Биохимические свойства и функциональная роль протонных насосов вакуолярного типа в проростках кукурузы

Шахова, Наталия Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биохимические свойства и функциональная роль протонных насосов вакуолярного типа в проростках кукурузы
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Биохимические свойства и функциональная роль протонных насосов вакуолярного типа в проростках кукурузы"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ШАХОВА Наталия Витальевна

ии^478ВЬ

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ПРОТОННЫХ НАСОСОВ ВАКУОЛЯРНОГО ТИПА В ПРОРОСТКАХ КУКУРУЗЫ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

1 ОКТ 2009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2009

003478655

Работа выполнена в лаборатории функциональной активности мембран Биологического научно-исследовательского института Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

IПолевой Всеволод Владимирович!

кандидат биологических наук Танкелюн Ольга Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Гончарова Эльза Андреевна

кандидат биологических наук Маркова Ирина Валентиновна

Ведущая организация: Институт физиологии растений

им. К.А. Тимирязева Российской Академии Наук

Защита состоится « ^» HZifj^Z 2009 г. в _ ч на заседании объединенного совета ДМ212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Биолого-почвенный факультет СПбГУ, аудитория

Факс: электронная почта:

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. A.M. Горького СПбГУ

Автореферат разослан « //» 09. 09 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е.И. Шарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследования В клетках высших растений вакуолярная система, включающая большую центральную вакуоль и малые вакуоли различной природы, играет значимую роль во многих физиологических процессах, таких как поддержание рН и ионного гомеостаза, временное хранение запасных веществ, ионов и метаболитов, консервация вторичных веществ и ксенобиотиков, осмотические быстрые изменения объема клетки, связанные с перемещением ионов и воды в центральную вакуоль, обеспечивающие присущий растениям рост растяжением.

Транспорт ионов водорода внутрь вакуоли осуществляется двумя Н+-насосами вакуолярного типа, Н+-АТФазой (Е.С.3.6.1.3), Н+-пирофосфатазой (Е.С.3.6Л.1). Эти ферменты выполняют функцию первично-активного транспорта ионов Н+ из цитоплазмы в вакуоль, создавая на тонопласте электрический потенциал (от +20 до +50 мВ ) и химический градиент (от 1,5 до 4,5 единиц рН) [Rea, Pool, 1993]. Энергия электрохимического потенциала используется в процессе вторично-активного транспорта ионов посредством симпортеров и антипортеров, а также системы ионных каналов. На долю Н+-пирофосфатазы приходится от 1 до 10% белков тонопласта. Н+-пирофосфатаза и Н+-АТФаза способны создавать на вакуолярной мембране близкие по величине градиенты концентрации протонов.

Н+-АТФаза V-типа присутствует в тонопласте, а также мембранах эндоплазматического ретикулума, аппарата Голджи, эндо- и экзосомальных везикул клеток растений. V-АТФаза - мультисубъединичный комплекс (состоящий из 8-10 типов субъединиц) с каталитической надмембранной частью Vi и мембранной Непроводящей частью V0. Отличительным признаком АТФазы вакуолярного типа является ингибирование бафиломицином А) и нитратом.

V-пирофосфатаза - интегральный мембранный белок, пронизывающий мембрану 14 раз, функционирующий как димер. Она локализована в вакуолярной мембране, мембранах аппарата Гольджи, у некоторых объектов - в плазмалемме, обладает высокой чувствительностью к ионам К+, ингибируется имидофосфатом, аминометилендифосфонатом.

По современным представлениям, два протонных насоса вакуолярного типа имеют различные физиологические функции в растительном организме. Часто Н+-АТФаза и Н+-пирофосфатаза включаются в альтернативных ситуациях. В условиях стресса (анаэробиоз, охлаждение, дефицит минерального питания) у некоторых растений (проростки риса, корни ржи) активность V-АТРазы понижается или остается неизменной, тогда как уровень пирофосфатазной активности резко повышается и пирофосфат становится существенным источником энергии. Механизмы регуляции активности этих ферментов изучены недостаточно.

Имеются сведения о том, что протонные насосы тонопласта приобретают различное физиологическое значение в процессе роста и развития растений. Объект исследования, колеоптиль кукурузы, характеризуется специальной функцией - ростом растяжением, который тесно связан с увеличением площади поверхности вакуолярной мембраны и изменением объема вакуоли при перемещении ионов и воды в центральную вакуоль. Представляло интерес

оценить уровень активности и участие каждого из насосов на разных стадиях роста растяжением.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в сравнительном изучении биохимических свойств Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы V-типа и определении их роли в процессах роста клеток проростков кукурузы. Задачи работы включали:

1) отработку методов выделения и идентификации мембранной фракции, обогащенной тонопластом из клеток колеоптилей кукрузы;

2) отработку методов определения гидролитической и Н+-транспортирующей активностей Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы;

3) определение влияния солей одновалентных катионов на активность протонных насосов;

4) изучение влияния ионов Са2+ на Н+-АТФазную и Н+-пирофосфатазную активности и АТФ- и пирофосфат-зависимый транспорт Н+;

5) анализ активности Са27Н+-антипортера во фракции эндомембран, выделенных из клеток колеоптилей кукрузы;

6) анализ Н+- транспортирующих насосов V-типа: а) на разных фазах развития клеток колеоптилей кукурузы; б) в различных зонах корней проростков кукурузы.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые проведен сравнительный анализ биохимических свойств Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы V-типа, определены специфические изменения активностей Н+-насосов в процессе роста клеток колеоптилей и корней проростков кукурузы. Впервые показано ингибирующее действие рутениевого красного на активность Н+-пирофосфатазы V-типа.

Научно-практическое значение. Полученные результаты дополняют имеющиеся знания о механизмах регуляции и физиологических функциях двух протонных насосов вакуолярной мембраны и сопряженных с их активностью Са2+/Н+-обменников. Результаты исследования могут быть использованы в лекционных курсах по физиологии и биохимии растений.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Сессии ОФР РАН по проблемам биоэлектрогенеза и адаптации у растений (Нижний Новгород, 2001), Международной конференции «Проблемы физиологии растений севера» (Петрозаводск, 2004), VIII Молодежной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге, Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 255 источника (13 публикаций отечественных авторов и 242 публикации иностранных авторов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили 3 - 5-суточные этиолированные проростки кукурузы (Zea mays L.) гибрид F1 Нарт-150. Растения выращивали на питательном растворе Кнопа (1/10) при температуре 26 °С в темноте. В работе использовали отрезки колеоптилей длиной 1-2 см без верхушки и с удаленным листом.

Препараты внутриклеточных мембран, содержащие фрагменты тонопласта и эндоплазматического ретикулума, выделяли из гомогенатов растительной ткани посредством высокоскоростного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (14/26%) фракции супернатанта 3400 g. Мембранный состав фракций оценивали с применением биохимических маркеров.

1ЧС)з~-ингибируемую АТФазную и KCl-стимулируемую пирофосфатазную активности определяли по количеству освободившегося при гидролизе субстрата ортофосфата с помощью метода образования фосфорномолибденовой кислоты при использовании SnCb для ее восстановления (Жуков, Верещагин, 1970).

АТФ- и пирофосфат-зависимый перенос ионов Н+ в везикулы фракции внутриклеточных мембран регистрировали спектрофотометрически как снижение поглощения моноаминного оптического зонда акридинового оранжевого (АО) при 495 нм. Оценивали начальную скорость изменения поглощения АО (АА495 • мин"1 • мг"1 белка) и максимальное значение ДА495 (соответствующее градиенту концентрации ионов Н+ между содержимым везикул и внешней средой при достижении реакцией равновесия).

Содержание белка в мембранных препаратах определяли по методу Брэдфорд (1976).

Опыты проведены в 3-7-кратной повторности, результаты обработаны статистически.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Фракция мембран, выделяемая из гомогената клеток колеоптилей кукурузы на границе слоев градиента плотности сахарозы 1,055 и 1,11 г/см3, по данным анализа биохимических маркеров, обогащена фрагментами тонопласта и эндоплазматического ретикулума. В ней обнаруживалась значительная нитрат-ингибируемая АТФазная активность, присущая АТФазе вакуолярного (V) типа, пирофосфатазная активность с высоким уровнем стимуляции КС1, характерная для пирофосфатазы V-типа, азид-нечувствительная НАДН-цитохром С-редуктазная активность (маркер ЭР), а также незначительная ванадат-чувствительная АТФазная активность.

В исследуемой фракции, обозначенной как фракция эндомембран, АТФазная активность обнаруживала специфическое для вакуолярной Н+-АТФазы свойство подавления бафиломицином Ai и нитратом. Г"Ю3~-ингибируемая АТФазная активность составляла более 50% от общей АТФазной активности. АТФазная активность проявляла чувствительность к ДЭС и ДЦКД. Ванадат, ингибитор Р-

АТФаз, оказывал слабое действие на ЫОз~-ингибируемую АТФазную активность (табл. 1).

Таблица 1. Ингибиторный анализ АТФазной активности фракции внутриклеточных мембран, выделенных из клеток колеоптилей кукурузы (1- Фн., мкмолъ ' мг'1 белка * ч'; 2 - % от контроля)._

Общая АТФазная ЫОз'-ингибируемая

активность АТФазная активность

1 2 1 2

Контроль, рН 7,0 7,65±0,57 100 4,61+0,50 100

Бафиломицин А,, 2нМ 1,26±0,11 16,5 - -

10 мМ 3,38+0,29 44,2 3,09±0,45 67,0

На3У04, 50 мМ 5,44±0,41 71,1 3,98+0,23 86,3

ДЭС, 0,1 мМ 4,27±0,38 55,8 2,68+0,33 58,1

ДЦКД, 0,1 мМ 3,80+0,12 49,7 2,44+0,48 52,9

№N3,1 мМ 7,36+0,80 96,2 - -

Пирофосфатазная активность показывала высокую стимуляцию хлоридом калия, характерную для Н+-пирофосфатазы тонопласта. Она проявляла слабую чувствительность к ингибиторам транспортных АТФаз, ДЭС и ДЦКД. Фракция этиопластов обладала собственной пирофосфатазной активностью со специфическими свойствами: низкой стимуляцией КС1, чувствительностью к ИаЫз и высокой активацией 2пСЬ при кислых значениях рН (Табл. 2). Препараты эндомембран не содержали существенных примесей мембран этиопластов.

Таблица 2. Пирофосфатазная активность фракций внутриклеточных мембран и этиопластов (1 - Фн., мкмолъ ■ мг'' белка ■ ч'; 2 - % от контроля)._

рН 8,0 Фракция эндомембран Фракция этиопластов

1 2 1 2

-КС1, 50 мМ 4,34±0,32 54,5 5,32±0,47 81,3

+КС1, 50 мМ (контроль) 7,95+0,42 100 6,54±0,64 100

ЫаС1, 50 мМ 5,36+0,96 67,4 3,35±0,51 48,8

10 мМ 1,85±0,26 23,3 1,17±0,38 17,9

Ма3У04, 50 мМ 6,77±1,23 85,2 4,66±1,09 71,2

ДЦКД, 0,1 мМ 6,81±0,82 85,7 4,08±0,72 62,4

ДЭС, 0,1 мМ 6,32±0,94 79,5 4,15 ±0,92 63,4

- №N3* 9,84+0,93 125 6,54±0,64 100

+ №N3, 1 мМ 7,95±0,42 100 3,41 ±0,48 52,1

рН6,0 - ХпС\2, 1 мМ (контроль) 3,99±0,30 100 3,90±0,49 100

+ 2пС12, 1 мМ 4,12±0,37 103,2 9,63+0,31 385,1

* - №N3 присутствовал в основной среде определения пирофосфатазной активности во фракции эндомембран, №N3 отсутствовал при анализе фракции этиопластов.

Анализ влияния кислотности среды реакции на гидролитическую и Н+-транспортирующую активности показал, что рН-оптимум АТФ-азы У-типа • 7,0, пирофосфатазы - 7,2.

6,8-

0,5

0,48

0,46

< 0,44

о" < 0,42

(1) ^ 0,4

ф 3 0,38

о с 0,36

о с: 0,34

0,32

0,3

; АТФ и ,__1

---3 /

\ РССР, 5 мкМ 1

0 12 3 4

5 6 7 1 Время, мин

9 10 11 12

Рис. 1. АТФ-зависимый транспорт Н* в везикулы фракции эндомембран (1), в присутствии 2 нМ бафиламицина А1 (2), 50мМКИОз (3).

Экспериментальные кривые на рис.1 и 2 демонстрируют Н+-транспортирующую активность везикулярной фракции эндомембран из клеток колеоптилей кукурузы в присутствии АТФ и пирофосфата (а также Mg2+ и КС1). Поступление Н+ в везикулы наблюдали как снижение поглощения

проникающего зонда

акридинового оранжевого (АО) при длине волны 495 нм. О регистрации снижения рН в везикулах видетельствовало повышение поглощения АО

до исходного уровня после добавления протонофора ТССР или разобщителя N11(01. Нитрат калия (10 мМ) снижал начальную скорость АТФ-зависимого транспорта Н+ и вызывал быстрый переход реакции в равновесное состояние, при котором вход и выход Н+ уравновешены (рис. 1, кривая 3). Высокоспецифичный ингибитор Н+-АТФазы вакуолярного типа бафиломицин А1 (2 нМ) полностью подавлял транспорт 1Г (рис. 1, кривая 2).

Активность пирофосфат-

зависимого транспорта Н+, начальная скорость и градиент концентрации Н+, составляли около 1/3 от активности АТФ-зависимого транспорта для 4-суточных проростков кукурузы (рис. 2). При замене КС1 в среде реакции на ШС1 активность переноса Н+ резко снижалась (рис. 2, кривая 3). Однако по-видимому, не является ингибитором активности Н+-пиро-4 5 6 7 8 9101112 фосфатазы, как это описано для Время, мин некоторых растительных

п „ „ , , „ „+ объектов [Тга1сЬагс1, й а1., 1993,

Рис. 2. Пирофосфат-зависимыи транспорт Н . 1000-,

, \ „д ткатига, ег а1., 1уу2\, так как в

в везикулы фракции эндомембран в среде с

КС1 (1, 2) и N001 (3). присутствии КС1 ионы Ыа

не подавляли транспорт Н+.

Анализировали влияние различных солей одновалентных катионов на характер изменения рН внутри везикул при работе Н+-насосов (рис. 3). В отсутствие СГ (или других проникающих анионов) снижение поглощения АО не обнаруживалось. Хлорид способствует закислению везикулярного содержимого, так как шунтирует мембранный потенциал (положительный внутри), индуцируемый активностью насосов, и тем самым повышает химическую составляющую ДцН+. По данным электрофизиологических и биохимических исследований, перемещение ионов СГ в вакуоль осуществляется с помощью ионных каналов нескольких типов и СГ/Н+-котранспорта. В динамике поглощения СГ в везикулярные фракции из клеток растений и дрожжей показано наличие насыщающего и линейного компонентов [МаЛшо1а, й а1„ 2000, \Vada, Апгаки, 1994].

т д.

—

—1~гМ~т

КС1 ВЬС1 СэС! №С1 иС1 КС1 К2804 КИОэ малат цитрат

калия калия

>8 0,8 2 0,6

1 0,4

£0,2 ^ О

КС1 №С1 СвС1 №С| Ь'С1 «С1 КгЭО, КГОСЬ малат ЧитРат

калия калия

50 мг-экв. К* 10 мг-экв. К*

Рис. 3. Влияние солей одновалентных катионов на начальную скорость АТФ (А)- и пирофосфат (Б)-зависимого транспорта ионов водорода в везикулы эндомембрап

Т ___ ... _______ Б

г1 " т

Л л 1 £ 1 Й й

Нитрат, который по способности к трансмембранному переносу близок к хлориду [Martinoia, et al„ 2000], в равной степени поддерживал пирофосфат-зависимый градиент pH (рис. ЗБ), но специфично ингибировал образование АТФ-зависимого градиента pH (рис. I, ЗА). Специфическое ингибирующее действие нитрата на V-АТФазу, по-видимому, обусловлено его прямым действием на фермент. Оно обратимо при низких концентрациях (1-10 мкМ) и может быть связано с окислением SH-групп [Forgac, 1998]. При высоких концентрациях действие нитрата необратимо и вызывается отделением примембранного Vi-комплекса [Rea, et al., 1987].

В присутствии слабо проникающего сульфата, как и анионов органических кислот, скорость снижения pH в везикулах эндомембран составляла половину и менее для обоих типов вакуолярных насосов.

Природа одновалентного катиона не оказывала существенного влияния на АТФ-зависимый транспорт Н+. Наиболее высокий градиент pH и начальная скорость реакции наблюдались в присутствии Li+ и Na+ (рис. ЗА). Способность Li+ максимально активировать образование АТФ-зависимого градиента pH была показана и для вакуолярной фракции из корней кукурузы [Hager, Biber, 1984]. Предполагается, что существующий в мембране механизм К+/Н+-антипортера отсутствует для Li+, вследствие чего последний, находясь в инкубационной среде, не расходует протонный градиент.

На пирофосфат-зависимое изменение pH, напротив, наибольшее влияние оказывали ионы К+ (рис. ЗБ). Ионы СГ в отсутствие К+ слабо поддерживали поступление Н+ в везикулы. Добавление ионов К+ в составе слабо проникающего сульфата в ходе пирофоефат-зависимого переноса Н+ активировало закисление везикул (рис. 2, кривая 2). Таким образом, в случае пирофосат-зависимого транспорта Н+, в отличие от АТФ-зависимого, наблюдалась ситуация, когда легко проникающий катион лучше поддерживает вход Н+ в везикулы. Это позволяет предположить, что транспорт К+ может быть тесно сопряжен с активностью Н+-пирофосфатазы.

Н+-транспортирующая активность пирофосфатазы проявлялась при более низких концентрациях KCl, чем активность Н+-АТФазы. Полумаксимальная скорость пирофосфат-зависимого переноса Н+ достигалась в присутствии 15 мМ KCl, АТФ-зависимого - в присутствии 25 мМ. По современным представлениям, пирофосфатаза не транспортирует К+ непосредственно [Maeshima, 2000; Ros et al., 1995]. Вопрос о механизме влияния К+ на активность Н+-пирофосфатазы еще не получил окончательного решения. Сохраняется возможность какого-то специфического взаимодействия Н+-пирофосфатазы с переносчиками К+.

Таким образом, Н+-насосы вакуолярного типа, проявляли различную чувствительность к солям одновалентных катионов. Скорость АТФ-зависимого транспорта Н+ зависела главным образом от присутствующих анионов и была максимальной в среде с хлоридом. Пирофосфат-зависимая Н+-транспортирующая активность характеризовалась высокой избирательностью к одновалентным катионам и предпочитала ионы К+.

Известно, что клетки эукариот поддерживают низкое содержание ионов Са2+ в цитоплазме (0,1-0,2 мкМ). Временное повышение уровня Са2+, является способом

регуляции активности многих белковых молекул и одним из основных механизмов внутриклеточной сигнализации в ответ на изменения во внешней среде и при переходе клеток в новое функциональное состояние [Медведев, 2005, White, Broadley, 2003]. Анализ влияния концентрации ионов Са2+ в реакционной среде на активность Н+-насосов вакуолярной мембраны показал, что чувствительность Н+-транспортирующей активности пирофосфатазы к Са2+ на порядок выше, чем у Н+-АТФазы (15П 3,46 и 32,4 мкМ соответственно) (рис. 4А).

-ЭГТА ЭГТА -6

(контроль)

lg[Ca , М]

-ЭГТА ЭГТА

(контроль) |д[Са2+, М]

Рис. 4 Влияние ионов Са2+ в среде реакции на Н*-транспортирующую (А) и гидролитическую(Б) активности АТФазы(1) и пирофосфатазы(2)фракции эндомембран из клеток колеоптилей кукурузы.

Концентрации ионов Ca2* в реакционной среде, включающей ЭГТА. рассчитывали по программе [Brooks, Storey, 1992]

Гидролитическая активность пирофосфатазы также ингибировалась ионами Са2+ в низких, субми-кромолярных концентрациях в отличие от нитрат-чувствительной АТФазной активности (рис. 4Б). Добавление ЭГТА, связывающей ионы Са2+, в среду реакции повышало активность пирофосфатазы и снижало активность

АТФазы (рис 4).

По литературным данным, эффект Са2+ на активность Н+-пирофосфатазы мгновенный и легко обратимый. Считается, что действие Са2+ обусловлено образованием СаРРЬком-плекса, конкурентного ингибитора для различных типов пирофосфатаз

[МаейЫта, 2000]. Однако, эта причина вероятно не может быть единственной, так как Н+-пирофосатаза обнаруживает чувствительность к субмикро-молярным концентрациям этого иона. Существует мнение о том, что свободные ионы Са2+также могут быть ингибиторами

Н+-пирофосфатазы, модулирующими ее активность [Rea, Poole, 1993].

Анализировали влияние рутениевого красного, поликатионного амина, сорбционного красителя и блокатора Са27Н+-обменников, кальциевых, калиевых и хлоридных каналов клеток эукариот, на активность Н+-насосов эндомембранной фракции проростков кукурузы. Было обнаружено сильное ингибирующее действие рутениевого красного на Н+-пирофосфатазную активность (рис. 5, 1). Полумаксимальное ингибирование для пирофосфат-зависимой транслокации протонов составляло 0,1 мкМ. Гидролитическая активность пирофосфатазы на порядок менее чувствительна к реагенту.

Рутениевый красный не оказывал существенного влияния на активность АТФазы фракции эндомембран (рис. 5, 2).

2,4

с а> 2

2 1,6

•

X 1,2

•

о? 0,8

< 0,4

0,5 1 1,5

Рутениевый красный, мкМ

Рис. 5. Влияние рутениевого красного на Н трапспортирующую активность пнрофос-фатазы(1) и АТФазы (2) фракции эндомембран из клеток колеоптилей кукурузы.

6 г

4 --.----2,

2 -

-1-1_i--J-1-1-1-1-1-1

0 10 20 30 40 50

Рутениевый красный, мкМ

Эти данные представляют интерес для дальнейших исследований, так как впервые обнаруженный эффект ингибитора может свидетельствовать о тесном взаимодействии Н+-пирофосфатазы с транспортерами ионов, таких, как кальций и калий.

Са2+/Н+-антипортер является существенным компонентом вакуолярной мембраны, обеспечивающим вместе с Н+-насосами, а также Са2+-АТФазами снижение уровня Са2+ в цитоплазме растительной клетки после временного его повышения в ответ на внешние стимулы и при выполнении клеткой определенных физиологических функций, таких как секреция и полярный рост.

В нашей работе активность Са27Н+-антипортсра оценивали по выходу Н+ из везикул при добавлении Са2+ в инкубационную среду. СаС12 вносили после того как градиент концентрации ионов Н+, образованный работой одного из протонных насосов, достигал максимальной величины и выходил на стационарный уровень.

о <

3 о

о с

0,48 0,46 0,44 0,42 0,4 0,38 0,36 0,34 0,32

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Время, мин

Рис. 6. Диссипация ионами Са2+ в различных концентрациях градиета ионов Н*, сформированного работой Н пирофосфатазы(А) и Н АТФазы(Б) в везикулярной фракции эндомембран из колеоптилей кукурузы.

Концентрации Сс?¥ (мкМ) показаны у

соответствующих кривых

ЭГТА

0,26

15 20 Время, мин

Как видно из рис. 6, СаСЬ в различных концентрациях вызывал уменьшение или полное рассеивание градиента рН, сформированного Н+-пирофосфатазой или Н+-АТФазой. При последующем добавлении ЭГТА (1 мМ) выход Н+ прекращался, и наблюдался рост градиента рН с переходом его в новое стационарное состояние.

Для доказательства того, что наблюдаемая диссипация протонного градиента под действием ионов кальция отражает активность Са27Н+-антипортера использовали ингибитор кальциевых транспортеров хлористый лантан ЬаС13. Ионы Ьа3+ присоединяются к мембране в местах связывания Са2+ и, тем самым, блокируют его перенос [Бге, 1985]. Предобработка мембранных препаратов

ЬаС13 (1мМ) в течение часа приводила к снижению не только Са"+-индуцируемого выхода Н+, но и градиента Н+, создаваемого Н+-насосами. Однако скорость выхода Н+ в присутствии Са2+, отнесенная к начальной скорости формирования градиента Н+ снижалась под действием Ьа3+ вдвое. Эти результаты могут свидетельствовать о присутствии Са2+/Н+-обменника в энергизованных активностью Н+-насосов эндомембранных везикулах из клеток колеоптилей кукурузы.

Зависимость начальной скорости выхода Н+ от концентрации Са"+ носила насыщающий характер и удовлетворительно описывалась кинетикой Михаэлиса-Ментен (рис. 7). Кажущиеся Км для Са2+ составляли 8,0±1,0 мкМ и 5,9±0,9 мкМ на фоне АТФ- и пирофосат-зависимого градиентов рН соответственно.

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Са2+, мкМ

Рис. 7. Влияние ионов Са2+ в различных концентрациях на скорость выхода Н* из везикул эндомембранной фракции, выделенной из колеоптилей кукурузы.

Было отмечено, что свойства Са2+/Н+-обменного механизма в препаратах мембран из клеток проростков кукурузы зависели от природы Н+-насоса, обеспечивающего закисление везикул. В присутствии пирофосфат-зависимого градиента рН была выявлена вторая возможная Ки для Са2+, на порядок более низкая - 0,2-0,5 мкМ (рис. 7, вставка). Она может свидетельствовать о дополнительном Са2+/Н+-обменном механизме. Имеется работа [Da-Silva, et al., 2003], выполненная на фракции тонопласта из корней проростков кукурузы, в которой при оценке поглощения меченого Са2+ в присутствии активной Н+-пирофосфатазы показана вторая константа для Са2+/Н+-обменника, составляющая

0,36 мкМ. Вторая Км, возможно, отражает присутствие в эндомембранах клеток проростков кукурузы Са2+/Н+-обменного механизма, тесно сопряженного с работой Н+-пирофосфатазы, который, обладая высоким сродством к Са2+, может принимать участие в тонкой регуляции концентрации этих ионов в цитоплазме растительной клетки.

