Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование электровозбудимости у развивающихся в культуре эмбриональных скелетных миоцитов лягушки

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Терентьев, Дмитрий Александрович, Санкт-Петербург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ

ИМЕНИ И.М.СЕЧЕНОВА

На правах рукописи УДК 591.175: 577.352.3/46+57.085.23:57.032

ТЕРЕНТЬЕВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ФОРМИРОВАНИЕ ЭЛЕКТРОВОЗБУДИМОСТИ У РАЗВИВАЮЩИХСЯ В КУЛЬТУРЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СКЕЛЕТНЫХ МИОЦИТОВ

ЛЯГУШКИ

03.00.13 - Физиология человека и животных

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор Г.А. Наследов

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1999

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

I. 1. Потенциалозависимые ионные каналы мембраны скелетной мышцы 11

I. 2. Натриевые каналы 13

I. 3. Кальциевые каналы 15

I. 4. Потенциалозависимые калиевые каналы 18

I. 5. Калиевые каналы входящего выпрямления ■...■ 21

II МЕТОДИКА И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 25

II. 1. Культивирование клеток 25

II. 2. Регистрация потенциалозависимых ионных токов и изменений мембранного потенциала 27

III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ 30

III. 1. ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИИ ПЛОЩАДИ ПОВЕРХНОСТНОЙ МЕМБРАНЫ И МЕМБРАНЫ Т-СИСТЕМЫ МИОЦИТОВ В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ 30

III. 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ОСНОВНЫХ СВОЙСТВ ТРАНСМЕМБРАННЫХ ИОННЫХ ТОКОВ МИОЦИТОВ. 33

III. 2. 1. Натриевый ток 34

III. 2.2. Кальциевые токи 36

III. 2. 3. Потенциалозависимые калиевые токи 38

III. 2. 3.1. Изменения кинетических характеристик 1к в процессе развития 38

III. 2. 3.2. Фармакологический анализ потенциалозависимых 1к 41

III. 2. 4. Калиевый ток входящего выпрямления. 45

III, 2, 4,1, Модулирующее влияние 4-АП на lir 52

III. 3. ДИНАМИКА ЭКСПРЕССИИ ИОННЫХ ТОКОВ МИОЦИТОВ И ФОРМИРОВАНИЕ ЭЛЕКТРОВОЗБУДИМОСТИ 56

III. 3.1. Количественные изменения К+ тока входящего выпрямления миоцитов в процессе развития; потенциал покоя 56

III. 3.2. Количественные изменения Na+ и потенциалозависимых К+ ионных токов миоцитов в процессе развития; потенциал действия 58

III. 3.3. Количественные изменения Са2+ ионных токов миоцитов в процессе развития 63

IV ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 65

IV. 1. Потенциал покоя и калиевые каналы входящего выпрямления 65

IV. 2. Натриевые и потенциалозависимые калиевые каналы; потенциал действия 68

IV. 3. Кальциевые каналы 70

IV. 4. Качественные изменения потенциалозависимого 1к 73

IV. 5. Модулирующее влияние 4-аминопиридина на калиевые каналы входящего выпрямления 74

IV. 6. Заключение 76

ВЫВОДЫ 80

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 83

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

АТФ - аденозинтрифосфат

4-АП - 4-аминопиридин

ВАХ - вольт-амперная характеристика

ДТП - дигидропиридин

ГТФ - гуанозинтрифосфат

Ел - постоянный поддерживаемый потенциал

Еконд - кондиционирующий потенциал

Етест - тестирующий потенциал

Ег - потенциал реверсии

Ек - равновесный потенциал д ля ионов К+

ПД - потенциал действия

1111 - потенциал покоя

СМВ - скелетно-мышечное волокно

ТТХ - тетродотоксин

ТЭА - тетраэтиламмоний

ЭМС - электромеханическое сопряжение

1ка - натриевый ток

т V» о

1к - потенциалозависимыи калиевыи ток

X О

lea - кальциевым ток

Iir - калиевый ток входящего выпрямления Iatp - АТФ-зависимый калиевый ток

ВВЕДЕНИЕ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Становление механизмов электровозбудимости в ходе онтогенетического развития организма - одна из важных проблем физиологии возбудимых мембран. Изучение развития электровозбудимости мембраны скелетно-мышечного волокна (СМВ) с помощью эмбриофизиологического приема исследования (Гинецинский, 1961) не только улучшает понимание физиологии проводящей функции мышечной мембраны, но и позволяет определить некоторые особенности становления этой функции в миогенезе и эволюции.

