Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фузикокцин-связывающие свойства плазмалеммы Vicia faba L.

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Фузикокцин-связывающие свойства плазмалеммы Vicia faba L."

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени МЛз. Ломоносова

на правах рукописи УДК 581.1:58.085:577,352.3

сс&рт.з^.-,.-''

Данилина Елена Эдуардовна ФУЗЙКОКЦИН-СВЯЗЫБАИЩ СВОЙСТВА Ш1АЗМАЛЕМШ'

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии

Научные руководители:.

доктор биологических наук, академик ВАСХНИЛ Муромцев Г.С.

кандидат физико-математических наук Бабаков A.B.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Кораблева Н.П. кандидат биологических наук Балнокин Ю.В.

Ведущая организация:

к»

Ленинградский государственный университет

Защита состоится "30" на* 1991 г. в /5До часов на заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К 053 05 14 при Вюлогическом факультете Московского государственного университета.

Адрес:Москва, Ленинские гори, Биологический ф-т MW

Автореферат разослан "23" 1991 г.

С Ъчссфтэуией кюххо оьпяюомчться 4 £и6лиоть*х,

6и.ащоп<ч<Ьсксго f>atCtf/Me.7ti, МГЦ

Ученый секретарь

Специализированного совета - Полесская О.Г.

канд. биол. наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблеммы. Настоящая работа посвящена исследованию механизма действия фузикокшна (РС)— одного из регуляторов роста растений, который показал высокую эффективность при его применении на сельскохозяйственных культурах. Выступая в роли стимулятора роста растений и антистрессового вещества, фузикокиин позволяет увеличивать урожаи таких сельскохозяйственных культур как рис, кукуруза, сахарная свекла (Леонова, Муромцев, 1989; Муромцев и др., 1989). Точный механизм действия фузикокцина до настоящего времени неизвестен. Вероятнее всего, что действие фузикокцина в качестве регулятора роста растений опосредовано его действием на ионный транспорт через ллазмалемму. Исследование БС—связывающих свойств плазмалеммы и характеристик фузикокцин—связывающих белков представляется в связи с этим необходимым шагом для раскрытия механизма действия фузикокцина на растительную клетку в целом. Кроме этого исследование связывания фузикокцина с плазмалеммой представляет самостоятельный научный интерес, тж. расширяет наши знания о рецепции различных физиологически активных веществ растительной клеткой и возможных путях регуляции жизнедеятельности клетки и всего растения. Знание общих принципов регуляции физиологических процессов в растительном организме и механизмов действия отдельных регуляторов роста растений и, в частности, фузикокцина в будущем позволит максимально оптимизировать применение этих регуляторов в сельскохозяйственной практике.

Найденные рядом исследователей на выделенной плазмалемме растений ГС-связывающие белки ( АсШса е1 а1, 1980; ВаШо е1 а1, 1980) по. многим критериям соответствовали требованиям, предъявляемым к белкам, которые могут принимать непосредственное

участие в физиологическом ответе клетки на фузикокцин. Так было показано, что есть корреляция между сродством производных фузикокцина к выделенной плазмалемме и степенью физиологического ответа целого растения на эти производные фузикокцина (Ballio et al, 1981а; Ballio et аЦ 1981b; Feyrabend, Weiler, 1988; Бабаков и др. 1990). В работе Рубинштейна было показано, что удаление с поверхности клеток листьев растений фузикокцин-связывающих белков с помощью осмотического шока приводит к снижению стимулирующего действия фузикокцина на выброс протонов этими клетками (Rubinstein, 1982). Поскольку у фузикокцина отсутствует существенная тканевая специфичность, белки, связывающие фузикокцин, были обнаружены во многих тканях растений (Aducci et al, 1984; De Boer et al, 1989; Blum et al, 1988). Однако для фузикокцин-связывающих белков характерна локализация только в одном типе мембран растений — плазмалемме (Feyrerabend, Weiler, 1988), что хорошо согласуется с тем фактом, что фузикокцин вызывает изменения в транспорте ионов именно на этой мембране.

Вместе с тем исследователями было обнаружено несоответствие между концентрационной зависимостью связывания фузикокцина с плазмалеммсй и концентрационной зависимостью физиологического ответа растительной клетки на фузикокцин (Бабаков и др. 1990). Это несоответствие заключается в том, что константа диссоциации фузикокцин—рецепторного комплекса для препаратов плазмалеммы, выделенных из корней кукурузы составляет 1.4 '10 М, а величина концентрации фузикокцина, при которой наблюдается половина от

_7

максимального физиологического ответа составляет около 2'10 как для стимуляции удлинения корней кукурузы , так и для стимуляции входа

Rb

в клетки корней под действием фузикокцина.

Поскольку сравниваемые зависимое™ исследовались в разных условиях: in vivo ( физиологические опыты) и in vitro ( опыты по связыванию), встал вопрос , не может ли указанное выше противоречие объясняться различными условиями для FC-связывающего 5елка in vivo и in vitro.

Цель и задачи исследований. Основной целью данной работы была гопытка разобраться в причинах расхождения между концентрационной ¡авйсимостью связывания фузикокцина с предполагаемым рецептором и сонцентрационной зависимостью физиологического ответа растения на фузикокцин. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Поиск системы, в которой можно одновременно изучать как физиологические или клеточные ответы на фузикокцин, так и :вязывание фузикокцина с нативной плазмалеммой в условиях, ¡лизких к in vivo.

2. В случае если такая система будет найдена, исследовать, сличаются ли FC—связывающие свойства выделенной и нативной шазмалеммы.

Ъ. Определить, соответствует ли концентрационная зависимость вязывания FC с плазмалеммой в новой системе концентрационной ависимости клеточного ответа на фузикокцин.

4. Определить, каковы причины различия FC-связывающих свойств ыделейной и нативной плазмалеммы, в случае, если такое различие удёт найдено.

Научная новизна. В результате проведенного исследования нами первые была показана возможность использования протопластов астительных клеток в качестве объекта для исследования • вязывания фузикокцина с наружной мембраной - плазмалеммой. первые показано различие FC-связывающих свойств нативной и ыделенной плазмалеммы. Обнаружено, что около 90% FC-связывающих

сайтов нативной плазмалеммы — это белки, которые связываются с фузикокцином при его физиологически активных концентрациях, причем их количество больше в тех клетках, которые характеризуются наиболее выраженным ответом на

фузикокцин. Показана различная чувствительность двух типов фузикокцин-связывающих сайтов плазмалеммы протопластов к действию протеолитических ферментов (Ь-химотрипсину).

Практическое и теоретическое значение работы. В результате проведенной работы в практику исследований ГС-связывающих белков введен новый объект- плазмалемма протопластов, что может послужить хорошим источником новой информации о механизме действия фузюсокцина, т.к. условия для фузикокцин-связывающих белков в подобной системе максимально приближены к нативным. Нами получены данные, углубляющие знания о мембранных белках и их свойствах; показана гетерогенность свойств фузикокцин-связывающих белков плазмалеммы. Работа также ставит вопрос об ограничениях использования выделенных биологических мембран для научных исследований, тж. процесс выделения мембран может приводить к изменению свойств мембранных белков.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на совещании "Физиологически активные терпеноиды" в 1989 году в Симферополе, на международном симпозиуме "Регуляция покоя и устойчивость растений к неблагоприятным факторам" в Душанбе в 1989 году, на школе "Биологические мембраны" в Звенигороде в 1989 году и на ежегодных конференциях молодых ученых ВНИИСБ в 1989 и 1990 годах.

Публикации. По результатам исследований опубликовано Н работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора

литературы, методики, результатов и их обсуждений, заключения, выводов и списка литературы, включающего 215 наименований, из них 195 на иностранных языках. Работа содержит 16 рисунков и 9 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оъектами исследования служили протопласты и микросомы, полученные из мезофилла, а также протопласты из замыкающих клеток устьиц Vicia faba L. Растения выращивали в климатической камере Fitotron 600Н (Англия) с 1б-ти часовым световым периодом при температуре 20°С ночью и 26°С днем.

Протопласты замыкающих клеток устыщ и мезофилла получали модифицированным методом Фейерабенда и Вейлера (Feyerabend, Weiler, 1988). Для сокращения времени инкубации и увеличения выхода протопластов к исходному ферментному составу был подобран дополнительный фермент - пектолиаза.

"Раскрытие" протопластов проводили, подвергая их осмотическому шоку, используя среды с пониженным осмотическим давлением.

Микросомальную фракцию из листьев V. faba L. получали модифицированным методом Вейлера и Фейерабенда (Feyerabend, Weiler, 1988).

Для определения специфического связывания использовали [%]дигидрофузикокцин, полученный в Институте молекулярной генетики АН СССР (57 Ku/ммоль). Протопласты ((1—20)"104 в пробе) или микросомы (20 мкг белка в пробе) инкубировали с [%1дигидрофузикокцном течение 1 ч. Для освобождения от несвязавшейся метки протопласты осаждали и 3 раза промывали при центрифугировании ( 3000 g по 30 с , t=4°C), в случае микросом использовали колонки с сефадексом G—50. Неспецифическое связывание

учитывали при проведении эксперимента в присутствии 1000—кратного избытка немеченого фузикокцина.

Изучение зачисления инкубационной среды протопластами в ответ на фузикокцин проводили в среде состава: MES-КОН - 0.1 mM, КС110 mM, CaCl2 1тМ, 10 мМ аскорбиновой кислоты, 05 M маннит ( или глюкоза). Опыты проводились при концентрации протопластов около 100т-150 тысяч в 1 мл, объем пробы был 3 мл. Для регистрации изменения рН инкубационной среды использовали иономер универсальный ЭВ-74 с комбинированным электродом ORION 8103 ROSS и самописец КСП-2.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Поиск системы, в которой возможно изучать

3

специфическое связывание [ Щдигидрофузикокцина.

Задачей данной работы была попытка найти систему, отличную от выделенной фракции мембран, более приближенную к системе in vivo, в которой можно было бы изучать специфическое связывание [^Щцигидрофузикокцина. Попытки зарегистрировать специфическое связывание с целыми тканями листа Vicia faba L. не дали положительного результата, т.к. не удавалось отмыть ткани от несвязавшейся метки. Этот факт не позволяет использовать и суспензию клеток. В связи с этим мы решили проверить, нельзя ли зарегистрировать специфическое связывание в суспензии протопластов, которые лишены клеточной стенки. Хотя протопласты и не являются истинной системой in vivo, в тоже время из литературы известно, что протопласты могут отвечать на фузихоцин (стимуляция выхода протонов и входа калия) также, как целые растительные ткани (Clint, 1985; Lin et al, 1984). Это говорит о том, что протопласты должны содержать функционально активные

у

фузикокцин—связывающие белки, и поэтому данная система удовлетворяет тем требованиям, которые мы предъявляем к искомой системе.

2. Определение параметров физиологических ответов протопластов на фузикокцин (по снижению рН среды).

Для изучения физиологических эффектов мы использовали протопласты замыкающих клеток устьиц и мезофилла из листьев Vicia faba L. сразу же после их получения, т.к. их способность отвечать на фузикокцин закислением наружной среды регистрировалась только в первые 1—2 часа для протопластов из замыкающих клеток устьиц и 20—40 минут для протопластов мезофилла.

На рис.1 приведена запись ответа суспензии протопластов замыкающих клеток устьиц на различные концентрации FC: от 10—^М до 10~5М. Закисление наружной среды протопластами мезофилла было слабее и менее продолжительным (максимальная скорость снижения рН протопластами мезофилла составляла 15-30% от таковой для протопластов замыкающих клеток устьиц при той же концентрации протопластов в пробе). Из рисунка 1 видно, что начало ответа

протопластов из замыкающих клеток устьиц приходится на

—7 —5

концентрацию 10 M, а максимальный ответ на 10 М. Из-за того,

что протопласты неспособны к длительному нормальному

функционированию, точно оценить величину, при которой наблюдается

физиологический ответ равный половине от максимального не

представляется возможным, однако, определить пределы, в которых

эта величина находится, исходя из получаемых нами данных, можно.

—7 _/г

Она попадает в диапазон между 10 и 10 М, и, по всей вероятности, совпадает с таковой на целом листе.

Рис.1. Закисление инкубационной среды

протопластами замыкающих клеток устьиц Vicia faba L. в ответ на добавление фузикокцина (10~~®-10-^М). протопластов в 1

мл.

РН

Таким образом нами показано, что получаемые протопласты способны отвечать на РС выбросом протонов во внешнюю среду и что характеристики этого процесса близки к таковым на целом растении.

3. Изучение специфического связывания

[^Щдигидрофузикокцина с микросомами и протопластами.

Локализация фузккокцин-связываницих мест у протопластов. В наших экспериментах впервые использованы протопласты как объект для изучения специфического связывания [%1]дигидрофузикокцина с плазмалеммой клеток высших растений. Поэтому, естественно, следовало убедиться, что использование протопластов для измерения связывания меченого лиганда с плазмалеммой правомерно и получаемые результаты относятся к интересующему нас явлению. В таблице 1 представлены данные по связыванию протопластами (4*10 в пробе) рН]дигидрофузикокцина (концентрация [3Н1дигидрофузикокцина равна 2'10~'м; 2.510'' распадов в минуту в пробе).

Таблица 1

протопласты связывание расп/мин

:уммарное неспецифическое специфическое %

нативные 8200±800 1900±70 6300±900 100

подвергнутые осм. шоку 8100±800 1940±50 6200±800 98

обработанные Ь-химотрипсином 3100±600 1800±40 1200±600 20

Табл.1. Влияние осмотического шока и Ь-химотряпсина на связывание

3

[ Н]дигидрофузикокцина протопластами мезофилла.

Из данных таблицы следует, что разработанный нами способ инкубации протопластов в растворе [3Н}дигидрофузикокцина и отмывки протопластов от несвязавшейся метки дает возможность зарегистрировать специфическое связывание, которое составляет около 75% от суммарного связывания протопластами [%}цигидрофузикокцина (нативные протопласты).

Поскольку используемый нами объект - протопласты- существенно отличается от используемых ранее объектов для изучения связывания меченых лигандов, интерпретация полученных данных достаточно сложна.

Суммарное связывание рН]дигидрофузикокцина с протопластами может складываться из связывания на плазмалемме, связывания на внутренних структурах протопластов , а также из накопления рН]дигидрофузикокцина во внутреннем объеме протопластов, что отражают следующие уравнения:

В«*аГ Вош + Ву * В ,п «

где ВШ1 - связывание на наружной мембране протопластов

а

Ву - накопление [ Н1дигидрофузикокцина во внутреннем

свободном объеме протопластов

В-п — связывание с внутренними структурами протопластов Чтобы определить, какой из членов уравнения (1) вносит существенный вклад в получаемые нами результаты, мы провели ряд дополнительных экспериментов. Для выяснения, происходит ли накопление [^Н^дигидрофузикокцина внутри протопластов во время инкубации, мы подвергали протопласты осмотическому шоку перед последней стадией отмывки протопластов от несвязавшейся метки. Теоретически, если бы протопласты накапливали [^Н]дигидрофузикокцин в своем объеме до концентраций [%1]дигидрофузикокцина наружного раствора, то, учитывая, что объем протопластов составляет 0.06—03% объема пробы (рассчитано из значения среднего диаметра протопластов - 38 мкм и количества

4

протопластов в пробе - 14-10 10 ), значения величины Ву составили бы 7500-г75000 распадов в минуту. Эта > величина близка к тем, которые мы получаем в наших экспериментах по связыванию рЩдигидроГС с протопластами. Однако, как следует из данных таблицы 1, осмотический шок не оказывает заметного влияния на величину В{0{а| и, следовательно, в условиях нашего эксперимента величиной Ву можно пренебречь.

Мы также подвергали протопласты действию Ь—химотрипсина в процессе их инкубации с [ Н]дигидроРС. Концентрация Ь-химотрипсина подбиралась таким образом, чтобы в течение часа инкубации с ферментом протопласты не потеряли бы жизнеспособность и их количество не отличалось бы от количества протопластов в контроле. В таблице 1 представлены результаты по влиянию Ь—химотрипсина (10 мкг/мл) на способность протопластов специфически связывать рН]дигидрофузикокцин. Как видно из этой таблицы одновременная

о

инкубация протопластов с Ь-химотрипсином и [ Н]-дигидроРС приводит

к снижению специфического связывания на 80%. Неполное разрушение FC—связывающих мест под действием L—химотрипсина, возможно, связано с недоступностью части FC-связывающих белков для протеолиза или со связыванием на внутренних структурах (Bjn). В экспериментах , о которых пойдет речь позже будут приведены доказательства того, что неполное разрушение FC—связывающих сайтов связано с неоднородностью FC-связывающих белков плазмалеммы и разной доступностью их для гидролиза L-химотрипсином.

Итак, если обработка протопластов L-химотрипсином вызывает

%

существенное уменьшение связывания [ HJunrampoFC с протопластами, а осмотический шок не сказывается на измерениях, то, следовательно, из трех величин В^ , Bout и Ву основной вклад в измеряемую нами величину связывания протопластов с [%]дигидроРС вносит его связывание на наружной поверхности протопластов.

4 Физико-химические параметры связывания

[ Щдигидрофузнкокцнна с микросомами и протопластами.

В наших экспериментах проведено сравнительное изучение

связывания ["ЬцдигидроРС с выделенными мембранами из листьев

Vicia faba L. и протопластами замыкающих клеток устьиц и мезофилла

из тех же самых листьев. На рисунке 2 представлена

концентрационная зависимость связывания [ Н]дигидроРС с

микросомами и протопластами из мезофилла , а на рисунке 3 - та же

зависимость для протопластов из замыкающих клеток устьиц. Как

видно из рисунка 2 для микросомальной фракции насыщение связывания

—8

фузикокцнна приходится на концентрацию 10 М. Аналогичные зависимости были ранее получены для выделенных мембран других объектов (De Michelis et al, 1989; Бабаков, Абрамычева, 1988; Dohrmann et al, 1977).

В отличие от микросом для протопластов не получено насыщение связывания даже при концентрации [ Н]дигидрофузикокцина равной 10~6М (рис. 23), что говорит о существенном различии в связывании [3Н1дигидроРС с выделенными и нативными мембранами.

Анализ полученных зависимостей в координатах Скетчарда показал наличие одного места связывания [^ЩцигидроРС с выделенной

плазмалеммой (рис.4). Константа диссоциации комплекса этого места

3 —9

связывания с [ Н]дигидрофузикокцином равна 2.0±15'10 М, что

хорошо согласуется с литературными данными для других растительных

объектов (Бабаков, Абрамычева, 1988 ), а также с данными ,

полученными на микросомах из того же объекта Вейлером и

Фейерабендом (Feyerabend, Weiler, 1988).

Для обоих типов протопластов показано два места связывания

["^Н]цигидрофузшсокцина ( рис. 5,6 ). Константы диссоциации

комплексов [^НЦцигидрофузикокцина с первым типом FC-связывающих

мест (КД1) имеют близкие значения для протопластв из мезофилла

(Кщ=2.0±1.510 М) и протопластов из замыкающих клеток устьиц

(КдрЗ/Ы^ЧСП^М). Константа диссоциации комплекса

3

[ Щдигидрофузякокцина со вторым типом мест связывания (Кда) у

_7

протопластов значитльно выше и составляет 2.0±L5'10 М для

_7

протопластов из мезофилла и 3.0±15 '10 М для протопластов из замыкающих клеток устьиц . Причем отношение количества мест связывания с Кщ к количеству мест связывания с Кда составляет 1:4ч-1:10 для протопластов из мезофилла, и Г20ч-1:30 для протопластов замыкающих клеток устьиц, т.е. протопласты замыкающих клеток устьиц содержат в 2—4 раза больше мест связывания с Кда по сравнению с протопластами из мезофилла.

Значения констант диссоциации комплексов [^Н]дигидрофузикокцина с местами его связывания на плазмалемме протопластов предполагает

Рис.2. Концентрационная

зависимость специфического связывания [ Щцигидрофузикокцина с микросомами (1) и протопластами (2) мезофилла листьев Vicia faba L. (1)- 20 мкг

4

бежа в пробе, (2)~ 4'10 протопластов в пробе.

£ хШ^РАСЛ/мИН

Ц í tJM3 диги^ро FC]

РисЗ. Концентрационная

зависимость специфического связывания [%1]дигидрофузикокцина с протопластами замыкающих клеток

устьиц Vicia faba L. (1.610' протопластов в пробе).

,4

H] gulu^po PC]

хШ*4 •1.5 -

Рис.4. Специфическое связывание [^Щдигидрофузикокцина с

микросомами, представленное в

координатах КД=2.0±1.5'Ю~9М.

Скетчарда.

1.0

0.5-1

0.0

О 4 1 5

В МО'10 моль/Л

Рис.5. Специфическое связывание [^Н]дигидрофузикокцина с

протопластами

мезофилла,

представленное в координатах Скетчарда. Кд^гЛкШО-'м, Кд2=2.0± 13' 10—

5 40

&*Ш"нмсаь/Л

Рис.6. Специфическое связывание

3

[ Н1дигидрофузикокцина с

протопластами замыкающих клеток устьиц, представленное в координатах Скетчарда.

Кд1=3.0±1510-9М, Кд2=3.0±1510~7М.

\0

Б/F

0 2^6 МО''0 Моль/Л

наличие нового сайта связывания [ Н]яигидрофузикокцика с Кд2. Что касается первого типа фузикокцин-связывающих мест на плазмалемме протопластов, то, по-видимому, он аналогичен таковому у микросом.

Таким образом, нами получены данные о существенном отличии в связывании фузикокцина с выделенной и нативной плазмалеммой. Как мы и ожидали, подавляющее большинство фузикокцин-связывающих мест плазмалеммы протопластов взаимодействует с фузикокцином при его физиологически активных концентрациях, т.е. существовавшее ранее противоречие между концентрационной зависимостью связывания фузикокцина с плазмалеммой и концентрационной зависимостью физиологического ответа растения на фузикокцин исчезает, если для изучения связывания используется нативная мембрана протопласта.

Следует отметить, что протопласты замыкающих клеток устьиц характезуются более сильным по сравнению с протопластами из мезофилла ответом на фузикокцин (закисление наружной среды). Эти результаты коррелируют с полученними нами данными о большем количестве фузгосоцин-связывающих мест, взаимодействующих с фузикокцином при его физиологически активных концетрациях в замыкающих клетках устьиц. Это подтверждает предположение о том, что обнаруженный нами новый сайт связывания фузикокцина может быть физиологически активным, и что связывание фузикокцина именно с ним приводит к физиологическому ответу.

5. Раздельное изучение двух типов мест связывания РВДдигндрофузикокцина на плазмалемме протопластов.

Наличие двух мест связывания на нативной мембране протопласта ставит перед исследователем ряд вопросов : имеем ли мы дело с двумя различными белками или это два конформационных состояния одного и того же белка; и почему на выделенной плазмалемме

присутствует только одно место связывания фузикокцина?

В настоящее время имеются данные о существовании в плазмалемме растений только одного типа белков, связывающих фузикокцин. FC-связывающие белки выделении из плазмалеммы овса (De Boer et al, 1989). В этой работе показано, что FG-связывающий белок представляет собой гетеротример с молекулярной массой 92 Кд. В тоже время Мейер с соавторами (Meyer et al, 1989) обнаружили, что фузикокцин связывается только с одним полипептидом плазмалеммы арабидопсиса с молекулярной массой 34 кД. Поэтому обнаружение нами дополнительного типа FC- связывающих мест на нативной мембране протопласта скорее указывает на существование двух различных конформационных состояний FC-связывающего белка, соответствующих высокому (Кщ) и низкому (Кд2> сродству к фузикокцину.

Исходя из предположения о существовании двух различных

конформационных состояний фузикокцин—связывающего белка, в нашей

работе мы попытались найти причины отсутствия сайтов с Кщ на

изолированных плазматических мембранах. Для этого мы .

проанализировали отличия нативной и выделенной мембран. Во-первых,

на нативной мембране имеется электрический потенциал, и можно было

бы предположить, что под действием поля на мембране FC—связ ывающий

белок переходит из состояния с Кщ в состояние с Кд?. Во-вторых,

среды выделения мембран и протопластов сильно отличаются по „ 2+

концентрации ионов Са в них, что также может вызывать конформациошше переходы белков. И, наконец, можно предположить, что FC-связывающий белок в конформационном состоянии с Кп? более чувствителен к протеолизу, чем в состоянии с Кщ.

Константы диссоциации двух типов мест связывания на плазмалемме протопластов по нашим данным отличаются друг от друга на два порядка, это дает возможность измерять связывание

1Э

[ ЩдигидроРС раздельно с обоими типами мест связывания. В

экспериментах использовались две концентрации

3 О —7

[ Н]дигидрофузикокцина - 510 М и 210 М. При меньшей

концентрации связывание определяется сайтом с высоким сродством

о

к РС. При большей концентрации [ Н]дигидроРС связывание представляет собой сумму связывания с сайтами низкого и высокого сродства, т.е. связывание с сайтом с Кд2 определяется как разница между связыванием ["Ь1]дигидр6фузикокцина при концентрации 210-^М и при 510~9М.

Влияние деэнергизации протопластов на специфическое связывание [^Н1дигидрофузикокцина проверяли путем обработки протопластов С1ССР, Иа^ и осмотическим шоком. Если бы предположение о влиянии электрического поля на конформационное состояние фузикокцин—связывающего белка было верным, тогда-следовало бы ожидать существенного уменьшения связывания при высоких концентрациях [^Н]дигидрофузикокцина и увеличения связывания при . малых его концентрациях. Однако этого не наблюдалось. Протонофор и ингибитор клеточного метаболизма вызвали одинаковое уменьшение связывания [%}дигидрофузикокцина с обоими типами мест связывания фузикокцина (табл.2). Такое падение связывания, вероятно, обусловлено уменьшением поверхности протопластов, наблюдавшимся в эксперименте. Влияние нарушения нативносги плазмалеммы на специфическое связывание [ Н]дигидрофузикокцина оценивали при обработке протопластов осмотическим шоком с помощью перевода их в среду с пониженным осмотическим давлением (02 М маннита вместо 05) до начала инкубации. После инкубации суспензию разрушенных осмотическим шоком протопластов осаждали в ультрацентрифуге. В таблице 2 приведены данные такого эксперимента: осмотический шок вызвал незначительное уменьшения

связывания фузикокцина как с первым, так и со вторым типами мест связывания [ Н]дигвдрофузикокцина. Таблица 2

связывание в %

обработка 1-й тип мест ( Кщ) 2-й тип мест (Кщ)

- 100±4 100±5

10 мкМ С1ССР -48±4 51±7

1 мМ КаИ3 52±7 49±5

3 мМ ЭДТА 98±4 94±8

Ь-химотрипсин 96±5 10±6

(10 мкг/мл) •1

осмотический шок 95±6 %±9

Таблица 2.Влшише различных факторов на способность протопластов мезофилла специфически связывать [ Щдигидрофузикокцкн

Итак, полученные данные показали несущественность целостности плазмалеммы и наличия мембранного потенциала для конформационного состояния фузикокцин-связывающего белка. Изменение концентрации кальция (с помощью ЭДТА) также не вызвало изменения связывания фузикокцина ни с первым, ни со вторым типами мест связывания (табл2.). Однако, нам удалось обнаружить существенное различие в устойчивости двух типов мест связывания к протеолитическому действию Ь-химотрипсина. Оказалось, что РС-связывающий белок в конформационном состоянии с Кщ значительно более чувствителен к протеолизу, чем в состоянии с Кщ {см. табл. 2). Раздельное измерение влияния Ь—химотрипсина на оба типа мест связывания показало, что связывание фузикокцина с первым типом мест почти не

изменилось, тогда как связывание со вторым типом мест упало почти на 90% . Гетерогенность свойств фузикокцин-связываюших белков может быть причиной неполного разрушения фузикокцин-связывающих сайтов в наших предварительных экспериментах (см. табл.1). Кроме этого, исходя из полученных данных также можно предположить, что освобождающиеся при гомогенизции растительной ткани протеолитические ферменты повреждают РС-связывающий белок или его окружение, что и является причиной потери на выделенной плазмалемме второго типа мест связывания фузикокцина.

б. Влияние различных фитогормонов на связывание протопластами [^Н]дигидрофузикокцина.

Поскольку есть основания предполагать, что обнаруженный нами новый тип РС-связывающих мест может быть рецептором фузикокцина, мы исследовали конкуренцию за связывание с ним между различными

с _с _/:

фитогормонами (10 М ауксином, Ю М гиббереллином, 10 М

б-бензиламинопурином) и [^Н]дигидроРС. По нашим данным подобная

конкуренция отсутствует. Было получено только слабое (на 20%)

ч

ингибирование связывания [ Н1дигидроРС со вторым типом мест связывания, наблюдаемое при очень высоких концентрациях АБК (Ю-4), что может быть объяснено уменьшением площади поверхности протопластов, из-за выхода из них под действием абсцизовой кислоты осмотически активных ионов (ЛасЫсе, 1984).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате проведенного нами исследования с помощью использования протопластов в качестве объекта для изучения связывания [3Н]дигидрофузикокцина с плазмалеммой было разрешено противоречие между концентрационной зависимостью связывания фузикокцина с белками плазмалеммы и концентрационной зависимостью физиологического ответа клетки на фузикокцин (стимуляция

транспорта протонов в наружную среду). Исходя из измеренных нами значений констант диссоциаций комплексов фузикокцина с фузикокцин-связывающими белками плазмалеммы, а также из полученых данных о корреляции между количеством фузикокцин-связывающих мест и силой физиологического ответа клеток на фузикокцин, есть основания предполагать, что обнаруженный нами новый тип фузикокцин-связывающих мест обусловлен существованием в плазмалемме клеток растений белков—рецепторов фузикокцина.

Абсолютным доказательством участия этого белка в физиологическом ответе клетки на фузикокцин была бы реконструкция в системе in vitro всей цепочки передачи сигнала от FC—рецепторного комплекса на эффекторную молекулу (АТФазу или какой-либо другой транспортный белок) и демонстрация в этой системе , что добавление фузикокцина приводит к эффекту, близкому к физиологическому. Для проведения подобного доказательства необходимо получить высоксючшценные и нативные компоненты всей описанной выше цепочки. Полученные нами данные о высокой чувствительности физиологически активной формы фузикокцин-связывающго белка к протеолизу показывают, что выделение этого белка нуждается в специальных условиях и усиленной защите от протеолитических ферментов.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что специфическое связывание протопластов из листьев Vicia faba L. с [%]дигидрофузикокцином в основном определяется связыванием этого регулятора роста растений с белками плазмалеммы.

2. Показано, что протопласты замыкающих клеток устьиц и мезофилла закисляют наружную среду в ответ на фузикокцин. На плазмалемме этих протопластов обнаружен дополнительный сайт

связывания фузикокцина, константа диссоциации которого попадает в

диапазон физиологически активных концентраций фузикокцина (Кд^=

—7 —7

2'10 М для мезофилла и Кд2=3'10 М для замыкающих клеток устьиц),

что может указывать на функциональную роль данного сайта

связывания в ответе растительной клетки на фузикокцин.

3. Количество сайтов связывания фузикокцина с Кда на плазмалемме протопластов из замыкающих клеток устьиц в 2-4 раза больше, чем на плазмалемме протопластов из мезофилла. Обнаружена корреляция между количеством фузикокцин-связывающих сайтов с Кщ в плазмалемме протопластов со способностью протопластов закислягь наружную среду в ответ на фузикокцин.

4. Показано отсутствие конкурентного взаимодействия между фузикоцином и фитогормонами ( индолилуксусной кислотой, 6-бензиламинопурином, абсцизовой кислотой и гиббереллином) за обнаруженный на плазмалемме протопластов ГС-связывающий сайт с

КД2-

5. Показано, что нарушение нативности плазмалеммы, а также изменение концентрации ионов кальция не влияют на связывания фузикокцина с этой мембраной. Деполяризация плазмалеммы не приводит к изменению соотношения количества сайтов связывания с

КД1 й КД2-

6. Показана большая чувствительность сайта с Кда к действию Ъ-химотрипсина, что может быть одной из причин полного или частичного отсутствия этого сайта на выделенных мембранах.

Основные публикации по теме диссертации: 1. Бабаков А£, Данилина ЕЭ, Шевченко ВН. Сравнение связывания фузикокцина с микросомами и протопластами из мезофилла листьев У1аа [аЬа Ь. // Биологические мембраны 1990, т.7, N 2, с.

113-118.

2. Бабаков А.В„ Данилина ЕЗ. Связывание фузикокцина с плазмалеммой протопластов, выделенных из мезофилла листьев Vicia faba L // Материалы международного симпозиума " Регуляция покоя и устойчивости растений к неблагоприятным факторам", Москва, 1989, с. 22.

3. Бабаков А.В, Данилина ЕЗ. Сравнительное изучение двух типов мест связывания фузикокцина, находящихся на плазмалемме протопластов Vicia faba L.// Биологические мембраны. 1991, т.8, N•2 с 134-139,

4. N.Yu. Abramycheva, А.Т. Babakor, S.V. Bilushi, Ё.Е. Danilina, and V.P. Shevchenko . Comparison of the biological activity of fusicoocia in higher plants with its binding to plasma membranes«// Planta. 1991» Vol. 183, N. 3, p. 315-320.

Формат 60x90 I/16. Объем 1,25д.л. _____Тир. 100 акз.

Поди.в печ. 4.04.91г. Зая. 397 к.

Типография Центрального стадиона им.В .Ленина