліцерину (НГ) на Іса:

А - дія НГ (100 мкМ) на Іса при наявності метиленового синього (10 мкМ) у піпеточному розчині. Б - зміна Iq, при дії 8-бром-цГМФ (200 мкМ) і при додавнні НГ (100 мкМ) на фоні дії 8-бром-цГМФ (200 мкМ).

+10

Є всі підстави вважати, то кінцевим етапом цього шляху є активація цГМФ-залежної протеінкінази, яка, мабуть, і діє на Са2+ канали Ь-типу, пригнічуючи їх. Для того, шоб з'ясувати це питання, ми досліджували дію блокатора цГМФ-залсжної протеінкінази, Н-8, на Іса- Ці дослідження показали, що на фоні дії Н-8 (0.5 мкМ) НГ викликає не зменшення, а навпаки, збільшення амплітуди Іса■ Слід відзначити, що сам Н-8 суттєво інгібував /Са з ІС5о=0.5 мкМ і максимальним ефектом 50% для 3 мкМ Н-8. Аналогічне інгібування Іса спричиняли інші блокатори протеїнкіназ - Н-7 і стаураспорін.

Ьремя(мин) г в іа м іа

-яа

-150

-200

ИП ІООмкМ

•і

с

З

-50

-100

-150

-200

бремя(мин) 12 16 20

МвтиленоЬиа синисі ЮмкМ

НП ІООмкМ

Рис. 3. Дія нітропрусиду натрію (НП) на Іс» мембрани гладеньком’язових клітин taenia coli морської свинки:

Зміна з часом амплітуди Іса при дії НП (100 мкМ) (А) і при дії НП (100 мкМ) в присутності метиленового синього (10 мкМ) в пілеточному розчині (Б).

В роботі було досліджено дію іншого донора N0, нітропрусиду натрію (НП), який спонтанно виділяє N0 в зовнішній розчин. Встановлено, що низькі концентрації НП (1-10 мкМ) спричиняли зростання амплітуди 1са, яке суттєво зменшувалося з часом. Розрахунки показали, що НП (10 мкМ) збільшував ГСа на 22% на 1 хв. після додавання його до розчину, тоді як ефект на 5 хв. складав тільки 4%. Високі концентрації НП (100-1000 мкМ) обумовлювали поступово зростаюче інгібування /Са (мал. З,А). НП (1000 мкМ) викликав інгібування Іса на 27% на 5 хв. після додавання його до розчину.

Обидва ефекти НП на ІСа були пов’язані з позаклітинною продукцією N0, оскільки вони блокувалися оксигемоглобіном (50 мкМ). Подібну дію на ІСа спричиняв N0, отриманий із нітріту натрію (ШМС^). Так, низькі концентрації КаЖ)2 викликали зростання Іса, тоді як високі концентрації викликали інгібування струму. В присутності метиленового синього (20 мкМ) в піпеточному розчині різні концентрації НП викликали тільки активацію струму, яка розвивалась за кілька секунд, не змінювалась в часі і була практично незворотною (мал. З,Б). Отже, як свідчать проведені дослідження, НП може викликати цГМФ-залежне інгібування (подібно до НГ) і цГМФ-незалежну активацію /Са.

2. Дія окису азоту на Са2+ струм мембрани гладеньком’язових клітин мезентеріальної артерії морської свинки

З метою ефективної реєстрації вхідного струму через Са2+ канали мембрани ГМК мезентеріальної артерії морської свинки як носій струму використовуйся Ва2+ (5 мМ). Показано, що в даних ГМК Ва2+ струм (І£а) переноситься через Ь-тип Са2+ каналів, високочутливих до дигідропіридинів (К<і для ніфедипіну становила 10 нМ).

Обидва донори N0 (НГ і НП) спричиняли дозо-залежне інгібування ІВа у більшості досліджуваних клітин. Так, НГ (100 мкМ) блокував струм на 40.4% (мал. 4, А). Інгібуючий ефект НГ і НП мав деяку потенціалзалежність, обумовлену прискоренням інактивації струму і збільшенням блокуючого ефекту при зростанні рівня деполяризації мембрани.

