Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы действия этанола на потенциалозависимые натриевые каналы сенсорных нейронов крысы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы действия этанола на потенциалозависимые натриевые каналы сенсорных нейронов крысы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. И. П. ПАВЛОВА

На правах рукописи

ВИ ЛИН Юрий Юрьевич

МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ЭТАНОЛА НА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМЫЕ НАТРИЕВЫЕ КАНАЛЫ СЕНСОРНЫХ НЕЙРОНОВ КРЫСЫ

03.00.02 - Биофизика 03.00.13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н. Б. В. Крылов, д.м.н. С. А. Куценко.

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

Работа выполнена в Институте физиологии им. И. П. Павлова РАН, Санкт-Петербург

Научные руководители: доктор биологических наук,

Б. В. Крылов, доктор медицинских наук, проф., С. А. Куценко, Официальные оппоненты: Чл. - корр. РАН, доктор медицинских наук,

профессор Я. А. Альтман Доктор биологических наук, профессор, М. И. Сологуб Ведущее учреждение: Физиологический научно-

исследовательский институт им. А. А. Ухтомского СПБГУ

Защита состоится «20 » £>(С7~Л<£р& 1997 г. в -/У час на заседании Диссертационного совета по защите кандидатских диссертаций (К 002.36.01) Института физиологии им. И. П. Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И. П. Павлова РАН

Автореферат разослан » 1997 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биол. наук

О. Г. Чивилева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Выдающиеся отечественные ученые внесли большой вклад в изучение действия алкоголя на организм человека. И.М. Сеченов посвятил свою докторскую диссертацию физиологии алкогольного опьянения (Сеченов, 1860). Влияние алкоголя на высшую нервную деятельность позже было исследовано в работах ИШ Павлова (Павлов, 1949) и его учеников (Петрова, 1945; Федоров, 1949). Биохимические основы действия алкоголя на центральную нервную систему были систематически изучены в работах И. А. Сытинского (Сытинский, 1975; 1980).

Особое ' место в мировой литературе занимает исследование взаимодействия спиртов с ионными каналами. Несмотря на большое количество работ в этой области, специфические механизмы действия этанола (EtOH) все еще изучены в недостаточной степени. В настоящее время существуют альтернативные гипотезы, с позиций которых могут объясняться возможные молекулярные механизмы действия п-алканолов на ионные каналы.

Гипотеза "модулированного рецептора" (Armstrong and Hille 1972; Hille, 1977) объясняет наблюдаемые, эффекты связыванием лигандов с активным центром (рецептором), структурно связанным с макромолекулой ионного канала.

Согласно гипотезе Хейдона (Haydon, Urban, 1983), п-алканолы, взаимодействуя с мембраной, Moiyr изменять ее толщину, влияя на трансмембранное электрическое поле (Haydon et. al., 1980) и зависимые от потенциала воротные характеристики ионных каналов (Elliott, Elliott, 1990).

Современные данные не указывают на существование конкретного молекулярного механизма действия этанола на ионные каналы. ЕЮН в концентрации 200 ммоль вызывает не зависимое от дозы снижение амплитуды натриевых ионных токов аксона кальмара (Moore et. al., 1964). Наиболее вероятными кандидатами на роль специфической мишени действия этанола могут считаться синаптические НМДА- и ГАМКд-активируемые каналы центральных нейронов млекопитающих (Lovinger et. al., 1989; Weight et. al. 1991; Ticku, 1991). Для этих типов каналов показано снижение амплитуды токов при действии этанола в концентрации 50 ммоль. Приложение 10 ммоль EtOH приводит к ингибированию кальциевых токов L - типа (Wang et. al., 1991). Подчеркнем, что амплитуда ионного тока является интегральным параметром. Количественные данные ь

о дозозависимом механизме связывания этанола с вероятной специфической мишенью в структуре ионного канала отсутствуют.

В последнее время появились данные, что нечувствительные к тетродотоксину (ТТХГ) натриевые каналы, впервые обнаруженные киевскими исследователями (Веселовский и др., 1980), играют особую роль в рецепторных приборах. Натриевые ТТХ, - каналы участвуют в кодировании ноцицептивной (Borovikova, et. al., 1996) и обонятельной (Trotier, 1986) информации. Исследование процессов регуляции ТТХГ - каналов различными фармакологическими агентами, в частности этанолом, вероятно, позволит глубже понять физиологическую роль каналов этого типа.

Нейроны спинальных ганглиев являются хорошо изученным и удобным объектом для исследования характеристик натриевых каналов, поскольку мембрана этих клеток имеет как ТТХГ - каналы, так и «классические», тетродотоксинчувствительные (ТТХ,) каналы (Hodgkin, Huxley, 1952 а).

При исследовании ионных каналов весьма существенным является вопрос, происходит ли изменение их характеристик после замещения вне-и внутриклеточной среды на экспериментальные растворы. Известно, что буферы водородных ионов способны оказывать влияние на кинетические характеристики ионных каналов (Hanrahan, Tabcharani, 1990). In vivo физиологические значения pH поддерживаются бикарбонатным и фосфатным буферами. В экспериментах in vitro наиболее часто применяемыми буферами ионов водорода являются HEPES (Ы-[гидроксиэтил] пиперазин -Ы'-[2-этансульфоновая кислота]) и TRIS ([2-амино-2-(гидроксиметил) пропан-1,3-диол]). В связи с этим возникает необходимость установить, какой из двух видов буферов является более близким к бикарбонатному буферу и не влияет на характеристики активационных и инактивационных воротных систем натриевых каналов. Цели и задачи исследования. Целью работы явилось изучение молекулярных механизмов действия этанола на натриевые каналы сенсорных нейронов. Были поставлены следующие задачи:

1. Установить, какой вид буфера не влияет на инактивационное воротное устройство и эффективный заряд (Zea), переносимый в активационном воротном устройстве при открывании натриевых каналов.

2. Исследовать механизмы взаимодействия этанола и воротных систем натриевых каналов, а также его влияние на Zeff.

3. Исследовать механизмы действия этанола на ионную избирательность натриевых каналов.

Научная новизна. В результате проведенной работы впервые показано, что ТШБ-буфер, в отличие от НЕРЕБ-буфера, вызывает необратимые изменения воротных систем натриевых каналов, значительно ускоряя процессы инактивации и уменьшая величину переносимого в их активационных воротных системах. Бикарбонатный буфер не ускорял кинетику инактивационного процесса, а также не уменьшал величину НЕРЕБ-буфер, таким образом, является более близким к естественной бикарбонатной буферной среде, по сравнению с Т1Ш-буфером.

Впервые установлено, что этанол в низких концентрациях (К0 = 450 мкмоль) вызывает обратимое уменьшение активационного воротного устройства ТТХГ - каналов.

Приложение этанола с двух сторон мембраны в концентрации от 10 ммоль и выше приводит к необратимому снижению ионной избирательности ТТХГ - и ТТХ, - каналов и смещению максимума ионной избирательности от X к XI ряду селективности Айзенмана. Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные представляются важными для понимания молекулярных механизмов действия этанола на натриевые каналы сенсорных нейронов.

Результаты и выводы работы могут быть использованы в медицине и фармакологии для реализации новых способов целенаправленного воздействия на функционирование сенсорных систем при некоторых формах патологии, а также для чтения учебных курсов по биофизике, нейрофизиологии и нейробиологии.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на: 1 Всероссийской конференции молодых физиологов и биохимиков России (С.-Петербург, 1995), 1 Всероссийской конференции токсикологов (С.-Петербург, 1995), Международном симпозиуме, посвященном памяти академика В.Н. Черниговского (С.-Петербург, 1997), ХХХШ Международном конгрессе физиологических наук (ШРБ) (С.-Петербург, 1997), Сателлитном симпозиуме международного конгресса физиологических наук (Россия, Колтуши, 1997). По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, вывода и списка литературы, содержащего 169 источников. Работа иллюстрирована 46 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Неидентифицированные нейроны спинальных ганглиев выделяли из областей L5 - Si спинного мозга новорожденных крыс линии Wistar (2-5 дней) по методу, предложенному П. Г. Костюком и соавторами (Kostyuk, et. al. 1981). Иссеченные ганглии помещали в раствор, состоящий из среды Игла и раствора Хэнкса (1:1). В качестве буфера водородных ионов использовали HEPES-Na в концентрации 10 ммоль. Ферментативную обработку проводили, добавляя в раствор 2 мг/мл коллагеназы (тип 1А) и 1 мг/мл проназы Е ("Sigma"). Продолжительность ферментативной обработки при температуре 32-34 °С составляла 10-15 минут. После ферментативной обработки ганглии тщательно отмывали в растворе Хэнкса с соевым ингибитором трипсина (100 мкг/мл, тип IS, "Sigma"). Клетки высевались в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм. Культуру клеток поддерживали в среде Игла на основе раствора Эрла с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота ("Sigma", США), 40 U/мл гентамицина при температуре 36 °С. Для экспериментов отбирались полностью изолированные тела нервных клеток диаметром от 15 до 30 мкм. Клетки использовали в опытах в течение двух суток. Работа выполнена на 210 статистически обработанных нейронах.

Регистрация ионных токов. В работе использовали «patch-clamp» метод в конфигурации "регистрация тока от целой клетки" («whole-cell») (Hamill et. al. 1981). Этот метод впервые был предложен Neher and Sakmann (Neher, Sakmann, 1976). Хочется отметить, что создатели метода были удостоены Нобелевской премии 1991 года в области физиологии и медицины.

Эксперименты проводили с помощью аппаратно-программного комплекса, включающего в себя усилитель фирмы "List Electronics", цифро-аналоговый и аналого-цифровой преобразователь, IBM-совместимый персональный компьютер и систему автоматизации научных исследований (Крылов и др., 1996).

Растворы. Для исследования воротных характеристик натриевых токов применяли растворы следующего состава (ммоль). Внеклеточный раствор N 1 (ммоль): NaCl - 65, CsCl - 100, СаС12 - 2, MgCl2 - 2, HEPES Na - 10, pH = 7,4. Внутриклеточный раствор N 2 (ммоль): CsF - 100, CsCl - 40, NaCl -10, MgCl2 - 2, HEPES-Na - 10, pH = 7,2. Исключение ионов калия из растворов позволило избавиться от всех компонентов калиевого тока, а ионы фтора во внутриклеточном растворе обеспечивали блокирование

кальциевых токов (Kostyuk et. al., 1975). В этих экспериментах также использовали бикарбонатный буфер. Растворы с бикарбонатным буфером готовили непосредственно перед регистрацией ионных токов, Добавляя в них 10 ммоль бикарбоната натрия. Затем рН растворов снижали до 7,4 -7,2, насыщая их углекислотой.

Для измерений зависимости потенциалов реверсии ионных токов от внеклеточной концентрации натрия применяли ¡ растворы N 2. Внеклеточный раствор N2 (ммоль): [NaCl] - изменялась в диапазоне от 140 до 30, [CsCl] - изменялась в обратных пределах от 25 до -115, СаС12 - 2, MgCl2-2, Tris-10, рН = 7,4. Внутриклеточный раствор N2 (мМоль): NaCl - 10, CsF - 100, CsCl - 40, Tris -10, MgCl2 - 2, pH= 7,2. -

В экспериментах по исследованию ионной избирательности натрйевых каналов ионы натрия во внеклеточном растворе N 2 замещались ¿¿'ионы Cs+, Rb+ , Li+ , Na+ в концентрации 100 ммоль (Chandler, Meves, 1965). Изменения осмолярности при этом компенсировали добавлением во внеклеточный раствор 50 ммоль ТЕА-С1.

Этанол использовали в концентрациях 0-100 ммоль. В тех случаях, когда условия эксперимента требовали присутствия этанола с внутренней стороны мембраны, микроэлектрод заполнялся внутриклеточным раствором, содержащим этанол, причем, такая же концентрация этого агента была и во внеклеточном растворе. Такой способ приложения исключает возможность появления мембранных эффектов исследуемого агента в результате изменения осмотического равновесия (Kukita, Mitaku, 1993)

В'экспериментах по исследованию активационной воротной системы натриевых каналов применяли неспецифический антагонист опиоидных - рецепторов налоксон ("Sigma", США). Налоксон вводили во внеклеточный раствор й концентрации Юмкмоль.

Фармакологическое разделение натриевых токов. Все измерения проведены на нейронах, мембраны которых включали в себя один из двух типов натриевых каналов. Для выделения «чистых» ТТХГ натриевых токов во внеклеточный раствор N 1 вводили 200 нмоль тетродотоксина (ТТХ) (Elliott, Elliott, 1993). Это приводило к полному устранению TTXS токов. ТТХ, - каналы блокировали в конце опыта . 5 ммоль Со2+ (Веселовский и др., 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Кинетика инактивации натриевых каналов сенсорных нейронов зависит от вида буфера водородных ионов. Замена HEPES-буфера на TRIS-буфер почти не сказывалась на кинетике инактивационного процесса TTXS Na-токов, но приводила к заметному ускорению динамики спада заднего фронта ТТХ, Na-токов. Нами установлено, что TRIS-буфер смещает стационарную инактивационную характеристику h^(E) в область более низких потенциалов, а также ускоряет кинетику восстановления проводимости из инактивированного состояния ТТХ, - и ТТХ, - натриевых каналов. Этот процесс необратим, поскольку обратная замена TRIS-буфера на HEPES-буфер не приводила к восстановлению исследованных характеристик инактивационной воротной системы каналов. Бикарбонатный буфер не оказывал влияния на кинетику инактивационного процесса.

Влияние буферов водородных ионов на эффективный заряд активационного воротного устройства натриевых каналов. В результате данной серии экспериментов установлено, что процесс переноса эффективного заряда в активационной воротной системе натриевых каналов может регулироваться ионами TRIS. Для анализа этого процесса по данным «пиковых» вольт-амперных характеристик строили графики «хордовой» проводимости для обоих типов каналов.

GNa(E) = INam»/(E-ENa). (1)

Здесь 1катах - амплитудное значение тока при деполяризующем потенциале Е, ENa - величина потенциала реверсии натриевого тока (Hodgkin, Huxley, 1952 a, d). Число открытых каналов (N0) пропорционально величине хордовой проводимости GNa(E), а число закрытых каналов (Nc) соответствует {GNamax - GNa(E)} (Hodgkin, Huxley, 1952, d; Armstrong, Bezanilla, 1973; Keynes, Rojas, 1973; Almers, 1976). Тогда (Алмерс, 1981),

lim (N0 / Ne ) = lim [GNa(E)/ {GNamax - GNa(E)}] = E -oo E —> -oo

= Const exp (Zefi*e*E / kT) (2)

Здесь Const - константа, не зависящая от Е, е- величина заряда электрона,

к - постоянная Больцмана, Т - абсолютная температура, Zeff - заряд, переносимый в активационном воротном устройстве натриевых каналов при е - кратном изменении Е. (Hodgkin, Huxley, 1952, d). В нашей работе, используя уравнение (2) установлено, что значения Zeff ТТХГ - и ТЩ, -каналов в присутствии HEPES и бикарбонатного буферов составляют 5,6±0,2 (п=18) и 5,7+0,3 (п = 15) зарядов электрона, соответственно. Отметим, что эти величины Zeff в контрольных условиях оставались постоянными в течение всего периода регистрации

Применение TRIS-буфера (10 ммоль) снижало величину Zeff активационного воротного устройства ТГХГ каналов, максимально, с 5,6+0,2 до 4,5±0,2 зарядов электрона (п = 10). В случае ТТХ3 натриевых каналов снижение величины Zeff после приложения TRIS-буфера в той же концентрации было меньшим, с 5,7±0,3 до 4,9±0,3 зарядов электрона (п = 12). Во всех случаях снижение Zcg активационной воротной системы каналов под влиянием ионов TRIS было необратимым.

На основании полученных данных, можно заключить, что HEPES-буфер является более адекватной средой при исследовании воротных процессов натриевых каналов.

Дальнейшие эксперименты по исследованию влияния этанола на воротные системы проводились нами с использованием только HEPES-буфера.

Этанол в низких концентрациях уменьшает величину Zeff активационной системы ТТХГ каналов. Исследовали изменения величины Zeff при воздействии широкого диапазона концентраций этанола. 1 ммоль EtOH вызывает снижение амплитудных значений ТТХГ - токов во всех экспериментах, (рис. 1, вставка). На рисунке 1, А показаны «пиковые» вольт-амперные характеристики этих каналов. Видно, что после приложения ЕЮН изменяется крутизна левой ветви вольт-амперной кривой. Это позволяет предположить, что обнаруженный эффект может быть обусловлен модификацией стационарных характеристик активационной или инактивационной воротных систем. Исследование стационарных инактивационных характеристик и процессов восстановления проводимости ТТХ, - натриевых каналов из инактивированного состояния показало, что этанол практически не взаимодействует с их инактивационной воротной системой.

Дальнейший анализ данных был проведен с использованием уравнений (1)и (2).

Внеклеточное приложение 1 ммоль этанола приводило к смещению функции Gns(E) ТТХГ - каналов в гиперполяризационном направлении на

10+5 мВ, а также к снижению Zl:SIактивадионной системы этих каналов от 5.6±0,2 до 3.7±0,3 (рис. 1, Б). Максимальное снижение ZeJf составило с 5.6±0,2 до 2.6±0,3. Подчеркнем, что величина никогда не снижалась до нуля. В противном случае канал полностью потерял бы потенциалочувствительность. Изменение параметра было выбрано для оценки «эффекта» этанола при построении функции Хилла.

лг /дгтах =1-{1/[1+(К0 / [ЕЮН])"}, (3)

где дг = (геВ - 1ев га!п) / (геЕГтах - Хс1Ттах и - максимальное и

минимальное значения эффективного заряда, Кв - константа диссоциации, [ЕЮН] - концентрация этанола, X - коэффициент Хилла. Использование уравнения (3) позволило определить значение X = 0,9, что свидетельствует о взаимодействии этанола с молекулой ТТХГ - натриевого канала в стехиометрии 1:1. К0 еюн составляет 450 мкмоль (рис. 1, В).

Взаимодействие этанола с ТГХ, - каналами носит обратимый характер. Значение Ze£f в контрольном эксперименте составляло 5,6±0,2, а после приложения 450 мкмоль этанола величина стала равна 4,4±0,3 (п = 3). После восстановления исходного ионного состава внеклеточного раствора величина составила 5,2+0,3 (п = 3). Удаление этанола из наружного раствора приводило также к почти полному восстановлению положения Ома(Е) относительно оси потенциалов.

Неспецифический антагонист опиоидных рецепторов налоксон устраняет вызванное этанолом снижение активационной системы ТТХг - каналов. Установлено, что после подачи 10 мкмоль налоксона был равен 5,7±0,3 (п=5). Последующее приложение 1 ммоль этанола на фоне налоксона практически не приводило к снижению величины (5,4+0,3, п=7). Отметим, что налоксон вводили в раствор каждые 5 минут. Влияние этанола на потенциалы реверсии натриевых токов. В этой серии экспериментов было исследовано изменение потенциала реверсии ТТХг-и ТТХ5-натриевых токов в контрольных опытах и после приложения этанола с двух сторон мембраны в концентрации 10 ммоль.

На вставке рисунка 2 показаны семейства ТТХГ - натриевых токов в контрольных условиях и после приложения этанола. Результатом его действия становится появление выходящих натриевых токов. Зависимости потенциалов реверсии ТТХг-и ТТХ8-натриевых токов от концентрации ионов натрия во внеклеточном растворе представлены на рисунке 2 А и Б.

Е, мВ

-30 о

Вставка. Семейства ТТХ, натриевых токов до в после приложения 1 ммоль этанола. Тестирующий потенциал

изменялся от -50 до 40 мВ. Калибровка тока: 180 пА, отметка времени: 3 мс.

4

S й

t £

-4

-30

0,01 0,1 1 10 [EtOH], ммоль

100

о

о

Рис. 1. Этанол снижает величину Ъ^ активационного воротного устройства ТТХГ натриевых каналов. А - Вольт-амперные характеристики ТТХ, каналов в контрольном опыте (черные кружки) и после приложения 1 ммоль этанола (белые кружки). Б - Влияние этанола на потенциапочувствительность активационной воротной системы ТТХГ натриевых каналов. Черные кружки - значения функции (1), данные контрольного эксперимента. Белые кружки - значения той же функции после приложения этанола в концентрации 1 ммоль. Показан тангенс угла наклона регрессионных прямых, который позволяет определить величину активационной воротной системы. В - Зависимость изменения величины эффективного заряда активационной воротной системы от

концентрации этанола. Черные кружки - средние значения величин Д2е{г. Сплошная кривая - результат расчетов с использованием уравнения (3) при Кц = 450 мкмоль и X = 0.9. Показано количество измерений (п) для каждой точки графика.

Вставка. Семейства ТТХг-натриевых токов, полученных в контрольном эксперименте (верхний рисунок) н после вне- и внутриклеточного приложения 10 ммоль этанола (нижний рисунок). Мембранный потенциал изменялся в диапазоне от -50 до 40 мВ. Токи утечки вычтены программным способом, емкостные токи оставлены без изменений.

Ш 5

г Ш

70 г

35 -

2,3

3,2 4,1 ИИаЬи«

Рис. 2. Зависимость потенциалов реверсии двух типов натриевых токов от логарифма концентрации внеклеточного натрия. А - зависимости Ег от [№]ои, ТТХГ - каналов. Б - те же зависимости для ТТХ5 - каналов. Черные кружки - средние значения Ег в контрольных опытах, белые кружки - средние значения Ег после приложения 10 ммоль этанола с обеих сторон мембраны. Каждая точка соответствует числу измерений (п = 7). Жирная прямая соответствует теоретическим значениям потенциалов реверсии, расчитанных по уравнению Нернста. По оси ординат отложены значения потенциала реверсии, по оси абсцисс представлены значения логарифма концентраций ионов натрия с наружной стороны мембраны.

Отметим два важных момента, которые следуют из результатов наших измерений. Во-первых, приложение этанола ведет к резкому (почти на 15 мВ, при [Na]out=140 ммоль) снижению потенциала реверсии как TTXS-, так и ТТХ, - натриевых токов. При этом зависимость потенциалов реверсии обоих типов натриевых каналов соответствует уравнению Гольдмана-Ходжхина-Катца при значениях PCs/PNa = 0-02 в контрольных экспериментах и 0.095 при воздействии этанола. Во-вторых, сдвиги потенциалов реверсии в случае как ТТХГ, - так и ТТХ, - натриевых каналов, практически не отличаются (рис. 2, А, Б), Это позволяет предположить, что этанол одинаковым образом изменяет характеристики их ионной избирательности. В следующей серии экспериментов исследовали ионную избирательность натриевых каналов. С помощью уравнения Гольдмана-Ходжкина-Катца установлено, что в контрольных условиях ионная избирательность ТТХГ - каналов соответствует X ряду селективности Айзенмана: Na>Li>Rb>Cs=l :0.8<0.2<0.02, что хорошо согласуется с ранее полученными данными для этих каналов (Веселовский Н.С. и др., 1980). В присутствии этанола ряд селективности приближается к XI ряду: Na=Li>Rb>Cs=l:l<0.25<0.095. Это может свидетельствовать о том, что селективный фильтр обеих популяций натриевых каналов теряет ионную избирательность по отношению к ионам натрия при действии этанола в концентрации 10 ммоль.

ОБСУЖДЕНИЕ

Для исследования процессов взаимодействия фармакологических агентов с воротными структурами ионного канала необходимо создать экспериментальные условия для адекватной регистрации их характеристик. При образовании конфигурации «whole-cell», внутриклеточная среда клетки замещается на раствор в микроэлектроде (Hamill et. al., 1981), что, может вести к изменению параметров воротных систем ионных каналов (Hanrahan, Tabcharani, 1990).

HEPES и TRIS являются буферными системами, которые наиболее часто применяются в «patch-clamp» - экспериментах. Поэтому вопрос, какой из двух видов буферов ближе к естественной бикарбонатной среде, является очень важным.

В настоящей работе Установлено, что ионы TRIS необратимо связываются с воротными устройствами вне зависимости от места приложения (вне- или внутриклеточный раствор). При этом ускоряются кинетические воротные процессы, а также происходит значительный сдвиг

стационарной инактивационной характеристики ТТХГ - каналов в область более отрицательных потенциалов. Присутствие TRIS - буфера1 приводит к уменьшению величины Zeff, переносимого в активационной воротной системе натриевых каналов, причем этот эффект необратим. Применение HEPES и бикарбонатного буферов не приводило к подобным изменениям воротных характеристик.

На основании этих данных мы заключаем, что HEPES - буфер более адекватен по отношению к характеристикам воротных систем натриевых каналов, чем TRIS-буфер. Именно HEPES-буфер мы использовали для исследования влияния ЕЮН на эффективный заряд активационного воротного устройства.

Эффективный заряд активационного воротного устройства является одним из фундаментальных термодинамических параметров

ионного канала, определяющий потенциалочувствительность канала в целом (Hodgkin, Huxley, 1952 a, d). Нами установлено, что этот параметр ТТХГ - каналов регулируется этанолом в зависимости от его дозы (рис. 1, В). Анализ этого взаимодействия с помощью функции Хилла (3) показал, что один канал, по-видимому, взаимодействует с одной молекулой этанола (коэффициент Хилла X = 0,9), а Ко Е,0н составляет 450 мкмоль (рис. 1, В). Это позволяет предположить, что взаимодействие этанола с молекулой натриевого канала носит характер лиганд - рецепторного связывания.

В последние годы появились данные, указывающие на связь опиоидных рецепторов с кальциевыми и калиевыми каналами (Christie, 1991; Gianoulakis, 1996). Нам удалось показать, что неспецифический антагонист опиоидных рецепторов налоксон устраняет вызванное этанолом снижение величины Zeff (5,7±0,3 в контрольных экспериментах и 5,4±0,3 после приложения этанола и налоксона). Вероятно, опиоидный рецептор может быть связан с макромолекулой ТТХГ - канала. Связываясь с опиоидным рецептором, молекула этанола, возможно, способна запускать каскад реакций, эффекторным звеном которых служит активационное воротное устройство натриевого канала.

Снижение величины Ze¡¡ сопровождается, также, сдвигом вольт-амперной характеристики и функции GNa(E) в гиперполяризационном направлении на 10±5 мВ (рис 1, А, Б). Этот эффект, вероятно имеет компенсаторный характер, поскольку уменьшение значения параметра Zcff ведет к снижению потенциалочувствительности канала, а смещение Gn3(E) в область отрицательных значений Е увеличивает возбудимость мембраны нейрона.

Необходимо отметить, что в случае ТТХ, - натриевых каналов этанол в таких низких концентрациях не приводил ни к снижению Ъ^к, ни к сдвигу Ома(Е). Можно предположить, что каналы этого типа не имеют молекулярного механизма связывания ЕЮН.

Нами обнаружен еще один новый эффект этанола. Установлено, что данный препарат в концентрации 10 ммоль и выше вызывает снижение потенциалов реверсии натриевых токов (рис. 2, вставка). Полученные данные свидетельствуют о том, что смещение потенциалов реверсии двух типов натриевых каналов может быть обусловлено лишь изменениями селективного фильтра натриевых каналов. Величина снижения потенциалов реверсии одинакова для обоих типов каналов. Это может свидетельствовать о том, что селективные фильтры ТТХГ - и ТТХ3 - каналов сходным образом реагируют на приложение этанола. Присутствие этанола в экспериментальном растворе приводит к смещению максимума ионной избирательности с X к XI ряду Айзенмана, сближению величин коэффициентов проницаемости исследуемых катионов по отношению к ионам натрия. Эти данные прямо указывают на модифицирующее действие этанола на селективные фильтры ТТХ, - и ТТХв - натриевых каналов. Таким образом, при воздействии этанола натриевые каналы в значительной степени теряют свою избирательность.

Изменение потенциалов реверсии наблюдалось при концентрациях этанола 10 ммоль и выше. С другой стороны, при исследовании молекулы бактериородопсина На1оЬас1егшт Иа!оЫит, показано, что этанол в концентрации 50-100 ммоль разрывает водородные связи между сегментами макромолекулы." Это приводит к частичному нарушению четвертичной структуры этого белка, причем его вторичная структура остается интактной (Mitak.ii, е1. а1., 1988). Можно предположить, что четвертичная структура молекулы натриевого канала, также, по-видимому, стабилизируется с помощью водородных связей подобно тому, как это имеет место в случае других макромолекул (ЕгщеЬпап, 1982). Вероятно этанол , в таких концентрациях, разрывая водородные связи, способен модифицировать молекулярную структуру селективного фильтра, что может проявляться в обнаруженном эффекте снижения ионной избирательности.

В нашей работе обнаружены новые механизмы действия этанола, которые могут, объяснять некоторые процессы начальной стадии алкогольной интоксикации, наблюдающиеся при [ЕЮН] = 1-5 ммоль. Снижение ионной избирательности натриевых каналов при более высоких

концентрациях (10 ммоль и выше) может быть одним из механизмов токсического действия этанола на ЦНС.

ВЫВОДЫ

1. HEPES-буфер (1Ч-[гидроксиэтил] пиперазин -N'- [2-этансульфоновая кислота]) и бикарбонатный буфер не приводят к снижению эффективного заряда активационной воротной системы натриевых каналов и не влияют на скорость инактивационного процесса. TRlS-буфер ([2-амино-2-(гидроксиметил) пропан-1,3-диол, (tris)]), уменьшает эффективный заряд вне зависимости от места приложения (вне- и внутриклеточная среда). Уменьшение величины эффективного заряда составляет от 5,6+0,2 (контрольные эксперименты) до 4,5±0,3 (после предъявления ионов TRIS) для ТТХГ - каналов и от 5,6±0,3 до 4,9±0,2 в случае TTXS - каналов.

2. Этанол, взаимодействуя с молекулой ТТХГ натриевого канала, уменьшает эффективный заряд активационного воротного устройства. Установлено, что для данного взаимодействия KD этанола составляет 450 мкмоль, а коэффициент Хилла равен 0,9. Максимальное снижение величина эффективного заряда составляло с 5,6±0,2 (контрольные эксперименты) до 2,6±0,2 (после воздействия этанола).

3. Этанол при его приложении с двух сторон мембраны нейрона в концентрациях 10 ммоль и выше модифицирует селективный фильтр ТТХ,-и ТТХ5 - натриевых каналов. Ионная избирательность ТТХГ - каналов, в контрольных экспериментах соответствующая X ряду Айзенмана (Na>Li>Rb>Cs = 1:0.8<0.2 <0.02) снижается, а ее максимум смещается к XI ряду (Na = Li > Rb >Cs = 1:1<0.25<0.095).

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Ю. Ю. Вилин, С. А. Ковалева, В. Б. Крылова. Этанол и его метаболит ацетальдегид блокируют натриевую проводимость мембраны сенсорных нейронов// В кн.: «Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций». Материалы

конф. молодых физиологов и биохимиков России. С.-Петербург, 1995. С.ЗЗ.

Куценко СЛ., Вилин Ю.Ю., Подзорова С.А., Крылов Б.В. Блокирующее действие этанола и его метаболита ацетальдегида на потенциал-зависимые натриевые каналы сенсорных нейронов.// В кн. «Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии». Материалы 1 Всероссийской конф. токсикологов. С.-Петербург, 1995, С. 59.

Б.В. Крылов, С.А. Подзорова, Ю.Ю. Вилин. Кинетика инактивации каналов сенсорных нейронов зависит от вида буфера водородных ионов// Физиол. журнал, 1996, N 7, С. 1-10.

Б.В. Крылов, Ю.Ю. Вилин, С.А. Подзорова, Н.И. Чалисова. Натриевые каналы сенсорных нейронов как возможная молекулярная мишень действия этанола// Сенсорные системы, 1996, Т. 10, N 4, С. 52-66.

Ю.Ю.Вшган, Б.В.Крылов, С.А.Подзорова. Возможный механизм взаимодействия этанола с тетродотоксиннечувствительными натриевыми каналами сенсорных нейронов// Сенсорные системы. 1997, Т. 11, N 3, С. 323-332.

Ю.Ю. Вилин. HEPES как адекватная буферная система для ионов водорода при исследовании инактивационных процессов натриевых каналов сенсорных нейронов// В кн. "Проблемы интероцепции". Материалы международного симпозиума, посвященного памяти академика В.Н. Черниговского к 90-летию со дня рождения. 1997. С.-Петербург С. 30-31.

В. V. Krylov, Yu. Yu. VUin, S. A. Podzorova, N. Z. Klueva. Can the TTXr sodium channels be modulated by extracellular ethanol membrane receptors?// XXXIII International Congress of Physiological Sciences. Abstracts. 1997. P002.21