Для всех мышц позвоночных мышечная дифференциация сопровождается арестом клеточного цикла, транскрипционной активацией мышечно-специфичных генов, слиянием одиночных миоцитов в мультинуклеарные миотубы и, наконец, установлением контактов с нейронами. До самого последнего времени работ, посвященных развитию возбудимости сарколеммы и механизмов ее регуляции в онтогенезе, было не так много. Но в последние 5 лет интерес к этой проблеме значительно возрос и появился целый ряд статей, где дискутируются вопросы о роли процесса слияния (Constantin et al., 1995), иннервации (Altiok et al., 1995, Pasino et al., 1996), взаимозависимости экспрессии ионных токов (De Luca et al., 1994; Greaves et al., 1996; Linsdell, Moody, 1994, 1995; Villaroel, Sakmann, 1996) и последовательности событий в развитии возбудимости скелетно-мышечных клеток. При этом остается большое количество неразрешенных вопросов.

Для развивающихся мышечных клеток характерными являются присутствие динамично сменяющегося "набора" и/или изменения уровня экспрессии практически для каждого описанного класса каналов и

рецепторов как то: потенциалозависимые натриевые каналы (Frelin et al., 1981; Kubo, 199la,б), калиевые каналы задержанного выпрямления (Ernsberger, Spitzer, 1995; Ribera Spitzer, 1991; Zemkova et al, 1989) калиевые каналы входящего выпрямления (Chautah-Patel, Spruce, 1997; Hancock et al., 1996), АТФ-зависимые калиевые каналы (Honore, Lazdunski, 1995; Tricarico et al., 1997), кальциевые дигидропиридин-чувствительные каналы (Bulteau et al., 1996), хлорные каналы (De Luka et al., 1990), никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (Missias et al.,1996, Romano et al.,1997).

До сих пор данные, полученные разными авторами, носят разрозненный характер; в исследованиях использовались различные объекты и методические подходы, в основном исследователи сосредотачивались на изучении одного конкретного типа каналов на определенных стадиях развития. Интерпретация результатов часто усложнялась, так как не были запрещены слияние миоцитов в миотубы и установление контактов с нейронами.

Как объект исследования электровозбудимости, зрелое СМВ лягушки изучено наиболее полно (Adrian et al., 1970а,b; Adrian, Peachey, 1973; Almers, Pallade, 1981; Lynch, 1985, Hencek et al., 1988). Поэтому удобной для сравнения и подходящей для комплексного изучения качественных и количественных изменений в процессе формирования электровозбудимости представляется культура эмбриональной мышечной ткани лягушки.

Учитывая все вышесказанное, мы поставили ЦЕЛЬЮ НАСТОЯТЦЕЙ РАБОТЫ исследование становления электровозбудимости мембраны скелетно-мышечной клетки лягушки на ранних этапах его онтогенетического развития.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1) Выяснить, до какой степени система электрогенеза может развиться на одиночной клетке, то есть насколько экспрессия ионных каналов, обеспечивающих электровозбудимость, определяется миогенными факторами, не связанными с нервной или эндокринной регуляцией.

2) Проследить последовательность событий в процессе формирования электровозбудимости, качественные и количественные изменения потенциалозависимых интегральных ионных токов, потенциала покоя и потенциалов действия у развивающихся в культуре скелетных миоцитов лягушки.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1) В процессе развития миоцитов в условиях, запрещающих как деление, так и слияние клеток, при отсутствии нейрональной и эндокринной регуляции, экспрессируются все основные типы потенциалозависимых ионных токов: тетродотоксин-чувствительный натриевый ток, быстрый и медленный кальциевые токи, а также токи через калиевые каналы входящего и задержанного выпрямления.

2) С различной динамикой все эти токи претерпевают количественные изменения.

3) Потенциалозависимый калиевый ток в процессе развития претерпевает не только количественные, но и качественные изменения, касающиеся в основном кинетики инактивации быстрой фазы.

4) Экспрессия медленного

Са тока происходит параллельно увеличению площади Т-системы. Медленные Са -каналы/ДГП-рецепторы, играющие важную роль в процессе электромеханического сопряжения, с самого начала мышечной дифференцировки встраиваются непосредственно в мембраны Т-системы.

5) В процессе развития одиночных миоцитов лягушки на ранних стадиях дифференцировки происходит формирование механизма генерации натриевого потенциала действия.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЙ. Был проведен детальный кинетический и фармакологический анализ интегральных потенциалозависимых ионных токов скелетной мышечной клетки лягушки Rana temporaria на ранних стадиях миогенеза. Показано, что миоциты обладают количественно и качественно изменяющимся в ходе миогенеза набором трансмембранных потенциалозависимых ионных токов через натриевые, кальциевые ДТП-чувствительные и низкопороговые ДТП-нечувствительные, калиевые задержанного и входящего выпрямления каналы. Впервые на эмбриональных скелетных миоцитах лягушки была исследована динамика изменений потенциала покоя и потенциалов действия. Также впервые было показано активирующее влияние 4-аминопиридина, "классического" блокатора потенциалозависимых калиевых каналов, на К+-ток входящего выпрямления.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Полученные данные дают существенный материал для понимания эволюции проводящей функции мышечной мембраны и развития процессов возбуждения и сокращения на ранних этапах миогенеза. Результаты исследования подтверждают, что культивирование одиночных миобластов лягушки дает уникальную возможность широкого изучения онтогенетических аспектов процессов возбуждения.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на следующих научных собраниях: на 1(Х1) Международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996 г.); на 25 Европейской мышечной конференции (Монтпелъе, 1996 г.); на XXXIII Международном Конгрессе физиологических наук (Санкт-Петербург, 1997 г.); на 42 ежегодной конференции Биофизического общества (Канзас Сити, Миссури, 1998 г); на 27 Европейской мышечной конференции (Лунд, 1998 г.); на XVII Съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998

г.)

ПУБЛИКАЦИИ: Основные результаты диссертации отражены в тринадцати публикациях.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методики, изложения результатов, дискуссии, выводов и списка литературы. Она изложена на 104 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 рисунками и 3 таблицами. Библиография включает 173 наименования.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В процессе эмбрионального развития скелетных мышц in vivo недифференцированные клетки должны пройти несколько важнейших этапов. Сначала клетки активно делятся, затем происходит слияние миоцитов в миотрубки, которые образуют контакты с нейронами. Развитие клеток in vitro в значительной степени зависит от условий их культивирования. В нашей лаборатории была разработана оригинальная методика культивирования первичных эмбриональных скелетных миоцитов лягушки (Lukyanenko et al., 1993). В течение 10 дней клетки развиваются в условиях, запрещающих как деление, так и слияние миоцитов в миотрубки. Однако несмотря на такие условия, клетки не только остаются жизнеспособными, но у нас есть основания полагать, что программа миогенеза запущена и до некоторой степени реализуется. Подтверждением этому служат результаты исследования структурной дифференцировки миоцитов (Наследов и др., 1998). Было выявлено, что слияние миоцитов в миотрубки не является необходимым условием образования в мышечных клетках сократительного аппарата с развитыми саркомерами, а также специализированных мембранных структур (Т-системы и триад), обеспечивающих электромеханическое сопряжение. Параллельно со структурно-морфологической специализацией происходят другие важные процессы: активно синтезируются мышечно-специфичные белки, обеспечивающие возбудимость мышечных клеток, экспрессируются мембранные каналы, ответственные за активный и пассивный мембранный транспорт. К 5-6-му дню развития в культуре миоциты приобретают способность сокращаться в ответ на деполяризацию, вызывающую вход кальция через потенциалозависимые Са2+-каналы (Nasledov et al., 1992). Морфологические исследования выявили, что в этот период клетки имеют сформированный

сократительный аппарат и триадные структуры. У культивируемых одиночных миоцитов крысы, не сливающихся в миотрубки, было показано сопряжение процессов возбуждения и сокращения (Constantin et al., 1995), а на эмбриональных миоцитах лягушки Xenopus выявлено, что отсутствие нейронального влияния не препятствует экспрессии Са2+-каналов (Moody-Corbett, Virgo, 1991).

Таким образом, не имеющие контактов с нейронами и не сливающиеся культивируемые миоциты способны достигать довольно продвинутых стадий мышечной дифференцировки, причем последовательность событий in vitro во многом повторяет последовательность in vivo.

Возбуждение в нервных и мышечных клетках обеспечивается движением ионов через ионные каналы клеточных мембран. Ионный канал - это гомо- или гетеромультимерная макромолекулярная трансмембранная пора, обладающая свойством избирательно пропускать тот или иной ион. По принципу избирательности каналы делятся на Na , К , Ca и Cl". По механизму, определяющему открытое и закрытое состояние канала, выделяют потенциалозависимые, лигандуправляемые, механочувствительные и др. каналы (Hille, 1992).

Впервые формальное описание изменений проницаемости возбудимой мембраны было предложено Ходжкиным и Хаксли в работе на гиганском аксоне кальмара (Hodgkin, Huxley, 1952).

Потенциалозависимые ионные каналы мембраны скелетной мышцы.

Прямые измерения трансмембранных ионных токов на мышечных волокнах стали производиться приблизительно с 20-летней задержкой по

сравнению с началом таких исследований нервных волокон. Это было связано с трудностью разработки адекватного метода фиксации потенциала на мышечной мембране. Деполяризация мышечного волокна выше -55мВ вызывает его сокращение. Кроме того, наличие у мышечных волокон Т-системы существенно затрудняет возможность создания удовлетворительных условий пространственной фиксации потенциала. В настоящее время вся полученная информация об ионных токах у скелетных мышц получена с использованием нескольких разновидностей метода фиксации потенциала: методы с применением внутриклеточных микроэлектродов (Adrian et al., 1970а; Adrian, Marshall, 1977); методы с использованием внеклеточных электродов при изоляции малых участков мышечной мембраны с помощью сахарозных (Ildefonse, Rougier, 1972) и вазелиновых мостиков (Hille, Campbell, 1976). В последнее время наиболее популярным и информативным методом исследования ионных токов является метод отведения от участков мембраны при помощи специального стеклянного электрода в условиях высокоомного контакта -пэтч-кламп (Hamill et al., 1981).

Электрическое раздражение мышечного волокна приводит к изменению ионной проводимости мембраны, обусловленному прохождением через натриевые, кальциевые и калиевые каналы токов соответствующих ионов. (Adrian et al., 1970а; Beaty, Stefani, 1976; Sanchez, Stefani, 1978; Stanfield, 1977). Ионная проводимость мышечной мембраны в покое обеспечивается функционированием хлорных каналов и калиевых каналов входящего выпрямления (Hodgkin, Horovicz, 1959; Adrian, Frey gang, 1962). Далее дается более подробное описание каждого из этих типов каналов.

Натриевые каналы

Потенциалозависимые натриевые ионные каналы ответственны за увеличение натриевой проницаемости во время начальной быстрой фазы деполяризации потенциала действия у большинства электровозбудимых клеток. Потенциалозависимый натриевый ток СМВ лягушки - быстрый входящий ток, чувствительный к тетродотоксину (ТТХ - 0.5 мкМ) (Adrian et al., 1970а; Hille, Campbell, 1976). Для описания кинетики INa были использованы формальные выражения модели Ходжкина-Хаксли (Adrian et al., 1970а). Кинетическая модель натриевого канала приведена в работе Хилле и Кэмпбелла (Hille, Campbell, 1976). Согласно модели, натриевый канал - это протеиновый комплекс, состоящий из селективного фильтра, воротного механизма и сенсора напряжения. Натриевый ток достигает пиковых значений обычно в течение 0.5-3.0 мс при Максимальные значения амплитуды 1ка отмечаются при тестирующем потенциале -20 - -30 мВ. После достижения пикового значения In3 быстро инактивируется. Скорость и стационарный уровень инактивации зависят от потенциала. Постоянная времени инактивации (т) при тестирующем потенциале (ЕтеСт), соответствующем максимальному значению амплитуды тока, равна примерно 1.5 мс при

1-5 °С (Mandrino, 1977; Stefani, Chirandini, 1982). Стационарный уровень инактивации (hoo)

изменяется от 1 до 0 в диапазоне потенциалов -100---40 мВ (Adrian et al.,

1970а).

Относительная проницаемость натриевых каналов представлена последовательностью: Na>Li>NH4>K (1: 0.96: 0.11: 0. 048) (Cambpell, 1976). Воротные характеристики и селективность натриевых каналов СМВ у лягушки и у млекопитающих близки (Adrian, Marshall, 1977; Duval, Leoty, 1980; Pappone, 1980).

Показано, что натриевый канал скелетной мышцы млекопитающих состоит из двух белковых субъединиц: а и Рь Следует отметить высокую гомологию белков Na+ - каналов не только разных позвоночных животных, но даже беспозвоночных (дрозофила) и позвоночных, установленную методами молекулярного клонирования (Noda et al., 1984; Trimmer et al., 1989; Salkoff et al., 1987).

К настоящему времени на мышечных волокнах млекопитающих описано 2 типа потенциалозависимых Na+ - каналов, различающихся по чувствительности к тетродотоксину. ТТХ-устойчивые каналы кодируются геном hi и экпре