Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ионные механизмы сенсорного кодирования

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Ионные механизмы сенсорного кодирования"

С. м РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

° [Га'\ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. И.П.ПАВЛОВА

.«А? ^ _:_:__

' :

На правах рукописи

КРЫЛОВ Борис Владимирович

ИОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ СЕНСОРНОГО КОДИРОВАНИЯ

(Специальность: 03.00.13 - физиология человека и животных)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 1994

Работа выполнена в лаборатории физиологии рецепции Института физиологии им.И.П.Павлова АН России

Научный консультант - доктор биологических наук, профессор Г.Н.АКОЕВ ' ;

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Я.А.АЛЬТМАН, доктор биологических наук, профессор Г. Н. МОЖАЕВА, доктор биологических наук, профессор Ф. Г. ГРИБАКИН

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный университет

У Защита диссертации состоится " С^ПрелЗ 1994 го.ч4 в /X"часов на заседании специализированного совета (Д 002.36.01) по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте физиологии им. И. П. Павлова АН России (199034, Санкт-Петербург, наб.' Макарова, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И. П. Павлова РАН.

Автореферат разослан *(0? 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Н. М. ВАВИЛОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Выяснение механизмов импульсного кодирования - важнейшая задача физиологии сенсорных систем, в особенности при исследовании рецепторных приборов, создающих первичный сенсорный код. Анализ накопленных злектрофизиологических данных позволил выявить ряд важных закономерностей преобразований сигналов в сенсорных системах (Adrian, Zotterman, 1926; Mountcastle, 1967; Вызов, 1971; Somjen, 1975; Пятигорский, 1979; Грибакин, 1981; Альтман, 1990; Ковбаса, Ноздрачев, 1990). Однако до настоящего времени не проведено ни одного законченного экспериментального исследования ионных механизмов генерации потенциалов действия кодирующей электровозбудимой мембраной чувствительных окончаний. Импульсная активность рецепторов возникает в результате воздействия рецепторного тока на их спайкгенерирующую область (Katz, 1950), поэтому особенности импульсного кодирования должны соответствовать' закономерностям возникновения потенциалов действия в нервном волокне под влиянием электрического тока (Granit, 1955; Ильинский, 1975). Эти закономерности в свою очередь могут быть изучены. на основе мембранной ионной теории (Hodgkin, Huxley, 1952а, 1952b, 1952с, 1952d; Hodgkin et al., 1952). Ответ на вопрос о том, в какой мере молекулярные характеристики ионных каналов определяют интегратив-ную кодирующую функцию сенсорной системы,особенно актуален. Нами делается попытка с помощью ионной теории провести исследование роли различных типов управляемых потенциалом ионных каналов в процессе аналого-импульсного преобразования, происходящего на электровозбудимой мембране. По ее реакции на постоянный ток можно выделить три основных типа преобразования сигналов: адаптацию, частотное и числовое кодирование. Адаптация проявляется в прогрессивном увеличении во времени межимпульсных интервалов. Феноменология частотного кодирования также хорошо известна в этом случае: мембрана увеличивает частоту следования нервных импульсов при увеличении амплитуды стимула (Adrian, Zotterraan,. 1926). При числовом кодировании амплитуда стимула оценивается числом возникающих в рецепторе импульсов. Чем больше максимальное число гене--рируемых разрядов, тем более тонко рецептор может оценивать внешнее воздействие (Ильинский, 1975).

В литературе существуют лишь немногочисленные данные о меха-

низмах числового кодирования, согласно которым начальное значение переменной натриевой инактивации может влиять на максимальное число потенциалов действия (ПД) в серии повторных ответов, рассчитанных на модели мембраны перехвата Ранвье (Frankenliaeuser, Vallbo, 1965: Vallbo, 1964b). Числовое кодирование обнаружено в электрорецепторной системе рыб (Suga, 1967). Зтот же механизм преобразования входного сигнала существует в тельцах Пачини кошки (Ильинский, 1966) и в мышечных веретенах лягушки (Ottoson. Shepherd, 1965). Рассмотренный феномен, основанный на изменении числа повторных ответов в серии импульсов, необходимо -отличать от способа кодирования числом одновременно активированных рецепторов, который имеет важное значение при изучении деятельности их популяций.

Во многих рецепторных приборах кодирующую функцию выполняет мембрана первого перехвата Ранвье. Шварц и Фогель (Schwarz, Vogel, 1971), исследуя инактивацию калиевого тока мембраны нервного волокна Xenopus taevis, выделили два компонента этого процесса, что позволило им высказать предположение о существовании двух типов калиевых каналов в указанной мембране. Гипотеза о гетерогенности калиевой системы мембраны перехвата Ранвье нашла свое экспериментальное подтверждение в работах В.С.Каковского и соавторов, обнаруживших популяцию медленных калиевых каналов в электровозбудимой мембране Kana ridibunda (Ильин и др., 1973а, 1974а, 19746; 1977, 1980). Вскоре каналы Маковского были обнаружены н в мембране нервного волокна ßana esculenta (Dubois, 1981а, 1981b, 1981с).

Выяснение роли этих каналов в адаптационных явлениях (Маковский, 1979) позволило по-новому подойти к изучению функции различных ионных систем в преобразовании аналог - код, .осуществляемом мембраной перехвата Ранвье.

Важным результатом рассматриваемого подхода является положение о том, что с помощью количественных изменений единственного параметра - плотности медленных калиевых каналов - можно объяснить качественные различия ответов моторных и сенсорных волокон, фазную и тоническую импульсацию рецепторов. Можно предположить, что сенсорный нейрон может синтезировать необходимое для первичного кодирования количество медленных калиевых каналов, управляя таким образом переработкой информации в афферентном звене рефлекторной дуги.

В настоящей работе исследован новый механизм регуляции импульсной активности электровозбудимой мембраны. Структурное изменение воротного устройства - инактивационной системы, натриевых каналов - может привести к тем же качественным отличиям в рисунке импульсной активности. Повышение точности измерений, прогресс в развитии экспериментальных методик позволяют сегодня на современном уровне уточнить основные постулаты ионной теории, одним из которых является использование однобарьерных моделей для описания кинетического поведения воротных устройств ионных каналов. Количественное выявление эффектов второго порядка при исследовании процесса инактивации натриевого тока мембраны нервного волокна (Cliiu, 1977) заставило искать ответ на вопрос о причинах и возможной роли этой более сложной организации инактивационной системы. Свойствами, как минимум, второго порядка обладают подобные системы различных мембран (Пеганов, 1973; Можаева и др., 1980; Лонский и др., 1981; 1984; 1989; Зильбертер, Тимин. 1982; Schauf 1974; Nonner, 1980; Kniffki et al., 1981; Ochsetal., 1981; Schwarz, 1984; Schmidtmayer, 1985; 1989).

В настоящей работе мы руководствовались при исследовании функциональной роли в импульсном кодировании потенциалозависимых ионных каналов следующими принципами. Из главного уравнения ионной теории следует, что •

dE/dt-(lB + ll„l- W - I,)/C, где dE/dt - скорость изменения потенциала, С - ешость мембраны, Im - стимулирующий ток, I! - ток утечки, IBX, 1В1П - входящие и выходящие ионные токи, соответственно. Очевидно, что любое увеличение входящих токов должно вести к росту скорости изменения потенциала. Ее увеличение в течение межимпульсных интервалов служит основным фактором, ведущим к учащению импульсации. Выходящие токи, осуществляя отрицательную обратную связь, наоборот, снижают частоту повторных ответов. Отсюда следует, что натриевые каналы и каналы тока утечки образуют базисную систему, способную обеспечить генерацию основной несущей частоты импульсной активности нервного волокна. Включение быстрых калиевых каналов приводит к своеобразной модуляции его ответов, формируя отрицательно ускоряющуюся функцию вход-выход, характерную для большинства рецепторов (Somjen, 1975). Тончайшие механизмы регулировки и настройки мембранного генератора могут обеспечиваться деятельностью медленных калиевых каналов или с помощью других молекулярных механизмов.

- исследованию которых посвящена настоящая работа.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Выяснить на основании мембранной ионной теории возможную функциональную роль потенциалозависимых ионных каналов в процессе первичного сенсорного кодирования, осуществляемого мембраной нервного волокна.

2. Исследовать роль инактивационной системы натриевых каналов в регуляции импульсной активности электровозбудимой мембраны сенсорных нейронов спинальных ганглиев крысы.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Дополнительное закрытое состояние инактивационной системы натриевых каналов обуславливает адаптацию электровозбудимой мембраны к действии постоянного стимула. .

2. Двухбарьерная модель указанной инактивационной системы адекватно описывает кинетику натриевого тока сенсорного нейрона, свойства второго порядка воротного устройства которого являются причиной его фазных ответов.

3. Изменение характеристик инактивационного воротного устройства натриевых каналов ведет, в свою очередь, к изменению функции "вход-выход" мембраны сенсорного нейрона, рассматриваемого в качестве преобразователя аналог-код.

4. Тельце Пачини, выполняя кодирующую функции фазного рецептора, содержит в своем первом перехвате Ранвье определенный набор потенциалозависимых ионных каналов, максимальные величины плотностей которых взаимосвязаны ограничивающим соотношением.

' НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В настоящей работе впервые предсказан натриевый механизм адаптации электровозбудимой мембраны к действию постоянного тока. Впервые получены константы скоростей переходов в двухбарьерной модели инактивационной системы натриевых каналов мембраны сенсорных нейронов теплокровных животных (крысы линии №istar). Установлено, что молекулярные термодинамические характеристики исследованной системы близки к соответствующим характеристикам инактивационной системы сенсорного нервного волокна (Rana pipiens) , что свидетельствует об общности происхождения молекулярного предшественника натриевого канала.

В результате выполнения работы впервые показано, что один и

тот же феномен адаптации к действию постоянного тока может быть обусловлен или активацией медленных калиевых каналов, или свойствами второго порядка инактивационной системы потенциалозависимых. натриевых каналов. Предсказаны механизмы регуляции импульсной активности с помощью'изменений молекулярных характеристик мембранных ионных каналов.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Полученные данные,о механизмах регуляции импульсной активности электровозбу-. димой мембраны при изменении молекулярных характеристик ионных каналов представляются важными для понимания общих принципов организации сенсорных систем.

Результаты и выводы работы могут быть использованы в медицине и фармакологии для разработки новых способов целенаправленного воздействия на функционирование сенсорных систем при некоторых формах патологии, при реализации принципиально новых компьютерных технологий, а также при чтении курсов лекций по биофизике сенсорных систем, по нейрофизиологии и нейробиологии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы настоящей работы были представлены и дотожены на XIV съезде Всесоюзного физиологического общества им. Павлова, Баку, 1983; Всесоюзной конференции по нейро-наукам, посвященной 80-летию В.Н.Черниговского, Ленинград, 1987; II Всесоюзной конференции по нейронаукам, Киев, 1988; ежемесячном семинаре Института физиологии при университете Гамбурга, Гамбург,' 1991; ежегодном съезде физиологов Германии, Дюссельдорф, 1992.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 282 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методик исследования, восьми глав экспериментальных данных, обсуждения результатов исследования, общего заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 76 рисунками и двумя таблицами. Список литературы содержит 93 отечественных и 245 иностранных источников.

Методики исследования

Моделирование импульсной активности мембраны перехвата Ранвье нервного волокна проведено на модели Доджа (Dodge, 1963). Другая модель типа Ходжкина-Хаксли была разработана нами для мембраны сенсорного нейрона. Численное интегрирование системы нелинейных дифференциальных уравнений осуществлено методом Рун-

ге-Кутта четвертого порядка, который позволяет производить теоретическую оценку погрешности интегрирования (Бахвалов, 1975). Помимо этого, использование стандартной процедуры, заключающейся в уменьшении на порядок выбранного шага интегрирования, приводило лишь к 2% изменению величины относительной погрешности, что соответствовало теоретической оценке. Программы реализованы на языке Фортран. В качестве инструментального компьютера используется IBM PC AT. Программные средства, разработанные в совместных исследованиях с Институтом информатики и автоматизации РАН, позволяют в ритме эксперимента проводить регистрацию, обработку данных, а также предварительное моделирование исследуемого процесса.

Неидентифицированные изолированные нейроны ганглиев областей L6 - Si спинного мозга белой крысы линии Wistar получали методом ферментативно-механической обработки (Kostyuk et al., 1981а) (1 мг/мл коллагеназы ("Serva") + 1 мг/мл проназы Е ("Serva"), рН 7.2, 32 - 34°С, 20 - 25 минут). Измерения натриевых токов целой клетки проводили с помощью пэтч-кламп метода (Hamill et al., 1981) при комнатной температуре.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Возможная роль различия характеристик ионной избирательности быстрых и медленных калиевых каналов в числовом кодировании, осуществляемом мембраной перехвата Ранвье

Селективные свойства быстрых и медленных калиевых каналов нервного волокна могут быть различны (Ilyin et al., 1980; Dubois, 1981a, 1981b). Было показано, что медленные калиевые каналы в отличие от быстрых обладают большей проницаемостью для ионов Rb, чем для ионов 1С (Катина, 1983; Лонский, Катина, 1981). В расчетах потенциал реверсии медленного канала (Erev) был принят равным -85 мВ, т.е. на 10 мВ ниже соответствующего потенциала быстрых каналов. Нами было установлено, что общая картина аналого-импульсного преобразования при равенстве и различии потенциалов реверсии быстрого и медленного калиевого токов осталась почти неизменной: число нервных импульсов в серии линейно зависит от амплитуды стимулирующего тока, причем "квантование" происходит с тем же шагом 1„ - 0,05 нА. Единственное отличие заключается в том, что при бо-

лее низком потенциале реверсии рассматриваемое преобразование наблюдается при большем стимулирующем токе. Этот эффект обусловлен увеличением склада медленного калиевого тока, осуществляющего отрицательную обратную связь з работе мембранного генератора. В результате повторные ответы возникают при больших величинах стимулирующего тока. В нашем случае он соответствует генераторному току рецепторного прибора, возбуждающему первгй (кодирующий) перехват Ранвье. Диапазон изменения этого тока в реальных условиях определяется характеристиками конкретного рецептора, т.е. может изменяться в некоторых пределах. По этой причине электровозбудимая мембрана, отвечающая на указанный стимул, должна быть сопряжена по своим свойствам с рецепторной мембраной, другими словами, настроена оптимальным образом на преобразование аналог-код. Наличие в электровозбудимой мембране двух популяций калиевых каналов, различающихся как по воротным, так и селективным свойствам, при известном соотношении их плотностей может обеспечивать сопряжение свойстз кодирующей и трансформирующей мембран рецепторов. Причем "тонкая настройка" на определенный диапазон генераторного .тока возможна именно за счет различия селективных свойств быстрых и медленных каналов.

Натриевый механизм адаптации и числового кодирования

Чиу (Chlu, 1977) впервые экспериментально определил константы скоростей переходов, соответствующие схеме трех состояний, т.е. для случая, когда инактивационная система мембраны перехвата Ранвье Rana pipiens обладает свойствами второго порядка. В соответствии с нашими расчетами это означает, что при переходе между открытым и закрытым состояниями переносится эффективный заряд (в единицах заряда электрона), равный -1,53, а при переходе между двумя закрытыми состояниями h-системы величина q2 составляет -2,74. Таким образом, основной перенос заряда в инактивационной системе натриевых каналов Rana pipiens происходит при закрытых h-воротах. В инактивационной системе перехвата Xenopus taevis, которая также подчиняется кинетике второго порядка (Knlffki et al., 1981), эффективные заряды распределены противоположным образом. Здесь q, --2,75, a q2 --1.06. Модификация модели Доджа учетом свойств второго порядка инактивационной системы натриевых каналов приводит к результата).!, представленным на рис.1. Расчеты

показывают, что генерация серии ПД в ответ на постоянный ток сопровождается изменением межимпульсных интервалов.

С,ч1 45

Рис.1. Генерация мембраной теоретического перехвата Ранвье конечной серии импульсов

А - серия ПД в ответ на постоянный стимулирующий ток, равный 0,7 нА; Б - зависимость от времени вероятностей нахождения инактивационной системы в открытом ) и закрытых (112 • (13) состояниях.

' _

" л Г,Иг '

0,5

в

О

/у га 30 с, "*

Откеченные нами альтернативные мембранные механизмы адаптации указывают на два принципиально различных способа возникновения апериодических ответов перехвата Ранвье. Первый из них связан с активацией каналов Маковского. Второй механизм адаптации обусловлен наличием взаимосвязанных быстрых перестроек в инактивационной системе натриевых каналов. Возникающие в результате этой взаимосвязи колебания переменной Ь медленно выходят на установившийся уровень. В течение переходного периода и происходит увеличение ыежимлульеных интервалов. Таким образом, регулирование импульсной активности с экспериментально наблюдаемом временном диапазоне может осуществляться как с помощью дополнительных медленных, так и взаимосвязанных быстрых процессов. Общая же закономерность рассыатриваешх механизмов заключается в том, что адаптационные явления обусловлены апериодическим поведением потенциалоза-висимых переменных.

Адаптационный эффект в рассматриваемом случае непосредственно связан еще с одним проявлением импульсного кодирования - с числовым кодированием. В диапазоне от 0,5 до 0,6 нА увеличение 1и на 0,05 нА сопровождается линейным ростом числа повторных ответов. Для возникновения четырех ответов шаг изменения тока должен быть увеличен до 0.1 нА, а появление пятого ПД связано с резким уменьшением шага до 0,02 нА. 1„ . равный 0,75 нА. является гра-

ничным. С этого уровня наблюдается переход от числового к частотному коду. Числовое кодирование играет важную роль в системе кожной чувствительности. Это показано в экспериментах на людях, проводимых с помощью электрофизиологической методики, разработанной скандинавскими исследоьателями (Уа11Ьо, НаеЬаг^, 1968; 1973). Им удалось зарегистрировать с помощью вольфрамового микроэлектрода импульсную активность одиночных периферических волокон, интернирующих механорецепторы кожи. Помимо этого, испытуемые сообщали об изменении своих ощущений в ответ на увеличение силы адекватного воздействия. Одна из первых работ, выполненная с помощью этой методики, показала, что числовой код лежит в основе формирования тактильных ощущений (Кп1ЬезЬо1, УаПЬо, 1970). Результаты этих исследований позволили, по-видимому, окончательно решить вопрос о физиологической значимости какдого из серии нервных импульсов, возникающих в афферентном волокне. . Предложенные наш механизмы числового кодирования воспроизводят в общих чертах его феноменологию.

Ионные механизмы генерации ответов сенсорных и моторных волокон

Подход, используемый в настоящей работе, указывает на то, что структурная организация воротных устройств ионных каналов может определять тип импульсной активности электровозбудимой мембраны. Отметим при этом одно важное обстоятельство. Волокно, входящее в состав афферентного звена рефлекторной дуги, по своим физиологическим свойствам может соответствовать моторному волокну. Хороио известно, что ответы последнего на ступеньку тока и реакции фазного рецептора на постоянный стимул представляют собой короткую серию ПД. По этой причине и деление волокон на моторные и сенсорные не может быть однозначно соотнесено с типом импульсной активности. С другой стороны, способность генерировать повторные разряды может■различаться даже у перехватов одного и того же волокна, поскольку первый перехват выполняет специфическую кодирующую функцию. Следовательно, при выяснении взаимосвязи структуры ионных каналов с функцией электровозбудимых мембран необходимо учитывать особенности их импульсной активности.

Каналы Маковского могут явиться одной из причин, обусловливающих различие свойств моторных и сенсорных волокон (Крылов, На-

ковский, 1978). Важно подчеркнуть, что их различная возбудимость может быть обусловлена единственной причиной - различной плотностью медленных калиевых каналов в перехватах Ранвье сенсорных и моторных волокон (Крылов, Маковский. 1978; Маковский, 1979). Для проверки этой гипотезы Дюбуа (Dubois, 1981b; 1982) провел серию опытов с целью сопоставления свойств калиевых мембранных систем моторных и сенсорных волокон Sana esculenta. Результаты его экспериментов показали, что медленные калиевые каналы в сенсорном волокне, видимо, необходимы для адаптации к действии постоянного стимула. Их роль в быстроадаптирующихся моторных волокнах амфибий остается, однако, невыясненной, поскольку величина максимальной проводимости медленных каналов здесь недостаточна для полного демпфирования колебаний.

В настоящей работе нами предложен новый механизм, определяющий фазный тип импульсной активности электровозбудимой мембраны (оис. 1). Этот механизм обусловлен более сложны»,i кинетическим поведением инактивационной системы натриевых каналов. Потенциалоза-висимость воротного механизма определяется важнейшим термодинамическим параметром - эффективным зарядом, определяющим как форму нервного импульса, так и тип импульсной активности. Наши расчеты показывают, что при переносе большей величины эффективного заряда между открытым и первым закрытым состояниями инактивационной системы, как это имеет место в перехвате Xcnopus laovis (Kniffki et al., 1981), форма нервного импульса меняется незначительно при блокировании калиевых каналов. Отметим таюке, что начальное значение переменной h здесь достаточно для возникновения ритмического разряда. Совериенно иной эффект наблюдается при переносе основной части эффективного заряда между двумя закрытыми состояниями инактивационной системы; процесс реполяризацни происходит как бы в две стадии, задний фронт потенциала действия имеет излом. Наши расчеты позволяют предположить, что функциональное различие быстро- и медленноадаптирусщихся волокон, связанное со способностью генерировать повторные ответы, обусловлено тем, что в первом случае основной перенос эффективного заряда в инактивационной системе натриевых каналов происходит между двумя закрытыми состояния»;!, во втором - между открытым и закрытым (Гнетов. Крылов, 1983). Ниже на примере натриевых каналов сенсорного нейрона будет noicaaatro, что учет дополнительного закрытого состояния позволит

предсказать новый механизм регуляции как динамики функционирования самого воротного устройства, тан и импульсной активности электровозбудимой мембраны. Итак, сравнительный анализ характеристик мембранных ионных каналов моторных (быстроадаптирующихся) и сенсорных (медленноадаптирующихся) волокон свидетельствует о различии как их натриевых, так и калиевых систем. Дальнейшие эксперименты на кодирующих электровозбудимых мембранах рецепторов позволят определить физиологическую роль этих различий.

Возможная роль потенциалозависимых калиевых каналов в генерации ответов телец Пачини

Тельце Пачини брыжейки кишечника представляет собой элемент афферентного звена интерорецепторной рефлекторной дуги, в котором механическая энергия трансформируется в электрическую и возникает первичный импульсный код. Закономерности этих процессов определяются главным образом деятельностью ионных каналов, встроенных в механо- и электровозбудимые мембраны. Предполагая, что наборы ионных каналов оптимальны для выполнения тельцем Пачини функции фазного рецептора, можно попытаться выяснить роль, которую могут играть при кодировании внешних сигналов мембранные ионные системы, чувствительные к тетраэтиламмонию (ТЭА) и 4-аминопиридину (4-АП). Известно (Glover, 1982; Staniield. 1983), что ТЭА и 4-АП взаимодействуют преимущественно с калиевыми каналами возбудимых мембран. Вопрос о роли калиевых каналов в преобразовании аналог-код. происходящем на мембране первого перехвата Ранвье рецепторов, остается открытым, несмотря на то, что результаты теоретических исследований, представленные выше, указывают на ванные функции как быстрых, так и медленных калиевых каналов, которые они выполняют здесь при адаптации, частотном и числовом кодировании.

Опыты проводили на тельцах Пачини, выделенных из брыжейки тонкой кишки кошки. Методика проведения экспериментов описана ранее (Акоев, Эльман, 1974; Акоев и др., 1988), Для изучения действия ТЭА на электровозбудимую мембрану рецепторы декапсулирова-лись на 10% относительно первоначального объема, что обеспечивало доступ раствора с ионами ТЭА только к первым перехватам Ранвье. Во всех опытах отмечалось двух- трехкратное увеличение длительности потенциала действия. В некоторых случаях по мере действия

ТЗА даже в отсутствие механического стимула возникали множественные разряды, хаотически распределенные во времени. Приложение 5 ммоль/л 4-АП почти не влияло на амплитуду нервного импульса, но заметно снижало скорость реполяризации, что приводило к его удлинению приблизительно в три раза. Отметим, что скорость нарастания переднего фронта в данном случае практически не изменялась.

Попытка выяснить с помощью модели возможные механизмы действия блокаторов калиевых каналов на мембрану первых перехватов Ранвье рецептора основывалась на следующих соображениях. Во-первых, 1'ЭА в концентрации 20 ммоль/л способен полностью блокировать все компоненты калиевого тока (Dubois,, 1982), при этом релоляри-зация осуществляется за счет каналов тока утечки, плотность которых должна быть достаточной для восстановления исходного уровня мембранного потенциала после генерации нервного импульса. Во-вторых, после выключения калиевых каналов длительность потенциала действия должна изменяться в три раза. Варьирование отношения максимальной натриевой проводимости (§ца) к проводимости каналов тока утечки (gj) позволило заключить, что при выключенном калиевом токе (gK •» 0) удовлетворяются экспериментальные требования относительно существования потенциала действия и полной реполяри-аации мембраны в диапазоне 10 < gNa /gj< 30 . Максимальная длительность нервного импульса при gNa /gj =30 составила 6 мс, что соответствует приблизительно трехкратному возрастанию длительности потенциала действия после блокирования калиевых каналов. Другим регулятором длительности ответа электровозбудимой мембраны служит зависимость постоянной времени инактивационной системы натриевых каналов ( th) от потенциала (Е). С увеличением в наших расчетах максимальных значений функции th(Е) до 10, 20 и 40 мс длительность нервного импульса значительно увеличивалась - до 8, 13 и 22 мс соответственно при полной реполяризации мембраны.

Таким образом, полученные нами' данные указывают на важную роль управляемых потенциалом ионных каналов в процессе первичного кодирования, происходящего на мембране первого перехвата Ранвье тельца Пачини. В процессе поиска подходящего объекта для количественного изучения молекулярных механизмов импульсного кодирования информации электровозбудимой мембраной ш исследовали калиевые и натриевые каналы различных клеток. Их инактивационные системы также обладает кинетическими свойствами второго порядка. Нейроны спинальных ганглиев крыс оказались наиболее удобны для

решения стоящей перед нами задачи. С одной стороны, это хорошо изученный объект, на котором возможно провести количественное исследование нелинейных свойств инактивационной системы натриевых, каналов в широком диапазоне потенциалов. С другой стороны, в соответствии с нашими'данными, полученными на мембране нервного волокна, указанные свойства определяют адаптационное поведение этой •электровозбудимой мембраны. Ниже нами предпринята попытка выяснить роль натриевых каналов в процессе генерации повторных ответов мембраной сенсорного нейрона.

Моделирование кинетического поведения инактивационной системы натриевых каналов сенсорного нейрона

Применение экспериментальных и теоретических методов позволило установить, что один из механизмов регулирования импульсных ответов мембраны сенсорного нейрона оказался обусловленным кине • тическими свойствами второго порядка инактивационной системы натриевых каналов, которая, в свою очередь, может изменяться благодаря воздействию физиологически активных веществ.

Функциональная особенность нейронов спинальных ганглиев заключается в их способности к формированию фазных ответов (Peacock etal., 1973; Chen et al., 1987). Повышенная возбудимость этих клеток неизбежно привела бы к нарушению или искажению передачи информации в "линии связи" (Somjen, 1975), т.е. в рассматриваемом наш афферентном звене рефлекторной дуги. По этой причине актуален поиск эффективного механизма демпфирования повторных ответов, который базировался бы на экспериментальных данных о молекулярных характеристиках ионных каналов.

Для количественного описания h-системы ТТХ-чувствительных натриевых каналов использовали двухбарьерную модель: I—iaoj I—ia12 n ЮН- ЮН- ICi , (1)

' 'a10 ^ a21 ^ где 0 - открытое, С - закрытые состояния. Здесь а,} (I, j=0,1,2) -константы скоростей переходов между состояниями, экспоненциально зависящие от потенциала (Е): au « exp(ot,j*E + j), причем «,j. B,j - константы. Основной результат этой части работы- заключается в построении количественной модели инактивационной системы натри-

евых каналов для трех различных нейронов. Полученные константы скоростей для двухбарьерной кинетической схемы процесса инактивации представлены в таблице 1.

Таблица 1. Константы скоростей переходов для двухбарьерной модели

(-----------т 1 N нейрона! 1__________| «01 ■ 1 001 1_____ 1— " 1 1 tf10l 1_____ "" " "Г Зю 1 ______1_ t 1 «12! P12I ____1_____1. — ■ 1 «211 _____|. 021 1 _______|

1 28 1 053 11.05 I-.008I -2.911 .0041-2.131 -.111 -12.7 1

1 13 1 053 10.90 I-.007I -2.941 .0041-1.751 -.101 -12.2 1

1 26 1 1 1 .039 I-.39 1 I-.009I 1 ,. ,1 -3.291 1 .0031-2.431 1 1 -.091 1 -11.6 1 1

С помощью этих четырех экспоненциальных функций удается в сжатой форме получить для каждого нейрона на модели все основные характеристики процесса инактивации,' выявленные в трех различных типах экспериментов: при исследовании развития процесса шактива-ции, в условиях восстановления натриевой проводимости из инакти-вированного состояния и при изучении стационарной инактивационной характеристики натриевых каналов.

Зависимости от потенциала стационарных инактивационных характеристик для всех исследованных нейронов асимметричны, что становится очевидным после преобразования функции h^(Е) к виду In (1/hoc - 1). Рассматриваемая функция имеет две асимптоты. Подчеркнем, что именно на этом примере, становятся очевидными "нелинейные" свойства инактивационной системы по сравнению с "линейным" однобарьерным ее описанием, не учитывающим наличие дополнительного третьего состояния. Потенциалозависимости постоянных времени tj(Е) и хг (Е) для всех изученных нейронов носят колоколо-образный характер.

При смещении разности потенциалов на мембране в сторону деполяризации быстрий компонент инактивационного процесса становится доминантным, а медленный постепенно исчезает. При гиперполяризации наблюдается обратная картина. Потенциалозависимости как амплитудных факторов, так и постоянных времени свидетельствуют в пользу выбора схемы (1) для описания инактивационного процесса. Соответствие теоретических и экспериментальных данных является важным аргументом, подтверждающим гипотезу о кинетических свойствах второго порядка системы натриевой инактивации исследуе-

мого сенсорного нейрона. Альтернативное предположение о двух популяциях натриевых каналов представляется маловероятным, поскольку трудно предложить физический механизм зависимости от потенциала максимальной проводимости каждого из компонентов, которые, к тому же, должны были бы еще и коррелировать между собой.

Регуляция кинетического поведения натриевой инактивацданной системы с помощью модифицирующего воздействия хлорамина-Т

Нами была предпринята попытка поиска агента, способного не просто модифицировать кинетические характеристики процесса инактивации, а целенаправленно изменять молекулярные параметры, определяемые переходом между двумя закрытыми состояниями. Таким агентом оказался оксидант хлорамин-Т. Его действие на натриевые каналы различных клеток хорош изучено (Mozhayeva et al., 1990; Niemann et al.,1991), что позволило нам провести математическое моделирование этого процесса и получить необходимые количественные термодинамические данные.

Действие ХА-Т носило необратимый характер и проявлялось, в первую очередь, в изменении кинетики инактивации и появлении стационарного неинактивирующегося компонента тока. Мы добивались минимального изменения инактивационного воротного механизма используя низкие концентрации оксиданта. Кинетику инактивации удалось описать моделью (схема 1) с дополнительным закрытым состоянием и определить константы скоростей переходов (табл. 2.). С помощью полученных наборов констант скоростей установлено соответствие между теоретическими и экспериментальными характеристиками воротной системы.

Таблица 2. Константа скоростей переходов двухбарьерной модели, полученные после воздействия хлорамина-Т

N нейрона! а^ I e01 I «,0 I р10 I а12| э12 I й211

....----1-----1-----1------1-----1-----1------1-----(____.

13 1.04 I-.50 I -.0281-3.661.00031 -1.9 I-.0211-6.2 21 1.03 I-.40 I -.0301-3.761.00051 -2.4 I-.015I-6.1 26 1.025 I-.80 I -.0201-2.761.00081 -2.7 I-.010I-5.1

Анализ кинетики развития инактивации, проведенный с помогьи

одно- и двухимпульсного методов, свидетельствует о том, что данный процесс отклоняется от одноэкспоненциального. Немоноэкспонен-циальный ход процесса восстановления проводимости сохранялся и после воздействия ХА-Т. Измерения, проведенные на многих клетках, выявили уменьшение наклона кривой стационарного уровня инактивации, сдвиг- ее в область деполяризации. Потенциалозависимости постоянных времени двух компонентов инактивации также имели колоко-лообразную форму. Наблюдалось значительное уменьшение скорости восстановления каналов из инакт»шированного состояния по сравнению с контрольными опытами (значения х возрастают примерно в два раза), а также и некоторое ослабление потенциалозависимости скорости развития инактивации в области деполяризационных потенциалов. Характер зависимости от потенциала амплитудных факторов не изменился. Относительный вклад медленной экспоненты становился незначительным при экстремальной деполяризации мембраны.

Результаты обработки экспериментальных данных и проведенного моделирования позволили установить, что модифицированная ХА-Т h-система Na каналов также описывается двухбарьерной моделью, причем константы скоростей прямого и обратного переходов между закрытыми состояниями значительно снижаются. Следовательно, количественным изменением всего лишь двух констант скоростей можно объяснить эффект модифицирующего воздействия ХА-Т, что хорошо согласуется с результатами, полученными для инактивациошой системы Na каналов мембраны нервного волокна (Schmidtmayer, 1989). Мы предполагаем, что основным механизмом, обуславливающим свойства второго порядка h-системы, является механизм повторного открывания каналов (Horn, Vandenberg, 1984), обнаруженный при регистрации активности одиночных каналов. Так, согласно расчетам (Patlak, Ortiz, 1985), при деполяризации мемораны до -30 мВ вероятность повторного открывания для На канала, ' h-система которого описывается моделью Чиу (Chiu, 1977), составляет 33%.

Использование ХА-Т позволило выявить границы применения модели. Она пригодна.для объяснения экспериментальных данных, полученных на нейронах с незначительно модифицированной h-системой, когда вкладом неинактивирующегося компонента тока можно пренебречь. Вероятно, следующим иагом может явиться использование циклической модели с тремя дискретными состояниями В этом случае процесс инактивации будет описываться набором уже не четырех функций констант скоростей переходов, а пести. Здесь появляется

возможность (БсЬтШтауег, 1989)'объяснить взрывоподобное повторное открывание Ыа каналов, подвергнутых химической модификации (Ков111аг<Ц et а1., 1987; ОиапсП, 1987). В атом аспекте, вероятно, будет представлять интерес гипотеза (Раиак еЬ а1., 1986), .связывающая взрывоподобные повторные открывания На каналов с одной из мод их активности.

Расчет термодинамических параметров инактивационных воротных систем мембран нервного волокна и сенсорного нейрона

Количественные данные о константах скоростей переходов позволяют сравнить молекулярные термодинамические параметры 11-систем различных На каналов. Важнейшими из них, на наш взгляд, являются величины эффективных зарядов (табл.3).

Таблица 3. Эффективные заряды (в единицах заряда электрона) и потенциалы "равнозаселекностн" (в мВ) инактивационной системы натриевых каналов сенсорных нейронов и нервных волокон Интантные спинальные нейроны

|Н нейрона! а12 I д23 I Е12 I Егз I

I 28 1-1.591-2.961-65 1-93 I

I 13 . 1-1.561-2.701 -64' 1-100 I

I 26 1-1.251-2.421 -60 1-99 I

I__1

Нейроны с модифицированными ХА-Т натриевыми каналами

13 1-1.771-0.551 -47 1-202 1

21 1-1.171-0.301 -44 ■ t-222 1

26 1 1-1.561-0.401 -56 1-239 1 1

Мембраны нервных волокон

I Rana 1-1.691-2.991 -61 I -91 I I plplens I I 1 I I

I_ I_I _I____I__I

IX.laevla l-2.96l-l.14l -65 I -60 I

I_____I

Результаты анализа термодинамических характеристик инактива-ционной системы позволяют сделать два важных вывода. Во-первых, основной перенос заряда между двумя закрытыми состояниями происг ходит как в исследованном нами сенсорном нейроне, так и в мембране нервного волокна Rana pipiens, отличающейся своими фазными свойствами. Эти фазные характеристики импульсных ответов нейронов спинапьных ганглиев будут рассмотрены ниже. Здесь же подчеркнем, что основной перенос эффективного Заряда между двумя закрытыми состояниями в соответствии с развиваемым нами предположением является важнейшим фактором, обуславливающим фазный тип активности электровозбудимой мембраны, Второй важный результат анализа термодинамических характеристик рассматриваемой воротной системы заключается в том, что обнаружен принципиально новый механизм регулирования ее динамического поведения. Этим регуляторным звеном служит дополнительный переход между двумя закрытыми ■ состояниями. Каши данные свидетельствуют о том/ что главным образом именно здесь происходит взаимодействие с оксидантом: хлорамин-Т резко уменьшает величину эффективного заряда, переносимого между закрытыми состояниями, оставляя соответствующий заряд, переносимый между открытым и закрытым состояниями почти неизменным. Можно предположить, что дополнительное закрытое состояние инактивацион-ной системы натриевых каналов расширяет возможности для регулирования импульсных ответов электровозбудимых мембран с помощью различных биологически активных веществ. Они могут иметь свой специфический центр связывания при переходе воротной системы между двумя ее закрытыми состояниями.

Возможная функциональная роль кинетических свойств второго порядка натриевой инактивационной системы мембраны нейрона

Простейшие механизмы регулирования импульсной активности нейронов с помощью потенциалозависимых ионных каналов могут быть разделены на два основных типа. Медленное регулирование импульсной активности с помощью управляемых потенциалом кальциевых и кальцийзависимых калиевых каналов характерно, по-видимому, для тонических нейронов (Миронов, 1984; СТау, 1985). Быстрое регулирование связано с деятельностью натриевых и калиевых управляемых

- 21 - '

потенциалом ионных каналов. По своим морфологическим и электрофизиологическим характеристикам нейроны спинальных ганглиев могут быть разделены на четыре группы (Harper, Lawson, 1985). Входящий ток этих клеток переносится ионами кальция и натрия, причем вклад натрий-калиевого. потенциалозависимого и кальций-калиевого-каль-цийзависимого механизмов в генерацию ответов нейронов различен не только для нейронов разных групп (Yoshida et al., 1978), но и изменяется в процессе онтогенеза (Федулова и др., 1986; Yoshlda, Matsuda, 1979). Наши расчеты показывают, что инактивационная система натриевых каналов, осуществляя отрицательную обратную связь при Функционировании мембранного генератора, определяет фазный тип активности сенсорного нейрона и действует на малых временах. Этот тип активности характерен для мембран, включающих в себя управляемые потенциалом натриевые и калиевые каналы (Крылов, Маковский, 1979; Akoev et al., 1988).

Согласно литературным данным, несколько механизмов -'было предложено для объягнения адаптации мембраны нейронов к действию постоянного стимула (Jack et al., 1983). Приводятся доказательства участия в этом явлении электрогенного натриевого насоса и кальцийзависимой калиевой проводимости (Nakajlraa, Onodera. 1969; Sokolove, Cooke, 1971; Gestrelius et al., 1981; Ottoson,Swerup, 1985a, 1985b). Для одного объекта, однако, тактильного нейрона таракана Periplaneta americana, установлено, что ни система активного транспорта, ни калиевая или хлорная проводимости, ни любой процесс, связанный со входом ионов кальция в клетку, не способен явиться причиной адаптации (French, 1985; 1В86а, 1986b; Ramírez, French, 1990). Вероятным механизмом, способны».! регулировать частоту повторных ответов этого нейрона, остается натриевый механизм адаптации. Приложение 10 ммоль/л хлорамина-Т привело к резкому изменению рисунка ритмической активности. Фазный тип его импульсной активности превратился в тонический (French, 1987). К сожалению, использованная в этих экспериментах методика внеклеточной регистрации не позволяет судить об изменении формы потенциала действия.

Наши расчеты показывают, что в случае, когда поведение инак-тивационной системы подчиняется кинетике первого порядка, наблюдаются обычные (Connor, Stevens. 1971с) ответы мембраны на изменение постоянного стимулирующего тока (1„) в физиологическом диапазоне его амплитудных значений (0-5 нА). При этом в одних

I - 22 -

• случаях (при начальном значении переменной натриевой инактивации 1)0 » 0,5) при увеличении 1п одиночный потенциал действия возникает во всем диапазоне стимулов, в других - при большем значении переменной Ь0 » 0,63 - за одиночным ПД следуют подпороговые колебания, которые сменяются при росте 1в бесконечной серией повторных периодических ответов.

Усложнение модели, в основе которого лежит учет кинетических свойств второго порядка натриевой системы инактивации, качественно изменяет характер ответов мембраны. Их отличительная особенность - появление конечных серий импульсов. Длительность таких серий зависит от амплитуды тока. Число повторных ответов возрастает при увеличении амплитуды стимула, причем при 1т <0,8 нА эта зависимость линейна, а при больших его значениях линейность нарушается и появляются серии повторных ответов, состоящие максимум из семи потенциалов действия. Дальнейший рост тока (1и >2,0 нА) сопровождается уменьшением межимпульсных интервалов, андершутов и снижением числа повторных ответов, так что при значении 1„ = 3,5 нА возникает одиночный ПД, после которого наблюдается деполяриза-ционный следовой потенциал.

Отметим, что возбудимость мембраны и при учете кинетических свойств второго порядка также сильно зависит от положения стационарной инактивационной характеристики относительно оси потенциалов. Так, сдвиг этой кривой на 5 мВ в сторону деполяризации (110 (Е) = 0,65) приводит к резкому росту крутизны зависимости стимул - ответ при числовом кодировании, которое при 1п > 0,65 нА сменяется частотным. Этот эффект свидетельствует о том, что стационарная инактивационная характеристика нейрональной мембраны является важнейшей функцией, регулирующей ее возбудимость, подобно тому, как это имеет место для электровозбудимой мембраны сенсорного нервного волокна (Уа11Ьо, 1964).

Наши расчеты показывают, что в случае, когда инактивационная система обладает свойствами второго порядка, величина потенциала покоя (Ег) оказывает регулирующее влияние на импульсную активность. При Ег - -51 мВ мембрана находится в покое. Увеличение Ег приводит к генерации одного ПД при значении Ег = -52,5 мВ, трех ПД при Ег - -53 мВ, пяти - при Ег - -54 мВ, одиннадцати - при Ег » -100 мВ. Таким образом,. сдвиг потенциала в гиперполяризационную область повышает возбудимость мембраны сенсорного нейрона, увеличивая число потенциалов действия в ее фазном ответе.

Регуляция импульсной активности величиной потенциала покоя была исследована в экспериментах на таламических нейронах нз срезов мозга морской свинки (Jahnsen, Llinas, 1984а, 1984b). Здесь было обнаружено, что при изменении Ег происходит переход от активности фазного типа к тонической, связанный, по-видимому, с изменением вклада инактивационной системы медленного кальциевого тока в процесс генерации повторных ответов.

Учет кинетических свойств второго порядка инактивационной системы позволяет с помощью параметра модели - максимальной плотности натриевых каналов - производить тонкую настройку мембранного генератора на выполнение определенной функции. Так, если 1ца -О,8 мкСм. при изменении стимулирующего тока в диапазоне 0,4 нА < Im < 1,0 нА функция вход-выход нейрона при числовом кодировании практически линейна. При уменьшении gi(a до 0,6 мкСм эта функция становится S-образной.

Плотность натриевых каналов в различных электровозбудимых. мембранах меняется в широких пределах (Holden, Yoda, 1981), однако экспериментальные значения 1ца нейронов спинальных ганглиев крыс обычно ограничены сверху (Веселовский и яр., 1986). Наши расчеты показывают, что синтез натриевых каналов действительно должен быть ограничен, поскольку при переходе через определенное критическое значение (в навей модели это 0,7 мкСм) даже кинетические свойства второго порядка инактивационной системы не способны снизить возбудимость и осуществить демпфирование ритмического разряда.

Анализируя полученные данные, отметим, что нейроны спинальных ганглиев представляют собой удобный объект для исследования тончайших механизмов регуляции импульсной активности с помощью электроуправляемых ионных каналов. Тот факт, что при Созревании этих нейронов доля кальциевых каналов по отношению к натриевым канала;,( снижается (Yoshida. Matsuda, 1979) или в результате динамического процесса дифференцировки остаются только натриевые и высокопороговые кальциевые каналы (Федулова и др., 1986), свиде-» тельствует о том, что предложенный нами механизм демпфирования повторных ответов за счет кинетических свойств второго порядка натриевой инактивационной системы моает играть определяющую роль в формировании фазного поведения электровозбудимой мембраны для одного или нескольких типов нейронов спинальных ганглиев. Исключив из рассмотрения кальциевый компонент ионного тока, мы получи-

ли эффекты, обусловленные лишь "нелинейностями" или свойствами второго порядка натриевой инактивационной системы. Несмотря на то. что эти нелинейности очень малы (согласно нашим данным, амплитуда дополнительного медленного процесса составляет лишь 10% от амплитуды процесса инактивации), они могут лежать в основе важного физиологического эффекта, обуславливая фазное поведение сенсорного нейрона.

Роль оксиданта в регуляции возбудимости мембраны сенсорного нейрона. Модификация модели типа Ходжкина-Хаксли учетом констант скоростей, полученных в наших экспериментах (табл. 2), позволила обнаружить следующие эффекты. Происходит резкое (почти пятикратное) увеличение длительности,потенциала действия. Этот эффект, как и в случае мембраны нервного волокна, легко объясняется увеличением постоянных времени инактивационной системы. Можно предположить, что такое усиление возбудимости может облегчить дальнейшую передачу нервного импульса. Однако тоническая импульсация в этом случае, разумеется, невозможна. Нам все же удалось получить на модели импульс обычной формы благодаря значительному увеличению плотности калиевых каналов. При этом несколько увеличена была и плотность натриевых каналов с модифицированной воротной системой инактивации. Ее регуляторный эффект в этом случае проявлялся в сдвиге рабочего диапазона стимулирующих токов вправо, в сторону больших токов, по сравнению с обнаруженным ранее процессом натриевого числового кодирования. Это указывает на возможный механизм сопряжения, который может регулироваться с помощью ней-ропептидов или других биологически активных веществ, электровозбудимой и рецепторной или синаптической мембран.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

На наш взгляд особенно важен ответ на вопрос о том, насколько общими могут считаться рассмотренные выше молекулярные механизмы регуляции импульсной активности. Проведенные нами экспериментальные исследования показали, что не только сенсорные мембраны обладают отмеченными выше нелинейными характеристиками ионных каналов. Инактивационная система натриевых каналов культивируемых клеток гипофиза, секретирующих гормон роста, также обладает свойствами второго порядка. Эти свойства могут изменяться с по-

мощью токсина скорпиона Buthus Martensiг. Интересен ' также тот факт, что система инактивации быстрых калиевых каналов нейронов моллюска подчиняется кинетике, как минимум, второго порядка. Анализируя возможный механизм регуляции указанной инактивационной системы с помощью 4-аминопиридина. мы предположили, что этот бло-катор изменяет величины констант скоростей переходов в закрытые состояния. Однако наиболее удобным объектом, на котором удалось провести проверку этой гипотезы, оказались ТТХ-чувствительные натриевые каналы нейронов спинальных ганглиев крыс. Учет дополнительного состояния инактивационной системы позволил выяснить скрытый механизм регуляции воротного устройства натриевого канала с помощью модифицирующего воздействия ХА-Т. Малая концентрация оксиданта привела к изменению главным образом констант скоростей и, следовательно, термодинамических характеристик второго дополнительного перехода между двумя закрытыми состояниями инактивационной системы, которые в гаассической модели рассматриваются как единое кнактивированное состояние. В соответствии с нашей гипотезой дополнительное состояние инактивационной системы имеет важное физиологическое значение: нелинейные свойства инактивации определяют адаптационные характеристики электровозбудимой мембраны, осуществляющей преобразование аналоговых сигналов в код нервных импульсов. В какой мере инактивационные системы натриевых и других каналов могут регулироваться физиологически активными веществами с помощью предложенного нами механизма, покажут будущие исследования.

Проведенный нами анализ функциональной роли потенциалозави-_ симых ионных каналов ограничивался исследованием довольно наглядных функций вход-выход электровозбудимой мембраны: рисунком ее импульсной активности в ответ на ступеньку стимулирующего тока и частотной характеристикой. Изучение возможной роли ионных каналов в формировании более сложных характеристик импульсной активности нейрона выполнено нами на примере клетки Ретциуса медицинской пиявки. Частичное выключение калиевых каналов приводит к изменению стохастического поведения мембраны как генератора нервных импульсов. Согласно обнаруженной Вернером и Маунткаслом закономерности снижение чувствительности функции "вход-выход" возбудимой мембраны при больших значениях стимула компенсируется снижением вариабельности ее ответов (Werner, Mauntcastle, 1963). При этом пред-

полагается, что дисперсия представляет собой лишь шум в линии связи. Наши данные находятся в соответствии с результатами цитируемых авторов. Потеря чувствительности зависимости "стимул-ответ" при интервальном кодировании на больших значениях входной переменной компенсируется снижением дисперсии распределения межимпульсных интервалов в серии ПЛ. ТЭА и в атом случае нарушает оптимальность настройки мембранного генератора, значительно увеличивая дисперсию межимпульсных интервалов по сравнению с данными контрольных экспериментов. Результаты, полученные нами для Hirudo medicinalis, показывают, что уже на этом этапе филогенеза действует закон Вернера-Маунткасла для частотной передаточной функции, установленный ранее при исследовании центральной нервной системы теплокровных животных.

•ВЫВОДЫ

1. Расчеты на модели типа Ходжкина-Хаксли мембраны нервного волокна,■ показали, что различие ионной избирательности быстрых и

. медленных калиевых каналов служит фактором, регулирующим рабочий диапазон электровозбудимой.мембраны при числовом кодировании.

2. Расчеты на модели, основанные на наших экспериментальных данных, привели к заключению, что мембрана первого перехвата Ранвье тельца Пачини отличается высокой плотностью калиевых каналов, а соотношение максимальной проводимости натриевых каналов и проводимости каналов тока утечки находится в строго определенном диапазоне: 10 < gNa/gi < 36.

' 3. Теоретический анализ роли дополнительного состояния инак-тивационной воротной системы нервного вологаа позволил предсказать новый натриевый механизм адаптации и числового кодирования.

4. С помощью метода регистрации активности целой клетки (Patch-clamp метода) экспериментально установлено, что стационарг ная характеристика инактивационной системы тетродотоксинчувстви-тельных натриевых каналов нейронов спинапьных ганглиев крыс является асимметричной функцией. Потенциалозависимость каждой из двух постоянных времени инактивационного процесса носит колоколообраз-ный характер. Относительный вклад быстрого компонента этого процесса увеличивается при деполяризации.

5. Полученные экспериментальные данные позволили разработать двухбарьерную модель инактивационной системы мембраны сенсорного

нейрона, учитывающую ее дополнительное закрытое состояние. Рассчитанные константы скоростей переходов удовлетворительно воспроизводят на модели всю совокупность экспериментальных характеристик инактивационного процесса.

6. Расчеты на модели типа Ходжкина-Хаксли, построенной для мембраны сенсорного нейрона, показали, что учет дополнительного закрытого состояния инактивационной • системы натриевых каналов обусловливает переход к фазному типу импульсной активности, а также ведет к расширению возможностей регулирования ответов электровозбудимой мембраны, выступающей в качестве преобразователя аналог-код. Адаптационные характеристики мембраны могут регулироваться уровнем мембранного потенциала, плотностью натриевых каналов, величиной стационарной инактивации при потенциале покоя.

7. Хлорамин-Т в концентрации 0,1 ммоль/л модифицирует инак-тивационную систему, изменяя главным образом константы скоростей переходов между двумя закрытыми состояниями. Эта модификация воротной системы приводит, как показывают расчеты ла построенной нами математической модели сенсорного нейрона, к изменению его возбудимости, что проявляется в удлинении нервного импульса и в сдвиге рабочего диапазона стимулирующих токов при числовом кодировании.

8. Термодинамические характеристики системы инактивации натриевых каналов нейрона спинальных ганглиев крысы близки к соответствующим параметрам мембраны быстроадаптирующегося нервного волокна Rana pipiens, что свидетельствует об общности молекулярных физических процессов генерации натриевого тока теплокровных и холоднокровных животных.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Крылов Б.В. Калиевый и натриевый механизмы адаптации мембраны перехвата Ранвье// XIV съезд Всесоюзного физиологического общества им. Павлова. Рефераты лекций, тезисы докладов и сообщений на симпозиумах. Баку, 1.983. Т. 1. С. 45-46.

2. Крылов Б.В. Возможный натриевый ионный механизм адаптации электровозбудимой мембраны нервного волокна// Нейрон и межнейронная интеграция. Материалы конф. Л.: Наука, 1983. С.75-76.

3. Крылов Б.В. Моделирование адаптации мембраны перехвата Ранвье нервного волокна к действию постоянного тока как реэуль-

тата инактивации натриевых каналов// Нейрофизиология. 1983. Т. 15, N 5. С. 535-539.

4. Вислобоков А.И., Крылов Б.В., Акоев Г.Н. Преимущественное блокирование 4-аминопиридином каналов быстрого калиевого тока нейронов моллюска// Физиол. журн. СССР. 1983. Г. 69, N11. С. 1420-1426.

5. Akoev G.N., 'GnetovA.V., KrylovB. V., Nazdrachev A.D. Possible role of the molecular characteristics of the sodium channel lnactlvatlon system In impulse coding// J. Theoret. Neu-robiol. 1984. Vol.3, N 2. P.51-65.

6. Гнетов A.B., Крылов Б.В. Кинетика второго порядка инактивации натриевой проводимости. Термодинамический и физиологический тесты// Доклады АН СССР. 1984. Т. £74, N6. С. 1511-1514.

7. Акоев Г.Н., Крылов-Б.В., Толстиков В.Е. Кинетика инактивации быстрых калиевых каналов мембраны нейронов моллюска// Биологические мембраны. 1985. Т.2, N 5, С. 516-518.

8. Гнетов А.В., Крылов Б.В. Возможная роль молекулярных характеристик инактивационной системы натриевых каналов нервного волокна.в импульсном кодировании//Физиол. журн. СССР. 1985. Т. 71, N 1. С.95-104. •

9. Катина И.Е., Крылов Б.В., Лонский А.В. Аналого-импуль-сное преобразование в миелинизированном волокне. Роль калиевых каналов в числовом кодировании// Физиол.журн. СССР. 1985. Т. 71, N 7. С. 862-866. •

10. Костяева О.В., Крылов Б.В., Подзорова С.А. и др. Гибкая интерактивная система автоматизации физиологических исследований// Планирование и автоматизация эксперимента в научных исследованиях. Тез. докл. VIII Всесоюз. конф. (Секция 3. Автоматизированные системы научных исследований). Ленинград, 1986. Л.: ЛГУ, ЛЭТИ,.' МЭИ, Гос. комитет СССР, по науке и технике, АН СССР. 1986. С. 47.

11. Крылов Б.В. Свойства второго порядка системы инактивации быстрых калиевых каналов мембраны нейронов моллюска// Тез. докл. Всесоюз. конф. по нейронаукам, посвященной столетию Д.С.Воронцова. Киев, 1986. С. 26-28.

12. Домарацкий А.Н., Суворов Н.Ф., Крылов Б. В. и др. Гибкий программно-аппаратный комплекс для автоматизации физиологических исследований// Тез. докл. XV съезда Всесоюз. физиол. об-

щества им.И.П.Павлова. Кишинев, 1987. Л.: Наука, -1987. С. 607-608.

13. Крылов Б.В. Ионные механизмы кодирования сигналов в афферентном звене рефлекторной дуги// Тез,докл. 'Всесоюз. конф., посвященной 80-летию В. Н. Черниговского, Ленинград, 198?. С.' 74.

14. Акоев Г.1!., Киров С.А., Крьшоо Б.В., Подзорова С.А. Кинетика инактивации тетродотоксинчувствительных натриевых каналов нейронов спинальных ганглиев крыс// Физиол. журн. СССР. 1988. Т. 74, N 6. С. 802-808.

15. Akoev G.W., Alekseev N. P.. Krylov B.V. Mechanorecep-tors. Tiieir functional organization. Berlin, Heidelberg, New York. London, Paris, Tokio: Springer-Verlag, 1988. 197 P.

16. Акоев Г.H., Крылов Б.В., Цой С.Л. Возможная роль по-тенциалозависимых калиевых каналов в генерации ответов телец Пачини// Нейрофизиология, 1988. Т. 20. N 5. С. 623-630.

17. Акоев Г.Н., Дик O.E., Киров С.А.. Крылов Б.В. Натриевый механизм торможения импульсной активности нейронов спинальных ганглиев крыс // Матер. II Всесоюз. конф. по нейронаукам. Киев, 1988. С. 173 - 174.

18. Каплюченко В.Н., Киров С.А., Крылов Б В., Подзорова С. А. Модель инактивационной воротной системы ТТХ-чувствительных натриевых каналов сенсорного нейрона // Цитология. 1990. ,Т. 32, H 9. С. 934.

19. Киров С.А., Крылов Б.В., Каплюченко В. 11. Модель инактивационной системы натриевого канала сенсорного нейрона// Сенсорные системы. 1990. Т. 4, N 3. С. 271-278.

20. Крылов Б.В., Лукашкин А.Н. Усилитель для одновременной регистрации и стимуляции с помощью одного электрода// Сенсорная физиология рыб (методические аспекты). Апатиты: изд-во Кольского научного центра, 1990. С. 31-33.

21. Лик O.E., Крылов Б.В. Математическое моделирование фазного типа импульсной активности сенсорных нейронов// Сенсорные системы. 1991. Т. 5, N 3. С. 60-69.

22. Акоев Г.Н., Крылов Б.В., Лукашкин А.Н. Ответы электровозбудимой мембраны клетки Ретциуса при модифицирующем воздействии тетраэтиламмония//Журн. звол. физиол. и биохимии. 1992. Т. 29, N 1. С. 49-56.

23. Bauer С.К.. Krylov B.V., Zhou P.-A., Schwarz J.R. Sodium currents of GH6/B6 cells are differently affected by two

fractions of Buthus Kartensii (Karsch) scorpion venom// Pflûgers Arch. 1992. Vol.420, Suppl. R28.

24. Bauer C.K., Krylov B.V., Zhou P.-A., Schwarz J.R. Effects of Buthus Martensti (Karsch) scorpion venom on sodium currents in rat anterior pituitary (GH3/B6) cells// Toxicon. 1992. Vol. 30, N 5/6. P. 581-589.