Таким образом, чувствительность к уровню ионов Са2+ в среде реакции была Более высокой для процессов, связанных с активностью пирофосфатазы, как для пирофосфат-зависимого закачивания Н+, так и для выхода Н+ при добавлении Са2+,

Наличие во внутриклеточных мембранах растительной клетки двух протонных насосов различной природы, обладающих, как показано выше, неодинаковыми биохимическими свойствами, позволяет предполагать разные физиологические функции этих насосов. Исследовали возможную роль Н+-насосов на разных стадиях роста клеток растяжением. Процесс роста растяжением включает интенсивную вакуолизацию клетки, и можно предположить активное участие и вакуолярных транспортных систем, в первую очередь вакуолярных Н+-АТФазы и пирофосфатазы. Колеоптиль злаков - первичный лист, ювенильный орган, быстро растущий растяжением и отмирающий. Представляло интерес оценить активность обоих протонных насосов на различных стадиях роста колеоптиля, а также в различных зонах роста корня проростка кукурузы.

Было установлено, что у колеоптилей 3-суточных проростков кукурузы, клетки которых находятся в начальной фазе растяжения, наблюдалась наибольшая транспортная и гидролитическая пирофосфатазная активность фракции эндомембран (рис. 8 а, 8 б). В ходе дальнейшего роста, характеризующегося постепенным замедлением ростовых процессов, транспортная функция пирофосфатазы постепенно снижалась. Максимальная гидролитическая и Н+-транспортирующая активность АТФазы во фракции эндомембран наблюдалась у растущих растяжением клеток колеоптилей 4-суточных проростков (рис. 8 в, 8 г). У 5 суточных проростков, на этапе завершения физиологической функции колептиля (первый настоящий лист выходит за пределы колеоптиля) и при полной остановке роста, наблюдалась наименьшая активность Н+-протонных насосов.

Таким образом, при переходе клеток колеоптиля к растяжению наибольший вклад в энергизацию внутриклеточных компартментов вносит V-пирофосфатаза. На более поздней стадии роста растяжением возрастает значение V-АТФазы.

В опытах были использованы также корни 3-4-суточных проростков кукурузы, которые являются удобным объектом для данного исследования, так как в их дистальной части присутствуют пространственно ограниченные зоны клеток в фазе деления, растяжения и дифференциации (корневых волосков). У корешков проростков кукурузы отделяли 2-миллиметровый кончик корня - зону меристемы с корневым чехликом, последующие б миллиметров - зону растяжения и 10 миллиметров - зону корневых волосков, в соответствии с литературными данными для корней кукурузы [Ishikawa, Evans, 1995; Иванов, 2004]. Показано, что активность KCl-стимулируемой пирофосфатазы максимальна в зоне деления. N03" -ингибирусмая АТФазная активность имеет наибольшую величину в зоне корневых волосков (рис. 9).

'у 18

• 16

- 4

-т

е 2

Возраст проростков, сутки

3 4 5

Возраст проростков, сутки

Рис. 8. Пирофосфатазпая гидролитическая (а) и пирофосфат-зависимая Н*- транспортирующая активность (б), нитрат-ингибируемая АТФазная (в ) и АТФ-зависимая Н*-транспортирующая активность (г) фракции эндомембрап из колеоптшей 3-, 4-, и 5-суточных проростков кукурузы.

•г 12 \ 10 ю б

Ъ 8 ■ I -X.

1 6 С § 4

5 2

® 0

1 2 3

Рис. 9. Пирофосфатазпая (а) и АТФазная (б) активность фракции эндомембран из корней проростков кукурузы.

1-зона деления, 2 - зона растяжения, 3 - зона корневых волосков Можно отметить некоторые особенности физиологии клеток в фазе деления, которые обеспечивают приоритетную роль Н+-пирофосфатазы на ранних этапах

онтогенеза. Молодые клетки растений до перехода к растяжению малы, они имеют более низкую интенсивность дыхания, а внутренние клетки меристем могут находиться в состоянии частичного анаэробиоза [Саламатова, 1983]. Это сочетается с пониженным уровнем АТФ и увеличивает значение пирофосфата как источника энергии электрохимического градиента Н+. При переходе клеток к росту растяжением возрастает интенсивность дыхания, накапливаются низкомолекулярные вещества, увеличивается содержание АТФ, которое поддерживается на миллимолярном уровне, как и у дифференцированных клеток. Содержание пирофосфата у большинства видов на порядок ниже [Rea, Pool, 1993; Maeshima, et al., 1996].

Чтобы оценить активность Н+-насосов эндомембран у стареющих клеток проводили 15-часовую инкубацию отрезков колеоптилей в водном растворе, слабо забуференном с добавлением сахарозы перед выделением мембран. Она приводила к снижению начальной скорости Н+-транспорта у обоих Н+-насосов. Однако Н+-пирофосфатазная активность показывала более значительное снижение при старении изолированных растительных тканей (рис. 10).

Двухсуточное хранение препаратов мембран в холодильнике приводило к снижению Н+-транспортирующей активности эндомембран, но более слабому, чем при старении изолированных органов (рис. 11). При этом активность V-АТФазы понижалась при старении мембран в большей степени, чем активность V-пирофосфатазы, что может быть связано со сложным строением Н+-АТФазы вакуолярного типа, обладающей надмембранным комплексом, чувствительным к окислению и способным отделяться от протон-переносящей мембранной части.

Рис. 10. Влияние 15-часовой инкубации изолированных колеоптилей кукурузы на Н*-транспортирующую активность АТФазы (I) и пирофосфатазы (II) фраю/ии эндомембран.

| | - 1ч инкубации отрезков колеоптилей

|||| -15 ч инкубагрш

Рис. 11. Влияние суточного хранения препаратов мембран на Н транспортирующую активность АТФазы (I) и пирофосфатазы (II) фракции эндомембран.

| | - контроль

ЦЦ - хранение препаратов сутки

Можно заключить, что, изменения эндомембран, вероятно, являются существенной, но не единственной причиной снижения активности протонных насосов при старении, которое представляет собой интегральный процесс, включающий такие явления, как изменения в синтезе ферментов de novo, высвобождение гидролаз из внутриклеточных компартментов, возможное повышение кислотности цитоплазмы. При старении внутриклеточные мембраны быстрее разрушаются по сравнению с плазматической мембраной. Разрушение внутриклеточных мембран способствует высвобождению в цитоплазму гидролитических ферментов.

ВЫВОДЫ

1. Во фракции эндомембран, выделенной из клеток колеоптилей проростков кукурузы, показана активность двух протонных насосов вакуолярного типа, которые проявляли различную селективность по отношению к солям одновалентных катионов. Скорость АТФ-зависимого транспорта Н+ определялась присутствующими анионами и была максимальной в среде с хлоридом. Пирофосфат-зависимая Н+-транспортирующая активность отличалась высокой избирательностью к ионам К+.

2. Ионы Са2+ вызывали снижение гидролитической и транспортной активности Н+-пирофосфатазы (полумаксимальное ингибирование достигалось при 3,5 мкМ Са2+). Чувствительность Н+-АТФазы к Са2+ - на 1-2 порядка ниже.

3. Впервые показано, что рутениевый красный оказывает сильное ингибирующее действие на активность Н+-пирофосфатазы вакуолярного типа клеток проростков кукурузы (15о для пирофосфат-зависимой транслокации Н+ - 0,1 мкМ рутениевого красного).

4. В везикулах эндомембран клеток колеоптилей кукурузы показано присутствие Са2+/Н+-антипортера, активность которого оценивали по скорости выхода Н+ при добавлении ионов Са2+ на фоне градиента ионов Н+, сформированного Н+-насосами. Предобработка мембранных препаратов LaCh в концентрации 1 мМ приводила к снижению относительной скорости выхода протонов, индуцируемой Са2+.

5. Показано, что кажущаяся Км Са2+/Н+-антипортеров для Са2+ составляла 6-8 мкМ. На фоне пирофосфат-зависимого градиента ионов Н+ выявлено дополнительное Са2+-зависимое освобождение Н+, возникающее при субмикромолярном уровне Са2+.

6. Сравнительный анализ активности Н+-насосов вакуолярного типа в зависимости от фазы роста и физиологического состояния клеток 3, 4 и 5-суточных проростков кукурузы, показал, что у 3-суточных колеоптилей, клетки которых находятся в фазе деления и начале фазы растяжения, наблюдалась наибольшая транспортная и гидролитическая пирофосфатазная активность. Максимальная активность Н+-АТФазы, показана у растущих растяжением клеток колеоптилей 4-суточных проростков. Во фракции эндомембран из корней проростков кукурузы активность пирофосфатазы, как и в клетках колеоптилей,

максимальна в зоне деления (кончик корня), Н+-АТФазная активность повышается в зоне дифференциации (корневых волосков). 7. 15-часовая инкубация изолированных колеоптилей кукурузы, способствующая старению клеток, приводила к снижению активности Н+-насосов. Эффект старения частично обусловлен изменением состояния внутриклеточных мембран, так как при 2-суточном хранении мембранных препаратов (8°С) активность Н+-насосов понижалась, в большей степени изменялась активность Н+-АТФазы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Танкелюн О.В, Шахова Н.В. Активность АТФазы и пирофосфатазы вакуолярного типа на разных фазах роста клеток проростков кукурузы // Вестник СПбГУ. 2000. Сер. 3, вып. 3 (№19). С. 64-69.

2. Шахова Н.В., Танкелюн О.В. Некоторые характеристики АТФ- и пирофосфат-зависимого транспорта ионов Н+ во фракции эндомембран из клеток колеоптилей проростков кукурузы // Вестник СПбГУ. 2008. Сер. 3, вып. (№1). С. 69-79.

3. Танкелюн О.В, Шахова Н.В. Н+-пирофосфатазная и Н+-АТФазная активность вакуолярного типа клеток проростков кукурузы // Материалы выездной сессии ОФР РАН по проблемам биоэлектрогенеза и адаптпции у растений. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2001. С. 48-50.

4. Танкелюн О.В, Шахова Н.В. Некоторые свойства АТФ- и пирофосфат-зависимого Н+-транспорта в везикулярных фракциях клеток колеоптилей кукрузы// Тез. докл. Шестой Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 2002. Т. 3. С. 244-245.

5. Танкелюн О.В, Шахова Н.В. Протонные насосы вакуолярной мембраны и способы их регуляции // Тез. докл. VIII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге. С.-Петербург, 2004. С. 143.

6. Танкелюн О.В, Шахова Н.В. Активный транспорт Н+ через вакуолярную мембрану клеток проростков кукурузы и сопряженные с ним транспортные процессы // Тез. докл. Годичного собрания Общества физиологов растений России и Международной конференции «Проблемы физиологии растений Севера». Петрозаводск, 2004. С. 176.

7. Рудашевская Е.Л., Танкелюн О.В., Кирпичникова A.A., Шахова Н.В., Шишова М.Ф. Изменение транспортной активности протонных насосов клеток колеоптилей на ранних этапах развития проростков кукурузы // Тез. докл. Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». Сыктывкар, 2007. Т. 1. С. 357.

8. Шахова Н.В..Танкелюн О.В. Чувствительность к Са2+ протонных насосов вакуолярного типа и транспорт Са2+, сопряженный с их активностью // Тез. докл. Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». Сыктывкар, 2007. Т. 1. С. 394.

Подписано в печать 04.09.2009 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 1267.

Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"»

199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шахова, Наталия Витальевна

Список сокращений.

Введение.

Цель и задачи исследования.

Обзор литературы

1.Н+-АТФаза вакуолярного типа.

1.1. Биохимическая характеристика Н+-АТФазы тонопласта.

1.2. Субъедииичная организация V-АТФазы.

1.3. Изоформы и тканеспецифичность Н^-АТФазы тонопласта.

2. Н+-пирофосфатаза тонопласта.

2.1. Биохимическая характеристика Н+-пирофосфатазы тонопласта.

2.2. Молекулярная организация пирофосфатазы V-типа.

2.3. Изоформы и тканеспецифичность Н+-пирофосфатазы.

2.4. Пирофосфат, как энергетический источник в клетках растений.

3. Физиологическое значение V-АТФазы и V-пирофосфатазы у растений.

3.1. Влияние засоления на активность протонных насосов тонопласта, Н+-АТФазу и Ь^-пирофосфатазу.

3.2. Влияние низких температур на активность V-АТФазы и V-пирофосфатазы.

3.3. Влияние фитогормонов на активность V-АТФазы и V-пирофосфатазы.

3.4. Протонные насосы тонопласта во время роста и развития растения.

Экспериментальная часть

1. Методы исследования

1.1. Получение мембранной фракции, обогащенной фрагментами тонопласта из клеток колеоптилей кукурузы.

1.2. Определение KCl-стимулируемой пирорфосфатазной п

К03"-ингибируемой АТФазной активности.

1.3. Определение НАДН и НАДФН -цитохром с-редуктазной активности.

1.4. Определение АТФ- и пирофосфат-зависимого транспорта Н+ в везикулярных фракциях.

1.5. Определение количества белка по сорбции красителя (метод Брэдфорд).

1.6. Статистический анализ.

2. Результаты и обсуждение

2.1. О характере мембранных препаратов, использованных для анализа пирофосфатазной и АТФазной активности.

2.2. Свойства пирофосфатазной активности фракции внутриклеточных мембран, выделенных из клеток колеоптилей кукурузы.

2.3. Свойства АТФазной активности фракции внутриклеточных мембран, выделенных из клеток колеоптилей кукурузы.

2.4. АТФ- и пирофосфат-зависимый транспорт Н+ в везикулярных фракциях, обогащенных тонопластом, выделенных из клеток колеоптилей кукурузы.

2.5. Влияние ингибиторов на уровень АТФ- и пирофосфат-зависимого транспорта Н+.

2.6. Влияние Са2+ на ТМ03-ингибируемую АТФазную и пирофосфатазную активность.

2.7. Влияние Са2+ на уровень АТФ- и пирофосфат-зависимого транспорта Н+.

2.8. Влияние рутениевого красного на гидролитическую и Н+-транспортирующую активность Н -АТФазы и Н -пирофосфатазы V-типа в везикулах эндомембран из клеток колеоптилей кукурузы.

2.9. Са2 Л Г-антипортер в везикулах внутриклеточных мембран, выделенных из клеток колеоптилей кукурузы.

2.10. Гидролитическая и Н+-транспортирующая активность Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы V-типа на различных стадиях роста клеток проростков кукурузы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимические свойства и функциональная роль протонных насосов вакуолярного типа в проростках кукурузы"

Одной из основных особенностей строения клеток растений, отличающей их от клеток животных, является наличие вакуоли. На долю центральной вакуоли может приходится до 90% объема клетки, она способна накапливать сахара, органические кислоты, белки, антоцпаны, алкалоиды другие вещества. Однако не следует думать, что вакуоли просто пассивно накапливают продукты метаболизма.

Центральная вакуоль играет важную роль в поддержании гомеостаза и тургора растительной клетки. Тонопласт (вакуолярная мембрана) содержит транспортные системы пассивного и активного переноса веществ: ионные каналы, помпы, котранспортеры и другие переносчики. Исследование механизмов транспорта различных веществ через эндомембраны клеток является одним из важнейших направлений в биохимии растений. К основными системами активного транспорта ионов относятся Н+-АТРаза вакуолярного (V) типа и неорганическая Н+-пирофосфатаза V-типа (Е.С.3.6.1.3 и Е.С.З.б.1.1). Эти ферменты осуществляют электрогенный перенос ионов водорода из цитоплазмы в вакуоль, приводящий к образованию электрохимического градиента протонов. Электрохимический градиент Auli+ расходуется на вторично активный транспорт ионов, аминокислот, органических кислот, Сахаров, вторичных соиденений.

В настоящее время имеется довольно подробная информация о структуре и биохимических свойствах этих ферментов. V-АТФаза -мультисубъеднничный комплекс (состоящий из 8-10 субъединиц) с периферической надмембранной частью Vi и интегральной мембранной частью V0, обладающий следующими свойствами: ннгибируется бафиломицином Аь конканомицином А и нитратом, а так же отсутствием чувствительности к азиду, ванадату, молибдату и олигомицину [Rea Р.А., Pool R.J., 1993]. пирофосфатаза - гидрофобный белок пронизывающий мембрану 14 раз, обладает высокой чувствительностью к ионам К+, ингибируется органическими пирофосфатами, аминометилендифосфонатом, ДЭС, ДЦКД, но нечувствительна к нитрату и ванадату.

Наряду с биохимическими свойствами активно изучается и физиологическая роль протонных насосов тонопласта. Существуют данные о том, что Н+-АТРаза и Н+-пирофосфатаза функционируют в альтернативных ситуациях. В условиях стресса (анаэробиоз, охлаждение, дефицит минерального питания) у некоторых растений (проростки риса, корни ржи) активность V-АТРазы понижается или остается неизменной, тогда как уровень пирофосфатазной активности резко повышается и пирофосфат становится существенным источником энергии. Однако процессы регуляции активности этих ферментов изучены недостаточно, они представляют особый интерес с точки зрения возможности управления транспортом метаболитов.

Появились некоторые сведения о том, что протонные насосы вакуолярной мембраны приобретают различное физиологическое значение в на различных этапах роста и развития растения. Известно также, что немаловажное влияние на активность ферментов оказывают такие факторы как повышение или понижение температуры и изменение концентрации солей.

Целью нашей работы являлось сравнительное изучение биохимических свойств

Н+-АТФазы и Н -пирофосфатазы V-типа; определение их роли в процессах роста клеток проростков кукурузы.

Задачи работы:

1. отработка методов выделения и идентификации мембранной фракции, обогащенной тонопластом из клеток колеоптилей кукрузы;

2. отработка методов определения гидролитической и Н+-транспортирующей активностей Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы во фракции содержащей тонопласт;

3. оценка влияния солей одновалентных катионов на активность протонных насосов;

4. изучение влияния ионов Са2+ на Н+-АТФазную и Н+-пирофосфатазную активность и АТФ- и пирофосфат-зависимый транспорт Н+;

5. анализ активности Са /Н -антипортера во фракции эндомембран, выделенных из клеток колеоптилей кукрузы;

6. анализ Н+-транспортирующих насосов V-типа: а) на разных фазах развития клеток колеоптилей кукурузы, б) в различных зонах корней проростков кукурузы.

Работа выполнена в лаборатории Функциональной активности мембран (ФАМ) Биологического НИИ Санкт-Петербургского государственного университета. Автор благодарит научных руководителей д.б.н. проф. В.В. Полевого и к.б.н., с.н.с. О.В.Танкелюн за внимание и помощь в работе, и всех сотрудников лаборатории ФАМ за поддержку и доброжелательность.

Обзор литературы

1. Н-АТФаза вакуолярного типа

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Шахова, Наталия Витальевна

Выводы

2. Ионы Са2+ вызывали снижение гидролитической и транспортной активности Н+-пирофосфатазы (полумаксимальное ингибирование достигалось при

3,5 мкМ Са2+). Чувствительность Н+-АТФазы к Са2+ - на 1-2 порядка ниже.

3. Впервые показапо, что рутениевый красный оказывает сильное ингибирующес действие на активность Н+-пирофосфатазы вакуолярного типа клеток проростков кукурузы (150 для пирофосфат-зависнмой транслокации

Н -0,1 мкМ рутениевого красного).

4. В везикулах эндомембран клеток колеоптилей кукурузы показано присутствие Са2+/Н+-антипортера, активность которого оценивали по скорости выхода Н+ при добавлении ионов Са2+ на фоне градиента ионов Н , сформированного Н+-насосамп. Предобработка мембранных препаратов LaCl3 в концентрации

1 мМ приводила к снижению относительной скорости выхода протонов, индуцируемой Са2+.

5. Показано, что кажущаяся Кт Са2+/Н+-антипортеров для Са2+ составляла 6-8 мкМ. На фоне пирофосфат-зависимого градиента ионов Н+ выявлено дополнительное Са2+-зависимое освобождение Н+, возникающее при субмикромолярном уровне Са2+.

6. Сравнительный анализ активности Н+-насосов вакуолярного типа в зависимости от фазы роста и физиологического состояния клеток 3, 4 и

5-суточных проростков кукурузы, показал, что у 2-суточных побегов, как и 3-суточных колеоптилей, клетки которых находятся в фазе деления и начале фазы растяжения, наблюдалась наибольшая транспортная и гидролитическая пирофосфатазная активность. Максимальная активность Н+-АТФазы, показана у растущих растяжением клеток колеоптилей 4-суточных проростков. Во фракции эндомембран из корней проростков кукурузы активность пирофосфатазы, как и в клетках колеоптилей, максимальна в зоне деления (кончик корня), Н+-АТФазная активность повышается в зоне дифференциации (корневых волосков). 7. 15-часовая инкубация изолированных колеоптилей кукурузы, способствующая старению клеток, приводила к снижению активности Н+-насосов. Эффект старения частично обусловлен изменением состояния внутриклеточных мембран, так как при 2-суточном хранении мембранных препаратов (8 °С) активность Н+-насосов понижалась, в большей степени изменялась активность Н+-АТФазы.

Заключение

Полученные данные указывают на присутствие во фракции эндомембран, обогащенной фрагментами вакуолярной мембраны и содержащей ЭР из колеоптилей этиолированных проростков кукрузы, двух протонных насосов, Н -АТФазы и Н -пирофосфатазы, которые закачивают ионы Н+ внутрь везикул.

В нашей работе было проведено сравнительное изучение биохимических свойств Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы вакуолярного типа. Анализ влияния кислотности среды на гидролитическую и Н+-транспортирующую активность показал, что протонные насосы вакуолярной мембраны имеют сходный рН-оптимум, лежащий в слабо кислой и нейтральной области рН 6,8-7,2, соответствующей рН цитоплазмы. АТФ-зависимый транспорт Н+ связан с работой Н+-АТФазы вакуолярного типа, т.к. он ингибировался высокоспецифичным ингибитором бафиломицином Аь нитратом, ДЭС и ДЦКД и не показывал чувствительности к ванадату. Пирофосфатазная активность, также отвечала биохимическим признакам Н+-пирофосфатазы вакуолярного типа, а именно, высокой стимуляцей КС1 и иигибироавнием NaCl.

Обнаруженное АТФ- и пирофосфат-зависимое закисление везикул эндомембран требовало присутствия проникающих анионов. Влияние анионов на активность Н+-насосов обусловлено следующими причинами: 1) перемещение анионов рассеивает мембранный потенциал (положительный внутри), генерируемый Н+-насосом и тем самым способствует закислению везикулярного содержимого, повышая ДрН, химическую составляющую электрохимического градиента ДрН+; 2) анионы оказывют непосредственное влияние на ферменты.

Установлено, что характер влияния анионов на АТФ- и пирофосфат-зависимый транспорт Н+ сходен, и соответствует способности анионов проникать через вакуолярную мембрану. Существенное отличие во влиянии анионов на формирование АрН насосами состоит в ингибирующем действии нитрата на V-АТФазу.

Существенные различия между активностями (как гидролитической так и транспортной) двух Н+-помп проявляются в их отношении к катионам. Пирофосфат-зависимый транспорт ионов Н+, в отличие от АТФ-зависимого, обнаруживал высокую зависимость от ионов К+. В присутствии других одновалентных катионов скорость пирофосфат-зависимого транспорта снижалась в два раза и более.

Легкопроникающие поны СГ в отсутствие К+ слабо поддерживали пирофосфат-зависимое закпсление везикул. Это позволяет предположить, что транспорт К+ тесно сопряжен с активностью Н+-пирофосфатазы. По литературным данным, К+ также является кофактором Н+-пирофосфатазы и необходим как для гидролитической, так и для Н+-транспортной активности пирофосфатазы. [Davies J.M. et al., 1992; Kasai M. et al., 1993; Martinoia E. et al., 2000]. Однако, по современным представлениям, пирофосфатаза не транспортирует К+ непосредственно [Maeshima М.,2000; Ros R.,1995]. Н+-транспортирующая функция пирофосфатазы активировалась более низкими концентрациями КС1, чем активность Н+-АТФазы. Зависимость Н+-пирофосфатазной активности от концентрации КС1 подчинялась кинетике Михаэлиса - Ментен, Кт для КС1 составлял 15,8 мМ Вопрос о механизме влияния К+ на активность Н+-пирофосфатазы еще не получил окончательного решения.

Скорость АТФ-зависимого транспорта Н+ зависела главным образом от присутствующих анионов и была максимальной в среде с хлоридом. Пирофосфат-зависимая Н+-транспортирующая активность характеризовалась высокой избирательностью к одновалентным катионам и предпочитала ионы К+.

Известно, что изменения концентрации Са в цитоплазме является одним из существенных механизмов внутриклеточной передачи сигналов и регуляции ферментативной активности в ответ на изменения во внешней среде и при переходе клеток в новое функциональное состояние. Показано, что в присутствии ЭГТА (0,2 мМ), извлекающей двухвалентные катионы, уровень пирофосфатазной активности возрастал на 50%, тогда как АТФазная активность не изменялась или немого снижалась. Гидролитическая активность Н+-АТФазы вакуолярного типа показывала слабую чувствительность к ионам Са" снижение активности наблюдалось при концентрации несвязанного Са2+ свыше 20 мкМ. Пирофосфатаза показывала большую чувствительность к изменению концентрации ионов кальция в реакционной среде, снижение активности наблюдалось уже при 0,5 мкМ Са2+ (150 - 3,5 мкМ).

Сравнительный анализ влияния концентрации ионов Са в реакционной среде на активность Н+-насосов вакуолярной мембраны показал, что чувствительность Н+-транспортирующей активности пирофосфатазы к Са2+ на порядок выше, чем у Н+-АТФазы (150 - 3,46 и 32,4 мкМ соответственно).

Показано, что ионы Са2+ ингибируют пирофосфат-зависимый транспорт уже на субмикромолярном уровне. Можно предположить, что свободные ионы Са2+ являются ингибиторами Н+-пирофосфатазы и способны модулировать ее активность.

По общепринятым представлениям основной причиной ингибирования Н+-пирофосфатазы ионами кальция может быть замещение Mg2+ в субстратном комплексе [Maeshima М., 2000]. Однако, эта причина вероятно не является единственной, так как Н+-пирофосатаза обнаруживает чувствительность к субмикромолярным концентрациям этого иона. Т.о, наблюдаются существенные различия в отношении двух Н+-насосов вакуолярного типа к изменению уровня ионов Са в среде реакции.

Впервые показано, что рутениевый красный, ингибитор кальциевых, калиевых, хлоридных каналов, Са2+/Н+-обменников клеток эукариот, вызывает снижение гидролитической и Н+-транспортирующей активности Н+-пирофосфатазы вакуолярного типа клеток проростков кукурузы. 150 для пирофосфат-зависпмой транслокации протонов составляет 0,1 мкМ. Вакуолярная АТФаза не проявляла чувствительности к рутениевому красному. Эти данные представляют интерес, так как:

- для пирофосфатазы известно мало специфических ингибиторов;

- это ингибирование может свидетельствовать о тесном взаимодействии пирофосфатазы с транспортерами ионов, таких, как кальций и калий.

Н+-насосы, создают на вакуолярной мембране электрохимический градиент ионов Н+, который может обеспечивать энергией транспорт других веществ. В нашей работе присутствие Са2+/Н+-обменинка показано как диссипация градиента концентрации ионов Н+, образованного работой Н+-насосов, при добавлении Са2+ в среду реакции. Действие кальция прекращалось при добавлении ЭГТА. Кажущиеся КП1 для Са2+ на фоне АТФ- и пирофосфат-зависимого градиентов Н+ были близки по величине (8,0 и 5,9 мкМ соответственно). Однако в присутствии пирофосфат-зависимого градиента рН была выявлена вторая Кт для Са2+, на субмикромолярном уровне. Это может свидетельствовать о присутствии Са2+/Н+-обменника с высоким сродством к Са2+, сопряженного с работой Н+-пирофосфатазы.

Для доказательства того, что наблюдаемая диссипация протонного градиента под действием ионов кальция отражает активность Са /Н -антипортера использовали ингибитор различных кальциевых транспортеров хлористый лантан LaCl3 [Sze II., 1985]. Показано, что под действием La3+ снижался как уровень пирофосфат-зависимого градиента Н+, так и вызываемый кальцием выход Н+. Установлено, что ингибирующий эффект предобработки La3+ на относительную скорость выхода H+(VBbIx./АрН) составил 60%, что может свидетельствовать о регистрации в наших опытах активности Са2+/Н+-обменника.

Сравнительный анализ характера изменении активности Н+-насосов вакуолярного типа в зависимости от фазы роста и физиологического состояния клеток колеоптилей 2, 3, 4, 5-суточных проростков кукурузы, показал, что у 2 - 3-суточных колеоптилей кукурузы, клетки которых находятся в фазе деления и начале фазы растяжения наблюдается наибольшая транспотртная и гидролитическая пирофосфатазная активность, которая снижается с ростом и при старении клеток. Максимальная гидролитическая и Н+-транспортнрующая активность, поддерживаемая АТФазон, наблюдалась у растущих растяжением клеток колеоптилей 4-суточных проростков. Наименьшая активность Н+-насосов наблюдалась у прекративших рост клеток 5-суточных проростков.

В опытах мы использовали также корни 3 - 4-суточных проростков кукурузы, которые являются удобным объектом для исследования, так как в их дистальной части присутствуют пространственно ограниченные зоны клеток в фазе деления, растяжения и дифференциации. Показано, что активность Н+-пирофосфатазы максимальна в зоне деления (кончик корня). Тогда как Н+-АТФазная активность возрастает в зоне растяжения и в зоне дифференцировки (корневых волосков). В нашей работе для изучения активности двух протонных насосов вакуолярного типа впервые были использованы колеоптили проростков кукурузы. По нашему мнению, отсутствуют данные об изменении активности этих ферментов в растущих зонах кончика корня растения.

С целью изучения активности Н+-насосов эндомембран у стареющих клеток проводили 15-часовую инкубацию отрезков колеоптилей в водном растворе, слабо забуференном с добавлением сахарозы. Она приводила к снижению начальной скорости Н+-транспорта у обоих Н+-насосов. Однако Н+-пирофосфатазная активность обнаруживала несколько более высокую чувствительность к старению изолированных растительных тканей.

Анализ активности Н+-насосов после 2-суточного хранения препаратов мембран в холодильнике, показал снижение Н+-транспортирующей активности эндомембран, но более слабое, чем при старении изолированных органов.

Активность V-АТФазы понижалась при старении мембран в большей степени, чем активность V-пирофосфатазы, что может быть связано со сложным строением Н+-АТФазы вакуолярного типа, обладающей надмембраппым комплексом, чувствительным к окислению и способным отделяться от протон-переносящей мембранной части.

Можно заключить, что, изменения эндомембран, вероятно, являются существенной, но не единственной причиной снижения активности про гонных насосов при старении, которое является интегральным процессом, включающим такие процессы, как изменения в синтезе ферментов de novo, высвобождение гидролаз из внутриклеточных компартментов, возможное повышение кислотности цитоплазмы. При старении внутриклеточные мембраны быстрее разрушаются по сравнению с мембранами плазмалеммы, ипри разрушении они способствуют высвобождению в клетку гидролитических ферментов.

Полученные результаты, наряду с данными других исследований, свидетельствуют о значительной физиологической роли Н+-насосов вакуолярной мембраны, как существенных элементов системы гомеостатирования клетки, и, возможно, внутриклеточной сигнализации. Велика роль протонных насосов и в процессах жизнедеятельности делящихся и растущих растяжением клеток растений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шахова, Наталия Витальевна, Санкт-Петербург

1. Андреев И.М. Кореньков В.Д. Молотковский Ю.Г. Са2+/Н+-антипорт ввезикулах тонопласта из листьев гороха // Биол. Мембраны. 1989. Т. 6. С. 153158.

2. Акопова О.В., Сигач В.Ф. Индукция открытия митохондриальной поры поддействием Са" в миокарде крыс // Укр. биохим. журн. 2004. Т. 76. №1. С. 4855.

3. Добрецов Г. Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран илипопротеинов//М.: «Наука». 1989. С. 82-83.

4. Иванов В.Б. Меристема как самоорганизующаяся система: поддержание иограничение пролиферации клеток // Физиология растений. 2004. Т. 51, №6. С. 926-941.

5. Курский М.Д., Костерин С.А., Рыбальченко В.К. Биохимическая кинетика //

6. Киев: «Вища школа». 1977. С. 262.

7. Медведев С.С. Кальциевая сигнальная система растений // Физиологиярастений. 2005. Т. 52, № 2. С. 282-305.

8. Медведев С.С. Физиология растений // С-Пб.: «СПбГУ». 2004. С. 143-162.

9. Танкелюн О.В. свойства мембранных АТФаз клеток колеоптилей кукурузы // Вестник СПбГУ. 1997. Сер. 3, №1. С.767-769.

10. Танкелюн О.В., Полевой В.В. Индуцируемое ауксином повышениепротеинкиназной активности микросомальной фракции клеток колеоптилей кукурузы. // Физиология растений. 1996. Т. 43, №2. С.201-207.

11. Танкелюн О.В., Шахова Н.В. Активность АТФазы и пирофосфатазывакуолярного типа на разных фазах роста клеток проростков кукурузы // Вестник СПбГУ. 2000. Сер. 3, № 19. С. 64-69.

12. Трофимова М.С. Н+-АТФаза плазмолеммы как компонент рН-стата цитозоляизолированных портопластов // Физиология растений. 1992. Т. 39, № 1. С.221-227 .

13. Черняева Е.В., Холодова В.П. Выделение вакуолей из клеток корня сахарнойсвеклы и АТФазная активность тонопласта // Физиология растений. 1990. Т. 37, №3. С. 441-449

14. АН R., Brett С. L., Mukherjee S., and Rao R. Inhibition of Sodium/Protonexchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, №6. P. 4498^1506.

15. Armbruster A., Bailer S.M., Koch M.H.J., Godovac-Zimmermann J., Gruben G.

16. Dimer fonnation of subunit G of the yeast V-ATPase // F.E.B.S. 2003. Vol. 546. P. 359-400.

17. Babourina O., Leonidova Т., Shabala S. and Newman I. Effect of sudden salt stress on ion fluxes in intact wheat suspension cells // Arm. Botany. 2000. Vol. 85. P. 759-767.

18. Bacon M.A., Wilkinson S., davies W.J. pH-regulated leaf cell expresion indraughted plants is abscisic acid dependent // Plant Physiol. 1998. Vol. 118. P. 1507-1515.

19. Baltscheffsky M., Schuitz A., Baltscheffsky H. H+-PPase: a tightly membrane-bound familu//FEBS. 1999. Vol. 457. P. 527-533.

20. Barcla B.J., Pantoja O. Physiology of ion transport across the tonoplast of higher plants // Annu. Rev. Plant Mol. Biol. 1996. Vol. 47. P. 159-184.

21. Barcla B.J., Vera-Estrella R., Maldonado-Gama M., Pantoja O. Abscisic acid induction of vacuolar H+-ATPase activity in Mesembryanthemum crustallinum is developmental^ regulated // Plant Physiol. 1999. Vol. 120. P. 811-819.

22. Barreu F., Chrispeels m.J. Delivery of a secreted soluble protein to the vacuole via a membrane anchor // Plant Physiol. 2004. Vol. 120. P. 961-968.

23. Bauerle C., Magembe C., Briskin D.P. Characterization of red beet protein homologous to the essental 36-kilodalton subunit of the yeast V-type Atpase // Plant Physiol. 1998. Vol. 117. P. 859-867.

24. Baykov A.A., Baculeva N.P., Rea P.A. Steadu-state kinetics of substrat hydrolysisby vacuolar F^-PPase. A simple three-state model // Eur. J. Biohem. 1993. Vol. 217. P. 755-762.

25. Beevers L. and Raikhel N. V. Transport to the vacuole: receptors and trans elements // J. Exp. Botany. 1998. Vol. 49, № 325. P. 1271-1279.

26. Belogurov G. A. and Lahti R. A Lysine Substitute for K+ // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. №51. P. 49651-49654.

27. Bethke P.C., Jones R.L. Ca2+-calmodulin modulates ion channel activity in storage protein vacuoles of barely aleurone cells // Plant Cell. 1994. Vol. 6. P. 277-285.

28. Beyenbach K. W., and Wieczorek H. The V-type H+ ATPase: molecular structure and function, physiological roles and regulation // J. Exp. Biol. 2006. Vol. 209. P.577-589.

29. Bihler H., EingCh., Hebeisen S., Roller A., Czempinski K., and Bertl A. TPK1 Is a vacuolar ion channel different from the slow-vacuolar cation channel // Plant Physiol.2005. Vol. 139. P. 417-424.

30. Blaudez D., Kohler A., Martin F., Sanders D., and Chalot M. Poplar Metal tolerance protein 1 confers zinc tolerance and is an oligomeric vacuolar zinc transporter with an essential leucine zipper motif // Plant Cell. 2003. Vol. 15. P. 2911-2928.

31. Bowers К., Levi B.P., Patel F. I., and Stevens Т. H. The sodium/proton exchanger

32. Nhxlp is required for endosomal protein trafficking in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Mol. Biol. Cell. 2000. Vol. 11. P. 4277-4294.

33. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the guantitation of microgram guantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1979 Vol. 72 P. 248-254.

34. Britten C.J., Zhen R.-J., Kim E.J., Rea P.A. Reconstitution of transport function ofvacuolar H+-translocating niorganic pyrophsphatas .// J. Biol. Chem., 1992, Vol. 267, №30. P. 21850-218555.

35. Brooks S.P.J., Storey K.B. bound and determined: A computer programm formarking buffers of degined concentrations // Anal. Biochem. 1992. Vol. 201. P. 119-126.

36. Bruggemann L. I., Pottosin I. I., Schonknecht G. Cytoplasmic magnesium regulates the fast activating vacuolar cation channel // J. Exp. Botany. 1999. Vol. 50, №339. P. 1547-1552.

37. Bughio N., Yamaguchi H., Nishizawa N.K., Nakanishi H., Mori S. Cloning an iron-regulated metal transport from rice // J. Exp. Botany. 2002. Vol. 57, № 374. P. 1677-1682.

38. Charles S. Buer and Gloria K. Muday The transparent testa4 mutation preventsflavonoid synthesis and alters auxin transport and the response of Arabidopsis roots to gravity and light // Plant Cell. 2004. Vol. 16. P. 1191-1205.

39. Cai X. and Lytton J. The Cation/Ca2+ Exchanger Superfamily: Phylogenetic Analysis and Structural Implications // Mol. Biol. Evol. 2004. Vol. 21, № 9. P. 1692-1703.

40. Cai X. and Lytton J. Molecular Cloning of a Sixth Member of the K+-dependent

41. Na+/Ca2+ Exchanger Gene Family, NCKX6 // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 7. P. 5867-5876.

42. Carter C., Pan S., Zouhar J., Avila E. L., Girke T. and Raikhel N. V. The Vegetative Vacuole Proteome of Arabidopsis thalianaReveals Predicted and Unexpected Proteins //Plant Cell. 2004. Vol. 16. P. 3285-3303.

43. Carystinos G.D., MacDonald H.R., Monroy A.F., Dhinda R.S., Poole R.J. Vacualar

44. H+-translocating pyrophosphatase is indused by anoxia or chilling in seedlings of rise // Plant Phisiol. 1995. Vol. 108, № 2. P. 641-649.

45. Buer C. S. and Muday G. K. The transparent testa4 mutation prevents flavonoidsynthesis and alters auxin transport and the response of arabidopsis roots to gravity and light // Plant Cell 2004 Vol. 16 P. 1191-1205.

46. Carter C., Pan S., Zouhar J., Avila E.L., Girke T. and Raikhel N.V. The vegetativevacuole proteome of Arabidopsis thaliana reveals predicted and unexpected proteins // Plant Cell. 2004. Vol. 16. P. 3285-3303.

47. Chaumont F., Barrieu F. Wojcik E., Chrispeels M. .T. and Jung R. Aquaporins constitute a large and highly divergent protein family in maize// Plant Phisiol. 2001. Vol. 125. P. 1206-1215.

48. Chardonnens A.n., Koevoets P.L.M., van Zanten A.,Schat H., Varkleij J.A.C.

49. Properties of enchanced tonoplast zinc transport in naturally selected zinc-tolerant Silene vugaris // Plant Physiol. 1999. Vol. 120. P. 779-785.

50. Chen L.-S. and Nose A. Day-Night Changes of energy-rich compounds incrassulacean acid metabolism (CAM) species utilizing hexose and starch // Ann. Botany. 2004. Vol. 94. P. 449^155.

51. Chen X., Kanokporn Т., Zeng Q., Wilkins T. A. and Wood A. J. Characteization of

52. V-type H+-ATPase in the resurrection plant Tortura nivalis: accumulation and polysonal recruitment of the proteolipid с subunit in response to solt-stress // J. Exp.I Botany. 2002. Vol. 53, № 367. P. 225-232.

53. Cheng N., Pittman J. K., Shigaki Т., and Hirschi K. D. Characterization of CAX4,an Arabidopsis H+/Cation Antiporter // Plant Physiol.2002. Vol. 128. P. 12451254.

54. Chrispeels M.J., Herman E.M. Endoplasmic reticulum-derived compartmentsfunction in storage and as mediators of vacuolar remodeling via a new type of organelle, precursor protease vesicles // Plant Physiol. 2000. Vol. 123. P. 12271233.

55. Cooley M.B. Yang H., Dahal R., Mella R.A., Dowine A.B., Haigh A.M., Bradford

56. K.J. Vacuolar H+-ATPase is expressed in response to Gibberelinn during tomato seed germination//Plant Physiol. 1999. Vol. 121. P. 1339-1347.

57. Crider B.P., Xie X.-S., Stone D.K. Bafilomycin inhibits proton flow through the H+channel of vacuolar proton pumps // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 1737917381.

58. Darely C., Davies J.M., Sanders D. Chill-induced changes in the activity and abundance of the vacuolar proton-pumping pyrophosphatase from mung-bean hypocotyls // Plant Physiol. 1995. Vol. 109. P. 659-665.

59. Davies J.M., Poole R.J. Sanders D. Vacuolar proton-pumping pyrophosphatase in Beta vulgaris shows vectorial activation by potassium 11 Plant Physiol. 1991. Vol. 278, № l.P. 66-68.

60. Davies J.M., Poole R.J., Rea P.A., Sanders D. Potassiun transport into plantvacuoles energized directly by a proton-pumping inorganic pyrophosphotase // Proc. Nat. Acad. Scin. USA. 1992. Vol. 89, № 24. P. 11701-11705.

61. Delhaize E., Kataoka Т., Hebb D. M„ White R. G., and Ryan P. R. Genes Encoding Proteins of the Cation Diffusion Facilitator Family That Confer Manganese Tolerance//Plant Cell. 2003. Vol. 15. P. 1131-1142.

62. Deitz K.J., Tavakoli N., Kluge C., Mimurf Т., Sharma S.S., Harris G.C.

63. Significance of the V-type ATPase for the adaptation to stressful grows condition and its regulation the molecular and biochemical level // J. Exp. Botany. 2001. Vol. 52, № 367. P. 1969-1980.

64. Dettmer J., Hong-Hermesdorf A. Stierhof Y.-D. and Schumacher K. Vacuolar H+-ATPase activity is required for endocytic and secretory trafficking in Arabidopsis II Plant Cell. 2006. Vol. 18. P. 715-730.

65. Domgall I., Venzke D., Luttge U., Ratajczak R., Bottcher B. Three-dimensional map of a plant V-ATPase based on electron microscopy.// J.Biol.Chem. 2002. Vol. 277, № 16. P. 13115-13121.

66. Drory O. and Nelson N. The emerging structure of vacuolar ATPases // Physiology. 2006. Vol. 21. P. 317-325.

67. Drozdovicz Y.M., Kissinger J.C., Rea P.A. AVP2, a sequence-divergent, K+insensitive H+-translocating inorganic pyrophosphatase from Arabidopsis// Plant Physiol. 2000. Vol. 123 P. 353-362.

68. Drozdowicz Y. Rea P.A. Vacuolar ^pyrophosphatases: from the evolutional*}' backwaters into the mainstream // Trends Plant Sci. 2001. Vol. 6, № 5. P. 206211.

69. Drozdovicz Y.M., Show M., Nishi M., Striepen В., Liwinski H.A., Roos D.S., Rea

70. P.A. Isolation and characterization of TgVPl, a type I vacuolar H+-translocating pyrophosphatase from Toxiplasma gondii II J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, № 2. P.1075-1085.

71. Dshida W.J.A., Bowman B.J. The vacuolar ATPase: sulfite stabilization and the mechanism of nitrat inactivation // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270, № 4. P. 15571563.

72. Echeveria E. Vesicle-mediated solute transport between the vacuol and plasma membrane // Plant Physiol. 2000. Vol. 123. P. 1217-1226.

73. Eichhorn H., Klinghammer M. Becht P. and Tenhaken R. Isolation of a novel ABC-transporter gene from soybean induced by salicylic acid // J. Exp. Botany. 2006. Vol. 57, № 10. P. 2193-2201.

74. Essah P.A., Davenport R., and Tester M. Sodium Influx and Accumulation in Arabidopsis // Plant Physiol. 2003. Vol. 133. P. 307-318.

75. Etxeberria E. and Gonzalez P. Evidence for a tonoplast-associated form of sucrose synthase and its potential involvement in sucrose mobilization from the vacuole // J. Exp. Botany. 2003. Vol. 54, № 386. P. 1407-1414.

76. Facanha A.R., Meis L. Reversibility of H+-ATPase and H+-PPase in tonoplast vesicles from maize coleoptels and seeds // Plant Physiol. 1998. Vol. 116. P. 1478-1495.

77. Fisher-Schliebs E., Mariaux J.-B., Luttge U. Stimulation of Ii+-transport activity of vacuolar H+-ATPase by activation of H+-PPase in Kalanchoe blosspeliana II Biol. Plantarum. 1997. Vol. 39, № 2. P. 169-177.

78. Forgac M. Structure, function and regulation of the vacuolar H+-ATPases// FEBS.1998. Vol. 440. P. 258-263.

79. Forgac M. Structure and properties of the vacuolar Hf-ATPases // J. Biochem.1999. Vol. 274, № 19. P. 12951-12954.

80. Forster C., Kane P.M. Cytosolic Ca2+ homeostasis is a cnstitutive function of the V-ATPase in Saccharomyces cerevisae И J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 49.P. 38245-38253.

81. Franchard A., Maguin Т., Trossat C., Pugin A. Properties of the proton pumping pyrophosphatase in tonoplast vesicles of Acer pseudoplatamis. Functional moecular mass and polipeptide composition // Plant Physiol. Biochem. 1993. Vol. 31, №3. P. 349-360.

82. Frey R.K., Randall S.K. Initial steps in the assembly of the vacuol-type H+-ATPases//Plant Physiol. 1998. Vol. 118. P. 137-147.

83. Fukuda A. Nakamura, Tagiri A., Tanaka H., Miyao A., Hirochika H. and Tanaka

84. Y. Function. Intracellular Localization and the Importance in Salt Tolerance of a Vacuolar Na+/H+ Antiporter from Rice // Plant Cell Physiol. 2004 Vol. 45, № 2. P. 146-159.

85. Gao F, Gao Q„ Duan X.G., Yue G.D., Yang A. and Zhang J. Cloning of an Hl

86. PPase gene from Thellimgiella halophila and its heterologous expression to improve tobacco salt tolerance // J. Exp. Botany. 2006. Vol. 57, № 12. P. 32593270.

87. Gao X.-Q., Li C.-G.,. Wei P.-Ch, Zhang X.-Y., Chen J., and Wang X.-C. The

88. Dynamic Changes of Tonoplasts in Guard Cells Are Important for Stomatal Movement in Vicia faba // Plant Physiol. 2005. Vol. 139. P. 1207-1216.

89. Geisler M., Frangne N., Gomes E., Martinoia E. and Palmgren M. G. The ACA4 Gene of Arabidopsis Encodes a Vacuolar Membrane Calcium Pump That Improves Salt Tolerance in Yeast // Plant Physiol. 2000. Vol. 124. P. 1814-1827.

90. Getz H.-P., Klein M. Characteristics of sucrose transport and sucrose-induced H+ transport on the tonoplast of red beet storage tissue // Plant Physiol. 1995. Vol. 107. P. 459-467.

91. Gogarten J.P., Starce T. Evolution and isoforms of V-ATPase subunits // J. Exp. Biol. 1992. Vol. 11. P. 137-147.

92. Golldack D., Deitz K.-J. Salt-induced expression of the vacuolar H+-ATPase in thecommon ice plant developmentally controlled and tissue specific //Plant Physiol. 2001. Vol. 125. P. 1643-1654.

93. Goodman C. D., Casati P., and Walbot V. A Multidrug Resistance-Associated

94. Protein Involvedin Anthocyanin Transport in Zea mays II Plant Cell. 2004. Vol. 16. P. 1812-1826.

95. Gordon-Weeks R., Korenkov V.D., Steele S.H., Leigh R.A. Tris Is a competitive inhibitor of K+ activation of the vacuolar H+-pumping pyrophosphatase // Plant Physiol. 1997. Vol. 114. P. 901-905.

96. Gordon-Weeks R., Parmar S., Davies d., Leigh r.A. Structural aspects of theeffectiveness of bisphosphonates as competitive inhibitors of the plant vacuolar proton-pumping pyrophosphatase // J. Biochem. 1991. Vol. 337, № 3. P. 373-377.

97. Hall J.L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance //

98. J.Exp. Botany. 2002. Vol. 53, № 366. P. 1-11.

99. Hall J. L. and Williams L. E. Transition metal transporters in plants // J. Exp.

100. Botany. 2003. Vol. 54, № 393. p. 2601-2613.

101. Hamilton C.A., Good A.G., Taylor G.J. Induction of vacuolar ATPase andmitochondrial Atp synthase by aluminium in an aluminium-resistant cultivar of wheat//Plant Physiol. 2001. Vol. 125. P. 2068-2077.

102. Hepler P. K. Calcium: A Central Regulator of Plant Growth and Development // Plant Cell. 2005, Vol. 17. P. 2142-2155.

103. Herman E.M., Li X., Su R.T., Larsen P., Hei-ti H., Sze H. Vacuolar-type H+

104. ATPases are assosiated with the endoplasmic reticulum and provacuoles root tip cells//Plant Physiol. 1994. Vol. 106, №4. P. 1313-1324.

105. Hirata Т., Nakamura N., Omote H., Wada Y., Futai M. Regulation and reversibility of vacuolar H+-ATPase // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 1. p.386-389.

106. Ikeda M., Satoh S., Maeshima M., Mucohata Y. Vacuolar ATPase and PPase in Acetabularia acetabulum И Biochem. Biophys. Acta. 1991. Vol. 1070, № 1. P. 77-82.

107. Imamura H., Nakano M., Noji H., Muneyuki E., Ohkuma S., Yoshida M., and Yokoyama K. Evidence for rotation of Vl-ATPase // PNAS. 2003. Vol. 100. P. 52312-2315.

108. Imamura H., Nakano M. Noji H., Muneyuki E., Ohkuma S., Yoshida M., and Yokoyama K. Evidence for rotation of Vl-ATPase // PNAS. 2003. Vol. 100. P. 52312-2315.

109. Ishimaru Y., Suzuki M., Kobayashi Т., Takahashi M., Nakanishi H., Mori S. and Nishizawa N.K. OsZIP4, a novel zinc-regulated zinc transporter in rice // J. Exp. Botany. 2005. Vol. 56, № 422. P. 3207-3214.

110. Jang S. Maeshima M., Tanaka Y., Komatsu S. Modulation of vacuolar H+-pumps and aquaporin by phytochromes in rice seedling leaf sheaths // Biol. Pharm. Bull. 2003. Vol. 26, № l.P. 88-92.

111. Jang S., Yang S.J., Kuo S.Y., Pan R.L. Radiation inactivation analysis of H+-phyrophosphatase from submitochondrial particles of etiolated mung bean seedlings // FEBS. 2000. Vol. 468. P. 211-214.

112. Jauh G., Philips Т.Е., Rogers J.C. Tonoplast intrinsic protein isoforms as markers for vacuolar functions //Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 1867-1882.

113. Jeyaraj S., Dakhlallah D., Hill S. R., and Lee B. S. HuR Stabilizes Vacuolar FI+-translocating ATPase mRNA during Cellular Energy Depletion // J Biol. Chem. 2005. Vol. 280, № 45. P. 37957-37964.

114. Jiang L. The role ofBP-80 and homologs in sorting proteins to vacuoles// Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 2069-2071.

115. Jentsch T.J., Stein V., Weinreich F. and Zdebik A.A. Molecular Structure and Physiological Function of Chloride Channels // Physiol. Rev. 2002. Vol. 82. P. 503-568.

116. Jiang S.S., Yang S.J., Kuo S.Y., Pan R.L. Radiation inactivation analysis of H+-pyrophosphatase from submitochondrial particles of etiolated mung bean seedlings // FEBS. 2000. Vol. 45. P. 211-214.

117. Johannes E., Collings D.A., Rink J.C., Allen N.S. Cytoplasmic pH dynamics in maize pulvinal cells induced by vector changes // Plant Physiol. 2001. Vol. 127. P. 119-130.

118. Kamiya T. and Maeshima M. Residues in Internal Repeats of the Rice Cation/I I Exchanger Are Involved in the Transport and Selection of Cations // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 1. P. 812-819.

119. Kasai M., Nakamura t., Kudo N., Sato H., Maeshima M., Sawada S. The activity of the root vacuolar H+-pyrophosphatase in rye plants grown under conditions deficient in mineral nutrients // Plant Cell Physiol. 1998. Vol. 39, № 8. P. 390394.

120. Kasai M. Sasaki M., Yamamoto Y., Matsumoto M. Aluminium stress increases K+ efflux and PPi-dependent H+ pumps of tonoplast-enriched membrane vesicles from barley roots // Plant Physiol. 1992.Vol. 33, № 7. P. 1035-1039.

121. Kasai M., Sasaki M., Yamamoto Y., Matsumoto M. In vivo treatments that modulate PPi-dependent H+ transport activity of tonoplast-enriched membrane vesicles from barley roots // Plant Cell Physiol. 1993. Vol. 34, № 4. P. 549-555.

122. Kawamura Y., Arakawa K., Maeshima M., Yoshida S. Tissue specificity of E subunit isoform of plant vacuolar H+-ATPase and existence of isotype enzymes // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 9. P. 6515-6522.

123. Keeling D.J., Herslof M., Rubera В., Siogen S., Solven L. Vacuolar Hf-ATPases. Targets for drug discovery // Ann. N.Y. Acad.Sci. 1997. Vol. 843. P. 600-608.

124. Kim Y., Kim E.A., rea P.A. Isolations and characterization of cDNA encoding the vacuolar ^-pyrophosphatase of Beta vulgaris // Plant Pysiol. 1994. Vol. 106. P. 357-382.

125. Kim E.A., Zhen R.G., Rea P.A. Heterologus expression of plant vacuolar PPase in yeast demonstrates sufficiency of the substrat-binding subunit for proton transpot.// Proc. Nat. Acad. Scin. 1994. Vol. 91, № 13. P. 6128-6132.

126. Kreps J. A., Wu Y., Chang H.-S., Zhu Т., Wang X., and Harper J. F. Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic, and cold stress // Plant Physiol. 2002. Vol. 130. P. 2129-2141.

127. Krol E., Trebacz K. Ways of ion channel gating in plant cells // Ann. Bot. 2000. Vol. 86. p. 449-469.

128. Kuriama H. Loss of tonoplast integrity programmed in tracheary element differentiation // Plant Physiol. 2002. Vol. 121. P. 763-744.

129. Kutsuna N. and Hasezawa S. Dynamic organization of vacuolar and microtubule structures during cell cycle progression in synchronized tobacco BY-2 cells // Plant Cell Physiol. 2002. Vol. 43, № 9. P. 965-973.

130. Lerchi J., Konig S., Zrenner R., Sonnewald U. Molecular cloning, characterization and expression analysisof isoforms encoding tonoplast-bound proton translocating PPase in tobacco // Plant Mol. Biol. 1995. Vol. 26 (4). P. 833-840.

131. Leustek T. and Saito K. Sulfate Transport and Assimilation in Plants // Plant Physiol. 1999. Vol. 120. P. 637-643.

132. Li H., Su R.T.S., Hsu H., Sze H. The molecular chaperone calnexin associates with the vacuolar H^ATPase from oat seedlings // Plant Cell. 1998. Vol. 10. P. 119-130.

133. Li Z.-H., Zhao Y., Rea P.A. Magnesium adenosine 5'-triphosphate-energized transport of glutathione-s-conjugates by plant vacuolar membrane vesicles // Plant Physiol. 1995. Vol. 107. P. 1257-1268.

134. Lichko L.P., Kulakovskaya T.V., Kulaev I.S. Purification and characterization of a soluble pyrophosphaatse from nitochondria of Saccharomyces cerevisae II Biochem. 2000. Vol. 65, № 3. P. 335-360.

135. Liu L.-H., Ludewig U., Frommer W. В. and von Wiren N. AtDUR3 Encodes a New Type of High-Affinity Urea/H+ Symporter in Arabidopsis // Plant Cell. 2003. Vol. 15. P. 790-800.

136. Loque D., Ludewig U., Yuan L., and von Wiren N. Tonoplast Intrinsic Proteins AtTIP2;l and AtTIP2;3 Facilitate NH3 Transport into the Vacuole // Plant Physiol.2005. Vol. 137. P. 671-680.

137. Luo S., Marchesini N., Moreno S.N.J., Docampo R. A plant-like vacuolar H+-pyrophosphatase in Plasmodium falciparum И FEBS. 1999. Vol. 52. P. 217-220.

138. Luttge U., Fischer-Schliebs E. and RatajczakR. The H+-pumping V-ATPase of higher plants: A versatil "ECO-ENZYME" in response to environmental stress // Cell. Biol. Mol. Lett. 2001. Vol. 6. P. 356-360.

139. Luttge U., Ratajczak R., Rasuch Т., Rockel B. Stress responses of tonoplast proteins an example for molecular ecophysiology and the search for ecoenzymes // Actc Bot. Neerl. 1995. Vol. 44, № 4. P. 343-362.

140. Maathuis F. J. M. The role of monovalent cation transporters in plant responses to salinity // J. Exp. Botany. 2006. Vol. 57, № 5. P. 1137-1147.

141. Macri F., Vianello A. ADP- or pyrophosphate-dependent proton pumping of pea stem tonoplast enriched vesicles // FEBS. 1997. Vol. 215, № 1. P. 447-452.

142. Magnin Т., Fraichard A., Trosart C., Pugin A. The tonoplast H+-ATPase of Acer pseudoplatanus is a vacuolar-type ATPase that operates with a phosphoenzyme intermediate//Plant Physiol. 1995. Vol. 109. P. 285-292.

143. Maeshima M. Vacuolar ^-pyrophosphatase // BBA. 2000. Vol. 1456. P. 37-51.

144. Maeshima M. H+-translocating inorganic PPase of plant vacuoles. Inhibition by Ca2+ stabilization by Mg2+ and immunological comparison with other inorganic PPases // Eur. J. Biochem. 1991. Vol. 196, № 1. P. 7-11.

145. Maeshima M., Nadayasu t. Cycloprodigiosin uncouples FT-pyrophosphatase of plant vacuolar membranes in the presence of chloride ion // Plant Cell Physiol. 1999. Vol. 40, № 4. P. 439-442.

146. Maeshima M., Nakanishi Z., Matsuura-Endo C., Tanaka Y. Proton pumps of the vacuolar membrane in graving plant cell // J. Plant Res. 1996. Vol. 109, № 1093. P. 119-125.

147. Malmstrom S.,. Akerlund H.-E, and Askerlund P. Regulatory role of the N terminus of the vacuolar Calcium-ATPase in cauliflower // Plant Physiol. 2000. Vol. 122. P. 517-526

148. Mansuor M.M.F., Salama K.H.A., Al-Mutawa M.M. transport proteins and salt tolerance in plants // Plant Sci. 2003. Vol. 164. P. 891-900.

149. Marty E. Plant vacuoles // Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 587-599.

150. Martinoia E., Maeshima M. and Neuhaus H. E. Vacuolar transporters and their essential role in plant metabolism // J. Exp. Botany.2007. Vol. 58, № 1. P. 83102.

151. Martinoia E., Massonneau A. and Frangne N. Transport processes of solutes across the vacuolar membrane of higher plants // Plant Cell Physiol. 2000. Vol. 41, № 11. P. 1175-1186.

152. Matsuura-Endo С., Maeshima M. Subunit composition of vacuolar membrane H+ATPase from mung been // Eur. J. Biochem. 1999. Vol. 187. P. 745-751.

153. Matsuoka K., Higuchi Т., Maeshima M., Nakamura K. A vacuolar-type H+ATPase in nonvacuolare organelle is reguired for the sorting of soluble vacuolar protein precursors in tobacco cells // Plant Cell. 1997. Vol. 9. P. 533546.

154. Mei H., Zhao J., Pittman J. K., Lachmansingh J., Park S. and Hirschi K. In planta regulation of the Arabidopsis Ca2+/H+-antiporter CAX1 // J. Exp. Botany. 2007. Vol. 58, №12. P. 3419-3427.

155. Merzendorfer H., Graf R., Huss M., Harvey W.-R., Wiecsorec H. Regulation of proton-translocating V-ATPases // J. Exp. Biol. 1997. Vol. 200, № 2. P. 225-235.

156. Miller E. Reply: The role of BP-80 in sorting to the vacuole in sigmas // Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 2071-2072.

157. Mimura T. Physiological characteristics and regulatium mechanisms of H+ pumps in the plasma membrane and tonoplast of characean cells // J. Plant Res. 1995. Vol. 108, № 1090. P. 249-256.

158. Mitsuda N., Enami K., Nakata M., Takeyasu K., Sato M.H. Novel type Arabidopsis thaliana H+-PPase islocalized to the Golgi apparatus // FEBS. 2001. Vol. 488. P. 29-33.

159. Mitsuhashi N., Hayashi Y., Koumoto Y., Shimada Т., Fukasawa-Akada Т., Nishimura M. A novel memebrane protein that is transroported to protein storage vacuoles via precursor-accumulating vesicles // Plant Cell. 2001. Vol. 71. P. 2361-2372.

160. Muller M.L., Jensen M. Taiz L. The vacuolar H+ATPase of lemon fruits is regulated by variable Ii+/ATP coupling and slip // J.Biol.Chem. 1999. Vol. 274, № 16. P. 10706-10716.

161. Mustroph A. Albrecht G., Hajirezaei M., Grimm B. and Biemelt S. Low Levels of Pyrophosphate in Transgenic Potato Plants Expressing E. coli Pyrophosphatase Lead to Decreased Vitality Under Oxygen Deficiency // Ann. Botany. 2005. Vol. 96. P. 717-726.

162. Nagamune К. and Sibley L. D. Comparative genomic and phylogenetic analyses of calcium ATPases and calcium-regulated proteins in the apicomplexa // Mol. Biol. Evol. 2006. Vol.23, № 8. P. 1613-1627.

163. Nakamura N., Tanaka Sh., Teko Y., Mitsui K. and Kanazawa H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and Post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation // J. Biol.Chem. 2005. Vol. 280, № 2. P. 1561-1572.

164. Nakanishi Y., Maeshima M. Molecular cloning of vacuolar H+-pyrophosphatase and its developmental expression in graving hypocotyl of mung-bean // Plant Physiol. 1998. Vol. 116. P. 589-597.

165. Nakanishi Y., Saija Т., Wada Y., Maeshima M. Mutagenic analysis of functional residues in putative substrat-binding site and acidic domains of vacuolar FT-pyrophosphatase // J.Biol. Chem. 2001. Vol. 276, № 10. P. 7654-7660.

166. Nore B.F., Sasaki-Nore Y., Maeshima M., Baltsheffsky M, Nyren P. Immunological cross-reactivity between proton-pumping inorganic PPases of widely phylogenic separated species // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1991. Vol. 181, №3. P. 962-970.

167. Obermeyer G., Sommer A., Bentrup F.V. Potassium and voltage dependence of inorganic pyrophosphatase of intact vacuoles from Chenopodium rubrum 11 Biochim. Biophys. Acta. 1996. Vol. 1284. P. 203-212.

168. Otegui M. S., Capp R., and Staehelin L. A. Developing Seeds of Arabidopsis Store Different Minerals in Two Types of Vacuoles and in the Endoplasmic Reticulum//Plant Cell. 2002. Vol. 14. P. 1311-1327.

169. OzolinaN.V., Pradedova E.V., Salyaev R.C. The effcct on hydrolitic activity of the tonoplast // Teses of symposium on "Plant hormone signal reception and transduction"/Moskow. 1993. P. 64.

170. Palma D.A., Blumward E., Plaxton W.C. Uprcgulation of vacuolar H+-translocating pyrophosphatase by phosphate starvation of Brassica napus (rapeseed) suspension cell cultures // FEBS. 2000. Vol. 486. P. 155-158.

171. Palmgren M.G. Acridine orange as a probe for measuring pH gradients across membranes: mechanisms and limitations // Analyt. Biochem. 1991. Vol. 192, № 2. P. 316-321.

172. Park S. Cheng N. H., Pittman J.K., Yoo K. S., Park J., Smith R. H., and Hirschi K. D. Increased Calcium Levels and Prolonged Shelf Life in Tomatoes Expressing Arabidopsis H+/Ca2+ Transporters // Plant Physiol. 2005.Vol. 139. P. 1194-1206.

173. Pfeffer W., Hagger A. Ca2+-ATPase and Mg2+/H+-antiporter are present on tonoplast membranes from roots of Zea mays L. I I Planta. 1993. Vol. 131. P. 377385.

174. Perzov N., Pader-Karavani V., Nelson H., Nelson N. Features of V-ATPases that distinguish them from F-ATPases // FEBS. 2001. Vol. 504. P. 223-228.

175. Pottosin 1.1., Martinez-Estevez M., Dobrovinskaya O. R. and Muniz J. Potassium-selective channel in the red beet vacuolar membrane// .J. Exp.Botany. 2003. Vol. 54, № 383. P. 663-667.

176. Pugliarello M.C., Rasi-Caldogno е., De Michiles M.J., Olivari C. The tonoplast H+-pyrophosphatase of radish seedlings: biochemical characteristics // Physiol. Plant. 1991. Vol. 83, № 3. P. 339-345.

177. Rahimoff R. and Alnaes E. Inhibitory action of ruthenium red on neuromuscular transmission//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1973. Vol. 70. P, 3613-3616.

178. Qiu Q.-S., Guo Y., Quintero F. J., Pardo J.M., Schumaker K. S., and Zhu J.-K. Regulation of Vacuolar Na+/PI+ exchange in Arabidopsis thalianaby the Salt

179. Overly-Sensitive (SOS) pathway // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 1. P. 207215.

180. Qual Р.Ы. Plant cell fractionation // Ann. Rev. Plant Physiol. 1989. Vol. 30. P. 425-484.

181. Quintero F.J., Blatt M.R., Pardo J.M. Functional cnservation between yeast and plant endosomal Na+/H+ antiporters // FEBS. 2000. Vol. 471. P. 224-228.

182. Ratajczak R., Hinz G., Robinson D.G. Localization of pyrophosphate in membranes of couliflower in fluorescence cells // Planta. 1999. Vol. 208. P. 205211.

183. Rautencranz A.A.F., Li L., Machler F., Martinoia E., Oertli J.J. Transport of Ascorbic and dehydroascorbic acids across protoplasts and vacuole membranes isolated from barley leaves // Plant Physiol. 1994. Vol. 106. P. 187-193.

184. Rea P.A., Britten С J., Jennings I.R., Calvert C.M., Skiera I.A., Leigh R.A., Sanders D. Regulation of vacuolar H+-pyrophosphatase by free calcium // Plant Physiol. 1992. Vol. 100, № 1. P. 157-180.

185. Rea P. A. Britten C. J., and Sarafian V. Common Identity of Substrate-Binding Subunit of Vacuolar H+-Translocating Inorganic Pyrophosphatase of Higher Plant Cells // Plant Physiol. 1992. Vol. 100. P. 723-732.

186. Rea P.A., Pool R.J. Vacuolar H+-translocating pyrophosphatase // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1993. Vol. 44. P. 157-180.

187. Rea P.A., Sanders D. Tonoplast energization: Tow H+ pumps, one membrane // Plant Physiol. 1987. Vol. 71. P. 131-141.

188. Ros R., Romieu G., Gibrat R., Grignon C. The plant inorganic pyrophosphatase does not transport K+ in vacuole membrane vesicles multilabeled with fluorescent probes for H+, K+ and membrane potential // J.Biol.Chem. 1995. Vol. 270, № 9. P. 4368-4374.

189. Saliba К.J., Allen R.J.W., Zissis S., Bray P.G. Ward S.A., Kirk K. Acidification of the malaria parasite's digestive vacuole by a II+-ATPase and a H+-pyrophosphatase // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, № 8. P. 5605-5612.

190. Sakakibara Y., Kobayashi II. Hasamo K. Isolation and characterization of cDNA encoding vacuolar H+-PPase isoforms from rise (Or is a sativa) // Plant Mol. Biol. 1996. Vol. 31, №5. P. 1029-1038.

191. Sanders D., Brownlee C., and Harper J. F. Communicating with Calcium.// Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 691-706.

192. Sanders D.,. Leigh R.A and Tester M. Plant Ion Channels // Lankaster meeting. 1996. P. 62-80.

193. Sanders D., Pelloux J., Brownlee C., and Harper J. F. Calcium at the Crossroads of Signalin // Plant Cell. 2002. Vol. 123. P. 401-417.

194. Sanderfoot A.A., Kovaleva V., Zheng H., Raikhel N.V. The t-SNARE AtAM3p resides on the prevacuolar compartment in Arabidopsis root cells // Plant Physiol. 1999. Vol. 121. P. 929-938.

195. Santra M. K., Beuria Т.К., Banerjee A., and Panda D. Ruthenium Red-induced bundling of bacterial cell division protein, FtsZ // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 25959-25965.

196. Sarafian V., Kim J., Poole R.J., Rea P.A. Molecular cloning and sequens of cDNA-encoding the pyrophosphate-energized vacuolar memebrane proton pump of Arabidopsis thaliana II Proc. Nat. Acad. Sciens. 1998. Vol. 85, № 5. P. 17751779.

197. Sato M.H., Kasahara m., Ishii N., Homareda H., Matsui H., Yoshida M. Purified vacuolar inorganic pyrophosphatase consisting of a 75-kDa polypeptide can pump H+ into reconstituted proteoliposomes // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 67256728.

198. Schaller A., Oecking C. Modulation of plasma membrane H+-ATPasc activity differentially activaties wound and pahogen defense responses in tomoto plants // Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 263-272.

199. Schopfer P. Determination of auxin-dependent pH changes in coleoptile cell walls by null-point method//Plant Physiol. 1993. Vol. 103. P. 351-357.

200. Schraut D., Ullrich С. I. and Hartung W. Lateral ABA transport in maize roots (Zea mays): visualization byimmunolocalization // J.Exp. Botany. 2004. Vol. 55, №403. P. 1635-1641.

201. Schultz A., Baltscheffsky M. Inhibition studies on Rhodospirillum rubrum H+-pyrophosphatase expressed in Esherichia coli //BBA. 2004. Vol. 1656. P. 156165.

202. Schumaker K. S. and Sze H. Calcium Transport into the Vacuole of Oat Roots // J.Biol.Chem. 1986. Vol. 261, № 26. P. 12172-12178.

203. Scott D.A., deSouza W., Benchimol M., Zong L., Lu H.-G., Moreno S.N.J., Docampo R. Presence of plant-like proton-pumping pyrophosphatase in acidocalcisomes of Tryponasoma cruzi II J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, № 34. P. 22151-22158.

204. Shabala S. Regulation of potassium transport in leaves: from molecular to tissue level //Ann. Botany. 2003. Vol. 92. P. 627-634.

205. Shiratake K., Kanayama Y., Maeshima M., Yamaki S. Changes in H+-pumps and a tonoplast in trinsic protein of vacuolar membranes during the Development of pear fruit // Plant Cell Physiol. 1997. Vol. 39, № 9. P. 1039-1045.

206. Shigaki Т., Pittman J. К., and Hirschi K. D. Manganese Specificity Determinants in the Arabidopsis Metal/H+ Antiporter CAX2 // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, №8. P. 6610-6617.

207. Sivula Т., Salminen A., Parfenyev A.N., Pohajanjoki P., Goldman A. Cooperman B.C., Baykov A. Lahti R. Evolutionary aspects of inorganic pyrophosphatase // FEBS. 1999. Vol. 454. P. 75-80.

208. Smart L.B., Vojdani F., Maeshima M., Wilkins T.A. Genes involved in osmoregulation during turgor-driven cell expansion of developing cotton fibcs are differentially regulated // Plant Physiol. 1998. Vol. 116. P. 1539-1549.

209. Smith II.B. Vacuolar protein trafficking and vesicles: continuing to sort it all out //Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 1377-1379.

210. Smith I.K. Role of calcium in serine transport into tobacco cells // Plant Physiol. 1978. Vol. 62. P. 941-948.

211. Strompen G., Dettmer J., Stierhof Y.-D., Schumacher K., Jurgens G., and Mayer U. Arabidopsis vacuolar H+-ATPasc subunit E isoform 1 is required for Golgi organization and vacuole function in embryogenesis // Plant Journal. 2005. Vol. 41. P. 125-132.

212. Swanson S.J., Jones R.L. Gibberellic acid induces vacuolar acidification in barley aleurone//Plant Cell. 1996. Vol. 8. P. 2211-2221.

213. Sze H., Li X., Palmgren M.G. Energization of plant cell memebranes by H+-pumping ATPases: regulation and biosynthesis // Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 677-689.

214. Sze H., Ward J.M., Lai S., Perera I. Vacuolar-type ЬГ-translocating ATPases in plant endomembranes: subunit organization and multigene tamilies // J. Exp. Biol. 1992. Vol. 112, №4. P. 123-135.

215. Takasu A., Nacanishi Y., Yamauchi Т., Maeshima M. Analysis of the substrate binding site and carboxy terminal region of vcuolar IT'VPpase of mung-bean with peptide antibodies // J. Biochem. 1997. Vol. 112, № 4. P. 883-889.

216. Tanaka Y„ Chiba K., Macda M. Maeshima M. Molecular cloning of cDNA for vacuolar PPase in Hordeum vulgare II Bochem. Biophys. Res. Communs. 1993. Vol. 190, №3. P. 1110-1114.

217. TaizL. The plant vacuole//J. Exp. Biol. 1992. Vol. 172, № 11. P. 1130122.

218. Teale W.D. Papanov I.A., Ditengou F., Palme K. Auxin and the developing root of Arabidopsis thaliana // Phisiol. Plantarum. 2005. Vol. 123. P. 130-138.

219. Terrier N., Sauvage F.-X., Ageorges A., Romieu C. Changes in activity and in proton transport at the tonoplast of grape berriese during development // Planta. 2001. Vol. 213. P. 20-28.

220. Thomine S., Wang R., Ward J.M., Crawford N. M., and Schroeder J. I. Cadmium and iron transport by members of a plant metal transporter family in Arabidopsis with homology to Nrampgenes // PNAS. 2000. Vol. 97, № 9. P. 4991-4996.

221. Tombola F., Oregna F., Brutche S., Szabo I., Del Giudice G., Rappuoli R., Montecucco G., Papini E., Zoratti M. Inhibition of the vacuolating and anionchannel activities of the Vac A toxin of Helicobacter pylori //FEBS. 1999. Vol. 460. P. 221-225.

222. Tovar-Mendez A., Mujica-Jimenez C. and Munoz-Clares R. A. Physiological implications of the kinetics of maize leaf phosphoenolpyruvate Carboxylase//Plant Physiol. 2000. Vol. 123. P. 149-160.

223. Vera-Estrella R„ Barkla B. J. Garcia-Ramirez L., and Pantoja O. Salt stress in thellungiella halophila activates Na+ transport mechanisms required for salinity tolerance // Plant Physiol. 2005. Vol. 139. P. 1507-1517.

224. Vianello A., Macri F. Proton pumping pyrophpophatase from higher plant mitochodria//Physiol. Plantarum. 1999. Vol. 105. P. 763-768.

225. Wang В. Luttge U., Ratajczac R. Effects of salt treatment and osmotic stress on V-ATPase and V-PPase in leaves of the halophyte Suaeda salsa II J. Exp. Botany. 2001. Vol. 52, № 365. P. 2355-2365.

226. Ward J.M., Sze H. Proton transport activity of the purified vacuolar H+-ATPase from oats // Plant Physiol. 1992. Vol.99. P. 925-931.

227. Wilkens S., Inoue T. and Forgac M. Three-dimensional structure of the vacuolar ATPase // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 40. P. 41942^11949.

228. Wilkens S., Vasilyeva E., and Forgac M. Structure of the Vacuolar ATPase by Electron Microscopy // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274, № 45. P. 31804-31810.

229. Xia J.-H., Roberts J.K.M. Regulation of H+ extursion and cytoplasmic pG in maize root tips acclimated to a low-oxigen environment // Plant Physiol. 1996.Vol. 111. P. 227-233.

230. Yamaguchi Т., Aharon G. S„ Sottosanto J.B., and Blumwald E. Vacuolar Na+/H+ antiporter cation selectivity is regulated by calmodulin from within the vacuole inа Са2+ and pH-dependent manner // PNAS. 2005. Vol. 102, № 44. P. 1610716112.

231. Yamaguchi Т., Apse M. P., Shi H., and Blumwald E. Topological analysis of a plant vacuolar Na+/H+antiporter reveals a luminal С terminus that regulates antiporter cation selectivity // PNAS. 2003. Vol. 100. P. 2112510-12515.

232. Yamaguchi H., Nishizawa N.-K., Nakanishi H. and Mori S. ID17, a new iron-regulated ABC transporter from barely roots, lacalizes to the tonoplast // J. Exp. Botany. 2002. Vol. 53, № 369. P. 727-735.

233. Yan F., Feuerele R., Schffer S., Fortmeier H., Schubert S. Adaptation of active proton pumping and plasmalemma ATPase activity of corn roots to low root medium pH//Plant Physiol. 1998. Vol. 117. P. 311-319.

234. Zhen R.G., Kim E.A., Rea P.A. Localization of cytosolically oriented maleimide-reactive domian of vacuolar E^-PPase // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 1334213350.

235. Zhong X., Malhota R., Guidotti G. ATP uptake in the Golgi and zetracellular release require Med 4 protein and the vacuolar ff1"- ATPase // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, № 35. P. 33436-33444.

236. Zocchi G., RabottiG. Calcium transport in membrane vesicles isolated from mize coleoptiles // Plant Pysiol. 1993. Vol. 101. P. 135-139.

Информация о работе

Шахова, Наталия Витальевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.12

Диссертация

Биохимические свойства и функциональная роль протонных насосов вакуолярного типа в проростках кукурузы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы