Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кальций-зависимые катионные каналы вакуолярной мембраны высших растений

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Кальций-зависимые катионные каналы вакуолярной мембраны высших растений"

На правах рукописи

ТИХОНОВА ЛЮБОВЬ ИГОРЕВНА

КАЛЬЦИЙ- ЗАВИСИМЫЕ КАТИОННЫЕ КАНАЛЫ ВАКУОЛЯРНОЙ МЕМБРАНЫ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

03.00.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино -1997

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН и на базе Юлиус-фон-Сакс-Инсгитута Вюрцбургского университета (Германия).

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор физико- математических наук, профессор Берестовский Г.Н.: кандидат биологических наук Потгосин И.И..

доктор физико- математических наук Казаченко В.Н.; доктор биологических наук Иванов Б.Н.

Ведущая организация:

кафедра биофизики биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится

и/0/С<Х 1997 г. в

часов на

заседании диссертационного совета Д 200.23.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142292, Московская область, г. Пущино, Институт биофизики клетки РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН. •

Автореферат разослан

•■40*

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

¡МИсК^ 1997 г.-

Смолихина Т.И.

Актуальность проблемы. Ионные каналы играют важную роль во мно-х процессах, происходящих в растительных клетках. Одни из них включе-I в систему генерации потенциала действия, другие- в механизмы движе-я устьиц или приспосабливания к изменяющимся условиям окружающей еды, функции некоторых пока не известны. Первые работы по исследова-ю ионных каналов растений с использованием пэтч- метода были опубли-ваны в 1984 г. (Moran et al., 1984; Schroeder et al., 1984). За последние не-олько лет в растительных мембранах обнаружено более 20 различных ти-в ионных каналов. Особый интерес представляют ионные каналы тоно-аста, так как вакуоль является самым большим запасающим компартмен-м растительной клетки и занимает до 90% её объёма. Описано два основ-IX типа Са2+- зависимых ионных токов в вакуолях высших растений:: так зываемые медленный (MB) и быстрый (БВ) вакуолярные токи. По сравне-ю с MB- каналами, которые активируются при увеличении концентрации топлазматического Са2+, БВ- токи изучены слабо. Быстрые вакуолярные ки впервые были зарегистрированы при уровне цитоплазматического 2+< 1 |iM (Hedrich & Neher, 1987). Возможно, что именно быстрые вакуо-рные каналы определяют проводимость вакуолярной мембраны в покое, таются спорными также многие свойства MB- каналов, а также их роль в дели Са2+- активируемого высвобождения вакуолярного Са2+ (Ward & iroeder, 1994; Ward, Pei & Schroeder, 1995).

Цель и основные задачи исследования. Для изучения свойств Са2+- зави-мых катионных каналов в вакуолярной мембране мезофильных клеток гтьев ячменя на уровне целых вакуолей и одиночных каналов и определе-я физиологической роли этих каналов в жизнедеятельности растительной пки были определены следующие основные задачи исследования: изучить свойства быстрого вакуолярного тока на уровне целых вакуолей из мезофильных клеток ячменя (Hordeum vulgare L.); идентифицировать одиночные ионные каналы, ответственные за быстрый вакуолярный ток;

зыяснить систему внутриклеточной регуляцию БВ- каналов; исследовать свойства медленных вакуолярных каналов; осуществить проверку правомерности общепринятой модели кальций-активируемого выхода Са2+ из вакуоли через MB- каналы. Научная новизна. Впервые изучены такие свойства быстрого вакуоляр-го тока, как зависимость от концентрации цитоплазматического и вакуо-шого Са2+, селективность и потенциалозависимость. Впервые идентифи-зованы одиночные ионные каналы, определяющие быстрый вакуолярный Найдены внутриклеточные вещества, способные контролировать ак-шость БВ- каналов в растительных клетках. Описаны такие ранее не изу-[ные свойства медленных вакуолярных каналов, как вольт- амперные ха-гтеристики одиночного MB- канала в широком диапазоне потенциалов, гяние вакуолярного кальция на потенциалозависимость и кинетику акти-(ин канала, зависимость относительной вероятности нахождения MB- ка-юв в открытом состоянии от значения кальциевого градиента на вакуо-

лярной мембране. Доказана несостоятельность общепринятой модели каль ций- активируемого высвобождения Са2+ из вакуоли через MB- каналы.

Практическая ценность. В результате проведённых исследований разра ботан удобный метод изолирования вакуолей, а также подобраны услови: для стабильной регистрации быстрых вакуолярных токов. Результаты рабо ты могут найти свое применение в растениеводстве для оптимизации калие вого и азотного питания злаковых культур. Кроме того, работа может ока заться ценной для дальнейшего решения проблемы засухоустойчивости рас тений, благодаря обнаруженной нами регуляции быстрых вакуолярных ка налов полиаминами, уровень которых повышается в стрессовых условиях, i том числе при засухе.

Структура н объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзо ра литературы, описания методов исследования, изложения результатов, об суждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 120 страниц ма шинописного текста, включая 28 рисунков и 1 таблицу. Список литературь содержит 223 источника литературы (из них 211- зарубежных).

Апробации работы и публикации. Материалы диссертации представлень на семинаре в институте имени Юлиус-фон-Сакса Вюрцбургсзсого универси тега (Германия, 1996), на ежегодных международных конференциях SEB i Ланкастере (Англия, 1996) и Кантербери (Англия, 1997), на отчетной конфе ренции ИБК РАН (1996), на 2-й городской конференции молодых учёны: (Пущино, 1997). По материалам диссертации опубликованы три работы Две работы приняты к печати.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Растительный материал. Ячмень (Hordeum vulgare L.) выращивался : почвенной культуре, в климатической камере со световым режимом: 14 ча сов- свет, 10 часов- темнота, при температуре- 20 С. Для исследований ис пользовался первичный лист 7-10 дневных растений.

Выделение протопластов. Мезофильные протопласты выделяли согласи* методике, описанной Мартинойя (Martinoia et al, 1981) и усовершенство ванной Кайзером (Kaiser, Martinoia Wiemken, 1982). Листья ячменя с уда ленным эпидермисом инкубировали 1 час в ферментативном раствор (в мМ): 500 D-сорбита, 1 СаСЬ, 15 MES, pH 5.5- ТРИС, 0.05% поливинил пирролидона, 1% цешполазы Y-C, 0.01% пектолиазы Y-23, 0.5% мацерози ма R-10, 0.1% бычьего сывороточного альбумина при 30 С. Мезофильны протопласты отделяли трехступенчатым центрифугированием в градиент перколла и хранили на льду в течении всего экспериментального дня.

Растворы. Контрольный раствор, использовавшийся для заполнени экспериментальной камеры и проведения контрольных измерений в нача ле и конце каждого эксперимента, содержал (в мМ): 100 KCl, 5 ЭГЪА 15 TRI CINE, 410 сорбита, pH 7.5- ТРИС (650 мОсм/кг). Для заполнени микроэлектродов использовался контрольный раствор, раствор, содержа щий 2 мМ СаСЬ или MgCh вместо ЭГТА, или раствор, содержат»

)0 мМ KCl вместо 100 мМ без добавления сорбита. Базовый раствор для иерения зависимости ионных токов от концентрации Са2+ и Mg2+ содер-л (в мМ): 100 KCl, 15 TRICINE- ТРИ С (pH 7.5), 2ЭГТА, 2 HEDTA, JTA, 400 сорбита (650 мОсм/кг). Заданные концентрации свободного Са2+ Vig2+ получали при добавлении к базовому раствору одномолярного растра СаС1г или MgCfe. Расчет свободного Са2+ по общем у проводили по ограмме к.б.н. Алексеева, используя константы стабильности комплексов зличных хелаторов с Са2+, приведенные в работах Otto (Otto et al, 1985) и шта (Smith & Miller, 1985). При проведении экспериментов по селективно-1100 мМ KCl в контрольном растворе заменяли на 10 мМ, 30 мМ, 300 мМ и 1 М KCl, а также на 100 мМ NH4CI, CsCl, RbCl, LiCl или NaCl, соответ-5енно. Для изучения влияния полиаминов к контрольному раствору до-вляли 5 мМ орнитина (CsH^OitoHCI); 1 и 5 мМ путресцина (1,4- диами-бутана дигидрохлорид, C4H12N22HCI); 0.01, 0.03, 0.1, 0.3 и 1 мМ спермина (N-[3- Аминопропил]-1,4- буганодиамина тригидрохлорид, C7Hi9N3-;С1) или 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1 и 1 мМ спермина (N,N'- бис([3-шнопропил]- 1,4-бутинодиамина) тетрогидрохлорид, C10H12N4 4HCI), со-ветсгвенно.

Выделение вакуолей. Вакуоли изолировали из протопластов посредст-м механического разрыва плазматической мембраны стеклянной неоп-вленной микропипеткой, заполненной контрольным раствором. Выход куоли наблюдали под микроскопом. Для экспериментов использовали лько свежевыделенные вакуоли. Все измерения проводились в режиме не-ерывной перфузии омывающего раствора со скоростью 0.5-1 мл/мин.

Пэтч- кламп- измерения проводили по стандартной методике, в режиме зссации мембранного потенциала, используя одну из трех различных пэтч-нфигураций: "whole vacuole" (аналогично "whole cell"), "cytosolic side-t" (аналогично "outside-out") и "vacuolar side-out" (аналогично "inside-t"). Эксперименты на целых вакуолях начинались через 20- 30 мин после зрушения мембраны под пипеткой для установления полного равновесия пегочного раствора с содержимым вакуоли. Емкость микроэлектрода и кость мембранной везикулы компенсировали в начале и корректировали фоцессе каждого эксперимента. Для измерения тока использовали усилить Axopatch 200А. В этой работе измерительный электрод и электрод авнения содержали KCl в равных концентрациях, поэтому диффузионный тенциал был пренебрежимо мал. Направление токов и потенциалов прн-малось согласно Бертлу (Berti et. al., 1992). Мембранный потенциал равен тенциалу цитоплазмы по отношению к вакуоли, а положительный входящий) ток определяется потоком катионов из цитоплазмы в вакуоль, ггегралыше токи и токи через одиночные каналы фильтровали на часто-200- 500 Гц и 0.5- 2.5 кГц, соответственно, и записывали на твердый диск мпьютера IBM PC. Для регистрации и анализа токов использовали па-г программ PClamp 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Быстрый вакуолярный канал.

1.1. Зависимость БВ- тока от цитоплазматического и вакуо-лярного кальция.

Быстрые вакуолярные (БВ) токи впервые наблюдали Хедрих и Нее (Hedrich & Neher, 1987) в вакуолях корнеплодов сахарной свеклы. Токи ак тивировались "мгновенно" потенциалами обоих знаков и доминировал! при низком цитоплазматическом Са2+. Детально свойства БВ- токов до на стоящего времени изучены не были. Мы исследовали зависимость инте грального БВ- тока от концентрации цитоплазматического кальция в диа пазоне от I нМ до 0.5 мМ в вакуолях мезофильных протопластов ячменя.

Рис. 1. Блокирование БВ- тока цитоплазма-,2*

тмческим и вакуолярным Са

.А

2 мМ Са

1 нМ Са.

вак

-8 -6 -4 log([Ca]/M)

При уровне вакуолярного кальци; близком к физиологическому (окол( 2мМ, е( а]., 1992) мгновенна;

компонента ионного тока проявляв-выходящее выпрямление (выходящш ток определяется потоком катионов и: цитоплазмы в вакуоль при положи тельных потенциалах). Записи токов полученные в ответ на изменение по тенциала от -100 до +100 мВ с шагом I .20 мВ от уровня поддерживаемого потенциала ОмВ приведены на рис. 1А слева. Выходящее выпрямление БВ-тока вызывалось блокированием вхо дящего тока вакуолярным кальцием При удалении кальция из вакуоли (1 нМ Са2+ на фоне симметричного ' 100 мМ КС1 с обеих сторон мембраны) токи при положительных и отрицательных потенциалах имеют сравнимые амплитуды (рис. 1А, справа). Вольт- амперные характеристики ва-куолярной мембраны с 2мМ (О) и 1 нМ (®) вакуолярного кальция и 1 нМ цитоплазматического Са2+ приведены на рис. 1Б. Относительные амплитуды токов (при 1 нМ вакуолярного Са2*), измеренные при +100 мВ (□) и -100 мВ (■), как функции от цито-

лазм этического кальция (средние по 6 экспериментам) представлены на ис. 1В. Оба набора точек аппроксимированы уравнением Хилла с кажущейся константой диссоциации около 6 цМ и коэффициентом Хилла = 0.7. Этот результат показывает, что связывание кальция со стороны ци-оплазмы является потенциалонезависнмым и, следовательно, Са2+- свя-ывающее место расположено вблизи поверхности тонопластной мембраны. : меньшим сродством и слегка потенцналозависимо БВ- токи блокируются итоплазм этическим М§2+ (константа блокирования около 19 цМ при 100 мВ и 15 цМ при -100 мВ). Блокирование токов Са2+ и полностью братимо.

Для детального анализа влияния вакуолярного кальция на БВ- ток были роведены эксперименты с тремя дополнительными концентрациями сво-одного вакуолярного Са2+, а именно 5 цМ, 18 цМ и 50 цМ и контрольным аствором с цитоплазматической стороны (1 нМ Са2+). Вакуолярный Са2+ локирует БВ- ток потенциалозависимым образом. Увеличение концентра-ин вакуолярного Са2+ вызывает большее уменьшение входящего БВ- тока о сравнению с выходящим. Уменьшение входящего БВ- тока вакуолярным а2+ описывается уравнением Хилла с кажущейся константой диссоциации римерно 14 цМ. Действие вакуолярного Са2+ не является специфичным: 1куолярный М§2+ также блокирует БВ- токи потенциалозависимым обра->м, к тому же проявляет большее сродство к каналу по сравнению с Са2+.

1.2. Селективность вакуолярной мембраны.

Для определения селективности вакуолярной мембраны для катионов по эавнению с анионами контрольный раствор с цитоплазматической сторо->1 заменяли на раствор, содержащий 10мМКС1. Результирующие вольт-лперные кривые с 1 нМ Са2+ с обеих сторон мембраны приведены на рис. 2 лева). Уменьшение концентрации КС1 в десять раз сдвигает потенциал ре-фсии токов на 50 мВ в сторону положительных значений, что близко к шновесному потенциалу для К+ равному +56 мВ (вычислено с учетом ион->1х активностей). Используя уравнение Гольдмана-.Ходжкина- Катца, на :новании потенциала реверсии вычислили отношение коэффициентов про-щаемости Рк+/Ра- = 30. Этот результат показывает, что быстрый вакуо-[рный ток переносится одновалентными катионами, хотя небольшой вклад >нов С1- нельзя не отметить. Десятикратное уменьшение концентрации КС1 омывающем растворе приводит к уменьшению амплитуды выходящего >ка примерно в 8 раз при +100 мВ. Трехкратное увеличение концентрации С1 в омывающем растворе от 100 мМ до 300 мМ приводило к увеличению тлитуды выходящего тока примерно в 1.3 раза при +100 мВ (рис. 2, жим образом, БВ- ток стремится к насыщению при нескольких сотнях шшмолеи К*. Проводимость, оцененная из наклона линейной части льт- амперных кривых при положительных потенциалах, составляет 2 ±1.0, 12.6 ±0.6, 16.6 ±0.9, 23.3 ±0.2 и 22.0 ± 0.8 См/м2 для 10, 30, 100, 300 1000 мМ цитоплазматического К+, соответственно.

Рис. 2. Селективность вакуолярной мембраны.

+

той Михаэлиса для К+ К*= 33.5 ± 9.3 мМ и максимальной проводимостью Отах= 23.8 См/м2. Проводимость мембраны при отрицательных потенциалах примерно в два раза выше, чем при положительных. При симметричных ионных условиях с 1 нМ Са2+ и 100 мМ КС1 с обеих сторон мембраны вольт-амперные характеристики мембраны нелинейны и слегка асимметричны. Участок высокого сопротивления в районе -40 мВ (рис. 1Б, 2) при увеличение концентрации цитоплазм этического К+ до 300 мМ или уменьшении её до 10 мМ сдвигается приблизительно к -20 мВ или +40 мВ (рис. 2, слева), соответственно, в направлении сдвига равновесного потенциала для К*.

Селективность вакуолярной мембраны для катионов исследовали, последовательно заменяя контрольный раствор в камере на растворы содержащие ЮОмМИШО, Ш>С1, СяО, ЫаС1 и ПС1. Результирующие вольт- амперные кривые с 1 нМ Са2+ с обеих сторон мембраны приведены на рис. 2, справа. Вакуолярная мембрана селективна для одновалентных катионов в ряду: ИН4+ > К+ = К.Ь+ > Св+ > Ыа+ > У + , который близок к 4 ряду селективности Эйзенмана, что свидетельствует о средней силе связывания иона с заряженными группами канальной поры. Ряд проводимостей вакуолярной мембраны, оцененный по наклонам линейных участков вольт- амперных кривых при положительных потенциалах аналогичен ряду селективности.

-71.3. Идентификация ионных каналов, ответственных за БВ-ток.

При условиях, позволяющих наилучшим образом наблюдать БВ- токи низкий цитоплазматический Са2+), используя изолированные фрагменты !акуолярной мембраны, мы регистрировали быстро флюктуирующие по-енциалозависимые токи через одиночные каналы.

>ис. 3. Проницаемость и потенциалозависимость 1ДИНОЧНЫХ БВ-каналов.

V 1000

100 К+/ 100 к+

мН

80

60

40 -40

у^П^А^^^^ -60

Разрешить кинетику активации токов нам не удалось, так как переходы между низкой и высокой активностью каналов происходили за время порядка 1-2 мс после изменения потенциала. Записи активности одиночных каналов в изолированном "cytosolic side- out" мембранном фрагменте при симметричных ионных условиях (IOOmMKCI, 1 нМ Са2+ с обеих сторон мембраны) и различных потенциалах показаны на рис. ЗА. Частота фильтрации токов-500 Гц. Слева приведены амплитудные гистограммы, построенные по тем же записям, но с использованием отрезков большей длительности (2- 3 с). Амплитудные гистограммы аппроксимировали суммой распределений Гаусса. Токи через одиночный канал проявляют небольшое вы-;одящее выпрямление при симметричных ионных условиях. Проводимость :анала, оцененная по наклонам участков вольт- амперной кривой, состав-тег 25.1 ±0.8 пСм и 17.5 ±0.4пСм (п= 14 экспериментов) при отрицатель-[ых и положительных потенциалах, соответственно (рис. ЗБ, О). Одиночные :аналы селективны для ионов К+ по сравнению с С1-. На рис. ЗБ приведены ;ольт- амперные характеристики одиночных БВ- каналов, построенные по [змерениям на "cytosolic side- out" и "vacuolar side- out" мембранных фраг-

ЦК) -120-80.И0

80 120 Е(К) ® V/mB

ментах в градиенте 10 КС1цнт/ 100 KCW (®) и 100 КС1циТ/ 10 KCU« (*), соответственно. Линейная регрессия точек в 10 мМ вакуоляркого и цитоплаз-мэтического KCl представлена прерывистой линией. Проводимость канала в 10 мМ KCl, оцененная по наклону этой прямой, составляет 4.3 + 0.3 пСм. Потенциал реверсии тока через одиночный канал в условиях 10 KCliair /100 КСЬак (•) градиента составляет +50 мВ, что близко к потенциалу Нернста для К+ (+56 мВ) и находится в прекрасном соответствии с потенциалом реверсии интегральных токов в аналогичных условиях (рис. 2). С противоположным 100КС1иит/10 KCW (#) градиентом потенциал реверсии токов через одиночный канал составил -50 мВ. Из этого можно предположить, что канал имеет одинаковую К+ / С1- селективность при положительных и отрицательных потенциалах. Отношение проницаемостей, оцененное по уравнению Гольдмаиа- Ходжкина- Катца для одиночных каналов Рк+ / Ра * 30. Одиночные каналы имеют катнонную селективность, аналогичную селективности вакуолярной мембраны. Канал имеет одинаковую селективность для катионов с цнтоплазматической и вакуолярной стороны. Мы исследовали зависимость вероятности нахождения канала в открытом состоянии от потенциала (рис. 4). Для этого амплитудные гистограммы, построенные по отрезкам записей токов через одиночные каналы, аппроксимировали суммой распределений Гаусса и вычисляли произведение вероятности нахождения канала в открытом состоянии (Ро) и числа каналов в мембранном фрагменте (N) как: NP0 = lPi + 2Рг + ЗРз +...+ пРп, где Pi- вероятность нахождения i- го канала в открытом состоянии.

Рис. 4. Сравнение потенциапозависимости одиночных БВ- каналов и интегральных токов.

1

о 0.5 р-

0

h

: К V 1

1.5

о

0.5 о Р-

0 *

Число каналоь б мстбрап!'.;

гКп 'U \

ff~

менте определяли по биномиальному распределению. Вероятность нахождения одиночного канала в открытом состоянии (Ро, ©) и среднее число открытых каналов на 1 цм2 площади вакуолярной мембраны (ЫРо, О) имеют минимум при -40 мВ (рис. 4). ИРо вычисляли, разделив интегральные токи от целой вакуоли на амплитуды токов через одиночные каналы при соответствующих потенциалах. Зависимости ИРо и Ро от потенциала (V) аппроксимировали распределением Больцмана

т п

-100 0 100 V/м В

по формуле: NPo = -

1 + ехр

(V, - V)zi

RT

1 +ехр

(V2-V)z2

RT

. Заряды во-

ротных частиц в области положительных и отрицательных потенциалов, соответственно, 21 =0.78 ±0.07 и 7Л - 1.10 ±0.13, потенциалы половинной ве-

тности Vi = 44 ± 3 мВ и V2 = -109 ± 4 мВ, а максимальные значения NPo 1 положительных и отрицательных потенциалах, соответственно, : 1.29 ±0.04 ип- 1.21 ±0.07. Вероятность нахождения одиночного канала гкрытом состоянии (Ро) и среднее число открытых каналов (NPo) имеют [ктически одинаковую потенциалозависимость. Основываясь на потен-шозависимости активности канала, мы считаем, что БВ- канал может на-1ится в одном из трёх возможных состоянии: одном закрытом состоянии вух открытых состояниях, имеющих место при больших отрицательных н южительных потенциалах (рис. 4, непрерывная линия). Среднее число г ялов на 1 дм2 вакуолярной мембраны, определённое посредством даНно-знализа, составляет N= 1.38.

Действие цитоплазматического Са2+ на одиночные каналы мы исследо-¡и на "cytosolic side- out" мембранных фрагментах. Контрольный раствор итоплазматической стороны последовательно заменяли на растворы, со->жащие 5 и 50 цм свободного Са2+, что приводило к уменьшению актив-гги одиночных каналов. Средние токи через одиночные каналы при ) мВ и -60 мВ обратимо уменьшаются с увеличением концентрации цито-пматического Са2 примерно на 50% при 5 цМ Са2+ и на 75-80% при цМ Са2+. Эти данные находятся в хорошем соответствии с нашими нзме-И1ЯМИ на целых вакуолях "(рис. 1В). Для исследования действия вакуоляр-о Са2+ на одиночные каналы, мы проводили измерения на "vacuolar side" мембранных фрагментах. Замена контрольного омывающего раствора ¡акуолярной стороны на раствор с 5 цМ свободного Са2+ вызывает гньшение амплитуды токов через одиночный канал при отрицательных генциалах (40% при -100 мВ). Интегральные токи на целых вакуолях в тех условиях (с 5 рМ вакуолярного Са2+) меньше на 35% по сравнению с пролем. Дальнейшее увеличение концентрации вакуолярного Са2+ до цМ приводило к уменьшению амплитуды токов на 78% при -100 мВ. С М вакуолярного Са2+ амплитуды входящих канальных токов становятся пмеримо маленькими. Выходящие токи (при положительных потенциа-;) через одиночный канал не чувствительны к увеличению вакуолярного гьция до 50 цМ.

1.4. Блокирование БВ- тока полиаминами.

Мы исследовали влияние орнитина, путрисцина, спермидина и спермина БВ- ток, добавляя гидрохлориды полиаминов к контрольному раствору, »ультирующие вольт- амперные зависимости приведены на рис. 5. Поли-ины блокируют БВ- токи в последовательности: спермин > спермидин > грисцин > орнитин, в основе которой лежит их эффективный заряд, ермидин и спермин блокируют БВ- токи с цитоплазматической стороны генциалозависимым образом.

Константы блокирования при +100 мВ примерно в три раза меньше, чем и -100 мВ (для спермидина при +100 мВ (И) Ko.s = 71 цМ и при-100 мВ (□)

Ко.5 = 204 р.М, для спермина при +100 мВ (♦) Ко.5 = 2.9 цМ и при -100 м Ко.5 = 7.2 цМ) (рис. 5). На основании значений констант блокирован! было рассчитано, что спермидин проникает в пору канала примерно на 4 её длины, а спермин на 3%. Рис. 5. Блокирование БВ- тока полиаминами.

путрисцин

;к

1 мМ ; 5 ММ

10 цМ

ГУ

-6 -5 -4 -3 -2 logC(cuepMHAHHa) / М

7 -6 -5 -4 -3 logC(cnepMHHa) / М

Токи чер( одиночные БВ- kj налы, подобно ш тегральным вакус лярным токад блокируются cncf мидином и cnej мином. Так ка концентрация свс бодных гюлиамг нов в растительны тканях колеблете на уровне 20 300 цМ для спер мина, 50- 600 (ilv для спермидина i 70 ц.М- 3 мМ дш путрисцина (Azi: & Larher, 1995; Ser rano et al., 1995 они могут был эффективными природными регу ляторами активности БВ- каналов.

2. Медленный вакуолярный (МВ) канал.

2.1 Вольт- амперные характеристики одиночного МВ- канала.

Для исследования медленных вакуолярных каналов прежде всего было необходимо изучить вольт- амперные характеристики одиночного МВ- канала при физиологических концентрациях К+ и различных градиентах Са2+ на тонопласте, а также ионную селективность канала. Записи токов через одиночные МВ- каналы в ответ на двухступенчатые изменения напряжения показаны на рис. 6. Вольт- амперные характеристики МВ- канала нелинейны даже в полностью симметричных ионных условиях (рис. 6, заполненные кружки). МВ- канал проявляет входящее выпрямление, проводимость кана-

[ при отрицательных потенциалах составляет порядка 100 пСм и уменьша-ся при положительных потенциалах примерно до 30 пСм (в симметричном

0 мМ КС1). Увеличение концентрации свободного вакуолярного Са2+ от

1 нМ (О) до 50 цМ (•) вызывает уменьшение входящего тока примерно на

1С. 6. Влияние вакуолярного Са2* на вольт- ам-:рные характеристики одиночного МВ- канала.

+ 100

= +40

10 пА

^тест= -40

Утест= -80

Дальнейшее увеличение вакуолярного Са2* до 2мМ (□) уменьшает входящий ток ещё на 25% (рис. 6). Увеличение концентрации цитоплазматического свободного Са2+ от 50 цМ до

2 мМ не оказывает никакого влияния на проводимость канала (данные не показаны). Создание кальциевого градиента на тоно-пласте на фоне симметричного ЮОмМКО вызывает небольшой сдвиг потенциала реверсии. Сдвиг/на ~ +5 мВ наблюдался с 50 цМ Са2+ с цитоплазматиче-ской стороны и с 2 мМ с вакуо-лярной стороны (рис. 6, незаполненные квадраты), и сдвиг - -5 мВ наблюдался с противоположным Са2+ градиентом (данные не показаны).Это доказывает, что МВ- каналы проницаемы для Са2+. Мы исследовали К+/С1- селективность МВ- каналов. При десятикратном градиенте хлорида калия потенциал реверсии тока одиночного канала составил -50 мВ, что близко к вновесному потенциалу для К+, Ек = -57 мВ (Еа = +41 мВ). Отношение юницаемостей канала, оцененное по уравнению Гольдмана- Ходжкина-ица с учетом коэффициентов активности ионов, составило Рк+ / Ра-» 28.

2.2 Модуляция потенциалозависимости МВ- канала двухвалентными катионами и протонами.

МВ- каналы активируются цитоплазматическим Са2+ > 10 цМ в сочета-[п с положительными потенциалами. М§2+ не активирует МВ- каналы да; при концентрации 50 мМ (данные не показаны). Контрольные измерения

120 V / мВ

проводили с 50 цМ Си2* с цитоплазматической стороны при отсутстви двухвалентных катионов (< 1нМ Са2+, < 5 цМ Мя2+) с вакуолярной сторон на фоне симметричного 100 мМ КС1, рН 7.5 (рис. 7, левый столбик). В эти условиях каналы активировались потенциалами начинался с -20 мВ, где № блюдалось лишь несколько канальных открываний, активация достигал максимума при > +80 мВ. Добавление 2 мМ Са2+ с вакуолярной сторон вызывало смещение порога активации к +100 мВ, существенное замедление активации и уменьшение максимального уровня тока (рис. 7, средняя часть,

Рис. 7. Влияние вакуолярного Са" и Мдг* на потенцналозависнмое управление медленного вакуолярного канала.

мВ +140

+ 120

1нМ Савак

2 мМ Са

0

вак

2 мМ Мёвак

+100

■р У 20 пА

1с 1с 1с

Эффект был полностью обратим. Добавление 2 мМ М£2+ вызывал-лишь умеренный сдвиг порога активации от -20 мВ до слегка положитель ных потенциалов и приводило к замедлению скорости активации канало: менее чем в 2 раза (рис. 7, правая часть). Все вышеописанные эксперимент! проводились при симметричном рН 7.5. В вакуолях мезофильных протопла стов ячменя уровень рН примерно на единицу меньше. Известно, что связы вание Са2+ хелаторами является функцией рН: чем ниже рН, тем слабе сродство Са2+- связывающих групп хелатора к Са2+. Поэтому, было необхо димо проверить действие вакуолярного рН на МВ- каналы. При низком ва куолярном Са2+ (< 1 нМ) рН уменьшали от 7.5 до 5.5. Это вызывало сдви потенциала активации к +40 мВ, замедление кинетики активации каналов I уменьшение максимального уровня тока (рис. 8). Эффект был полностьв

ратим. Записи одиночных каналов сделаны на том же "vacuolar side-out" мбранном фрагменте, который представлен на рис.7, со ЮОмМКС] юс 50 цМ свободного Са2+ с цитоплазм этической стороны (пэтч- пипет-)■

с. 8. Модуляция потенциал озависимого управ-ния MB- канала вакуолярным рН при 1 нМ ва-олярного Са2*.

мВ

1 нМ Сав рН 7.5

120

J

100

yjw*

1 нМ Савак рН 5.5

J 20 пА

1 с

Добавление 50 цМ свободного Са2+ с вакуоляр-ной стороны при рН 7.5 вызывало замедление активации МВ- каналов и сдвигало порог активации к +60 мВ (данные не показаны). Снижение рН до 5.5 при уровне свободного Са-+ с вакуолярной стороны 50 ц.М и 2 мМ не оказывало существенного влияния на потенциалоза-висимую активацию МВ-каналов (данные не показаны). Следовательно, при физиологическом уровне вакуолярного Са2+

(> 50 цМ) потенциалоза-висимая активация МВ-каналов не зависит от уровня вакуолярного рН в физиологическом диапазоне. Увеличение вакуолярного Са2+ вызывает

щиг порога активации МВ- каналов к более положительным потенциалам, то время как увеличение цитоплазматического Са-+ вызывает противопо-эжный сдвиг потенциалозависимости. Эффекты вакуолярного и цитоплаз-атического Са2+ специфичны и не вызываются Mg2+.

2.3 Потенциалозаоисимость МВ- тонов при различных кальциевых градиентах на вакуолярной мембране. Количественное описание.

Для измерения потенциалозависимости МВ- тока при различных Са2+ )адиентах мы использовали маленькие везикулы (ёмкость 1-10 пФ, пло-:адь поверхности 100- 10(30 цм2), изолированные из вакуолей. Для количе-гвенного анализа на основе интегральных вакуолярных токов вычисляли

относительную активность МВ- каналов. Для этого интегральные МВ- ток! при различных потенциалах (V / мВ) и различных вакуолярных (сверху вниз и цитоплазматических (различные символы) концентрациях свободной Са2+ делили на соответствующие токи одиночных каналов для вычислена относительной вероятности нахождения МВ- каналов в открытом состояшн (ОТо / ЫРОшах) (рис. 9).

Рис. 9. Модуляция потенциалозависимостн МВ-то-

ков вакуолярным и цитоплазматическим Са

А

-80 -40

0 40 V/mB

Максимальную активность каналов NPom«, определяемую по токам при высоких концентрациях Са2+ и больших положительных потенциалах, нормировали к 1 рм2 поверхности мембраны. NPo /NPo max анализировали при трех различных уровнях вакуолярного Са2+:

1 нМ Савак (вверху), 50 цМ Сава* (в середине) и 2 мМ Савак (внизу) и при пяти различных концентрациях цитоплазм этического свободного Са2+: 12.5 цМ (А), 50цМ(В), 100 цМ (□), 500 цМ(«) или

2 мМ (О) (рис. 9). Потенциало-зависимость для каждой данной комбинации цитоплазматиче-ского и вакуолярного Са2+ аппроксимировали распределением Больцмана по формуле:

А([Са])

NPo NPo™

1 + ехр

(V0-V)z

RT

-80 -40

где А([Са])- максимальная активность каналов при заданной концентрации Са2+. Параметры аппроксимации представлены в таблице 1.

По результатам аппрокси-

0 40 У/мВ

маций потенциалозависимостей, приведённым в таблице 1, и распределению Больцмана можно вычислить относительную вероятность нахождения МВ-каналов в открытом состоянии (ИРо / ЫРоти) при любых потенциалах для

разных кальциевых градиентов на вакуолярной мембране. Для десяти раз-гшчных Са2+ градиентов (50 цМ и 2мМ (♦) СаЕак) мы вычислили потенциал (V), при котором открыт 1% МВ- канатов. Параллельно, для каждого Са2+- градиента был вычислен кальциевый равновесный потенциал (Еса) согласно уравнению Нернста.

Таблица 1. Параметры потенцмалозавмсимостн MB- какала при различных /ровнях вакуолярного и цитоплазматического свободного CaJ*.

Закуолярный Са2+ 0 50 цМ 2 мМ

Зоротный заряд (z) 0.94±0.06 » 1.27±0.04» 1.68+0.135

Цитоплазм этический потенциал полуактивации Vo / мВ

Са2+ (цМ)

12.5 +79±39 +89±16 +151+6

50 +52±12 +86±7 +141±2

100 +29±7 +83±3 +126+1

500 +24±4 +64±1 +97±1

2000 3.7+2.6 +58±1 +86+1

А

12.5 0,10±0.06 0.10±0.03 .б

50 0,26+0.03 0.19Ю.02 .6

100 0,39±0.03 0.50+0.021 .б

500 0,76+0.03 1.03±0.02 .6

2000 1,00±0.02 1.0Ш.02 .6

'Данные аппроксимировали, принимая воротный заряд (г) одинаковым для всех активностей цитоплазматического Са2+.

5 Данные аппроксимировали с А = 1.

Зависимость потенциала Г/о открытых MB- каналов от кальциевого равновесного потенциала приведена на рис. 10А. Невзирая на кальциевый гра-циент (Еса изменяется в диапазоне от -46 до +76 мВ) разница химических тогенциалов для Са2+ (Ее») компенсировалась вычисленной разницей электрических потенциалов (V) таким образом, что результирующие движущие :илы для Са2+ всегда направлены из цитоплазмы в вакуоль (диагональная пиния на рис. 10А разделяет области движения Са2+ в вакуоль и выхода Са2+ ¡13 вакуоли). Оказалось неожиданным, что разница электрохимических потенциалов для Оа2+ (Д Дса = V - Еса), движущая его в вакуоль, является по-л-оянной (+16.8 ± 8.7 мВ) для всех условий, При которых открыт 1% МВ- Качалов, что показано прерывистой линией на рис. 10А. Это означает, что при физиологических активностях вакуолярного Са2+ (50 цМ- 2 мМ), акти-зация цитоплазматическим Са2+ 1% МВ- каналов и мембранный потенциал создают условия, при которых поток Са2+ направлен из цитоплазмы в ваку-эль. Мы провели тот же анализ для МВ- каналов вакуолей замыкающих слеток устьиц Vicia /aba на основе литературных данных (Schulz- Lessdorf & Hedrich, 1995). Как видно из рнс. I0A (+), отношение между потенциалом 1% открытых каналов и равновесным кальциевым потенциалом (Еса) было

одинаковым для MB- каналов мезофильных вакуолей ячменя и вакуолей за мыкающих клеток Vicia faba. Это свидетельствует о том, что координирующий контроль потенциалозависимости MB- каналов ионами Са2+ с обей? сторон вакуолярной мембраны сходен для MB- каналов различных видое высших растений.

Рис. 10. Изменение свойств MB- канала под действием сил, движущих Саг* через тонопласт.

Мы повторили приведённые выше вычисления для разных относительных вероятностей нахождения MB- каналов в открытом состоянии (4%, 0.4%, 0.1%, 0.04% и 0.01%). В каждом случае для десяти разных Са2+- градиентов (50 цМ или 2 мМ СаВак, различные Сащп) вычислялся потенциал (V) приводящий к соответствующей относительной вероятности нахождения MB- каналов в открытом состоянии. Для каждого значения вероятности результирующая Са2+- движущая сила (А Дса = V - Еса) остаётся постоянной. Потенциалза-висимое управление MB- каналов, по- видимому, контролируется Са2+-градиентом на тонопласте, а не концентрацией цитоплазматического свободного Са2*. Формально, относительная вероятность нахождения MB- каналов в открытом состоянии может быть описана функцией log(NPo / NPomax) = 0.03 • A ЦСа - 2.45, как показано на рис. 10Б. Так как 1% каналов активен при условиях, когда движущие силы для Са2+ направлены в вакуоль (A Jica > 0), нулевая результирующая Са2+- движущая сила (А цса = 0) соответствует относительной вероятности нахождения MB- каналов в открытом состоянии NPo / NPomax = 0.35 ±0.01%. При двух MB- каналах на 1 рм2 типичная вакуоль (0 = 2цм) имеет примерно 10 открытых MB- каналов в условиях Са2+- равновесия. При условиях, направленных на высвобождение Са2+ из вакуоли (А рса < 0), относительная вероятность нахождения MB- каналов в открытом состоянии продолжает уменьшаться. Принимая во внимание по крайней мере в 1000 раз более высокую активность Са2+ в вакуоли, чем в цитоплазме (Еса = -87 мВ), что наблюдается при

-90 -60 -30_ 0 30 Д|1Са/мВ

юиологических условиях (Bush, 1995), и маленький отрицательный тоно-астный потенциал (Bethmann et al., 1995), относительная вероятность на-ждения МВ- каналов в открытом состоянии, согласно нашим данным, го-здо меньше одного открытого канала на вакуоль Ро /NPomai = 0.0025%). Несмотря на высокую плотность МВ- каналов, их [зиологическая роль и регуляция не ясны. На основе представленных здесь нных совершенно очевидно, что через МВ- каналы не может осуществ-ться Са2+- активируемый выход Са2+ из вакуоли'. -Контроль МВ- каналов льциевым градиентом на тонопласте очевидно направлен на уменьшение ечки Са2+ из вакуоли через МБ- каналы при увеличении Са2+- градиента.

ВЫВОДЫ.

На изолированных вакуолях мезофильных протопластов ячменя зарегистрированы быстрые вакуолярные (БВ) токи с кинетикой активации порядка нескольких миллисекунд. Установлено, что БВ- токи блокируются цитоплазм этическим и вакуолярным кальцием и магнием, переносятся од-новалентнами катионами и являются потенциалозависимыми. Следовательно, стало возможным идентифицировать одиночные БВ- каналы. На основании таких свойств как селективность, потенциалозависимость и Са2+- чувствительность были идентифицированы одиночные БВ- каналы. Вольт- амперная характеристика одиночного БВ- канала квазилинейна, а потенциалозависимость вероятности нахождения БВ- канала в открытом гостоянии идеально соответствует потенциалозависимости среднего числа открытых каналов на целых вакуолях. Вероятно, именно эти каналы определяют интегральный БВ- ток.

БВ- токи блокируются с цитоплазм этической сторюны полиаминами пропорционально их эффективному заряду. спермин4* > спермидин3+ > пут-рисцин2+ > орнитин+. Аналогичным образом спермидин и спермин блокируют и одиночные БВ- каналы. Следовательно, кроме двухвалентных катионов, активность БВ- каналов в естественных условиях может регулироваться полиаминами.

Физиологическая роль БВ- каналов состоит в стабилизации потенциала гонопласта на уровне калиевого равновесного.

Свойства медленных вакуолярных (МВ) каналов мезофильных протопластов ячменя исследованы на уровне одиночных каналов и целых вакуолей. Показан нелинейный характер вольт- амперных характеристик одиночных МВ- каналов с входящим выпрямлением.

МВ- каналы селективны для К+ по сравнению с Cl- (Рк+ / Ра- « 28) и проницаемы для Са2+. МВ- каналы регулируются- Са2+ с вакуолярной стороны. В физиологических условиях только Са2*, но не Н+ или Mg2+ осуществляют регуляцию МВ- каналов.

На целых вакуолях получены потенциалозависимости относительной вероятности нахождения МВ- каналов в открытом состоянии для десяти различных кальциевых градиентов. Установлено, что при условиях вы-

свобождения Са2+ из вакуоли (Д |Дса < 0), относительная вероятное нахождения МВ- канала в открытом состоянии менее 0.35 ±0.01%. физиологических условиях в среднего размера вакуоли, по нашим расчета открыто менее одного МВ- канала. Таким образом, через МВ- каналы не мож осуществляться Са2+- активируемое высвобождение вакуолярного Са2+.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации:

1. SchOnknecht G., Pottosin I., Tikhonova L. (1996). Characterization of ft vacuolar currents. J. Exp. Botan. V.47. Supplement. P.69.

2. Тихонова Л.И. (1997) Быстрые вакуолярные каналы высших растет Сборник тезисов 2-й открытой городской научной конференции молода учёных г. Пущино. С. 122.

3. Pottosin I.I., Tikhonova L;I., Schdnkneclit G. (1997). Luminal calcium inliib Cai+-in<luced Ca2+ release by slow vacuolar ion channels. J. Exp. Botan. V/ Supplement. P .62

4. Tikhonova L.I., Pottosin I.I., Dietz К.-.Г., Schflnknecht G. (1997). Fast activati cation channel in barley inesophyll vacuoles. Inhibition by calcium. Plant J. V. 1 N.5. P. 101-112. у

5. Pottosin I.I., Tikhonova L.I., Hedrich R., Schonknecht G. (1997). SIov activating vacuolar channels can not mediate Ca2+- induced Ca2+ releas. Plant (in presse).

18.04.97 r. 3. 75I4P. T. 75 экз. Усл. печ. л. 1,125.

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН.