Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интегральные переходные ионные токи через мембраны изолированных вакуолей и протопластов из клеток высших растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Интегральные переходные ионные токи через мембраны изолированных вакуолей и протопластов из клеток высших растений"

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНИ РАН

На правах рукописи

РГ8 ОД

УДК 581.17:577.352

ПАРФЕНОВА Евгения Леонидовна

ИНТЕГРАЛЬНЫЕ ПЕРЕХОДНЫЕ ИОННЫЕ ТОКИ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ ВАКУОЛЕЙ И ПРОТОПЛАСТОВ ИЗ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

03.00.12 - физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ - 1994

Работа выполнена в группе электрофизиологии лаборатории ионного обмена и дыхания растений Казанского института биологга КНЦ РАН

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

Г.А.Великанов

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук,

профессор О.О.Лялин

- доктор физ.-мат. наук, А.Н.Анисимов

Ведущее учреждение: Биологический НИИ

Санкт-Петербургского государственного университета

«о

Защита состоится " " М&Л 1994 г. в " " час. нг заседании специализированного совета К 002.16.01 по присуждении ученой степени кандидата биологических наук (специальность -физиология растений) при Казанском институте биологии КНЦ РА! (420503, г.Казань, абонементный ящик 30).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан А&А/1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук -^/¿-'с'с'- ! Н.Л.Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В настоящее время уже обще-физнано, что ионные каналы, представляющие собой пути пассив-гай ионной проводимости мембран и пропус!сающие потоки ионов при здвигах мембранного потенциала, играют исключительно важную золь во многих процессах жизнедеятельности растительной клетки: /чествуют в процессах адаптации клетки к внешним воздействиям, галяются одним из звеньев механизма осморегуляции и регуляции гургора, обеспечивают проведение потенциала действия, реализуют ззаимодействие различных систем клетки.

Разработанный в последнее десятилетие метод фиксации напряжения на исследуемой мембране с помощью микропипеток (patch з1ашр) и его различные варианты позволяют изучать работу отдельных ионных каналов путем регистрации токов одиночных канатов, а также работу всей системы ионных каналов мембраны с помощью регистрации интегральных переходных ионных токов, активирующихся при сдвигах потенциала на мембране. Изучение интегральных ионных токов через исследуемую мембрану в различных физиологических условиях и при различных воздействиях позволяет приблизиться к пониманию механизмов регуляции многих внутриклеточных процессов и роли ионных каналов в реализации этих механизмов. Сведения об ионных каналах в мембранах клеток растений, имеющиеся в научной литературе, достаточно объемны и, вместе с тем, противоречивы, а участие системы ионных каналов в физиологических процессах растительной клетки до сих пор является одним из наименее изученных вопросов в физиологии растений. Это и послужило причиной интереса к данной теме исследования.

Цель и задачи исследования. Основная цель данного исследования заключалась в поиске и изучении зависимости от мембранного потенциала интегральной ионной проводимости мембран изолированных вакуолей и протопластов в различных условиях с помощью модифицированного метода фиксации напряжения с неплотным контактом (loose patch clamp). Для этого были поставлены следующие задачи: 1) исследовать потенциалзависимость интегральной ионной проводимости тонопласта и плазмалеммы, выявить сходство и раз-

личие в свойствах проводимости этих мембран; 2) ^исследовать влияние механического натяжения мембраны на интегральные , ионные токи через плазмалемму и тонопласт.

Научная новизна. 1) Показано, что мембрана изолированной вакуоли (тонопласт), как и мембрана изолированного протопласта (плазмалемма), может обладать различными типами потенциалзави-симости интегральной ионной проводимости ("симметричной" и "выпрямляющей"). Установлено, что переход от одного типа проводимости тонопласта к другому может происходить при воздействии абсцизовой кислоты (АБК). 2) Обнаружена чувствительность "це-локлеточной" ионной проводимости мембраны изолированных протопластов к механическому натяжению ее локального фрагмента (меха-ночувствительность); подобной чувствительности у мембраны изолированных вакуолей не обнаружено. 3) Показано, что вольтампер-ная характеристика плазмалеммы в условиях натяжения ее фрагмента отличается от таковой в отсутствие натяжения. 4) Установлено, что чувствительность интегральной проводимости плазмалеммы к натяжению ее фрагмента зависит от наличия ионов кальция в наружной среде, изменяется под влиянием растительного гормона -абсцизовой кислоты и ингибиторов фосфорилирования внутриклеточных белков - хлорпромазина и тетракаина. 5) Обосновывается гипотеза, о совместном участии системы ионных каналов плазмалеммы и системы , цитоскелета в регуляции клеточных процессов, сопровождающихся локальными деформациями и/или изменениями натяжения плазмалеммы. На основании полученных результатов высказывается предположение о важной роли механочувствительности потенциалза-висимой проводимости плазмалеммы в процессах осморегуляции и регуляции тургора раститель ной-клетки.

Практическая и теоретическая значимость работы. Результаты исследований помогают понять механизмы, вовлеченные в процессы осморегуляции и регуляции тургора растительных клеток, 1 а также в регуляцию других процессов в растениях, связанных с механическим воздействием на плазмалемму (рост клеток растяжением, движения органов растений, деление клеток, проведение потенциала действия). Они свидетельствуют о том, что механочувствитель-ность проводимости плазмалеммы может выполнять функцию сенсора и переключателя в регуляции этих процессов, а также способству-

ют пониманию той важной роли, которую выполняют мехапочувстви-тельные ионные каналы в реализации целостной системы внутриклеточной регуляции. Экспериментальные результаты о влиянии растительных гормонов на пассивную проводимость мембран растительных клеток, полученные в работе, дают возможность глубже понять механизмы воздействия гормонов на клетки растений. ,Не исключено, что использованный в работе методический подход дает наилучшую возможность изучения ответной реакции целого протопласта или вакуоли, а также любой модельной системы, имитирующей клетку, на внешние воздействия, поскольку он не нарушает целостности мембраны объекта и не "вымывает" его содержимое.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались аа Всесоюзных Сабининских семинарах (1987,1988,1989, Москва), на Всесоюзной конференции ' 'Физиолого-г енетические аспекты минерального питания растений", 1990, Киев), на Всесоюзных школах "Биомембраны".(1986,1988, Звенигород; 1990, Пущино-на Оке), на Всесоюзной конференции молодых ученых "Механизмы регуляции функционирования биологических систем и методы их изучения" (1988, Казань), на Отчетных конференциях Казанского научного центра РАН (1986 - 1992), на III съезде ВОФР (1993, С.-Петербург) , на расширенных заседаниях научного семинара лаборатории ионного обмена и. дыхания растений и отдела энергетики и адаптации КИБ КЩ РАН (Казань, 1993; 1994).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 10 печатных работах. .

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на "fp.-зтраницах машинописного текста, Еключая 31 рисунок и 1 фотографию, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы (195 наименований, из"них 40 на русском языке).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ

J

Объектами исследования являлись: 1) вакуоли'; изолированные лз клеток корнеплода красной столовой свеклы Beta vulgaris L. механическим способом (Саляев и др., 1981) в рабочем растворе, содержащем 400 мМ Tris-Mes, 100 мМ КС1 и 25 мкМ Са2+, рН 7,2 ; 2) протопласты, изолированные из клеток стеблей 10-12 -дневных

проростков бобов Vicia faba знзиматическим способом (Ценцевиц-кий и др., 1982). После выделения одиночные протопласты переносили в стандартный рабочий раствор, содержащий 130 мМ КС1, 5 Са(Шз)2, 10 мМ Tris-Mes, 350 мМ сахарозы, рН 7,2. Для исследований использовали объекты, имеющие диаметр от 55 до 11О мкм.

Для регистрации интегральных переходных ионных токов черег исследуемую мембрану использовали электронное устройство, реализующее модифицированный метод фиксации напряжения с неплотньа контактом измерительной микропипетки с поверхностью исследуемо! мембраны (Нуриев,. Великанов, 1989). Метод состоит в том, что ? локальному участку мембраны исследуемого объекта (целой изолированной вакуоли или протаплЗЬта) прижимается термически отполированная стеклянная микропипетка с площадью отверстия в кончике 100+200 мкм2 (Рис.1). Электрическое сопротивление пипетга Rn составляет величину порядка 500 КОм. В зоне соприкосновенш пипетки с поверхностью мембраны образуется "контакт", сопротивление которого (сопротивление "утечки" Ry) составляет величину порядка единиц МОм. На пипетку подайтся импульсы напряжения калиброванной амплитуды (VK) с тем, чтобы изменить потенциал н< локальном участке мембраны, находящемся под кончиком пипетки, Регистрируемым параметром является ток, активирующийся по; действием командного напряжения. В использованном устройств« применена аналоговая компенсация "паразитных" параметров: последовательного сопротивления Rn, сопротивления "утечки" Ry ; емкостных переходных процессов Сп, схожая с описанной В.Штюме-ром с соавт.(1987). Измерительная ячейка конструктивно не отличалась от примененной в работе А.Н.Ценцевицкого с соавт.(1982) Микропипетки изготавливались по способу Фонбрюна (1951) и за полнялись тем же рабочим растЕором, что и измерительная ячейка "Приклеивание" микропипетки к мембране исследуемого объект осуществлялось с помощью микроманипулятора КМ-2 под визуальны: контролем посредством микроскопа МБИ-3 и осциллографа С1-83 Интегральные токи регистрировали на самописце Enàï 620.02(ГДР). Микропипетка была соединена с баллончиком от шпри ца (объем 2 см3), высоту уровня раствора в котором относитель но уровня раствора в измерительной ячейке можно было регулиро вать. Этим достигалась возможность установления требуемого кон

такта микропипетки с мембраной исследуемого объекта, а также возможность подачи на локальный фрагмент мембраны под кончиком пипетки отрицательного гидростатического давления (подсасывания), за счет чего этот фрагмент мембраны натягивался и/или деформировался. Таким образом можно было изучать влияние натяжения локального участка мембраны исследуемого объекта на регистрируемые переходные токи.

Анализ всей совокупности результатов, полученных нами в экспериментах с изолированными вакуолями и протопластами, а также результатов, полученных при отработке этого нового для исследуемых объектов методического подхода, позволил нам заключить, что регистрируемые переходные токи являются результатом фиксации подаваемого напряжения на "целоклеточном" фрагменте мембраны объекта (whole-cell, whole-vacuole). Это подтверждается плотностями регистрируемых токов (10+100 мкА/см2), их пропорциональностью размерам объекта; сравнением результатов, полученных в условиях неплотного контакта и в условиях диализа объектов; опытами с использованием нистатина для перфорирования "це-локлеточного" фрагмента мембраны; соответствием плотностей токов и емкостей мембран, рассчитанных по переходным процессам, с известными величинами, а также соответствием регистрируемых нами переходных токов результатам других исследователей, полученных в условиях диализа исследуемых объектов. Это заключение также подтверждается результатами опытов, свидетельствующими о малом вкладе нелинейности сопротивления "контакта" (Ry) в регистрируемые токи (менее 2 нА, вклад менее 10-2ОХ) (опыты с каплями масла, с вакуолями и протопластами малых размеров, ин-гибирование переходных токов тетраэтиламмонием и др.). Фиксация командного напряжения на "целоклеточном" фрагменте мембраны исследуемого объекта, по-видимому, обусловлена стрессированием фрагмента мембраны под пипеткой и переходом его в состояние обратимого электрического пробоя. Это подтверждается фактом включения дополнительной ёмкости в токовый ответ на тестирующие импульсы, совпадением осциллограмм емкостных переходных процессов от объектов, полученных при различных вариантах регистраций (при неплотном контакте и при диализе), и другими наблюдениями. Об обратимости пробоя можно говорить на основании того, что

разрушения фрагмента мембраны под кончиком пипетки не происходит, так же как и не наблюдается выхода бетацианина (эндогенного красителя) из вакуолей красной свеклы. Кроме того, объект можно без повреждения "сбросить" с кончика пипетки и вновь "приклеить". Ранее исследователями было установлено (Корзун, 1987), что мембрана изолированной вакуоли легко переходит в стрессиро-ванное состояние, характеризующееся повышенной проводимостью, что объясняется расширением уже имеющихся или образованием новых пор'в мембране. Они обнаружили, что переходу мембраны в состояние с повышенной проводимостью способствует приложение к ней электрического напряжения и гидростатического давления. В наших экспериментах мембрана объекта находилась под воздействием обоих факторов - электрического напряжения и гидростатического давления. В данной работе мы не ставим перед собой цель строго обосновать причины осуществления электрического доступа внутрь исследуемого объекта.• Это вряд ли возможно из-за сложности электростатических и механических взаимодействий в области контакта кончика микропипетки с мембраной. Не исключено, что здесь определённую роль играют размер отверстия в кончике микропипетки и процедура настройки регистрирующего устройства.

Таким образом, токи, зарегистрированные использованным в данной работе устройством на изолированных вакуолях и протопластах в условиях локальной фиксации напряжения с неплотным контактом, являются "целоклеточными" переходными токами мембраны объекта вследствие обратимого электрического пробоя фрагмента мембраны под кончиком микропипетки. Компенсация сопротивления "утечки" 1?у позволяет вычитать из регистрируемых токов также и токи "утечки" по мембране. Поэтому регистрируемые переходные токи отражают лишь потенциалзависимые изменения (приращения) проводимости (сопротивления) мембраны исследуемого объекта. Компенсацию ¡?у осуществляли каждый раз перед подачей смещения напряжения (Ук) на мембрану исследуемого объекта (стандартная ступенька ±100 мВ, 6-7 с). На представленных регистрациях тока положительный ток соответствует току выходящего направления, отрицательный - току входящего направления.

- 9 -

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.Потенциадзависимость проводимости тонопласта. На мембране изолированной вакуоли фиксировали ступеньки командного напряжения от 0 до ¿150 мВ. Были зарегистрированы переходные токи двух типов: 1) "симметричный" - деполяризация активировала выходящий ток, а гиперполяризация - примерно равный по амплитуде входящий ток (Рис.2А); 2) "входящее выпрямление"- входящий ток, активируемый гиперполяризацией, в 5-10 раз превышал выходящий ток, активируемый деполяризацией ( Рис.2Б). Вероятности их регистрации из общей популяции вакуолей составляли соответственно 50% и 48% (п-35). Стационарные вольтамперные характеристики тонопласта для этих переходных токов показаны на Рис.3.. Факт наличия переходных ионных токов в ответ на смещение потенциала на тонопласте свидетельствует о потенциалзависимости проводимости тонопласта. Обнаруженные на тонопласте токи "входящего выпрямления", по-видимому, физиологически целесообразны и свидетельствуют о том, что тонопласт может находиться в состоянии, слабо диссипирующем ионные концентрационные градиенты, "разрешая" ток только входящего в вакуоль направления. Это свойство проводимости тонопласта может быть необходимо для реализации запасающей функции вакуоли и поддержания тургора^клетки.

Интегральные ионные токи "входящего выпрямления", имеющие плотность и кинетику активации, подобные зарегистрированным нами, были обнаружены в условиях диализа на мембранах вакуолей, изолированных из клеток различных органов и тканей растений (Hedrich et al., 1986; Coyaud et all, 1987; Colombo et al., 1988; 1989 и др.). Симметричные токи с быстрой кинетикой активации на тонопласте были обнаружены А.М.Корзуном и Р.К.Саляевым (1984). Зарегистрированные нами переходные токи "симметричного" типа с медленной кинетикой активации* насколько нам известно, на тонопласте еще не были обнаружены. Вместе с тем, такая двусторонняя проводимость тонопласта представляется оправданной, поскольку, например, процесс потери и восстановления тургора растительной клеткой трудно представить без выхода и входа в вакуоль электролитов, в частности, калия.

Анализируя существование двух преобладающих типов потенциалза-

пипетки с мембраной исследуемого объекта.

Рис.2. Переходные токи тонопласта: А - "симметричные", В -"входящего выпрямления".

Рис.4. Влияние АБК (10 4М) на переходные токи тонопласта: А (1) - до внесения АБК, А (2)- 15 мин., Б - 25 мин. действия АБК.

- 11 -"

висимости интегральной ионной проводимости тонопласта, полученных в настоящей работе, можно предположить, что они относятся к двум популяциям вакуолей ("солевых" и "сахарных"), характерным для тканей корнеплода (Саляев, 1985), т.е. отнести их к вакуолям из клеток различного функционального назначения. Можно также считать вероятным существование тонопласта одной и той же клетки в различных функциональных состояниях, допуская при каких-то условиях переходы между ними. В пользу последнего предположения свидетельствуют результаты, полученные в экспериментах с использованием растительного гормона - абсцизовой кислоты (АБК).

3.1.1.Влияние АБК и ИУК. В условиях регистрации на тоноплас-те "симметричного" токового ответа (Рис.4А,1) в ячейку вносили АБК (конечная концентрация 10"4М). После 2-15 минут воздействия АБК (Рис.4А,2) выходящий ток почти исчезал (уменьшался в 8-10 раз), а входящий ток не- изменялся. Таким образом, под действием АБК наблюдался переход тонопласта из состояния с "симметричной" проводимостью в состояние с проводимостью "входящего выпрямления". После 25 минут воздействия АБК токовый отклик снова становился "симметричным", но был в 4-5 раз слабее начального отклика (Рис.4Б). Если АБК вносили на фоне "входящего выпрямления", то в результате регистрировали слабые "симметричные"' отклики. Двухфазность действия АБК на физиологические процессы в растениях отмечалась и в других работах (Лялин, 1993). Наблюдаемые изменения переходных токов вероятно являются следствием закрывания потенциалзависимых ионных каналов тонопласта под влиянием абсцизовой кислоты. Можно предположить, что АБК переводит вакуолярную мембрану в "запертое" состояние, что соответствует характеру действия этого гормона на клетки растений (Полевой, 1982; 1989). Внесение в среду АБК в меньшей концентрации (10_5М) не оказывало влияния на переходные токи.

Эксперименты с использованием индолилуксусной кислоты (ИУК), играющей исключительно важную роль в жизнедеятельности растений и, видимо, способной влиять на ионную проводимость мембран клеток растений, показали, что этот растительный гормон также может изменять потенциалзависимость проводимости тонопласта. При внесении в среду ИУК (конечная концентрация 10~4М)

на фоне "симметричных" токовых откликов амплитуда переходных токов возрастала примерно в 2 раза. Таким образом, под действием ИУК наблюдалось увеличение потенциалзависимой проводимости тонопласта, особенно для входящих токов. Наблюдаемая феноменология согласуется с известным явлением увеличения поглотительной способности клеток растений под влиянием ИУК (Медведев и др, 1975; 1978; 1980; Полевой, 1982).

Описанные результаты экспериментов с АБК и ИУК кажутся интересными, поскольку могут внести новый аспект в понимание механизмов регуляции этими гормонами функциональной активности мембран, учитывая возможность их влияния на пассивный ионный транспорт через ионные каналы. Способность АБК и ИУК изменять потенциалзависимую проводимость тонопласта, воздействуя на ионные каналы, может являться необходимым звеном в механизме осмо-регуляции и регуляции тургора клеток растений.

3.1.2. Чувствительность к.натяжению. Наши попытки обнаружить чувствительность потенциалзависимой проводимости тонопласта к натяжению- его фрагмента (механочувствительность) не увенчались успехом. Приложение отрицательного гидростатического давления (натяжения) к фрагменту тонопласта, находящемуся под кончиком микропипетки, не оказывало влияния на регистрируемые интегральные переходные токи через тонопласт. Это может свидетельствовать о том, что вакуолярная мембрана не обладает чувствительностью к механическому натяжению, что, в свою очередь, может объясняться тем, что вакуолярная мембрана в клетке не испытывает больших перепадов гидростатического давления и, следовательно, не испытывает необходимости в механочувствительности. В то же время не исключено, что одиночные ионные каналы тонопласта могут обладать чувствительностью к натяжению, как общи* свойством ионных каналов живых клеток (Поттосиг, 1990).

3.2. Потенциалзависимость проводимости плазмалеммы. На плаз-малемме изолированных протопластов при сдвигах напряжения от С до ±200 мВ были получены два основных типа переходных токов: 1] "симметричный": деполяризация активировала выходящий ток, а гиперполяризация - ток входящего направления (Рис.бА); 2)"входящее выпрямление": гиперполяризация активировала входящий ток, <

выходящий ток в ответ на деполяризацию практически отсутствовал (Рис.ББ). Вероятность их регистрации составляла 75% и 23% соответственно (п-114). Стационарные вольтамперные характеристики плазмалеммы, соответствующие этим токам, показаны на Рис.б. Плотности токов и кинетика их активации соответствуют данным других исследователей, зарегистрировавшим входящие и выходящие переходные токи в условиях диализа как на плазмалемме специализированных клеток, так и на плазмалемме обычных клеток (Нес1гз.сЬ, 5сЬгоес!ег, 1989 и др.). Очевидно каналы, опосредующие эти токи, присутствуют практически во всех клетках, что, вероятно, является общим свойством плазматической мембраны растений. Предполагается, что такие ионные каналы участвуют в поддержании осмотического баланса, ионного гомеостаза и в регуляции тургора растительных клеток. Обнаруженные в представленных экспериментах два основных типа переходных токов при смещении потенциала на плазмалемме могут соответствовать различным физиологическим состояниям протопластов или протопластам из функционально различающихся клеток.

Представленные результаты показывают,, что плазмалемма и то-нопласт тлеют общие свойства, в частности, интегральная ионная проводимость этих мембран зависит от трансмембранного потенциала, причем обе мембраны обладают двумя типами потенциал-зависимости проводимости - "симметричной" и "выпрямляющей". Эти результаты подтверждают гипотезу С.В.Конева (1987) о множественности и функциональной специфичности структурных перестроек мембран, о том, что одна и та же мембрана может обратимо и кооперативно переходить в несколько дискретных структурно-функциональных состояний при достижении порогового уровня метаболических сдвигов или внешних сигналов. Помимо общих свойств проводимости тонопласта и плазмалеммы нами было обнаружено и их существенное отличие заключающееся в том, что интегральная по-тенциалзависимая проводимость плазмалеммы обладает чувствительностью к натяжению ее локального фрагмента, а тонопласт, как отмечалось выше, очевидно не обладает подобным свойством.

З.З.Механочувствительность потенциадзависимой проводимости плазмалеммы. Результаты экспериментов показали, что приложение отрицательного гидростатического давления (натяжения) к ло-

§0 100 ¿00*3

Рис.5. Переходные токи плазмалеммы: А - "симметричные", Б -"входящего Еыпрямления".

Рис.6. Вольтамперные характеристики плазмалеммы: А - для "симметричных" токов, Б - для токов "входящего выпрямления". а .»» чя\

*чо -во

О,¡с

Рис.7. Влияние натяжения фрагмента плазмалеммы на "целоклеточ-ные" переходные токи протопласта: А - отсутствие натяжения, Б -слабое натяжение, В - увеличение натяжения (давления). Рис.8. Вольтамперная характеристика плазмалеммы в условиях натяжения ее фрагмента.

кальному участку мембраны изолированного протопласта, находящемуся под кончиком микропипетки, изменяет "целоклеточные" переходные токи. В качестве исходных (контрольных) переходных токов брали "симметричные" токи. Величину отрицательного давления контролировали по разнице уровней раствора в измерительной ячейке и баллончике, соединенном с микропипеткой. Было установлено, что слабое натяжение участка плазмалеммы отрицательным давлением порядка 1-2 мм водного столба изменяет "симметричный" токовый ответ (Рис.7А): ток в ответ на гиперполяризацию становился двухкомпонентным (Рис.7Б). Сначала активировался выходящий ток, сменяющийся входящим током. При дальнейшем увеличении натяжения фрагмента плазмалеммы гиперполяризационный ток становился выходящим, как и деполяризационный (Рис.7В). Таким образом, в этом состоянии гиперполяризация, как и деполяризация, активировала переходный ток выходящего направления. Дальнейшее увеличение натяжения (давления) практически не влияло на характер регистрируемых токов. Стационарная вольтамперная характеристика плазмалеммы для переходных токов в условиях натяжения ее локального фрагмента показана на Рис.8.- Аналогичная процедура приложения гидростатического давления (натяжения) к фрагменту мембраны изолированной вакуоли не оказывала влияния на регистрируемые переходные токи через тонопласт. Следовательно, полученные результаты позволяют говорить о чувствительности интегральных переходных ионных токов через плазмалемму к натяжению ее локального фрагмента и, значит, о механочувствитель-ности потенциалзависимой проводимости плазмалеммы. Появление выходящего переходного тока в ответ на гиперполяризацию в условиях близкого к нулю мембранного потенциала и отсутствия на плазмалемме существенных градиентов для возможных носителей то-, ка означает уменьшение (отрицательное приращение) "целоклеточ-ной" проводимости плазматической мембраны в условиях натяжения ее локального фрагмента. Уменьшение проводимости плазмалеммы, в свою очередь, отражает деактивацию ионных каналов при гиперполяризации. В этих условиях, очевидно, натяжение "выключает" каналы, активирующиеся при гиперполяризации, и "включает" каналы, деактивирующиеся при гиперполяризации плазмалеммы. Таким образом, при натяжении фрагмента плазмалеммы происходит переключе-

ние её интегральной проводимости на другой тип ионных каналов. Это видно по промежуточному отклику (Рис.7Б), где ответ на гиперполяризацию имеет еще двухфазный характер: уже "работают" каналы, активируемые натяжением, но еще не выключились полностью каналы, деактивируемые натяжением. Возможно эта ситуация отражает гиперполяризационный ответ, связанный с эффектом электровозбудимости мембран при высоких концентрациях ионов калия в наружной среде. Взаимосвязь изменений тургорного давления и потенциала отмечалась В.А.Опритовым (1978) при изучении распространяющегося воэбулщения!по проводящим элементам борщевика и тыквы. Величина потенциала действия при этом составляла около 100 мВ.

Представленные результаты о чувствительности интегральной потенщалаавистой проводимости плазмалеммы изолированных протопластов к механическому натяжению её локального фрагмента интересны в связи с возможностью участия этого свойства плазма-леммы в процессах регуляции объёма и тургора клетками растений. Ионные каналы, чувствительные к натяжению мембраны, вероятно являются необходимым элементом того механизма, посредством которого клетки "чувствуют" изменения объёма и отвечают на них. Пэтч-кламп-исследования показали (Chamberlin, Strange, 1989), что каналы, активируемые натяжением, "включаются" малыми изменениями гидростатического давления, приложенного к пэтч-пипетке. Такие каналы идентифицированы у широкого ряда клеток и тканей (Morris, 1990). Было постулировано, что они играют роль регуляторов объема клетки (Ubl et al., 1988 и др.). На мембрана: клеток растений исследование механочувствительных ионных каналов только началось. Существуют лишь единичные работы (Falke ei al., 1988; Schroeder, 1988), в которых на плазмалемме были зарегистрированы токи одиночных механоактивируемых ионных каналов. Показано (Hurst, Hunter, 1990), что каналы, активируемы' натяжением, регистрируются при деполяризующих потенциалах ил; при потенциале покоя, а гиперполяризация уменьшает вероятност: открытого состояния этих каналов. В связи с этим представляете вероятным, что регистрируемые нами в условиях натяжения плазма леммы переходные ионные токи отражают следующие процессы: натя жение плазмалеммы активирует механочувствительные ионные кана

лы, которые закрываются при гиперполяризации, тогда как деполяризация открывает дополнительные каналы, находившиеся в деакти-вированном состоянии. Эти процессы соответствуют увеличению проводимости плазмапеммы при деполяризации и уменьшению её при гиперполяризации, наблюдающимся в условиях натяжения. Предполагается (Schroeder, 1988), что натяжение мембраныtпротопластов приводит к активации каналов, которые могут деполяризовать мембрану и поэтому работать в качестве сенсоров и регуляторов тургора. Исчезновение входящего тока при натяжении мембраны может отражать процесс инактивации натяжением ионных каналов-плазмапеммы. Не исключено, что в плазмалемме протопластов бобов, так же как и в мембранах клеток животных (Morris, 1989 и др.), сосуществуют каналы, активируемые натяжением, и каналы, инактивируемые натяжением, которые вместе обеспечивают эффективный механизм регуляции объёма и тургора растительной клетки. По крайней мере, полученные нами результаты позволяют предположить это. До настоящего времени все исследования механочувстви-тельных ионных каналов мембран были выполнены с помощью регистрации работы одиночных ионных каналов. Применённая в данной работе методика позволила регистрировать ответ всей системы ионных каналов исследуемой мембраны на локальный механический стимул (натяжение локального фрагмента плазмалеммы). Очевидно, что такой методический подход может помочь понять роль ионных каналов в процессе регуляции объёма и тургора.

Дальнейшие эксперименты показали, что причиной изменения переходных токов является именно натяжение фрагмента мембраны протопласта под пипеткой. После регистрации выходящих токов в условиях натяжения фрагмента мембраны (Рис.ЭА) осуществлялось разрушение этого фрагмента (диализ), что возвращало картину регистрируемых переходных токов к "симметричному" виду (Рис.9В). По-видимому', разрушение фрагмента устраняет причину переключения "целоклеточной" проводимости мембраны при натяжении.

Локальное структурное возмущение (натяжение) может распространяться на всю мембрану по непрерывному мембранному каркасу, функцию формирования которого выполняют и элементы подмембран-ного цитоскелета - микротрубочки и микрофиламенты, которые ассоциированы с цитоплазматической стороной плазмалеммы (Конев,

1987). За счет сокращающихся волокон микрофиламентов появляется возможность эффективно перемещать в продольном и поперечном направлениях локальные участки деформации мембраны. Результаты, подтверждающие возможность именно такого механизма влияния локального натяжения мембраны на "целоклеточные" переходные конные токи, были получены при использовании ингибитора микрофиламентов - цитохалазина В.

3.3.1.Участие цитоскелета. Было обнаружено, что через 10 минут после внесения в среду цитохалазина В (конечная концентрация 10"%) на фоне выходящих токов, полученных при натяжении мембраны (Рис.ЮБ), ток в ответ на гиперполяризацию становится двухфазным (Рис.10В), а затем входящим (Рис.ЮГ), т.е. отклик становится "симметричным", как если бы натяжение фрагмента мембраны было снято или мембрана перестала его "чувствовать". Однако кинетика переходных токов полностью не восстанавливается до исходной, зарегистрированной в отсутствие натяжения мембраны (Рис.ЮА). По-видимому, состояние микрофиламентов важно и для функционирования ионных каналов, работающих в отсутствие натя--жения мембраны. Связь каналов, зависящих от растяжения, со структурами цитоскелета была установлена на животных клетках (Sachs, 1991). Участие ансамбля белков цитоскелета очевидно является необходимым компонентом объём-зависимой регуляции транспорта ионов (Орлов и др., 1988; Казсинов, Маслова, 1990; Турки-на, 1990). Полученные нами результаты позволяют предположить важную роль цитоскелета в передаче сигнала о деформации (или натяжении) локального участка плазмалеммы на всю мембрану и изменении потенциалзависимости её проводимости.

3.3.2.Влияние ABK. В связи с обнаруженным влиянием абсцизо-вой кислоты на потенциалзависимость проводимости тонопласта и известными эффектами этого гормона на движения устьиц, связанные с изменениями тургорного давления клеток, а, следовательно, с изменениями натяжения плазмалеммы, можно было ожидать влияния АБК на механо<1увствительные переходные ионные токи протопластов. Результаты экспериментов подтвердили это предположение. В условиях регистрации выходящих токов при натяжении плазмалеммы (Рис.НА) внесение в среду абсцизовой кислоты (конечная концентрация 10~4M) через 15 минут устраняло гиперполяризацион-

_,

ll.lt

гс.9. Влияние разрушения фрагмента плазмалеммы под-кончиком тетки на переходные токи: А - натяжение фрагмента; Б, В - две эследовательные регистрации токов после разрушения фрагмента. 1с.10. Переходные токи плазмалеммы: А - в отсутствие натяжения эагмента; Б - в условиях натяжения фрагмента; В, Г - через 10 га. и 15 мин. после внесения в среду цитохалазина В (10-5М).

Й ~ ,11а

£

£

ll.Se

ЛИ

ю.11. Влияние абсци^овой кислоты (10-4М) на переходные токи 1азмалеммы в условиях натяжения ее фрагмента: А - до внесения Ж, Б - после внесения АБК (10~4М).

ю.12. Влияние хлорпромазина (10_5М) на переходные токи плаз-злеммы в условиях натяжения: А - до внесения хлорпромазина; , В - после 10 мин. и 20 мин. воздействия хлорпромазина.

ную компоненту тока (Рис.ПБ). В концентрации 10"5М АБК ингиби-ровала обе компоненты тока. В отсутствие натяжения фрагмента плазмалеммы АБК не влияла на переходные токи. По видимому, АБК блокирует именно механочувствительные элементы ионной проводимости плазмалеммы, работающие в условиях натяжения мембраны. Другой мишенью действия АБК могут являться компоненты цитоске-лета клеток растений и прежде всего, как отмечают исследователи (СороЧинский и др., 1990), система микротрубочек - основного организующего компонента цитоскелета. Такая точка зрения кажется вероятной в связи с описанным выше влиянием цитохалазина Е на механочувствительность переходных токов плазмалеммы и предположениями об участии системы подмембранного цитоскелета е обеспечении механочувствительности проводимости плазматическое мембраны. Нельзя исключить и влияние АБК на гидравлическую проводимость мембран (Скобелева, 1990).

Полученные экспериментальные результаты о влиянии АБК нг пассивный ионный транспорт, осуществляемый системой потенциал-зависимых ионных каналов, позволяют предположить, что абсцизо-вая кислюта участвует в регуляции физиологических процессо! растительной клетки, связанных с изменениями натяжения плазмалеммы.

3.3.3.Участие ионов кальция. Известно, что внутриклеточный Са2+ необходим для нормального функционирования клеток, в частности, для активации процессов регуляции объема и тургора (Медведев, Штонда, 1989; Лялин, 1990; Hodick, Sievers, 1988). Кром< того, для растяжения плазматической мембраны в гипотоническо] среде необходимы внеклеточные ионы Са2+ (Glaser, Donath, 1989). Предполагается (Скобелева, 1990), что десорбция Са2+ с поверхности плазмалеммы нарушает запуск процесса осморегуляции растительной клетки. В наших экспериментах было обнаружено, чт< изолированные протопласты при переносе в бескальциевый раство] стандартного состава лизируют. Таким образом, предполагая участие ионов Са2+ в обеспечении чувствительности плазмалеммы протопластов к натяжению, были проведены эксперименты по регистрации интегральных переходных токов на протопластах, предварительно обработанных хелатором ионов кальция - ЭДТА (10"2М) На таких протопластах не было обнаружено чувствительности пере

ходных токов к натяжению фрагмента плазмалеммы. Внесение в среду ЭДТА (конеч.концентрация 10~2М) на фоне выходящих токов в условиях натяжения фрагмента мембраны трансформировало эти токи в' слабые "симметричные". Видимо связывание ионов Са2+ хелатором лишает плазмалемму способности отвечать на механический стимул изменением её проводимости. Данные литературы (Okazaki et al., 198?; 1990) свидетельствуют о том, что воздействие' гипотонической среды- приводит к возрастанию концентрации Са2+ в цитоплазме, опосредованному активацией механочувствительных Са2+-каналов плазмалеммы, а также об активации ионами Са2+, поступающими в цитоплазму, калиевых и хлорных каналов плазмалеммы и тоноп-ласта, что вызывает увеличение выхода ионов из метки. Можно предположить, что Са2+ осуществляет двойное действие в условиях натяжения плазмалеммы: ингибирует входящие токи и дополнительно активирует выходящие токи. 0 возможности такого влияния кальция на ионные каналы плазмалеммы свидетельствуют сообщения исследователей (Ketchmt, Poole, 1990; 1991 и др.). Такое предположение хорошо согласуется с известными процессами, происходящими при адаптации протопласта к гипотоническим условиям, когда выход электролитов и отсутствие их входа в "клетку" обеспечивает выход воды и восстановление объёма протопласта, т.е. соответствует механизму осморегуляции. Нельзя исключить и возможность потери чувствительности ионных каналов к потенциалу при отсутствии свободных ионов Са2+ в среде (McClintock, Ache, 1990).

3.3.4.Влияние ингибиторов фосфорилирования внутриклеточных белков. Многие из эффектов ионов Са2+ опосредуются классом Са2+-связывающих белков, в частности, кальмодулином. Некоторые исследования (Onozuka et al., 1987) показали, что кальмодулин может быть вовлечён в отклики, опосредованные кальцием, поскольку антикальмодулиновые фармакологические агенты ингибируют регуляцию объёма клеткой. В этой связи было интересно выяснить, имеют ли регистрируемые нами механочувствителъные переходные токи какую-либо связь с процессами фосфорилирования внутриклеточных белков. Результаты экспериментов показали, что через 20-27 минут после внесения в среду хлорпромазина (конечная концентрация 10"5М) деактивация проводимости при гиперполяризации в условиях натяжения фрагмента мембраны протопласта исчезает

(Рис.12). Этот результат свидетельствует о том, что систем элементов, ответственная за этот отклик, перешла в закрыто состояние или о том, что исчезла ее_потенциалзависимость. Пос кольку хлорпромазин является ингибитором (антагонистом) кальмс дулина, то можно предполагать участие Саг+-кальмодулин-аави симого фосфорилирования в обеспечении механочувствительност ионной проводимости плазмалеммы. Субстратами фосфорилированй могут являться белки ионных каналов и/или элементов цитоскеле та. Однако, механизм действия хлорпромазина весьма многостаро нен. Отмечают конкурентные взаимоотношения между фенотиазинам и кальцием в мембране (Гайнутдинов и др., 1971; Кемпинс кас,1972), а также блокирование хлорпромазином кальциевого ток (Жерелова, Гриценко, 1988; Zherelova, 1989).

Макконнеллом и Голдстейном (McConnell, " Goldstein, 1988) был показано участие протеинкиназц С и обмена фосфатидилинозитидо в регуляции объёма эритроцитов.. Наши эксперименты с использова нием местного анестетика тетракаина (конеч.концентраци 2-10""%), являющегося ингибитором протеинкиназы С, хотя ин строго специфичным (Hannum, Bell, 1987), показали, что он тож ингибирует- гиперполяризационный ток в условиях натяжения фраг мента мембраны. Эти результаты указывают на возможность участи Са2+-фосфолипид-зависимого фосфорилирования в обеспечении меха нечувствительности ионной проводимости плазмалеммы. Не исключе но также, что тетракаин ингибирует подъем уровня Са2+ в цитоп лазме, на что указывают некоторые авторы (Hazama A., Okada Y. 1990). Если деактивируемая гиперполяризацией проводимость плаз малеммы связана со входом ионов Са2+ через механоактивируемы каналы, то блокирование хлорпромазином и тетракаином Са2+-ток должно приводить к исчезновению гиперполяризационной компонент переходных ионных токов. Именно это и наблюдалось в эксперимен тах. Нельзя исключить и возможность неспецифического действи этих агентов на мембраны (Гордон, 1976; Анисимов и др., 1983)

Проведенная нами проверка влияния некоторых блокаторов ион

ных каналов (этакриновой кислоты, ТЭА, CdCl2 и др.) на механо

чувствительные токи плазмалеммы не дала положительных ре

зультатов, что согласуется с сообщениями исследователе (Ktorris, 1990) о слабой селективности механочуветвительных йог

1ых каналов, ответственных за чувствительность проводимости «ембран к натяжению, и об отсутствии для них специфических бло-саторов.

В целом, полученные в представленной работе результаты позволяют предположить, что механочувствительность интегральной «энной проводимости плазмалеммы клеток растений является важным звеном в сложной внутри: ¿неточной системе осморегуляции, регуляции тургора и других процессов, сопряженных с изменениями натя-кения плазмалеммы.

ВЫВОДЫ

1. Ионная проводимость тонопласта и плазмалеммы зависит от. грансмембранного потенциала. Для обеих мембран выявлено два типа этой зависимости, соответствующие двум типам зарегистрированных переходных токов ("симметричным" и "входящего выпрямления").

2. Переход от одного типа проводимости тонопласта к другому может происходить под влиянием абсцизовой кислоты. Абсцизовая кислота вызывает уменьшение, а индолилуксусная кислота - увеличение амплитуды переходных ионных токов (т.е. потенциалзависи-мой проводимости) тонопласта.

3. Обнаружено, что потенциалзависимая проводимость плазмалеммы обладает чувствительностью к механическому натяжению мембраны, а проводимость -тонопласта не обладает такой чувствительностью.

4. Установлено, что натяжение локального фрагмента плазмалеммы изменяет "целоклеточные" переходные токи: гиперполяризационный ток меняет направление с входящего на выходящий, что означает уменьшение вместо увеличения проводимости.плазмалеммы при гиперполяризации. Это изменение может отражать "выключение" ионных каналов, активируемых гиперполяризацией в отсутствие натяжения, и'"включение" ионных каналов, деактивирующихся гиперполяризацией плазмалеммы.

5. Передача локального воздействия (натяжения) на всю плазматическую мембрану может осуществляться с участием системы цитоскелета.

6. На чувствительность интегральных переходных токов плазма-леммы к натяжению ее локального фрагмента влияют: абсцизова* кислота, связывание ионов Са2+ в среде, а также ингибиторы фос-форилирования внутриклеточных белков (хлорпромааин и тетракаин'

7. Полученные результаты и данные литературы позволяют предположить, что чувствительность потенциалзависимой проеодимост! плазмалеммы к натяжению может являться сенсором и переключателем в физиологических процессах, связанных с изменениями натяжения плазмалеммы при осмотически-индуцированных изменения> объема и тургора клеток растений.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1. Парфенова Е.Л., Нуриев И.X., Ценцевицкий А.Н., ВеликаноЕ Г.А. Является ли емкость клеточных мембран на частотах 10-50С Гц . конформационно-чувствительным параметром состояния липид-но-белковой.фазы? - Казань.- 1986.- Деп. в ВИНИТИ N 7486-В86.-30с. "

2. Парфенова Е.Л., Нуриев И.X., Ценцевицкий А.Н., ВеликаноЕ Г.А. Переходный ток на плазмалемме протопластов из клеток стеблей бобов и его связь с внутриклеточными процессами. - Казань.-1988.- Деп. в ВИНИТИ N 5261-В88.- 24с.

3. Парфенова Е.Л., Нуриев И.Х. Изучение природы переходного тока на плазмалемме изолированных протопластов из клеток стеблей бобов // Мат-лы конф. мол. ученых Казанск. ин-та биологии КФАЬ СССР. Казань.- 1988.- Деп. в ВИНИТИ N 1014-В90.- С.145-148.

4. Великанов Г.А.,. Парфенова Е.Л., Ценцевицкий А.Н., Нуриев И.Х. Потенциалзависимые интегральные токи через мембрану вакуолей из корнеплода свеклы // В сб.: Н+-АТФазы и реактивность растительной клетки,- Казань.- 1989.- С.38-47.

5. Великанов Г.А., Парфенова Е.Л., Ценцевицкий А.Н., Нуриев И.Х. Механизм функционирования системы сопряженного транспорте и частотная зависимость электрической емкости тонопласта // Tai,' же,- С.47-60.

6. Парфенова Е.Л., Великанов Г.А. Управляемые гидростатическим давлением интегральные токи через плазмалемму изолированных

- 25 -

протопластов из клеток стеблей бобЬв // Там же,- С.77-79. 7. Великанов Г.А., Парфенова Е.Л., Нуриев И.X., Ценцевицкий А.Н. Интегральные ионные токи и электрический пробой тонопласта // Биологические мембраны.- 1991.- т.8, N2.- С.172-181. 3. Парфенова Е.Л., Великанов Г.А., Нуриев И.Х. Потенциалзависи-мая проводимость плазмалеммы изолированных протопластов Vicia faba, чувствительная к натяжению мембраны' // В сб: Биоэлектро-генез и транспортные процессы у растений.- Н.Новгород.- 1991-С.52-58.

9. Великанов Г.А., Парфенова Е.Л., Нуриев И.Х. Интегральные токи пассивного транспорта ионов через мембрану изолированной вакуоли // Физиол. и биох. культурных растений.-1992.- т.24, N3.-С.275-280.

10. Парфенова ь'.Л., Великанов Г. А. Механочувствительная проводимость плазмалеммы как сенсор в осморегуляции растительной клетки// III съезд ВОФР, С.-Петербург, Тез. докл., 1993.-С.184. -

Сдано в набор 23.03.94 г. Подписано в печать 30.03.94 г. Форм.бум. 60-х 84 1/16. Печ.л. I. Тираж 100. Заказ ИЗ.

Лаборатория оперативной полиграфии КГУ 420003 Казань, Ленина, 4/Ъ