Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нативный фитохром овса: особенности конформационного состояния красной и дальней красной форм in vitro

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Нативный фитохром овса: особенности конформационного состояния красной и дальней красной форм in vitro"

ргБ ОД

r-«— ti

2 i дс» - 5

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

УДК 581.1.03:535.15:577.3

КОЖУХ Геннадий Викторович

НАТИВНЫЙ ФИТОХРОМ ОВСА: ОСОБЕННОСТИ КОНФОРМАЦИОННОГО СОСТОЯНИЯ КРАСНОЙ И ДАЛЬНЕЙ КРАСНОЙ ФОРМ IN VITRO

03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск -1998

Работа выполнена в Институте фотобиологии HAH Беларуси

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор,

академик HAH Беларуси Волотовский И.Д.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Джагаров Б.М. доктор физико-математических наук Немкович H.A.

Оппонирующая организация:

Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита состоится "23" flEMBPfl 1998 года в Л46* часов на заседании совета по защите диссертаций (Д 01.37.01) в Институте фотобиологии HAH Беларуси по адресу: 220072 Минск, ул. Академическая, 27. Телефон ученого секретаря - 284-23-57

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии HAH Беларуси

Автореферат разослан "¿О" _1998 года

Ученый секретарь

совета по защите диссертаций,

кандидат биологических наук

Л.Ф. Кабашникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Семейство фитохромов (фитохромы А, В, С, D, Е) является наиболее изученным из известных растительных фоторецепторов. В этиолированных растениях в пуле фитохромов большая часть приходится на фитохром А. До настоящего времени остаются неизвестными »механизмы реализации фитохром-зависимых эффектов в растении. Известно, что их стартовым событием является конформационное превращение при трансформации красной в дальнюю красную форму. Поэтому актуальной задачей является выявление конформационных различий между физиологически активной Фдк- и неактивной Фк-формами фитохрома А физико-химическими методами.

Актуальность подобного исследования обусловлена также необходимостью пересмотра полученных ранее результатов на частично деградированном фитохроме (60 кДа и 114/118 кДа), так как оказалось, что физико-химические свойства нативного (М.М.= 124 кДа) и деградированных видов хромопротеина существенно отличаются.

В рамках решения данной задачи актуальной является разработка эффективной методики выделения нативного фитохрома А, поскольку по известным методикам выделение хромопротеина занимает продолжительное время и имеет невысокий выход очищенного препарата.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Отдельные этапы научных исследований, результаты которых обобщены в представленной работе, выполнялись в рамках Республиканской программы фундаментальных исследований по темам:

- "Исследование зависимости регуляторных свойств фитохромной системы от ее физико-химической организации" (1987 - 1989 г.г.), N госрегистрации 01870037714;

- "Изучение взаимосвязи молекулярной организации и функционирования фитохромной системы в растительной клетке" (1990 - 1994 г.г.), N госрегистрации 01900027723.

- "Исследование промежуточных стадий процессов трансдукции световых сигналов в клетке" (1996-2000 г.г.), N госрегистрации 1996294;

- "Поиск и идентификация белков растительной клетки, участвующих в трансдукции световых сигналов" (1996-1998 г.г.), N госрегистрации 19962442.

Цель и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы явилось исследование конформационного состояния красной и .дальней красной формы нативного (124 кДа) фитохрома А овса. Для достижения этой цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод быстрого спектрофотометрического определения содержания фитохрома in vivo и с его помощью оценить возрастные и сортовые различия в содержании фитохрома в этиолированных проростках овса.

2. Усовершенствовать методику выделения нативного (124 кДа) фитохрома овса с целью увеличения выхода чистого белка и сокращения времени выделения.

3. Охарактеризовать полученный препарат фитохрома, провести сравнительный анализ ряда его физико-химических свойств с соответствующими данными, приведенными в литературе.

4. Провести зондирование Фк- и Фдк-форм нативного фитохрома с помощью нафтил-сульфонатных зондов (АНС, ТНС), позволяющее идентифицировать при фотоконверсии появление на поверхности макромолекулы хромопро-теина гидрофобных сайтов.

5. Изучить конформационные особенности красной и дальней красной форм нативного фитохрома овса по их чувствительности к денатурирующему действию высоких температур и детергентов различной химической природы.

6. Определить конформационные различия Фк- и Фдк-форм фитохрома по их чувствительности к ограниченному протеолизу.

7. Определить количество поверхностно-локализованных сульфгид-рильных • групп и дисульфидных мостиков в макромолекулах Фк- и Фдк-форм фитохрома.

Объект и предмет исследования. Объектом настоящего исследования был растительный фоторегуляторный хромопротеин - фитохром А. Предмет исследования - конформационные состояния биологически неактивной красной (Фк) и активной дальней красной формы (Фда) фитохрома.

Методология и методы проведенного исследования. При выполнении работы были использованы многие современные методы исследования белков -спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, зондирование с помощью флуоресцентных зондов, ограниченный протеолиз, ДСН-электрофорез. При выделении и очистке фитохрома использовали гель-проникающую и аффинную адсорбционную хроматографию, метод избирательного растворения.

Научная новизна и значимость полученных результатов. Разработана новая методика выделения нативного фитохрома А овса, что позволило существенно снизить время выделения и увеличить выход высокоочищенного препарата нативного фитохрома.

На основании установленной корреляции между оптической плотностью образцов и содержанием фитохрома в растительной ткани выявлены сортовые и возрастные различия в содержании фитохрома в этиолированных проростках овса.

Впервые проведен прямой сравнительный анализ флуоресцентных свойств фитохрома овса ш vitro и in vivo. Показано сходство флуоресцентных параметров хромопротеина в двух состояниях.

Изучена термостабильность различных форм фитохрома. Обнаружена более высокая термостабильность дальней красной формы фитохрома in vitro.

Исследовано влияние детергентов различной химической природы на спектральные параметры Фк- н Фдк-форм фитохрома. Показано, что меньшую чувствительность по отношению к детергентам проявляет Фдк -форма.

Проведено зондирование структуры Фк- и Фдк- форм нативного фитохрома с помощью нафтилсульфонатных флуоресцентных зондов (АНС, ТНС) и выявлены различия в их взаимодействии с нативным (124 кДа) и частично деградированным (114/118 кДа) фитохромами. Показана важная роль N-концевого фрагмента хромопротеина в структурно-функциональной организации молекулы.

Определено количество поверхностно локализованных SH-групп у Фк- и Фдк-форм. Показано, что дисульфидные мостики в молекуле фитохрома отсутствуют.

Установлены конформационные различия красной и дальней красной форм фитохрома, проявляющиеся в особенностях локализации пептидных связей в участках полипептидной цепи на поверхности макромолекулы, чувствительных к протеолизу.

Практическая (экономическая, социальная) значимость полученных результатов. Выявленные в диссертации особенности конформационных состояний красной и дальней красной форм фитохрома, контрастно различающихся по своей биологической активности, позволяет в перспективе разработать методы целенаправленного управления фитохромной регуляцией различных физиологических процессов в растении.

Методика выделения и очистки нативного фитохрома представляет практический интерес для специалистов, работающих в области фотобиологии и физиологии растений, поскольку позволяет получать большие количества нативного фитохрома из различных видов растений, что важно для физико-химического анализа хромопротеина.

Существование корреляции между оптической плотностью образцов при 730 нм и содержанием фитохрома в растительных проростках использовано для экспресс-анализа содержания хромопротеина в тканях растений овса различных сортов и возраста.

Некоторые результаты диссертационной работы вошли в монографии и обзорные статьи и используются в курсах лекций по фотобиологии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Установление сортовых и возрастных различий содержания фитохрома в этиолированных проростках овса.

2. Разработанная новая методика выделения и очистки нативного фитохрома овса, позволяющая получать высокоочищенный нативный фитохром с большим выходом и гораздо быстрее по сравнению с другими методиками.

3. Обнаружение различия конформационных состояний Фк- и Фдк-форм фитохрома по чувствительности хромопротеина к действию высоких температур и детергентов, протеолизу, а также по экспонированности сульфгидрильных групп белка.

Личный вклад соискателя. Выбор условий эксперимента, получение экспериментальных данных, анализ и интерпретация полученных результатов проведены при решающем участии автора.

Апробация результатов диссертации. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на 6-й и 7-й конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1988, 1991), на Втором Всесоюзном съезде общества физиологов растений (Минск, 1990), на Первом съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994).

Опубликованность результатов. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ (6 статей в научных журналах и 3 тезиса докладов) на 41 странице.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 4-х глав, заключения и списка цитируемой литературы, включающего 152 источника. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста и проиллюстрирована шестью таблицами и 35 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ

Материалы и методы исследования

Исходным материалом для выделения нативного фитохрома служили верхушки (2,5 - 3 см) 4-5-дневных этиолированных проростков овса сорта "Эрбграф" (Avena sativa £.). Срезанные при слабом зеленом свете проростки замораживались в жидком азоте и хранились в морозильной камере при температуре не выше -18° С.

Процедура выделения включала 3 стадии сульфат-аммонийного фракционирования и две хроматографические стадии - на кальций-тартратном геле и на Toyopearl HW-65 (Toyo Soda, Япония). Для оценки чистоты выделенного фитохрома использовался спектральный критерий - спектрофотометрический индекс А667/А28о- Наиболее чистые образцы фитохрома имели спектрофотометрический индекс равный 1,1-1,2.

Определение молекулярной массы фитохрома проводилось с использованием ДСН гель-электрофореза на вертикальных пластинах [Laemmli, 1970].

Для определения количества фотообратимого фитохрома использовался параметр Д(ДА), определяемый согласно [Litts et al., 1983].

Для быстрой оценки количества фитохрома также использовалась величина - фитохромная единица, равная одной оптической единице (A¿67 =1,0, для Фк) при длине оптического пути 1 см в 1мл раствора фитохрома.

Флуоресценция фитохрома измерялась на установках, сконструированных Синещековым [Синещеков и Синещеков, 1987].

Для изучения взаимодействия фитохрома с флуоресцентными зондами использовались нафтилсульфонатные зонды - 1-анилинонафталин-8-сульфонат (АНС) и 2-толуидинонафталин-6-сульфонат (ТНС).

При изучении термостабильности препараты фитохрома инкубировались в темноте при различных температурах и в пределах различных временных интервалов. Спектры поглощения записывались после охлаждения образцов до 2° С. Для определения способности фитохрома претерпевать обратимую фототрансформацию после термообработки и охлаждения их облучали последовательно К-, ДК- и К- для Фк и ДК-, К-, ДК-светом для Ф,ж, записывая спектры после каждого облучения. Количество фотообратимого фитохрома вычисляли, используя параметр Д(ЛА) (см. выше).

В работе исследовалось влияние детергентов различных классов: ионных (додецилсульфат натрия (ДСН), дезоксихолат натрия (ДХН)), неионных (Тритон Х-100, додециямальтозид (ДДМ), сахарозомонолауреат (СМЛ), Твин 20 и Твин 80) и цвиттерионных (цвитгергент 3-14).

Методика количественного определения фитохромных SH-rpynn была основана на реакции 4,4'-дитиодипиридина с белковыми SH-группами [Grasseti and Murray, 1967]. Для денатурации фитохрома использовался 6М гуанидин-гидрохлорид (ГГХ) в сочетании с высокой температурой (60° С, 60 мин).

При протеолизе фитохрома в качестве фермента использовался трипсин. Продукты протеолиза анализировались с помощью ДСН гель-электрофореза (см.выше).

Представленные результаты являются средними значениями трех и более независимых экспериментов.

Основные результаты и их обсуждение

Разработка эффективного метода выделения и очистки пативиого (124 кДа) фитохрома овса

Одна из задач исследования состояла в получении высокоочищенного нативного фитохрома овса с максимальным снижением времени, требуемого для процедуры выделения, и повышением выхода фитохрома.

Для подбора исходного растительного материала с максимальным содержанием фитохрома были проведены исследования по установлению возрастных изменений в содержании фитохрома у различных сортов овса.

Фотообратимое изменение поглощения при 730 нм (АА7з0) служило количественной характеристикой содержания фитохрома. Концентрацию фитохрома в растворе определяли после начальных стадий экстрагирования и концентрирования хромопротеина сульфатом аммония, используя молярный коэффициент экстинкции хромопротеина, равный 132000.

Было определено количество фитохрома в различных частях проростков овса сортов "Эрбграф " и "Буг " разного возраста. Оказалось, что во всех случаях содержание фитохрома в проростках овса "Эрбграф" было выше, чем в аналогичном материале сорта "Буг", причем максимальные отличия наблюдались для 3,5-дневных растений.

Все процедуры выделения и очистки фитохрома проводили в холодильной камере при 2° С. Гомогенизацию материала (1 кг проростков овса сорта "Эрбграф") проводили при зеленом свете. Процедура выделения в отличие от традиционных схем выделения [Grimm and Ruediger, 1986], включала две стадии сульфат-аммонийного фракционирования (1-я - 250 г сульфата аммония на 1 л раствора, 2-я -14 г на 100 мл).

Далее следовала хроматографическая стадия с кальций-тартратным гелем [Akhrem et al., 1989], позволявшем сократить время хроматографии до 1,5-2 часов против 7 часов разделения на гидроксиапатите [Viersta and Quail, 1983; Grimm and Ruediger, 1986; Chai et al., 1987; Datta and Roux, 1985], а также уменьшить потери белка.

Дальнейшая очистка проводилась с использованием процедуры избирательной солюбилизации примесных белков сульфат-аммонийного преципитата фитохрома небольшими объемами фосфатного буфера [Grimm and Ruediger, 1986]. Фитохромные фракции (А667/А28о-0,85) наносились на гель-фильтрационную колонку 1,5x60 см с гелем Toyopearl HW-65 (Япония). 85% нанесенного фитохрома после гель-хроматографии имело индекс 0,9-1,1. Фракции фитохрома, имеющие спекгрофотометрический индекс не менее 0,9, объединяли и хранили при -20° С.

В табл.1 представлены основные этапы выделения и очистки нативного фитохрома.

Таблица 1

Характеристика основных этапов выделения фитохрома из 1 кг _этиолированных проростков овса_

Стадия выделения Количество фитохр. ед. Выход % Аббо/А28о Время с начала выделения, ч

гомогенизация, осаждение ПЭИ 14 100 1,5

1-е осаждение сульфатом аммония (250 г/л) 12 86 0,007-0,012 2,5

2-е осаждение сульфатом аммония (14г/100 мл) 10 71 0,02-0,06 3,5

Кальций-тартратный гель 8 57 0,2-0,3 5,5

3-е осаждение сульфатом аммония (13г/100 мл) и отмывки в фосфатном буфере 6 43 0,7-1,0 7,5

гель-фильтрация (Тоуореаг! Н\У-65) 5 35 0,9-1,1 10,5

Таким образом, благодаря применению новых сорбентов и введению дополнительного сульфат-аммонийного фракционирования, удалось получить высокоочшценный препарат нативного фитохрома овса за существенно более короткое время (11-12 часов) и при более высоком выходе (35 %) по сравнению с известными методиками [Grimm and Ruediger, 1986; Chai et a!., 1987].

Физико-химические свойства дативного (124 кДа) фитохрома овса

Для нативного (124 кДа) фитохрома овса, имеющего спектрофотометрический индекс 1,02, были записаны спектры поглощения, а также дифференциальные спектры поглощения (рис. 1). Многократная фотоконверсия фкс>фдк после установления динамического равновесия не приводит к изменениям в спектрах поглощения фитохромных форм.

Дяя оценки молекулярной массы и гомогенности полученного препарата нативного фитохрома овса был применен ДСН-электрофорез в полиакрила-мидном геле. При разделении он обнаруживал одну полосу в области 124 кДа.

Флуоресцентные исследования красной формы фитохрома в этиолированных проростках овса in vivo (Фк) и нативного (124 кДа) фитохрома овса in vitro (Ф'к) проводились по двум направлениям: во-первых, определялись флуоресцентные характеристики Фк и Ф'к; во-вторых, определялись фотохимические свойства их состояний на основе фотоиндуцированных изменений интенсивности флуоресценции в температурном интервале -188° С - +20° С.

нм

Рис. 1 Спектры поглощения и дифференциальный спектр поглощения нативного (124 кДа) фитохрома овса (А667/Л280=1,02) в 10 мМ На-фосфатном буфере, рН 7,8 (4° С).

На рис. 2 представлены спектры флуоресценции по возбуждению и испусканию фитохрома овса in vivo и в растворе при -188°С. Спектры обоих образцов очень близки как по положению максимума спектра, так и по форме полос свечения. Максимумы в спектрах испускания находятся при 685нм и 684 нм, в спектрах возбуждения они распо ложены при 673нм и 672нм для Фк и Ф'к, соответственно.

Квантовый выход cpf низкотемпературной флуоресценции Ф'к при -188° С был равен 0,2±0,05, что близко значению cpf Фк-фитохрома овса in vivo - 0,2. С ростом температуры от -188°С до комнатной температуры интенсивность флуоресценции хромопротеина резко падала, уменьшаясь приблизительно в 30-35 и 35-40 раз для Фк и Ф'к, соответственно.

1фл

o.e.

40 -

30 -

20 -

10 -

600 640 680 720 760 X ,нм

Рис. 2 Низкотемпературные (-188° С) спектры возбуждения (Г, 2') и излучения (1, 2) флуоресценции красной формы фитохрома овса in vivo (1, 1 ') и in vitro (2,2').

О фотохимических превращениях фитохрома в интервале температур -188° С - +20°С судили по фотоиндуцированным изменениям интенсивности его флуоресценции в ее максимуме при 685 нм. В обоих случаях (Фк и Ф'к) первое освещение образца, адаптированного к дальнему красному свету, красным светом при комнатной температуре и затем замороженного до -188°С в темноте, вызывало уменьшение интенсивности флуоресценции, которое лишь частично обращается дальним красным светом (Я=696 нм). Для Фк необратимое изменение интенсивности флуоресценции (ji) при -188°С составило 0,15. В случае Ф'к оно несколько меньше - 0,05-0,1. Обратимое изменение интенсивности флуоресценции (у2) для Фк составило 0,05 при -188° С, 0,12 при -141° С и близко к нулю при -55° С. В выделенном фитохроме (Ф'к) изменения интенсивности низкотемпературной флуоресценции белка выражены слабее: 0,02-0,03 при -188° С, 0,05 при -141°С и близки к нулю при -55° С.

Таким образом, сравнение флуоресцентных параметров фитохрома in vivo в клетках колеоптилей этиолированных проростков овса и in vitro в натив-ном (124 кДа) фитохроме овса показало, что низкотемпературные спектры излучения и возбуждения флуоресценции фитохрома, а также ее квантовый выход in vivo и in vitro практически совпадают.

Взаимодействие Фк- и Фдк-фори фитохрома с флуоресцентными зондами

АНС н ТНС

Согласно ранней модели [Hahn and Song, 1981], в результате фотоактивации фитохрома в молекуле Фдк экспонируется гидрофобный контактный сайт для взаимодействия с неидентифицированным рецептором. Рядом авторов в экспериментах, выполненных на так называемом "большом" фитохроме (114/118 кДа) были получены данные, свидетельствующие об увеличении доли гидрофобной поверхности в макромолекуле при Фк—>ФДК фотопревращении [Hahn and Song, 1981; Tokutomi et al., 1981]. Поэтому в данной работе предпринята попытка выяснить с помощью флуоресцентного зондирования, появляются ли гидрофобные сайты на поверхности молекулы нативного хромопротеина при фототрансформации.

В работе использовали близкие по строению, но несколько различающиеся по гидрофобности зонды - АНС и ТНС. Как видно из рис. 3, увеличение концентрации флуорофоров выше 200 мкМ и 100 мкМ для АНС и ТНС, соответственно, не вызывает роста интенсивности их флуоресценции. При длительной инкубации (60 минут) смеси фитохрома в Фк- и в Фдк-форме с 1 мМ АНС спектральные характеристики форм остаются неизменными и сохраняется способность форм к обратимой фототрансформации.

В случае "большого" фитохрома высокие концентрации АНС ускоряют прямую (Фк—>ФДК) и ингибируют протекание обратной (Фдк—>ФК) фотореакции. Однако у нативного фитохрома принципиального изменения скорости прямой и обратной фотореакций не наблюдается. Это свидетельствует о том, что ин-термедиаты прямого и обратного фотопревращения, вероятно, не имеют каких-либо дополнительных центров связывания зонда.

Рис. 3 Зависимость интенсивности флуоресцентных зондов АНС (пунктирная линия) и ТНС (сплошная линия) в смеси с фито-хромом (С = 0,5 мкМ) от их концентрации.

0 200 400 600 800 1000 С.мкМ

Следовательно, в молекуле нативного белка М-концевой фрагмент закрывает гидрофобный карман, в котором локализован хромофор, от взаимодействия с зондом, либо он препятствует связыванию зонда с другими гидрофобны-

1фя оТе. 1.0 -

ми участками в структуре хромопротеииа, непосредственно отвечающими за сохранение фитохромом своих спектральных свойств. Ы-концевой фрагмент нивелирует различия между Фк- и Фдк-формами нативного фитохрома по количеству поверхностно экспонированных гидрофобных центров, которое было ранее обнаружено у деградированного "большого" фитохрома.

Конформационные перестройки Фк- и Фцк-форм фитохрома, индуцированные высокой температурой и различными детергентами

Установлено, что спектры поглощения фитохрома оставались практически неизменными после нескольких часов его инкубации при температуре 30° С. При температуре выше 30° С появлялось индуцированное теплом "обесцвечивание" Фк- и Фда-форм в области 667 нм и 730 нм, соответственно, причем, Фда-форма "обесцвечивалась" с большей скоростью, чем Фк-форма.

При высоких температурах (45° С и 50° С) различие в "обесцвечивании" Фк- и Фдк-форм было выражено сильнее.

Было установлено, что значения Д(ЛА), рассчитанные для Фк- и Фдк-форм, сильно различаются. Так, Фк-форма инкубированная при 40° С в течение 60 мин теряла более 50 % фотообратимого белка при незначительном изменении поглощения при 667 нм, в то время как, Фдк-форма инактивировалась при аналогичных условиях всего лишь на 30 % (табл. 2).

Таблица 2

Фитохромные формы Фотообратимость, %

Условия 35° С 40° С 45° С 45° С 50° С 50° С

термообработки 60 мин 60 мин 30 мин 60 мин 15 мин 30 мин

Фк 89 46 27 14 7 4

фдк 92 71 44 23 21 11

Примечание. Процент фотообратимости равен [Д(ДА')/Д(ДА°)]хЮ0%, где Д(ДА°) - параметр для исходного образца, Д(ДА') - параметр для образца после тепловой обработки.

При 45° С и 50° С Фда-форма также денатурировалась слабее, чем Фк-форма, но при этих температурах различие между формами снижалось.

Облучение частично денатурированной Фк-формы (А.=660 нм) (рис. 4, кривая 3) красным (кривая 4), а затем дальним красным светом (кривая 5) сопровождалось уменьшением поглощательной способности хромопротеина и сдвигом максимума его спектра поглощения к 667 нм.

Подсветка частично денатурированной Фдк-формы (рис. 5, кривая 3) дальним красным светом не сопровождалась сдвигом максимума спектра поглощения (А,=660 нм) (кривая 4), но после одного цикла фототрансформации (КС, ДКС) происходило уменьшение поглощательной способности и сдвиг

максимума спектра поглощения к 667 нм (кривая 6). Данное стабильное состояние Фк-формы могло быть получено также облучением исходной термоде-натурированной Фдк-формы (кривая 3) последовательно красным и дальним красным светом. Этому состоянию фитохрома в Фк-форме (кривые 6,8) соот-

Рис. 4 Спектры поглощения Фк-фитохрома в 20 мМ фосфатном буфере, рН 7,8, 2° С после темповой термообработки 45° С 30 мин и последующего освещения насыщающим красным и дальним красным светом. (1) и (2) - Фдк- и Ф^-формы без термообработки, соответственно; (3) - термообработка Фк-формы; (4) - термообработка+ КС; (5) - термообработка+КС+ ДКС; (6) - термообработка+КС+ ДКС+КС; (7) - термообработка +КС+ДКС +КС+ДКС.

Ш\>н

ветствовала Флк-форма (кривые 5,7), при этом, в результате Фк—>ФДК фототрансформации происходило уменьшение поглощения при 667 нм, которое не сопровождалось увеличением поглощения при 730 нм.

Была исследована также чувствительность промежуточных продуктов Фк—>ФДК и Фдк—>ФК фотоконверсии к термоденатурации. Освещение фитохрома при высоких температурах (особенно КС) усиливает термоденатурацию. При этом интермедиаты, появляющиеся при прямой, так и обратной фототрансформации хромопротеина были менее стабильны, чем Фк- и Фдк-формы.

Итак, в пуле хромопротеина после термообработки его Фк- и Фдк-форм можно было выделить три состояния: (а) хромопротеин, который сохранил свою нативную конформацию и обладает способностью к обратимой фототрансформации - (Ф); (б) хромопротеин, незначительно поглощающий при 730 нм после освещения КС, но все еще обладающий фотообратимостью (обнаруживает рост поглощения при 660 нм после облучения ДКС) - (Ф*); (в) денатурированный фитохром (Ф**).

Анализ термостабильности форм фитохрома показывает, что высокая температура оказывает на их спектры поглощения влияние, сходное воздействию мочевины и ионных детергентов. Сходство заключается в большем "обесцвечивании" спектров Фдк-формы по сравнению с Фк-формой. При этом Фдк-конформация более стабильна.

Рис. 5 Спектры поглощения Фдк-о.ё, 6(50 фитохрома в 20 мМ фосфатном бу-

А

фере, рН 7,8, 2 С после темновой термообработки 45° С 30 мин и последующего освещения насыщающим красным и дальним красным светом. (1) и (2) - Фк- и Фдк-формы без термообработки, соответственно; (3) - термообработка Фдк-формы; (4) - термообработка+ ДКС;

(5) - термообработка+ДКС+КС;

(6) - термообработка+ДКС+КС+ 800 Хнм ДКС; (7) - термообработка+ДКС+

КС+ДКС+ КС+ДКС.

Чувствительность Фк- и Фдк-форм фитохрома к денатурирующему действию различных детергентов оценивалась по их способности к обратимой фототрансформации.

Цвиттерионный детергент ЦВГ в концентрации 0,05 % приводил к практически полной денатурации хромопротеина. Отмечены различия спектральных изменений, вызываемых детергентом у Фк- и Фдк-форм.

Неионные детергенты Д ДМ и СМЛ при концентрациях ниже ККМ (0,005 %) не вызывали сколько-либо заметных спектральных изменений фитохрома. При концентрации ДЦМ до 0,1 %, что в 20 раз превышает ККМ, через 30 мин инкубации ФдК-форма "обесцвечивалась" на 35 %. Однако даже после двух циклов фотопревращения параметр Д(АА) составлял не менее 40 % от исходной величины. В аналогичных условиях Фк-форма обесцвечивалась на 30 %, происходил коротковолновый сдвиг максимума спектра поглощения к 660 нм. При этом хромопротеин практически утрачивал способность к обратимой фототрансформации.

В присутствии 0,1 % СМЛ (ККМ=0,01 %) также наблюдалось обесцвечивание красной и дальней красной форм фитохрома. Каждый цикл фототрансформации приводил к падению у Фк- и Фдк-форм содержания фотообратимого фитохрома на 15-20 %.

Неионные детергенты: Тритон Х-100, Твин 20, Твин 80, практически не оказывали влияния на спектральные свойства фитохрома.

Таким образом, приведенные данные показывают, что эффективность влияния детергентов на спектральные параметры и, следовательно, на кофор-мацию макромолекулы фитохрома зависит от химической природы детергента и от того в какой спектральной форме находится фитохром.

Ограниченный протеолиз Фк- и Фдк-форм фитохрома

Для ограниченного протеолиза Фк- и Фдк-форм фитохрома использовались невысокие концентрации трипсина (весовое соотношение трипсина к фи-

тохрому - 1:200, Сф1ГГ=0,1 мг/мл) в сочетании с низкой температурой (4°С) и применением детергентов, что позволило проследить начальные стадии проте-олиза, постепенно увеличивая время инкубации хромопротеина с ферментом (15 мин, 1, 4, 8 и 16 часов).

При 15-минутном протеолизе Фк-формы нативного (124 кДа) фитохрома овса наблюдалось образование полипептидов с молекулярными массами 114, 75, 63, 59 кДа, группы полипептидов 53-55 кДа с доминирующим 55 кДа, а также полипептида 39 кДа. Протеолиз Фдк-формы нативного фитохрома приводил к несколько иному результату. В этом случае наблюдалось образование фрагментов с молекулярными массами 83, 67 и 69 кДа, а также сохранение значительной части фитохрома в нативном (124 кДа).

Более продолжительная инкубация Фк-формы фитохрома с ферментом приводила к возрастанию доли 59 кДа фрагмента. При аналогичных условиях у Фдк-формы наблюдалось расщепление 83 кДа полипептида, при сохранении полосы нативного (124 кДа) фитохрома, а содержание 114 к Да фрагмента было сравнительно меньшим, чем у Фк-формы.

Более высокие концентрации трипсина (1:100 и 1:50) нивелировали различия в характере протеолитического расщепления Фк- и Фдк-форм. Однако при одинаковых концентрациях фермента протеолиз Фдк-формы быстрее, чем Фк-формы.

Качественно сходная картина наблюдалась при действии других протеаз - химотрипсина и термолизина.

Данные ограниченного протеолиза свидетельствуют о существенных конформационных различиях Фк- и Фл„-форм фитохрома, выражающихся в различной топографии на поверхности глобулы пептидных связей, гидроли-зуемых трипсином при экспонировании >}-концевого фрагмента (6 кДа) у Фк-формы, а участка полипептидной цепи вблизи Лиз-753 у Фдк-формы.

Экспонированность БН-групп в макромолекуле фитохрома.

Для изучения реакционной способности локализованных 8Н-групп в Фк-и Фдк-формах фитохрома использовали ДТП, взятый в молярном отношении к белку ([Сятп]/[Сф]) в пределах от 30 до 3000.

Для изучения доступности цистеиновых остатков у Фк- и Фдк-форм в на-тивных условиях исследовалась кинетика взаимодействия БН-групп при различных (30, 100, 300, 500,2000) концентрациях ДТП (рис. 6).

При [Сдта]/[Сф], равном 30, какого-либо спектрально детектируемого взаимодействия БН-групп с реагентом не наблюдалось ни для одной из форм фитохрома. Увеличение [СлтУ[Сф] до 100 приводило к практически моментальной (в течение 0,5-1,0 мин) модификации 2-х сульфгидрильных групп в Фк-и Флк-формах (см. рис. 6, кривые 1 и 2).

время, мин

Рис. 6 Кинетические кривые модификации БН-групп (Ъ1) в Фд- и ФдК-формах фитохрома овса под влиянием 4-4'-дитиодипиридина (ДТП) при различных соотношениях [Сдти]/ [Сф]:

1 - Ф«, [Сдтп]/[СФ]=100;

2 - Фдк, [Сдтп]/[СФ]=100;

3 - Фк, [Сдтп]/[Сф]=300;

4 - Фдк, [Сдтп]/[СФ]=300;

5 - Фв [Сдш]/[СФ]=500;

6 - Фдк, [СДТп1/[Сф]=500;

7 - Фк, [Сдтп]/[СФ]=2000;

8 - Фдк, [Сдтп]/[Сф]=2000;

9 - денатурированный фитохром, [Сдт]/ [Сф]=2000. Где Сдтп - концентрация ДТП, Сф - концентрация фитохрома.

Дальнейшее увеличение соотношения (300) вызывало дополнительный рост количества модифицируемых 8Н-групп. Однако в данном случае наблюдалось существенное различие в ходе кинетики реакции у Фк- и Фяк-форм. У Фк-формы она имела сложный ступенчатый характер, свидетельствующий о гетерогенности поверхностно-локализованных цистеиновых остатков у этой формы фитохрома (см. рис.6,кривая 3). Конформация Фдк-формы характеризуется более гомогенным состоянием 5Н-групп, что следует из кинетической кривой, имеющей гиперболическую форму (кривая 4). В конечном счете при этом соотношении в реакцию способно вступать 5 8Н-групп у Фк- и 6 ВН-групп у Фдк-формы.

При [Сдтп]/[Сф], равном 500, при общей для фитохромных форм тенденции к возрастанию реагирующих БН-групп, наблюдаемое выше различие кине-тик реакций сохранялось (см. рис.6, кривые 5 и 6), а количество реагирующих 8Н-групп составило для Фк-формы - 8 для Фдк-формы - 9.

Увеличеие [Сдтп]/[Сф] выше насыщающей (2000) не вносило существенных изменений в характер кинетических кривых реакций взаимодействия у Фк-и Фдк-форм (см. рис.6, кривые 7 и 8). В нативных условиях у Фк-формы модифицировалось 13 БН-групп, а у Фдк-формы - 15. При более высоком соотношении компонентов реакции (до 3000) дополнительная модификация сульфгид-рильных групп у Фк- и ФдК-форм не наблюдалась. Следовательно, конечное количество детектируемых в нативных условиях сульфгидрильных групп в Фк- и Фдк-формах фитохрома можно отнести к поверхностнорасположенным БН-группам.

При денатурирующих условиях (6 М гуанидингидрохлорид, 60°С, 1час) количество способных модифицироваться БН-групп возрастало до 22 (см.

рис.6, кривая 9), т.е. совпадало с количеством существующих в молекуле фито-хрома свободных SH-rpynn.

Таким образом, установлено, что Фк—>ФДК фототрансформация приводит к появлению на поверхности хромопротеина дополнительных центров связывания для дисульида (ДТП). В третичной структуре фитохрома дисульфидные мостики не обнаружены.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании полученных результатов сделаны следующие выводы:

1. С использованием спектрофотометрического метода проведен анализ возрастных и сортовых различий содержания фитохрома в разных частях этиолированных проростков овса in vivo. Наибольшее содержание фитохрома наблюдалось в верхушках 3,5-дневных проростков овса сорта "Эрбграф" [6,9].

2. Разработан метод быстрого выделения и очистки нативного фитохрома овса, основанный на применении новых сорбентов и использования сульфат-аммонийного фракционирования, отличающийся от общепринятых методик большим выходом и высокой степенью чистоты получаемого препарата [3].

3. Проведено сравнение флуоресцентных характеристик фитохрома in vivo и in vitro. Обнаружено практически полное совпадение низкотемпературных спектров излучения и возбуждения флуоресценции для фитохрома in vivo и in vitro [2, 7].

4. Выявлены особенности информационного состояния Фк- и Фда-форм фитохрома, характеризующиеся различиями в топографии участков макромолекулы, доступных атаке протеаз и действию SH-специфического реагента дитиодипиридина [8].

5. Показано, что конформационные состояния Фк- и Фдк-форм фитохрома отличаются по устойчивости к денатурирующему действию высоких температур и детергентов различной химической природы. При этом, большей кон-формационной стабильностью обладает Фдк-форма хромопротеина [1,3,5].

6. Установлено, что обратимая фк-»фдк фототрансформация фитохрома не приводит к появлению на поверхности макромолекулы дополнительных гидрофобных сайтов, способных связывать флуоресцентные зонды АНС и ТНС. Это свидетельствует о важной роли N-концевого фрагмента хромопротеина в контроле структурной организации макромолекулы [4].

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лапко В.Н., Кожух Г.В., Ляхнович Г.В., Волотовский И.Д. Термостабильность нативного фитохрома // Доклады АН БССР.- 1990.- Т.34, N 6.- С. 554-556.

2. Sineshchekov V.A., Lapko V.N., Sineshchekov A.V., Kozhukh G.V., Udal'tsov A.V. Fluorescence studies of phytochrome in the cells of etiolated oat seedlings and 124 kDa phytochrome isolated from them // J.Photochem.Photobiol. Ser. В.- 1990,- Vol. 5, N 2,- P. 219-229.

3. Лапко B.H., Кожух Г.В., Ляхнович Г.В. Нативный фитохром овса: выделение и изучение термостабильности красной и дальнекрасной форм // Физиология растений.- 1991.-Т.38, вып.4,- С.701-707.

4. Кожух Г.В., Лис П.И., Лапко В.Н. Изучение структуры нативного фитохрома овса с помощью нафтилсульфонагных зондов // Весщ АН БССР. Сер. б1ял. навук.- 1991.-N2.-С. 41-43.

5. Lapko V.N., Kozhukh G.V., Lyakhnovich G.V., Volotovsky I.D. Differences in the thermostability of red- and far-red-absorbing forms of oat phytochrome //J.Photochem.Photobiol. Ser. В.- 1992,- Vol. 12,- P. 91-100.

6. Лапко B.H., Гвардиян B.H., Кожух Г.В., Лис П.И., Ходасевич Э.В. Характеристика возрастных изменений в содержании фитохрома в проростках различных сортов овса // Весщ АН Беларусь Сер. б'тл. навук.- 1994,- N 2. - С. 50-53.

7. Лапко В.Н., Синещеков В.А., Синещеков A.B., Кожух Г.В. Флуоресцентные и фотохимические характеристики фитохрома овса с молекулярной массой 124 кДа // 6-я конф. по спектроскопии биополимеров: Тез. докл. конф., Харьков, 11-13 октября 1988,- Харьков, 1988.- С.186-187.

8. Кожух Г.В., Лапко В.Н., Крылов А.Б. Исследование SH-групп фитохрома овса с помощью 4-4'-дитиодипиридина // Тез. докл. 1-го Съезда Бел. об-ва и биофизиков, Минск, 22-23 ноября.- Минск, 1994.- С. 83.

9. Кожух Г.В., Гвардиян В.Н., Лапко В.Н. Количественный анализ фитохрома в этиолированных проростках овса // Тез. докл. 1-го Съезда Бел. об-ва фотобиологов и биофизиков, Минск, 22-23 ноября.- Минск, 1994 - С. 82.

РЕЗЮМЕ

Кожух Геннадий Викторович

Натнвнын фитохром овса: особенности конформационного состояния красной п дальней красной форм in vitro

Ключевые слова: нативный (124 кДа) фитохром овса, Фк-форма, Фдк-форма, фотообратимость, термостабильность, денатурация, конформация.

В качестве объекта исследования использовался растительный хромо-протеин - фитохром А. Предмет исследования - конформационные состояния биологически неактивной красной (Фк) и активной дальней красной (Фдк) формы фитохрома. Цель работы - изучение конформационного состояния красной и дальней красной форм хромопротеина. В работе применялись следующие методы исследования: спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, флуоресцентное зондирование, ограниченный протеолиз, ДСН-электрофорез, гель-проникающая и афинная адсорбционная хроматография.

Проведен анализ возрастных и сортовых различий содержания фитохрома в разных частях этиолированных проростков овса in vivo. Разработан метод выделения и очистки нативного (124 кДа) фитохрома из этиолированных проростков овса, позволяющий увеличить выход хромопротеина, значительно уменьшить продолжительность и свести к минимуму протеолнтическую деградацию белка. Согласно флуоресцентным данным фитохром in vivo и in vitro обладает сходным конформационным состоянием. Методом флуоресцентного зондирования установлено, что N-концевой фрагмент полипептидной цепи фитохрома контролирует взаимодействие красителей (АНС и ТНС) с белком. Зарегистрировано различие термостабилыюсти красной и дальней красной форм фитохрома: большую устойчивость обнаруживает Фдк-форма. Она обладает также большей устойчивостью к денатурирующему действию детергентов. У красной формы фитохрома в отличие от дальней красной N-концевой фрагмент экспонирован. Участок полипептидной цепи С-терминального домена вблизи Лиз-753 экспонирован только у Фдк-формы. С помощью дитиодипиридина установлено, что у дальней красной формы хромопротеина экспонировано на 2 SH-группы больше, чем у красной формы. Показано отсутствие в молекуле фитохрома дисульфидных связей.

Полученные данные могут быть использованы при изучении фотобиологических процессов в растении.

РЭЗЮМЕ

Кожух Генадзш Вжтарав1ч

Натыуны фгтахром аусу: асабл1васщ канфармацыйнага стану чырвонай i далекай чырвонай формы in vitro

Ключавыя словы: натыуны (124 кДа) фгтахром аусу, Фч-форма, Фдч-форма, фотаабарачальнасць, тэрмастабшьнасць, дэнатурацыя, канфармацыя.

У якасц1 аб'екта даследавання выкарыстоувауся раслшны хромапратэт -фггахром А. Прадмет даследвання - канфармадыйныя станы б1ялапчна неак-тыунай чырвонай (Фч) i актыунай далекай чырвонай (Фдч) формы фгсахрому. Мэта працы заключалася у вывучэшп канфармацыйнага стану чырвонай i далекай чырвонай форм хромапратэшу. У працы бьш выкарыстаны наступныя ме-тады даследвання: спектрафотаметрыя, спектрафлуарыметрыя, флуарысцэнт-нае зандзфаванне, абмежаваны пратэол!з, ДСН-электрафарэз, гель-праншаючая i афшная адсарбцыйная храматаграфЬь

Праведзены анал1з узроставых i сартавых адрозненняу у утрыманш фггахрому у розных частках этьшправаных праросткау аусу in vivo. Распраца-ваны метад вылучэння i ачыста натыунага (124 кДа) фгахрому з этыя-Л1раваных праросткау ауса, яю дазваляе павял1чыць выхад хромапратэшу, значна паменшыць працягласць i звесщ да мшмума пратэаттычную дэграда-цыю бялку. Згодна з флуарысцэнтны.чп даным! ф!тахром in vivo i in vitro вало-дае падобным канфармацыйным станам. Метадам флуарысцэнтнага занд-з^равання установлена, што N-канцавы фрагмент полшептыднага ланцугу фкахрому кантралюе узаемадзеенне зондау (АНС i ТНС) з бялком. Зарэ-пстравана адрозненне тэрмастабшьнасш чырвонай i далекай чырвонай форм ф1тахрому: большую устошпвасць выяуляе Фдч-форма. Яна таксама валодае большай устошпвасцю да дэнатурацыйнага дзеяння дэтэргентау. У чырвонай формы у адрозненш ад далекай чырвонай формы N-канцавы фрагмент экспа-наваны. Участак полшептыднага ланцугу С-тэрмшальнага дамена набл13у JIÍ3-753 экспанаваны толыа у Фл,,-формы. Пры даследаванш сульфпдрыльных груп фггахрому з дапамогай дытыодытрыдзша, выяулена, што у далекай чырвонай форме экспанавана на 2 SH-групы больш, чым у чырвонай форме. Паказана ад-сутнасць у малекуле фггахрому дысульфщных сувязей.

Атрыманыя BbiHiKi магуць быць выкарыстаны пры вывучэнш фота-б!ялапчных працэсау у раслшах.

SUMMARY

Kozhukh Gennady Victorovich

Native oat phytochrome: particularities of in vitro conformational state of the red- and far-red-absorbing forms

Key words: native (124 kDa) oat phytochrome, Pr form, Pfr form, photoreversibility, ther-mostability, denaturation, conformation.

As the object of the study a plant chromoprotein phytochrome A was used. The conformation states of its biologically non-active red-absorbing (Pr) and bioloically active far-red-absorbing (Pfr) forms were under investigation. The aim of this study was to elucidate the differences in conformational states of both forms of phytochrome using spectrophotometric and spectrofluorimetric measurements, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, fluorescence probing, a limited proteolysis, gel filtration and affinity elution chromatography.

By means of spectrophotometric measurements the in vivo analysis of age and species differences in phytochrome content in various parts of oat etiolated seedlings was carried out. The effective procedure for the isolation and purification of phytochrome from oat etiolated seedlings was developed. It allowed to increase the chromoprotein yield, to decrease the procedure duration and to minimize the proteolytic degradation of the chromoprotein. The fluorescence study did not show any remarkable differences in fluorescence features of phytochrome for in vivo and in vitro states. Fluorescence probing indicated the importance of the N-terminus segment of phytochrome polypeptide chain to control the probes interaction with protein moiety. A difference in thermostability for Pr and Pfr phytochroms was found. It was also shown that Pfr form is more stable both to denaturating action of high temperatures and to detergents as compared with Pr form. According to limited proteolysis data the N-terminus segment of the polypeptide chain of Pr form was found to be exposed. On the contrary, P& form exposed the C-terminus domain at Lys-753 position. Using dithiodipiridine it was established that the Pfr form exposed two additional SH-groups in comparison with Pr form. No S-S bonds in phytochrome molecule were detected.

The data of the thesis can be used for the study of the photobiological processes in plants.

Кожух Геннадий Викторович

НАТИВНЫЙ ФИТОХРОМ ОВСА: ОСОБЕННОСТИ КОНФОРМАЦИОННОГО СОСТОЯНИЯ КРАСНОЙ И ДАЛЬНЕЙ КРАСНОЙ ФОРМ IN VITRO

Специальность 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано к печати 10.11.1998. Формат 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,1. Усл. кр.-отт. 1,2. Уч.-изд. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ № 157.

Отпечатано на ризографе АНК "ИТМО им. А.В.Лыкова" НАНБ 2200072, Минск, П.Бровки,15. ЛП № 117 от 29 декабря 1997 г.