Дослідження можливих механізмів інгібуючої дії N0 на /Йй мембрани ГМК мезентеріальної артерії показало, що основним вторинним

А Б

Рис. 4. Інгібуюча дія нітрогліцерину (НГ) та 8-бром-цГМФ на Тв» мембрани гладеньком’язових клітин мезентеріальної артерії морської свинки:

А - дія 1 і 100 мкМ НГ на ІВа. Б - дія 8-бром-цГМФ (200 мкМ) на Іва.

посередником, який бере участь в цьому ефекті, є цГМФ. Метиленовий синій, який додавали до піпеточного розчину, зменшував інгібуючий ефект НГ (100 мкМ) в 5 разів. 8-бром-цГМФ (200 мкМ) викликав незворотне блокування /&, (мал. 4,Б). Як і у випадку донорів NO, дія 8-бром-цГМФ на ІВа була пов'язана з прискоренням інактивації струму.

3. Дія окису азоту на Са2+-активовані К+ канали мембрани гладеньком’язових клітин taenia coli морської свинки

В наступній частині роботи було досліджено дію донорів NO на К+ канали мембрани ГМК taenia соїі морської свинки. Як було встановлено раніше (Жолос 1986, Ymamoto 1989), в плазматичній мембрані цих клітин К+

струм (If:) переноситься через К+ канали двох типів: канали затриманого випрямлення і Са2+-залежні канали.

Розділення Іц мембрани ГМК на потенціал- і Са2+-залежний можна заблокувавши Іса, і, таким чином, усунути Са2+ -залежний компонент ік- Коли Са2+ канали були заблоковані Со2+ (3 мМ), залишався тільки Ік затриманного випрямлення. Проведені дослідження К+ струму затриманого випрямлення виявили, що донори N0 і 8-бром-цГМФ не викликали змін цього струму.

А

контроль

ПП

'-нппг -------п

НГ ЮОмкМ

пміог

ТІШГШ

200мс

-12 -в -в -з ток (пА)

5пА

НГ

НГ+Мет cuHuo

ТПГ ШППГ *ТГГ~ ТїН" ппш ПГ

ТУ" HrTHL

11 іопдр"

о.ов

0.14

45сєк

контроль НГ отмьЬ М.с. НГ+М.с.

Ьремя(сек)

Рис. 5. Дія нітрогліцерину (НГ) на активність К+(Са2+) каналів (кофігурація “cell-attached”) мембрани гладеньком’язових клітин taenia coli морської свинки:

А - зміна активності К+(Са2+) каналів при дії НГ (100 мкМ) (потенціал фіксації -40 мВ) і амплітудні гістограми струму К+(Са2+) каналу в контролі і дії НГ (100 мкМ). Б -зміна активності К+(Са2+) каналів при дії НГ (100 мкМ) при наявності метиленового синього (10 мкМ) та зміна з часом ймовірності відкритого стану (пРс) К+(Са2+) каналу.

Дослідження дії NO на вихідний Са2+-залежний К+ струм проводились на рівні поодиноких Са2+-залежних К+ (К+(Са2+)) каналів. Є дві обставини, що примушують проводити ці дослідження на рівні поодиноких іонних каналів. По-перше, на рівні макрострумів не можна в ізольованому вигляді досліджувати Са2+-залежний lg, оскільки його кінетика і амплітуда залежать від ІСаі тобто від кількості іонів Са2+, що входять до клітини і активують відповідні К+ канали. По-друге, тільки дослідження поодиноких каналів дозволяє з'ясувати, які біофізичні параметри каналу (час відкритого стану, провідність) змінюються під дією того чи іншого чинника.

Встановлено, що в мембрані ГМК taenia coli морської свинки існує висока щільність К+(Са2+)-каналів з провідністю 125 пСм при [K+]0/[K+}j=14 (конфігурація “outside-out”). Ці канали блокувалися карібдотоксином (селективний блокатор К+(Са2+)-каналів великої провідності) і TEA, доданими до зовнішнього розчину. Активність К+(Са2+)-каналів зростала при збільшенні мембранного потенціалу і [Са2+]і.

В конфігурації “cell-attached” обидва донори N0 (НГ і НП) спричиняли збільшення активності К+(Са2+) каналів в умовах відсутності входу Са2+ через клітинну мембрану або його звільнення з внутрішньоклітинних депо. Дія N0 була пов’язана із збільшенням імовірності (пР0) і середнього часу (т0) відкритого стану К+(Са2+) каналу. При цьому N0 не змінював амплітуду струму поодинокого каналу. Так, НГ (100 мкМ) спричиняв збільшення пР0 в 2.6 рази і т0 в 2.3 рази при потенціалі фіксації -40 мВ (мал. 5).

В роботі було встановлено, що стимулююча дія NO на активність К+(Са2+) каналів обумовлена завдяки активації гуанілатциклази. В присутності метиленового синього (10 мкМ) в зовнішньому розчині, ефект 100 мкМ НГ зменшувався в 2.2 рази (мал. 5,Б). 8-бром-цГМФ, подібно донорам

N0, виявляв стимулюючу дій на активність К+(Са2+) каналів. 1 мМ 8-бром-цГМФ збільшував пРв в 3 рази і т0 в 2.5 рази, не змінюючи амплітуду струму через поодинокий канал.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

1. Дія окису азоту на Са2+ струм мембрани гладеньком’язових клітин В поданій роботі були проведені дослідження дії N0 на високопороговий Іса L-типу Са2+ каналів мембрани ГМК, виділених з taenia coli і мезентеріальної артерії морської свинки.

Як донор N0 використовувася відомий вазодилатор нітрогліцерин (НГ). Відомо що, процес утворення N0 із НГ відбувається при дії специфічних ферментів (глутатіон S-трансферази, цитохрома Р450) усередині клітини (Gerland 1991, Bennett 1994). Нами виявлено, що НГ спричиняє зворотне дозо-залежне інгібування вксокопорогового Іса в ГМК taenia coli морської свинки. Зменшення Іса при дії НГ не було потенціалзалежним, а також воно не пов'язане з процесом Са2+-залежної інактивації Са2+ струму. На рівні аналізу активності поодиноких Са2+ каналів було встановлено, що виявлене зменшення амплітуди Са2+ макроструму під дією НГ зумовлено зниженням частоти відкривання Са2+ каналів L-гнпу, а не зменшенням амплітуди струму, що проходить через цей канал.

За класичною схемою, дію N0 на різні ГМК пояснюють через збільшення рівня цГМФ завдяки активації цитоплазматичної гуанілатциклази Rapoport 1983, Murad 1986, Moncada 1991). В нашому випадку, виявлене в експерименті зменшення амплітуди Іса під дією НГ було обумовлене активацією цГМФ-шляху. Цей висновок випливає з таких фактів: 1) ефект НГ інгібувався метиленовим синім, блокатором гуанілатциклази; 2) мембранопроникні аналога цГМФ (дібутирил- і 8-бром-цГМФ) спричиняли

подібне інгібування і с а, 3) НГ не спричиняв суттєвого блокування Іса на фоні дії. 8-бром-цГМФ.

Відомо, що кінцевим етапом гуанілатциклазного шляху є активація цГМФ-залежної протеїнкінази, яка, мабуть, і діє на воротний механізм Са2+ каналу, пригнічуючи його. Експерименти з використанням Н-8, блокатора протеїнкінази, показали, що інгібування 1са при дії НГ дійсно пов’язане з активацією цГМФ-залежної протеїнкінази. Важливо відмітити, що блокатори протеїнкіназ Н-8, Н-7 та стауросопрші приводили до інгібування Як відомо, ці сполуки можуть блокувати активність протеїнкіназ циклічних нуклеотидів та протеїнкінази С. Можна припустити, що в ГМК taenia coli морської свинки наявна базальна активність протеїнкіназ (цАМФ-залежної і/або протеїнкінази С), яка обумовлює збільшення активності Са2+ каналу.

Отримані результати свідчать, що активація цГМФ-залежної протеїнкінази спричиняє пригнічення активності L-типу Са2+ каналів мембрани ГМК taenia coli морської свинки. Очевидно, цей механізм лежить в основі NO-залежного інгібування скорочення гладеньких м’язів. Проте до сьогодні не ідентифіковано ділянку Са2+-каналу, яка зазнає фосфорилювання цГМФ-залежною протеїнкіназою. Можна також припустити, що дія цГМФ-залежної протеїнкінази пов’язана з активацією фосфатази і наступним дефосфорштюванням каналу, що спричиняє інгібування /о

В наших дослідженнях інший донор NO, нітропрусид натрію (НП), спричиняв два різнонаправлені ефекти на /<> Один із цих ефектів ми віднесли до цГМФ-залежного інгібування Іса, механізм якого подібний до дії НГ та аналогів цГМФ на /о Інший ефект НП - збільшення Іса, яке незалежало від активності гуаншатниклази. Відмінності в дії НГ і НП на Іса можна пояснити різними механізмами виділення N0 з цих сполук. Використання

оксигемоглобіну, який зв’язує N0, показало, що обидва ефекти НП на ІСа обумовлені виділенням NO в зовнішній розчин. Нами зроблено припущення, що у випадку НП дія N0 може проявлятися як із зовнішнього боку мембрани (пряма дія на Са2+ канал), так і внутрішньоклітинно через активацію цГМФ-залежної протеїнкінази.

Не зовсім зрозуміле фізіологічне значення стимулюючого ефекту N0 на /Са, хоч добре відомо, ідо НП і N0 викликають розслаблення різних гладеньких м’язів. Ми вважаємо, що в гладеньких м’язах розслаблююча дія NO завдяки активації цГМФ-процесів є домінуючою, а незначне підвищення [Ca2+]j в лримембранній ділянці, за рахунок збільшення Іса, буде швидко ліквідоване Са2+-дєпо і тому не буде впливати на скоротливий апарат м’язу. Проте останній ефект може бути корисним для активації різних Са2+-залежних каналів (К+- і СІ'- каналів).

На відміну від клітин taenia coli в ГМК мезентеріальної артерії морської свинки, донори NO (НГ і НП) викликали тільки інгібування Іда. Цей ефект був пов’язаний з активацією гуанілатциклази і збільшенням рівня цГМФ. Крім того, в ГМК мезентеріальної артерії ефект донорів NO і 8-бром-цГМФ виявляв деяку залежність від мембранного потенціалу, обумовлену прискоренням інактивації струму і збільшенням інгібуючого ефекту при зростанні рівня деполяризації мембрани. Ці результати добре узгоджуються із даними авторів (Clapp 1991, Ishikawa 1993, Blatter 1994), які вивчали дію N0 і цГМФ на Са2+ канали ГМК судин. Можливо, що дія N0, яка пов’язана з цГМФ-залежним інгібуванням входу Са2+ через Са2+ канали, є загальним механізмом пригніченій скорочення-' гладеньких м’язів, викликаного деполяризацією клітинної мембрани.

2. Дія окису азоту на К+ канали мембрани гладеньком’язових клітин

Заслуговує на увагу дослідження дії N0 іга К+ канали мембрани ГМК. І це тим більше, що, як засвідчують літературні дані (Fujino 1991, Tombury 1991, Garland 1992, Robertson 1993, Murphy 1995), в дію NO на гладенькі м’язи можуть втягуватись як Са2+-залежні, (високо- або низько- провідні), так і АТФ-залежні К+ канали. Більше того, складається враження про те, що тип К+ каналів, що втягуються в дію N0, може мати тканинну і навіть видову специфічність. В усякому разі, модулювання цих каналів NO обов'язково супроводжується зміною збудливості цих клітин. Дійсно, N0, що виділяється з нервових закінчень, викликає в ГМК кишечника “синаптичну” гіперполяризацію, під час якої збудливість гладеньких м'язів пригнічується. Зокрема, згідно нашим дослідам в taenia coli морської свинки стимуляція певного класу периферичних (кеадренергічних) нейронів спричиняє генерування двохфазного гальмівного постсинаїгшчного потенціалу, повільний компонент якого блокується інгібітором синтезу NO - L-NMMA (Загороднюк 1994).

В даній роботі, використовуючи метод фіксації потенціалу, ми досліджували дію донорів NO на К+ канали мембрани ГМК taenia coli морської свинки. Показано, що в цих клітинах є два типи К+ каналів: канали затриманого випрямлення і Са2+-залежні канали. Як показали наші дослідження, тільки Са2+-залежні К+ ((К+(Са2+)) канали великої провідності втягуються в дію NO на ГМК.

К+(Са2+) канали великої провідності ідентифіковані в багатьох типах гладеньких м' язів. Вони активуються завдяки зростанню [Са2+]; і таким чином вони виконують роль “від’ємного зворотнього зв’язку”, який контролює мембранний потенціал при збудженні клітини. В ГМК taenia coli морської

свинюі присутні К+(Са2+) канали великої провідності (125 пСм), які чутливі до карібдотоксину і ТЕ А..

В даних дослідженнях донорами N0 були вищезгадані нітрогліцерин та нітропрусид натрію. При дії цих сполук на ГМК іатіа соїі морської свинки імовірність відкритого стану (Р0) К+(Са2+) каналів зростала в 3 рази, а середній час відкритого стану (ц) каналів збільшувався в 2-3 рази. В той же час амплітуда іонного струму каналу не змінювалась. Слід зазначити, що цей ефект N0 не вимагав вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинних Са2+-депо і входу до ГМК Са2+ через Са2+ канали з позаклітинного середовища. Метиленовий синій, блокатор гуанілатциклази, перешкоджав зміні згаданих біофізичних параметрів (Р0, г0) К+(Са2+) каналів, що говорить про участь в цьому ефекті цГМФ-залежних механізмів. Припускається, що стимулююча дія N0 на К+(Са2+) канали пов’язана з активацією цГМФ.-залежної протеїнкінази і наступним фосфоршшванням каналу. Справді, мсмбранопроникний аналог цГМФ, 8-борм цГ'МФ, викликав такі ж зміни в параметрах досліджуваних К+ каналів, як і донори N0.

З функціональної точки зору викликані зміни біофізичних параметрів (Ро, то) К+(Са2+) каналів великої провідності під впливом N0 мають істотне значення, бо в розглянутих умовах вони неодмінно приводитимуть до гіперполяризації мембрани ГМК і як наслідок цього - до пригнічення збудливості, а отже і до зменшення входу іонів Са2+ до м'язових клітин, що беруть участь в активації скорочення. Поруч з цим, виявлена в цих дослідженнях блокуюча дія N0 на Са2+ канали Ь-типу, тільки посилюватиме пригнічуючу дію N0 на скоротливий процес.

19

ВИСНОВКИ

1. За допомогою методу фіксації потенціалу (“patch-clamp”) досліджувалась дія N0, який вивільняється з нітрогліцерину та кітропрусиду натрію, на Са2+-та К+ -канали еклектрозбудливої мембрани ГМК taenia coli і мезентеріальної артерії морської свинки.

2. NO, що вивільнюється з нітрогліцерину внутрішньоклітинно, спричиняв оборотне дозо-залежне інгібування Са2+ струму L-типу Са2+ каналів. Зменшення Са2+ струму при дії N0 не було потенціалзалежшш, а також воно не пов’язане з процесом Са2+-залежної інактивації Са2+ струму.

3. Встановлено, шо інгібуюча дія NO на Са2+ струм обумовлена активацією такого внутрішньоклітинного шляху: N0 -» гуанілатциклаза -> нГМФ цГМФ-залежна протеїнкіназа - > Са2+ канал L-тнпу.

4. В гладеньком’язових клітинах taenia coli морської свинки виявлено базальну активність протеїнкіназ (цАМФ-залежної і/або протеїнкінази С), яка спричиняє зростання активності Са2+ каналу.

5. Виявлено, шо NO вивільнюваний в позаклітинне середовище (донор N0 нітропрусид натрію), в залежності від концентрації викликає цГМФ-залежне інгібування або цГМФ-незалежну активацію Са2+ струму L-типу Са2+ каналів мембрани ГМК taenia coli морської свинки.

6. Показано, що N0 вивільнюваний з обцдвох донорів викликав тільки цГМФ-залежне інгібування високопорогового Са2+ струму L-гипу Са2+ каналів мембрани ГМК мезентеріальної артерії морської свинки.

7. Використовуючи метод фіксації потенціалу в конфігураціях “cell-attached”, “outside-out” і “inside out”, показано, що в гладеньком’язових клітинах taenia coli морської свинки містяться Са2+-залежні К+ канали великої провідності (125 пСм), які чутливі до карібдотоксину.

20 -

8. N0, що вивільняється з нітрогліцерину та нітропрусиду натрію, спричиняв цГМФ-залежне збільшення активності Са2+-залежних К+ каналів. Цей ефект N0 не вимагав вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинних Са2+-депо і входу Са2+ через Са2+ канали з позаклітинного середовища.

9. В природних умовах N0 може здійснювати пригнічення скорочення гладеньких м’язів, яке було викликане деполяризацією клітинної мембрани, завдяки інгібуванню входу Са2+ через Ь-тип Са2+ каналів, а також може викликати гіпериоляризацію мембрани внаслідок активації Са2+ каналів великої провідності.

Перелік робіт, опублікованих за матеріалами дисертації.

1) Загороднкж В.П., Зима А.В., Владимирова И.А., Шуба М.Ф. / Механизм действия NO как нехоленергического тормозящего медиатора в гладкомышечных клетках желудочно-кишечного тракта морской свинки. // Нейрофизиология/Neumphysiology, (1994) т.26, N 2, с.с. 108-114.

2) Зима А.В., Белевич А.Э., Цугорка А.М., Шуба М.Ф. / Угнетающее дейсвие нитроглицерина на потенциалактивируемый кальциевый ток изолированных гладкомыщечных клеток кишечника// Нейрофшиология/Neurophysiology, (1994) т.26, N 3, с.с. 21 В-222.

3) Зима А., Белевич А., Цицюра Я., Шуба М./ Действие окиси азота на Са2+-и Са2+-активируемые К+- каналы в гладкомышечных клетках taenia coli морской свинки.// Физика живого, (1996), т.4, N 1, с.с. 67-72.

4) Zima A.V., Belevich А.Е. and Shuba M.F. / Modulatory action of glyceryl trinitrate and sodium nitroprusside on potential-operated calcium channels in smooth muscle cells. /[CanadJ.Physiol and Pharmacol., (1994) v.72, suppl.l, p.580.

5) Belevich A., Zima A. and Shuba M. / Augmentation of potential-activated calcium current by GTPyS-activated G proteins in taenia coli smooth muscle cells. // J.Physiol.(London), (1995) v.487, p,198P.

6) Belevich A., Zima A. and Shuba M.F. / The mechanism of modulatory action of nitrocompounds on calcium activated K+ channels of taenia coli smooth muscle cells. // Pflugers Arch., (1995) v.430, No.4, p.R28.

7) Zima A.V. & Shuba M.F. / Action of nitric oxide on calcium current in non-vascular smooth muscle cells. // Biophysical J., (1996) v.70, No.2, p.A320.

8) M.F. Shuba, A.E. Belevich, A.V. Gurkovskaya, A.V. Zima. / Membrane and intracellular mechanisms of nitric oxide relaxing action on vascular smooth muscle. // J. Vascular Research, (1996) v.33, S2, p. 46.

Zima A.V. The mcchanism of nitric oxide action on calcium and potassium channels in the membrane of smooth muscle cells. The dissertation (manuscript) is presented in accordance with requiremerits for the degree of candidate of biological sciences in speciality 03.00.05. -Biophysics, A.A.Bogomoletz Institute of Physiology. National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1996.

The action of nitric oxide (NO) on Ca2+ and K+ channels in smooth muscle cells (SMCs) isolated from guinea-pig taenia coll and mesenteric artery has been studied using the patch-clamp method. In taenia coli SMCs nitroglycerin (NG) reduced L-type Ca2+-channel current (lea) in a concentration-dependent maimer (IC50 ІцМ) without significant altering voltage-dependence of current-voltage relationship and steady-state inactivation. Inhibitory action of NG on la, was shown to be mediated by an increase in cGMP level and activation cGMP-dependent protein kinase. Sodium nitroprusside (SNP) (1-10 дМ) caused eGMP-independent increase of lc„ , while high concentrations (100-1000 цМ) reduced current via cGMP-dependent pathway. SNP was not effective in presence of scavenger NO, oxyhemaglobin. NO, released from NaN02, mimicked the effects of SNP on /<>. In contrast, in SMCs from guinea-pig mesenteric artery both NO donors (NG and SNP) evoked only cGMP-dependent inhibition of high-threshold fca. The cell-attached configuration of patch-clamp method was used to study the action of NO on high-conductance Ca2+-activated K+ (K+(Ca2+)) channels in SMCs isolated from guinea-pig taenia coli. Both SNP and NG increased activity of K+(Ca2+) channels in Ca-independent manner. Methylene blue partly blocked and 8-bromo-cGMP mimicked stimulatoty action of NG and SNP on K+(Ca2+) channels.

Зима A.B. Механизм действия окиси азота на кальциевые и калиевые каналы электровозбудимой мембраны гладкомышечных клеток. Диссертация (рукопись) на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.05. - Биофизика, Институт физиологии им. АА.Богомольца НАН Украины, Киев, 1996.

Методом фиксации потенциала (“patch-clamp”) исследовалось действие доноров окиси азота (NO) на активность Са2+- и К+-каналов в изолированных гладкомышечных клетках (ГМК) taenia coli и мезентериальной артерии морской свинки. В ГМК taenia coli морской свинки нитроглицерин (НГ) вызывал дозозависимое ингибирование высокопорогового Са2+ тока (1са) с ICj0 1 мкМ. Действие НГ не было потенциалзависимым , а также не было связано с Са2+-зависимой инактивацией 1са■ Ингибирующий эффект НГ на 1са был связан с увеличением продукции цГМФ и последующей активацией цГМФ-зависимой протеинкиназы. Низкие концентрации нитропруссида натрия (НП) (1-10 мкМ) вызывали цГМФ-независимую активацию 1са, тогда как большие концентрации (100-1000 мкМ) приводили к ингибированию тока посредством цГМФ-зависимого пути. НП не вызывал изменений /<;« в присутствии оксигемоглобина, вещества связующего N0. NO полученный из NaNO} вызывал сходное изменение Tea, что НП. В отличие от ГМК taenia coli морской свинки в клетках мезентериальной артерии оба донора N0 вызывали только цГМФ-зависимое ингибирование высокопорогового /о Используя конфигурацию “cell-attached” метода “patch-clamp” исследовалось действие N0 на Са2+-активируемые К4 (К+(Са2+)) каналы большой проводимости в ГМК taenia coli морской свинки. НГ и НП приводили к увеличению активности К+(Са2+) каналов в условиях отсутствия входа Са2+ через Са2+ каналы и его высвобождения из внутриклеточных депо. Активирующее действие доноров N0 на К+(Са2+) каналы блокировалось метиленовым синим. 8-бром-цГМФ вызывал сходное увеличение активности К+(Са2+) каналов.

Ключові слова: метод фіксації потенціалу (patch-clamp), гладеньком’язові клітини, taenia coli, мезентеріальна артерія, окис азоту, нітрогліцерин, нітропрусид натрію, цГМФ, Са2+-струм, Са2+-активовані К+-канали.