Влияние оксида азота и ионов кальция на функционирование протонных помп тонопласта при изменении редокс-статуса в онтогенезе и при стрессе

Колесникова, Екатерина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние оксида азота и ионов кальция на функционирование протонных помп тонопласта при изменении редокс-статуса в онтогенезе и при стрессе
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние оксида азота и ионов кальция на функционирование протонных помп тонопласта при изменении редокс-статуса в онтогенезе и при стрессе"

Колесникова Екатерина Владимировна

ВЛИЯНИЕ ОКСИДА АЗОТА И ИОНОВ КАЛЬЦИЯ НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ПРОТОННЫХ ПОМП ТОНОПЛАСТА ПРИ ИЗМЕНЕНИИ РЕДОКС-СТАТУСА В ОНТОГЕНЕЗЕ И ПРИ СТРЕССЕ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

- 1 ДЕК 2011

Иркутск, 2011

005004528

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, г. Иркутск

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Озолина Наталья Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Глянько Анатолий Константинович

доктор биологических наук

Петров Клим Алексеевич

Ведущая организация:

Иркутский государственный университет, биолого-почвенный факультет

Защита диссертации состоится 22 декабря 2011г. в 14°° ч. на заседании диссертационного совета Д. 003.047.01 при Учреждении Российской академии наук Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 а/я 317. Факс (3952) 510754; e-mail: matmod@sifibr.ru

Автореферат размещен на сайте СИФИБР СО РАН по адресу www.sifibr.irk.ru С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН

Автореферат разослан «14» ноября 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

IfUJLtfff^ Г .П. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из приоритетных научных направлений в современной биологии является изучение регуляции механизмов мембранного транспорта. В настоящее время в этом направлении менее всего изучена вакуолярная мембрана (тонопласт). Основной вклад в активный транспорт на тонопласте вносят две протонные помпы: Н+-АТФаза и Н+-пирофосфатаза (Н+-ПФаза). Изучение регуляции протонных помп тонопласта вызывает особый интерес в связи с тем, что изменение их активности может определять интенсивность процессов транспорта и запасания метаболитов. В последние годы интенсивно изучаются адаптационные механизмы, используемые клеткой при стрессе, поэтому встал вопрос о роли в этих процессах протонных помп и о необходимости присутствия на вакуолярной мембране двух ферментов с близкими функциями. Имеющиеся на сегодня данные, полученные в экспериментах на мембранах в условиях температурного и солевого стрессов, противоречивы, и ответить на поставленные вопросы в полной мере не могут. Регуляция активности протонных помп тонопласта также изучена недостаточно, практически не исследовалось влияние сигнальных молекул на функционирование транспортных систем вакуолярной мембраны, в том числе оксида азота и ионов кальция - важных вторичных мессенджеров. Изучение влияния сигнальных молекул на протонные помпы тонопласта в норме и при осмотическом стрессе внесёт вклад в понимание механизмов адаптации при абиотическом стрессе и поможет оценить роль изменения редокс-статуса в этих процессах.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы состояла в изучении влияния сигнальных молекул на функционирование механизмов мембранного транспорта на тонопласте растений столовой свёклы (Beta vulgaris L.) при изменении редокс-статуса на разных фазах онтогенеза и при стрессовых воздействиях.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.

1. Оценить динамику изменения гидролитической и транспортной активностей протонных помп тонопласта при разных видах осмотического стресса.

2. Изучить влияние оксида азота и ионов кальция на период полураспада изолированных вакуолей, транспортную и гидролитическую активности протонных помп в онтогенезе и при разных видах осмотического стресса.

3. Оценить взаимодействие оксида азота и ионов кальция при регуляции активности протонных помп тонопласта в норме и при разных видах осмотического стресса.

4. Выявить на вакуолярной мембране и в вакуоли фермент (нитратредуктазу), участвующий в синтезе оксида азота, и исследовать динамику его активности при осмотическом стрессе.

5. Изучить изменения в соотношении окисленного и восстановленного глутатиона в корнеплодах столовой свёклы при осмотическом стрессе.

Научная новизна. Впервые показано, что Н+-АТФаза и Н+-ПФаза тонопласта по-разному реагируют на стрессовые воздействия, более существенные изменения активности отмечены для Н+-ПФазы. Изменение редокс-статуса клетки в разной степени влияет на активность вакуолярных протонных помп, что может объяснить необходимость присутствия на тонопласте двух ферментов, выполняющих близкие функции. Оксид азота и ионы кальция изменяют активность протонных помп тонопласта, что позволяет говорить о возможности участия ]\'0-синтазной и кальциевой сигнальных систем в регуляции активного транспорта на вакуолярной мембране. Во фракции изолированных вакуолей выявлена активность нитратредуктазы, которая может синтезировать оксид азота в примембранных слоях тонопласта. Влияние оксида азота на активность протонных помп тонопласта связано с поддержанием гомеостаза ионов кальция.

Теоретическая и практическая значимость работы. Отмечена возможность участия сигнальных систем в регуляции активности протонных помп тонопласта, что может быть связано не только с процессами накопления метаболитов, но и с работой других транспортных систем, играющих важную роль в механизмах адаптации. Обоснована необходимость присутствия двух протонных помп на вакуолярной мембране, что особенно важно при изменении редокс-статуса клетки. Данные диссертационной работы могут быть использованы при чтении курсов лекций по физиологии и биохимии растений в вузах на кафедрах соответствующего профиля. Изучение регуляции активности протонных помп тонопласта открывает перспективы разработки подходов к управлению процессами накопления в вакуоли ценных, с народнохозяйственной точки зрения, метаболитов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009); 13— международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2009); III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз - России 2010»

(Нижний Новгород, 2010); III международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011); VII Съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и международной научной школе «Инновация в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (Нижний Новгород, 2011); отчетных научных сессиях СИФИБР СО РАН (20082010 гг.).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка используемой литературы. Список используемой литературы включает 222 работы, из них 66 отечественных и 156 работ зарубежных авторов. Работа изложена на 131 странице, содержит 32 рисунка и 1 таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили корнеплоды столовой свёклы {Beta vulgaris L.) сорт Бордо. Изолирование вакуолей и вакуолярных мембран проводили по методу (Саляев и др., 1981).

Барьерные свойства мембран оценивали с помощью оригинальной экспериментальной установки цейтрафферной компьютерной видеосъемки (ЦКВ) (Нурминский и др., 2004).

Транспортную функцию ферментов оценивали по изменению рН везикул тонопласта методом флуоресцентных зондов. Эксперименты проводили на спектрофлуориметре RF-5301 PC, Shimadzu (Германия). В качестве зонда использовали акридиновый оранжевый в концентрации 5 мкМ. Все эксперименты проводили с добавлением ингибиторов, специфически подавляющих активность вакуолярных протонных помп. Для Н+-АТФазы использовали бафиломицин А| (20 нМ) и нитрат калия (KN03 50 мМ), а для Н+-ПФазы - ионы фтора (KF 50 мМ).

Гидролитическую активность ферментов определяли по количеству выделившегося при гидролизе субстрата ортофосфата (Ф„). Измерения проводили на спектрофотометре Specord S-100 (Германия). Концентрации белка определяли методом Бредфорд (Bradford, 1976).

Изучение активности нитратредуктазы проводили методом, который основан на количественном определении нитритов, образовавшихся при восстановлении нитратов под действием нитратредуктазы в присутствии восстановленного НАДН2 (Клименко и др., 2006).

Содержание глутатиона в растительных образцах определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Zechmann, Muller, 2010). Подготовку растительного экстракта выполняли по методике Relian-Alvares, модифицировав для нашего объекта (Relian-Alvares et al., 2006). Пробоподготовку проводили методом твердофазной экстракции (ТФЭ). Для концентрирования пробы использовали картридж С 18 (Sep-Pak). Очищенные пробы анализировали на хроматографе Shimadzu LC - 10АТ VP (колонка -kromasil 100-5С18, 25 см><4,6 мм)

Биологическая повторность всех экспериментов была 5-7 кратная. Полученные данные обработаны статистически: рассчитаны средние арифметические значения и их стандартные отклонения (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Для определения гидролитической активности протонных помп тонопласта использовали фракцию изолированных вакуолей столовой свёклы (рис. 1). Из этой фракции получали везикулы тонопласта для изучения транспортной активности Н+-АТФазы и Н+-ПФазы.

В работе использовали два вида осмотического стресса:

гиперосмотический и гипоосмотический. По данным ряда исследователей именно при этих видах стресса отмечены разнонаправленные изменения в состоянии мембранных липидов, которые могут влиять на активность протонных помп (Лось, 2007). Стрессу подвергались корнеплоды, находящиеся на стадии покоя.

Используемое в экспериментах стрессовое воздействие основано на создании существенных сдвигов осмотической концентрации клеточного сока. Так, у корнеплодов, не подвергнутых воздействию стрессора, осмотическая концентрация клеточного сока составляла 645 ± 35 мОсм кг"1 Н20, в условиях гиперосмотического стресса она возрастала до 749.4 ± 42.3 мОсм кг"1 Н20, а при гипоосмотическом стрессе снижалась до 568.3 ± 7.6 мОсм кг"1 Н20 (Нурминский и др., 2011).

Чтобы выявить влияние гипер- и гипоосмотического стресса на работу протонных помп тонопласта столовой свёклы было проведено изучение динамики транспортной и гидролитической активности АТФаз и Н+-ПФазы.

100 мкм

Рис. 1. Фракция изолированные вакуолей столовой свёклы.

Эта активность принималась за 100 %, и использовалась в качестве контроля в дальнейшей работе.

Выявленная

гидролитическая активность

пирофосфат-зависимой

протонной помпы была

выше активности АТФаз как

на разных фазах онтогенеза,

так и в условиях стресса

(рис. 2). Все исследуемые

ферменты снижали свою „ „ ^

Рис. 2. Гидролитическая активность АТФаз и активность при переходе от и+

г Н -ПФазы на разных фазах онтогенеза и при

периода роста к периоду г„пеР-и гипоосмотичееком стрессе.

покоя.

В ответ на стрессовое воздействие происходило изменение активности фосфогидролаз тонопласта. В условиях гипер- и гипоосмотического стресса наибольший вклад в активность вносила Н+-ПФаза. Однако при сравнении динамики гидролитической активности Н+-ПФазы и АТФаз было выявлено, что при переходе от гиперосмотического стресса к гипоосмотическому активность АТФаз увеличивалась в 1,5 раза, в то время как у Н+-ПФазы наблюдалось снижение уровня активности.

Относительно высокая активность Н+-ПФазы как в периоды роста, покоя, так и при осмотических стрессах, по-видимому, связана с более важной ролью пирофосфатазы на вакуолярной мембране, чем транспорта, осуществляемого за счет АТФаз.

Транспортная активность протонных помп представлена АТФ- и пирофосфат-индуцированным изменением флуоресценции акридинового оранжевого в везикулах тонопласта (рис. 3). Используемый для контроля протонофор (СССР) полностью предотвращал тушение флуоресценции.

□ АТФазы

□ ПФаза

£ ©

3,5 1

3 I

2,5 ' 2

1,5 1

1 '

0,5 ;

о 4-

гЗ-

г£п

гЬ

НИ пМ

рост покой гиперосм. гипоосм, (норма) стресс стресс

Рис. 3. АТФ-зависимый (А) и пирофосфат-зависимый (Б) транспорт Н+ в везикулы тонопласта (Т) без специфических ингибиторов (1), в присутствии 50 мМ К1Ч03 (2), 20 нМ бафиломицина А, (3), 50 мМ КГ (4). СССР использовали в конпентоапии 10 мкМ.

На рис. 4 представлена динамика изменения

транспортной активности протонных насосов

тонопласта в онтогенезе и при гипер- и

гипоосмотическом стрессах. Было обнаружено, что при переходе от периода роста к периоду покоя происходило заметное снижение уровня активности изучаемых

ферментов. Эту же закономерность отмечали при изучении

гидролитической активности исследуемых ферментов.

В условиях осмотического стресса активность Н+-АТФазы и Н+-ПФазы увеличивалась. Причем активность прирофосфат-зависимого транспорта была значительно выше нормы Такой характер изменения активности протонных помп позволяет говорить о более важной роли Н+-ПФазы при гипер - и гипоосмотических стрессах. Увеличение активности протонных помп при осмотическом стрессе может быть связано с изменением липидной составляющей мембраны, которая при этом виде стресса меняет свою "вязкость" (Лось, 2007).

5ТК30

0 к

| 25

У |20

1 ^ 15-

Н 1-§•¿10

ей \0 О- о-

ь о

□ АТФва

[41

рост

□ Шва

нЕн

покои (норш)

гиперосм. стркк

гипоосм страх

Рис. 4. Транспортная активность Н+-АТФазы и Н+-ПФазы тонопласта на разных фазах онтогенеза и при гипер- и гипоосмотическом стрессе.

Изучение влияния изменения редокс-состояния на гидролитическую и транспортную активность АТФаз проводили на стадии покоя в норме при гипер- и гипоосмотическом стрессах. Сдвиг редокс-статуса проводили с помощью физиологической редокс-пары окисленного и восстановленного глутатиона. Известно, что в клетке глутатион выполняет антиоксидантные и регуляторные функции, которые зависят от концентрации и редокс-состояния глутатионового пула (Октябрьский, Смирнова, 2007; Колупаев и др., 2011).

Было установлено, что в нормальных условиях гидролитическая активность АТФ-зависимых транспортёров в присутствии восстановленного и окисленного глутатиона значительно увеличивалась (в 2,4 и 1,9 раз) (рис 5.).

о- 8 У В*

250 200 150 -100 50 ■

п.

□ ОБН

ВДЗО Г+1

ПОКОИ

(норма)

гипоосм. стресс

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

НН"

покои гиперосм. (норма) стресс

гипоосм. стресс

Рис. 5. Гидролитическая активность АТФаз (А) и транспортная активность Н+-АТФазы (Б) при изменении редокс-статуса в норме и при разных видах осмотического стресса. Концентрации ввН и С88С - 10 мМ

При гипоосмотическом стрессе в восстановленных условиях также наблюдалось стимулирование активности ферментов, однако при смещении редокс-статуса в более окисленную сторону происходило ингибирование. В условиях гиперосмотического стресса любое изменение редокс-статуса подавляло активность АТФаз. Ингибирование гидролитической активности АТФаз возможно связано со способностью СББО образовывать —Б-Б— связи с остатками цистеина на субъединицах А и Е (ТауакоП е1: а1., 2001).

Транспортная активность Н+-АТФазы при изменении редокс-статуса, в норме и при гиперосмотических условиях, снижалась. Только при гипоосмотическом стрессе происходило выраженное стимулирование активности Н+-АТФазы в присутствии редокс-агентов.

Изучение влияния изменения редокс-статуса на активность Н+-ПФазы показало, что во всех вариантах опыта происходило существенное ингибирование гидролитической и транспортной активностей фермента (рис. 6). Исключение составляет вариант с транспортной активностью в условиях

гиперосмотического стресса в присутствии окисленного глутатиона. Наблюдаемое снижение активности пирофосфатазы можно объяснить глутатионированием отдельных тиольных групп, что может приводить к изменению активности фермента.

Рис. 6. Гидролитическая (А) и транспортная (Б) активность Н+-ПФазы при изменении редокс-статуса в норме и при разных видах осмотического

Анализировали влияние оксид азота (N0) на активность протонных помп тонопласта при изменении редокс-статуса. N0 обладает множеством функций и принимает участие в регулировании внутриклеточных и межклеточных процессов в растительных, животных и бактериальных клетках (N6111 е1 а1., 2003; ВезБоп-Вага ег а1„ 2008).

Чтобы доказать влияние оксида азота на активность протонных помп тонопласта использовали гемоглобин (0,1 у//\), которой связывал свободный оксид азота.

Было отмечено, что оксид азота вызывал слабое стимулирование гидролитической активности АТФаз на стадии покоя корнеплодов (рис. 7А).

В период роста влияние оксида азота также практически не было выявлено. В условиях осмотического стресса наблюдалось ингибирование гидролиза АТФ. Однако при изменении редокс-статуса в более восстановленные значения с одновременным внесением N0 происходило резкое увеличение гидролитической активности АТФаз как в покое, так и при гиперосмотическом стрессе. Следует учесть, что восстановленный глутатион на стадии покоя сам по себе вызывал увеличение активности (рис. 5А), поэтому в каждом конкретном случае мы не можем говорить о прямом влиянии оксида азота.

При гиперосмотическом стрессе стимуляция

гидролитической активности АТФаз после добавления восстановленного глутатиона связана, по-видимому, с добавлением оксида азота, так как сам по себе восстановленный глутатион при этом виде стресса вызывал снижение активности фермента. При гипоосмотическом стрессе происходило

ингибирование активности

ферментов.

В опытах с окисленным глутатионом активность АТФаз подавлялась во всех вариантах, кроме того, на стадии покоя добавление N0 снимало стимулирующее влияние ОББС, выявленное в проведённых ранее экспериментах (рис. 5А).

Исследование влияния оксида азота на транспортную активность Н+-АТФазы показало отсутствие влияния как на стадии покоя, так и при осмотических стрессах (рис. 7Б). При смене редокс-условий наблюдалось ингибирование

транспорта протонов через вакуолярную мембрану в большинстве вариантов. Однако подавление активности на стадии покоя и при гиперосмотическом стрессе обусловлено не действием N0, а влиянием тиолов, которые сами по себе вызывали такую реакцию (рис. 5Б). При гипоосмотическом стрессе отмеченное ранее стимулирующее влияние С8Н и вЗБв в присутствии N0 снижалось, причем в окисленных условиях, вплоть до ингибирования работы фермента.

Исследование другого протонного насоса вакуолярной мембраны - Н+-ПФазы - показало иной характер реагирования на действие оксида азота с совместным использованием редокс-агентов (рис. 8).

покой (норма) гиперосм. стресс гипоосм. стресс

П5№ аБОТ+СБН с^Р-КЖО

пН4]

йй х:

покой (норма) гиперосм стресс гипоосм. стресс

Рис. 7. Влияние оксида азота на гидролитическую активность АТФаз (А) и транспортную активность Н+-АТФазы (Б) тонопласта в норме, при разных видах осмотического стресса и при изменении редокс-статуса. В качестве источника N0 использовали 8№ в концентрации 100 мкМ.

□ SNP BSNP+GSH ESNP+CSSG

покой (норма) гиперосм. стресс гипоосм. стресс

6 s

0 ь

1 о

покои (норма) гиперосм. стресс гипоосм. стресс

Рис. 8. Влияние оксида азота на гидролитическую (А) и транспортную (Б) активность Н+-ПФазы тонопласта в норме, при разных видах осмотического стресса и при изменении редокс-статуса.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что оксид азота вызывает стимулирование гидролитической активности Н+-ПФазы в норме и усиливает ингибирующий эффект, особенно в восстановленных условиях при разных видах осмотического стресса.

Транспортная активность Н'-ПФазы в присутствии монооксида азота как в норме в период покоя, так и при изменении осмотических условий не имела существенных отличий от контроля. Только в период роста было отмечено достаточно сильное стимулирующее влияние. Изменение редокс-состояния в любую сторону с совместным внесением оксида азота вызывало ингибирование активности фермента, такая же реакция была выявлена и без внесения N0, поэтому нельзя говорить о влиянии этого соединения. Исключение составляет уровень активности Н+-ПФазы в окисленных условиях при гипоосмотическом стрессе. В данном случае оксид азота снимал ингибирующее влияние окисленного глутатиона и увеличивал активность на 27% по сравнению с контролем.

Сравнивая чувствительность протонных помп вакуолярной мембраны, можно отметить, что в присутствии одного оксида азота достоверное увеличение гидролитической и транспортной активностей происходит только у Нт-ПФазы. При изменении редокс-условий в присутствии NO отмечена стимуляция транспортной активности Н+-ПФазы в окисленных условиях и гидролитической активности АТФаз в восстановленных условиях.

Поскольку эксперименты по влиянию оксида азота в процессах регуляции протонных помп тонопласта проводились in vitro с экзогенным источником N0, нельзя говорить о его влиянии in vivo.

гиперосм.стресс гипоосм.стресс

Рис. 9. Активность нитратредуктазы в покое (норма) и при гипер- и гипоосмотическом стрессе.

Чтобы проверить возможность влияния эндогенного монооксида азота на активность протонных помп тонопласта, была предпринята попытка выявить фермент нитратредуктазу в исследуемой фракции вакуолей. Нитратредуктаза

является одним из потенциальных источников формирования оксида азота в растительной клетке (ЫеШ й а!., 2008; Трифонова и др., 2010) и использует нитрат в качестве субстрата.

В результате проведенных исследований впервые установили наличие нитратредуктазной

активности во фракции вакуолей. Кроме того, и во фракции везикул тонопласта также была отмечена активность нитрат-зависимого фермента.

Полученные данные приведены на рис. 9. Активность нитратредуктазы присутствует во фракции вакуолей покоящихся корнеплодов и во фракции вакуолей, выделенных из корнеплодов, подвергнутых разным видам осмотического стресса, причем при гипоосмотическом стрессе наблюдалось снижение уровня активности фермента.

Известно, что увеличение содержания ионов кальция в клетке приводит к возникновению ответных реакций, направленных на защиту от воздействия какого-либо вида стрессора (Тарчевский, 2002; Медведев, 2005).

Проводили изучение влияния ионов кальция на активность протонных помп тонопласта при изменении редокс-статуса и при разных видах

Рис. 10. Транспортная активность Н+-АТФазы при изменении содержания ионов кальция в норме, при осмотических стрессах и при изменении редокс-статуса.

Концентрация ЭГТА 2 мМ.

осмотического стресса (рис. 10). В экспериментах использовали ЭГТА как хелатор (поглотитель) ионов кальция, которые, как мы предполагаем,

содержались в примембранных слоях и могли принимать участие в регуляции работы протонных помп.

Удаление ионов кальция в нормальных условиях приводило к небольшому увеличению транспортной активности Н+-АТФазы, которое исчезало при гипоосмотическом стрессе (рис. 10). В гиперосмотических условиях было отмечено ингибирование транспорта протонов. Изменение редокс-статуса в большинстве случаев приводило к снижению активности этого фермента.

В нестрессированных условиях связывание ионов кальция увеличивало уровень гидролитической активности Н+-ПФазы по сравнению с транспортной. Изменение редокс-условий приводило к ингибированию обоих видов активности.

Связывание ионов кальция в примембранных слоях также, как и при изучении активности АТФаз, оказывало стимулирующее влияние на гидролитическую активность Н+-ПФазы у нестрессированных корнеплодов (рис.11). Но у НГ-ПФазы увеличение уровня активности происходило и при

180 150 120 90 60 30 0

ОЭГТА ПЭГТА+ОЗН °ЭГТА-НЭБЗО

гЬ

Г-Ь

покой (норма) гиперосм, стрессгипоосм. стресс

120 100 80 60 40 20 0

ОЭГТА НЭГТА+ОБН ИЭГТА-КЖО

гЬ

покой (норма) гиперосм. стрессгипоосм. стресс

Рис. 11. Гидролитическая (А) и транспортная (Б) активность Н+-ПФазы при изменении содержания ионов кальция в норме и при разных видах осмотического стресса и при изменении редокс-статуса.

разных видах осмотического стресса, что не было отмечено для АТФаз. Изменение редокс-статуса у Н+-ПФазы приводило к резкому снижению гидролитической активности. Это может быть в большей степени связано не с влиянием ЭТТА, а с воздействием глутатиона, который сам по себе способен ингибировать гидролитическую активность (рис. 6А).

При изменении концентрации ионов кальция транспортная активность Н -ПФазы практически не менялась. При гипер- и гипоосмотическом стрессах также происходило снижение активности пирофосфат-зависимого фермента, связанное с влиянием изменения редокс-условий. Изменение содержания ионов

кальция в этих экспериментах существенного влияния на регуляцию активности Н -ПФазы не оказывало.

Установлено, что в растениях вероятными медиаторами N0 сигналов являются ионы Са2+, а также протеинкиназы, включая МАРК и 8пЯК2 (Вевзоп-Ваг<1 й а1., 2007). Нами проводилось изучение совместного влияния оксида азота и изменения содержания ионов кальция на гидролитическую и транспортную активность протонных помп тонопласта в норме и при разных видах осмотического стресса.

В нормальных условиях совместное воздействие оксида азота и хелатора ионов кальция на гидролитическую активность АТФаз приводило к существенному ингибированию гидролиза субстрата (рис. 12). Это говорит о необходимости присутствия в примембранных слоях определённых концентраций ионов кальция для успешного выполнения оксидом азота своих функций. При действии стрессоров, только в условиях гипоосмотического стресса было отмечено увеличение уровня активности АТФаз при одновременном использовании ЭГТА и оксида азота.

ТА ПвМР+ЭГТА

покои гнперосм. гипоосм (норма) стресс стресс

140 120 100 80 60 40 20

□ 5ЫР НЭГТА авЫР+ЭГТА

Г*| &

покои гнперосм гипоосм. (норма) стресс стресс

Рис. 12. Влияние взаимодействия оксида азота и ионов Са2+ на гидролитическую активность АТФаз (А) и транспортную активность Н+-АТФазы (Б) на разных фазах онтогенеза и в стрессированных условиях.

Транспортная активность Н+-АТФазы во всех вариантах опыта с внесением N0 не имела достоверных отличий по сравнению с контролем. Однако при совместном применении ЭГТА и оксида азота при гипоосмотическом стрессе было отмечено стимулирование активности фермента.

Исследование гидролитической активности Н+-ПФазы показало, что совместное использование оксида азота и хелатора ионов кальция, меняющего кальциевый гомеостаз, приводило к исчезновению стимулирующего влияния N0 в нормальных условиях (рис. 13). При гиперосмотическом стрессе

обнаружили, что связывание ионов кальция совместно с добавлением оксида азота оказывает стимулирующее влияние на Н+-ПФазу. Однако такой же результат наблюдался и при применении одного ЭГТА. При гипоосмотическом стрессе оксид азота ингибировал гидролитическую активность Н+-ПФазы.

гидролитическую (А) и транспортную (Б) активность Н+-ПФазы на разных фазах онтогенеза и в стрессированных условиях.

Существенного влияния сигнальных молекул на транспортную активность Н+-ПФазы в период покоя не наблюдалось. Только при гиперосмотическом стрессе ингибирование акд-ивности, вызванное добавлением оксида азота, усиливалось в ответ на связывание ионов кальция.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что оксид азота и ионы кальция участвуют в регуляции транспортных процессов на тонопласте, причем регулирующее влияние оксида азота связано с поддержанием гомеостаза ионов кальция.

Анализировалось влияние осмотического стресса на стабильность мембран по результатам периода полураспада изолированных вакуолей. Было отмечено, что при гиперосмотических условиях происходило значительное снижение стабильности мембран вакуолей. Возможно, такие изменения связаны со структурными нарушениями, возникающими в условиях дефицита влаги. В условиях гипоосмотического стресса существенных сдвигов в стабильности мембран не наблюдалось.

Проводилось изучение используемых в работе редокс-агентов (вБИ, СБЭО) и оксида азота на стабильность вакуолярных мембран в норме и при осмотических стрессах, поскольку свойства и состояние мембраны зависят от редоск-статуса клетки, который меняется при действии стрессора (8га1а1 е1 а1., 2009).

По результатам проведённого эксперимента в нормальных условиях было выявлено увеличение стабильности мембран вакуолей при добавлении 08Н в

концентрации 1 мМ (рис. 14). Полученный эффект может быть связан со способностью глутатиона стабилизировать мембранные структуры (Октябрьский, Смирнова, 2007). Использование окисленной формы тиола в той же концентрации приводило к сокращению периода полураспада изолированных вакуолей. Оксид азота не оказывал заметного воздействия на барьерные свойства вакуолярной мембраны.

В условиях гипоосмотического стресса при добавлении обеих форм глутатиона и N0 в концентрации 1 мМ происходило снижение стабильности мембран. В условиях гиперосмотического стресса наблюдалось увеличение устойчивости вакуолярных мембран к окисленному глутатиону и к N0. Восстановленный глутатион не влиял на стабильность мембран. Изменение стабильности вакуолярных мембран в экспериментах с редокс-агентами может быть связано со сложными физиолого-биохимическими процессами,

Рис. 14. Период полураспада изолированных вакуолей при воздействии редокс-агентов в норме и при гипо- и гиперосмотическом стрессе.

Отношение восстановленный/окисленный глутатион внутри клетки является одним из важнейших параметров, который характеризует состояние стресса и запускает синтез сигнальных молекул.

Чтобы оценить изменения в соотношении пула глутатиона в корнеплодах столовой свёклы, было проведено количественное определение этого тиола при разных видах стрессового воздействия (табл. 1).

Таблица 1. Содержание восстановленного и окисленного глутатиона в корнеплодах столовой свёклы, мкг/г сыр. веса.

Вариант GSH GSSG GSH/GSSG

Норма 257±39 12.9±2.1 19.9

Гиперосмотический стресс 222±3.8 185±48 1.2

Гипоосмотический стресс 381.2±55 536.5±67.6 0.71

протекающими в вакуоли.

Было отмечено, что соотношение восстановленного глутатиона к окисленному меняется при переходе от нормальных условий роста к гипер- и гипоосмотическому стрессу. Происходит значительное снижение соотношения глутатиона в корнеплодах столовой свёклы, причём самый низкий показатель отмечен при гипоосмотическом стрессе.

ВЫВОДЫ

1. Протонные помпы тонопласта при разных видах осмотического стресса могут участвовать в адаптационных процессах, происходящих в клетке, причем более существенный вклад вносит Н+-ПФаза.

2. Протонные помпы по-разному реагируют на изменение редокс-статуса, особенно эти отличия заметны при разных видах осмотического стресса. Проведённые эксперименты обосновывают необходимость присутствия на тонопласте двух протонных помп, выполняющих одинаковые функции.

3. Оксид азота и уменьшение содержания ионов кальция в примембранных слоях оказывают, главным образом, стимулирующее влияние на активность протонных помп тонопласта. Изменение редокс-статуса в условиях осмотического стресса приводит к ингибированию активности протонных помп тонопласта. Эти результаты позволяют говорить о возможности участия КО-синтазной и кальциевой сигнальных систем в регуляции активного транспорта на вакуолярной мембране.

4. Во фракции изолированных вакуолей выявлена активность нитратредуктазы, которая может быть источником оксида азота в растительной клетке.

5. Регуляторное влияние оксида азота на активность протонных помп тонопласта связано с поддержанием гомеостаза ионов кальция.

6. Стабильность изолированных мембран меняется при разных видах осмотического стресса, причем при гипоосмотическом стрессе этот процесс существенно зависит от редокс-условий.

7. Наиболее значимые изменения в активности протонных помп происходят при гипоосмотическом стрессе, что может быть связано с разницей в соотношении восстановленного и окисленного глутатиона.

Работа выполнена при поддержке Гранта РФФИ 09-04-00396-а.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Озолина Н.В., Колесникова Е.В., Нестёркина И.С., Нурминский В.Н., Бояркин Е.В., Ситнева Л.А., Саляев Р.К. Взаимодействие ЫО-синтазной и кальциевой сигнальных систем в регуляции гидролитической активности Н -

пирофосфатазы тонопласта в норме и при стрессе // Доклады академии наук. -2009. - Т. 428, №2. - С. 269-271.

2. Озолина Н.В., Колесникова Е.В., Нурминский В.Н., Нестёркина И.С., Дударева Л.В., Донская Л.И., Саляев Р.К. Влияние экзогенного донора N0 и изменение содержания ионов кальция на транспортную активность протонных насосов тонопласта в онтогенезе и при гиперосмотическом стрессе // Биологические мембраны. - 2010. - Т. 27, №4. - С. 354-358.

3. Озолина Н.В., Колесникова Е.В., Нурминский В.Н., Нестёркина И.С., Дударева Л.В., Третьякова A.B., Саляев Р.К. Редокс-зависимость транспортной активности протонных насосов тонопласта и её изменение под влиянием оксида азота в онтогенезе, при гипо- и гиперосмотическом стрессе // Биологические мембраны. - 2011. - Т. 28, №4. - С.1-6.

4. Нурминский В.Н., Озолина Н.В., Нестёркина И.С., Колесникова Е.В., Корзун А.М., Чернышов М.Ю., Тихонов Н.В., Тарков М.С., Саляев Р.К. Стабильность вакуолярных мембран растений при осмотическом стрессе и воздействии редокс-агентов // Биологические мембраны. - 2011. - Т. 28, №3. -С. 224-229.

5. Колесникова Е.В., Озолина Н.В., Нурминский В.Н., Саляев Р.К. Особенности регуляции протонных помп тонопласта в норме и при стрессе // Материалы Всероссийской научной конференции по проблемам устойчивости к неблагоприятным факторам внешней среды, Иркутск 2009, издательство РИО НЦРВХ СО РАМН, С. 231 -234.

6. Колесникова Е.В., Озолина Н.В., Нурминский В.Н., Нестёркина И.С., Дударева Л.В., Саляев Р.К. Влияние экзогенного донора N0 и изменения содержания ионов кальция на транспортную активность протонных помп тонопласта в онтогенезе и при гиперосмотическом стрессе // Тез. докл. III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010», Нижний Новгород 2010, С. 57-58.

7. Колесникова Е.В., Озолина Н.В., Саляев Р.К. Влияние оксида азота на транспортную активность протонных помп вакуолярной мембраны при изменении редокс-состояния в онтогенезе и при осмотическом стрессе // Тез. докл. III международного симпозиума «Клеточная сигнализация у растений», Казань 2011, С. 79-80.

8. Колесникова Е.В., Озолина Н.В., Саляев Р.К. Динамика транспортной и гидролитической активности протонных помп тонопласта при разных видах осмотического стресса // Тез. докл. VII Съезда общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий», Ч. 1. Нижний Новгород 2011, С. 351.

9. Озолина Н.В., Саляев Р.К., Колесникова Е.В., Нестёркина И.С. Посттрансляционная регуляция протонных помп тонопласта в норме и при абиотическом стрессе // Тез. докл. VII Съезда общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий», Ч. 2. Нижний Новгород 2011, С. 519-520.

10. Нурминский В.Н., Озолина Н.В., Нестёркина И.С., Колесникова Е.В., Корзун А.М., Саляев Р.К. Влияние редокс-агентов на стабильность тонопласта растений, подвергнутых осмотическому стрессу // Тез. докл. VII Съезда общества физиологов растений России «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий», Ч. 2. Нижний Новгород 2011, С. 514-515.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колесникова, Екатерина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Особенности строения вакуолярной мембраны.

1.2. Транспортные системы тонопласта.

1.2.1. Н^-АТФаза.

1.2.2. НГ-ПФаза.

1.2.3. Са2+-АТФаза.

1.2.4. АВС-транспортеры.

1.3. Механизмы регуляции мембранных транспортных систем.

1.4. Сигнальные системы растений.

1.4.1.1чГО-синтазная сигнальная система.

1.4.2. Кальциевая сигнальная система.

1.5. Реакция растительного организма на стрессовые воздействия.

1.6. Выводы из обзора литературы. Постановка целей и задач диссертационной работы.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Характеристика объекта исследования.

2.2. Выделение изолированных вакуолей и вакуолярных мембран.

2.3. Определение стабильности изолированных вакуолей.

2.4. Изучение транспортной активности протонных помп тонопласта.

2.5. Определение гидролитической активности фосфогидролаз тонопласта.

2.6. Определение количества белка.

2.7. Изучение активности нитратредуктазы.

2.8. Определение концентрации глутатиона.

2.9. Статистический анализ.

2.10. Использованные реактивы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Характеристика изолированных вакуолей и фракции изолированных мембран.

3.2. Характеристика гипер- и гипоосмотического стресса.

3.3. Изучение динамики гидролитической и транспортной активностей протонных помп тонопласта в онтогенезе и при осмотическом стрессе.

3.4. Изучение динимики изменения гидролитической и транспортной активностей протонных помп тонопласта при изменении редокс-статуса в норме и при осмотическом стрессе.

3.4.1. Н+-АТФаза тонопласта.

3.4.2. Н'-ПФаза тонопласта.

3.5. Изучение влияния оксида азота на гидролитическую и транспортную активности протонных помп тонопласта в норме, при осмотическом стрессе и при изменении редокс-статуса.

3.5.1. Н^-АТФаза тонопласта.

3.5.2. ТГ-ПФаза тонопласта.

3.6. Выявление на вакуолярной мембране и в вакуоли фермента, ответственного за синтез оксида азота (нитратредуктаза), и исследование динамики его активности в норме и при осмотическом стрессе.

3.7. Изучение влияния изменения содержания ионов кальция на гидролитическую и транспортную активности протонных помп тонопласта в норме, при осмотическом стрессе и при изменении редокс-статуса.

3.7.1 ЕГ-АТФаза тонопласта.

3.7.2. Н^-ПФаза тонопласта.

3.8. Изучение взаимодействия влияния оксида азота и ионов кальция на гидролитическую и транспортную активности протонных помп тонопласта в норме и при разных видах осмотического стресса.

3.8.1. Н^АТФаза тонопласта.

3.8.2. КГ-ПФаза тонопласта.

3.9. Изучение стабильности вакуолярных мембран при осмотическом стрессе, воздействии редокс-агентов и оксида азота.

3.10. Изучение динамики окисленного и восстановленного глутатиона в корнеплодах столовой свёклы при осмотическом стрессе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние оксида азота и ионов кальция на функционирование протонных помп тонопласта при изменении редокс-статуса в онтогенезе и при стрессе"

Воздействие стрессовых факторов (засуха, высокие концентрации солей, затопление и др.) оказывает неблагоприятное влияние на рост и развитие растений, что приводит к снижению продуктивности сельскохозяйственных культур (Хюп§ е1 а1., 2002). Одной из фундаментальных проблем современной биологии является выяснение механизмов, ответственных за поддержание ионного гомеостаза в клетках растений, как в нормальных условиях, так и при воздействии стресса. Действие этих механизмов во многом зависит от активности ион-транслоцирующих систем, локализованных в клеточных мембранах, в том числе и в эндомембранах внутриклеточных органелл.

В клетках растений в регуляции ионного состава очень важную роль играет вакуоль. Кроме этого вакуоль принимает участие в поддержании клеточного объёма, тургора, рН, удалении вторичных продуктов метаболизма и ксенобиотиков, участвует в передаче сигналов, в ответных защитных реакциях на воздействие стресса. Транспорт веществ через вакуолярную мембрану осуществляют различные транспортные системы, наиболее важными из них являются протонные помпы: НГ-аденозинтрифосфатаза (Н+-АТФаза) и пирофосфатаза (ТНГ-ПФаза), обеспечивающие поддержание ионного гомеостаза. Оба фермента выполняют функцию первично-активного транспорта протонов из цитоплазмы в вакуоль, создавая на тонопласте электрохимический потенциал, в дальнейшем используемый в процессе вторично-активного транспорта посредством ионных каналов, антипортеров и симпортеров.

Считается, что в растениях обе протонные помпы тонопласта имеют одинаковые физиологические функции, и в настоящее время до конца не выяснено, для чего на вакуолярной мембране необходимо присутствие двух протонных помп. В условиях стресса, таких как засоленность и засуха, выживание клеток растений зависит, главным образом, от активности АТФазы, что говорит о том, что она играет важную роль в процессе адаптации к стрессу е1 а1., 2001). Имеются также сведения, что и Н^-ПФаза является важным элементом в стратегии выживания растений при стрессе (Zhang et al., 2011). Механизмы регуляции активности этих ферментов пока еще изучены недостаточно. Влияние сигнальных молекул на функционирование основных транспортных систем вакуолярной мембраны практически не исследовалось.

В настоящей работе проведён сравнительный анализ активности протонных помп вакуолярной мембраны и способов её регуляции при разных видах осмотического стресса, а также изучены барьерные свойства исследуемой мембраны в присутствии редокс-агентов.

Актуальность работы определяется ограниченностью информации о механизмах регуляции протонных помп вакуолярной мембраны растений при действии стрессовых факторов. Результаты исследований помогут понять роль протонных помп в механизмах адаптации растительной клетки к стрессу.

Работа выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю работы доктору биологических наук Озолиной Наталье Владимировне за поддержку, всестороннюю помощь в работе и ценные земечания при написании рукуписи. Сердечная благодарность всем сотрудникам лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР СО РАН за помощь в работе, обсуждение результатов и доброжелательное отношение. Отдельная благодарность сотрудникам лаборатории физико-химических методов исследования за помощь в проведении экспериментов.

Список используемых сокращений

ABC-транспортеры - ATP-Binding Cassette

АТФ - аденозинтрифосфат

АФК - активные формы кислорода

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДЦКД - N, N-дициклогексил-карбодиимид

ЖК - жирные кислоты

Фн - ортофосфат неорганический

ФРТ - факторы регуляции транскрипции цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЭГТА - этилен гликоль-бис (2-аминоэтил)-Ы,Ы,Ы,Ы-тетрауксусная кислота

Са -АТФаза - Са -аденозинтрифосфатаза

СССР - карбонилцианид-3-хлорофенилгидразон

GSH - восстановленный глутатион

GSSG - окисленный глутатион

НАДН2 - |3-никотинамидадениндинуклеотид

FT-АТФаза - Н^-аденозинтрифосфатаза

НГ-ПФаза - Н^-пирофосфатаза

KSCN - роданид калия

NO - монооксид азота

NOS - NO-синтаза

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Колесникова, Екатерина Владимировна

5. ВЫВОДЫ

3. Оксид азота и уменьшение содержания ионов кальция в примембранных слоях оказывают, главным образом, стимулирующее влияние на активность протонных помп тонопласта. Изменение редокс-статуса в условиях осмотического стресса приводит к ингибированию активности протонных помп тонопласта. Эти результаты позволяют говорить о возможности участия ЫО-синтазной и кальциевой сигнальных систем в регуляции активного транспорта на вакуолярной мембране.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение регуляции основных компонентов активного транспорта на тонопласте представляет большой интерес. С народнохозяйственной точки зрения возможность направленной регуляции накопления в растительной клетке важных метаболитов, таких как сахара, аминокислоты и др. позволит решить ряд важных продовольственных проблем. Как происходят эти процессы в условиях стресса, которым постоянно подвергаются растения, начали изучать сравнительно недавно. Однако уже показана важная роль протонных помп тонопласта при засолении, высоких концентрациях тяжёлых металлов, при температурных стрессах (КаЬа1а, Тапюка-Яшзак, 2011). В данной работе была поставлена цель выяснить, как реагируют протонные помпы на осмотический стресс. Решение этой проблемы особенно интересно тем, что при разных видах осмотического стресса, согласно литературным данным, меняется состояние липидного бислоя, который может регулировать активность мембраносвязанных ферментов, в том числе и изучаемых нами протонных помп (Лось, 2007). Проведённые эксперименты показали, что в условиях осмотического стресса повышается и гидролитическая и транспортная активность Н^-АТФазы, причём более активно это происходит при гипоосмотическом стрессе. Наиболее существенные изменения в активности отмечены для другой протонной помпы - ЕГ-ПФазы, что позволяет нам сделать предположение о более важной роли в ответной реакции на осмотический стресс именно этого фермента. При изучении активности этого фермента было установлено разобщение его гидролитической и транспортной активности при гипоосмотическом стрессе. При сравнении двух видов осмотического стресса наиболее существенные изменения в активности обеих протонных помп были выявлены при гипоосмотическом стрессе.

Исследования по изменению редокс-статуса в экспериментах при разных видах осмотического стресса показали, что протонные помпы по-разному реагируют на изменение редокс-статуса, и особенно эти отличия заметны в зависимости от вида изучаемого стресса. Н+-ПФаза реагировала на любые изменения редокс-статуса снижением активности, особенно интенсивно при гипоосмотическом стрессе, тогда как активность рГ-АТФазы в присутствии восстановленного глутатиона стимулировалась, но только в условиях гипоосмотического стресса. При гиперосмотическом стрессе изменение редокс-статуса приводило к ингибированию рГ-АТФазы, но менее существенному, чем у рГ-ПФазы. Полученные результаты могут быть связаны с разным соотношением восстановленного и окисленного глутатиона, которое было нами отмечено при разных видах осмотического стресса.

Основная часть исследований была посвящена изучению влияния на активность протонных помп тонопласта важных сигнальных молекул, принимающих активное участие в защите растительной клетки от стрессового воздействия. Результаты исследования показали, что N0 оказывал влияние на активность протонных помп тонопласта, и особенно существенно на рГ-ПФазу. Изменение редокс-статуса при добавлении оксида азота приводило к снижению активности протонных помп и исчезновению стимулирующего влияния этого соединения, что позволяет говорить о зависимости влияния этого соединения на активность протонных помп от состояния редокс-окружения. При осмотическом стрессе также отмечено влияние оксида азота на активность протонных помп тонопласта. Значительная часть изменений, которые оказывал оксид азота на работу изучаемых ферментов при осмотическом стрессе, были связаны с ингибированием их активности. Возможно, наблюдаемый эффект был связан с изменениями редокс-статуса, которые происходили при стрессах (таблица 1). Увеличение активности протонных помп в присутствии оксида азота было отмечено только при гипоосмотическом стрессе, причём транспортная активность рГ-ПФазы возрастала при сдвиге редокс-статуса в более окисленные условия, а в более восстановленных происходило ингибирование. У рГ-АТФазы, наоборот, в более восстановленных условиях активность фермента возрастала, а в более окисленных ингибировалась. Эти эксперименты объясняют необходимость присутствия на тонопласте двух протонных помп, выполняющих одинаковые функции.

Во всех иследованиях в качестве источника оксида азота был использован нитропруссид натрия. Может ли оксид азота осуществлять регуляторные процессы в живой клетке? Для ответа на этот вопрос были проведены эксперименты по выявлению на вакуолярной мембране активности фермента, способного синтезировать оксид азота. В работе впервые была выявлена активность нитратредуктазы во фракции изолированных вакуолей и на тонопласте. Этот фермент обеспечивает присутствие оксида азота, который может участвовать в регуляции протонных помп.

Кроме оксида азота, было изучено влияние на активность протонных помп тонопласта ещё одной важной сигнальной молекулы, которой являются ионы кальция. Использование хелатора кальциевых ионов - ЭГТА - позволило снизить содержание ионов кальция в примембранных слоях. В ряде экспериментов это оказало существенное влияние на активность протонных помп тонопласта. Так, в период покоя, добавление ЭГТА приводило к стимулированию гидролитической и транспортной активностей протонных помп. Для Н+-ПФазы это повышение активности сохранялось и при осмотическом стрессе. Любое изменение редокс-условий на фоне изменения содержания ионов кальция приводило к ингибированию гидролитической и транспортной активностей протонных помп. Таким образом можно сделать заключение о возможной регуляторной роли ионов кальция, причём уменьшение содержания ионов кальция более благоприятно сказывалось на активности протонных помп тонопласта, стимулируя их активность.

Были проведены исследования по совместному влиянию оксида азота и ЭГТА. Результаты экспериментов позволили установить, что влияние оксида азота зависит от содержания ионов кальция. Для сохранения стимулирующего воздействия оксида азота необходимо присутствие ионов кальция, поскольку их связывание ЭГТА снимало стимулирующее воздействие оксида азота.

Стрессовые условия могут оказывать влияние на стабильность изолированных вакуолей. Для оценки степени и характера этого влияния была проведена серия экспериментов, которая показала, что гиперосмотический стресс оказывал значительное воздействие на стабильность вакуолярной мембраны, по сравнению с гипоосмотическим стрессом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колесникова, Екатерина Владимировна, Иркутск

1. Александров В.Я. (1985) Реактивность клеток и белки. Л.: Наука, 317с.

2. Александров В.Я., Кислюк И.М. (1994) Реакция растений на тепловой шок: физиологический аспект. Цитология, 36, 5-59.

3. Андреев И.М. (2001) Функции вакуоли в клетках высших растений. Физиология растений, 48, 777-787.

4. Бекназаров Б.О., Валиханов М.Н. (2007) Свойства неорганической пирофосфатазы хлопчатника. Прикладная биохимия и микробиология, 43(2), 172-177.

5. Блехман Г.И., Шеламова H.A. (1992) Синтез и распад макромолекул в условиях стресса. Успехи, совр. биол., 112, 281-297.

6. Болдырев A.A., Кяйвяряйнен Е.И., Илюха В.А. (2006)

7. Биомембранология, Петрозаводск, 221 с.

8. Владимиров Ю.А. (1998) Кальциевые насосы живой клетки. Соровский образовательный журнал, Биология, 3(28), 20-27.

9. Гамбарова Н.Г (2011) Сопоставление особенностей действия высокой температуры и экзогенной перекиси водорода на активность антиоксидантной системы хлоропластов пшеницы. Вестник Московского государственного областного университета, Биология, 2 , 1-6.

10. Генкель П.А. (1982) Физиология жаро- и засухоустойчивости растений. М.: Наука, 278с.

11. Глянько А.К., Митанова Н.Б., Ищенко A.A., Васильева Г.Г., Макарова

12. Л.Е. (2007) Влияние параквата и оксида азота (NO) на симбиотическое взаимодействие клубеньковых бактерий с корнями проростков гороха. ВестникХНАУ, серия биологическая, 3(12), 57-62.

13. П.Глянько А.К., Митанова Н.Б., Степанов A.B. (2009) Физиологическая роль оксида азота (NO) у растительных организмов. Журнал стресс-физиологии и биохимии, 5(3), 33-52.

14. Гришко В.Н., Сыщиков Д.В. (2006) Глутатион: синтез, деградация и физиологическая роль у растений. Вестник ХНАУ. сер. Биологич., 1(8), 2133.

15. Дубовская JI.B., Колеснева Е.В., Князев Д.М., Волотовский И.Д. (2007) Защитная роль оксида азота при окислительном стрессе, индуцированном в растения табака пероксидом водорода. Физиология растений, 54(6), 847-855.

16. Жолкевич В.Н., Пустовойтова Т.Н. (1993) Роль листьев Cucumis sativum L. и содержания в них фитогормонов при почвенной засухе. Физиология растений, 40, 676-680.

17. Иванова А.Б., Полыгалова О.О., Гордон JI.X. (1997) Ионы кальция в регуляции некоторых метаболических процессов растительной клетки. Цитология, 39(4/5), 352-360.

18. Катков Б.Б. (1989) Антипорт сахарозы и Н+ через вакуолярную мембрану клеток корнеплода свеклы: Автореф. дисс. канд. биол. наук, Иркутск: СИФИБР СО РАН СССР, 26с.

19. Клименко С.Б., Пешкова A.A., Дорофеев Н.В. (2006) Активность нитратредуктазы у озимой пшеницы при тепловом шоке. Стресс-физиология и биохомия, 2(1), 50-56.

20. Колесниченко A.B., Побежимова Т.П., Войников В.К. (2000) Характеристика низкотемпературного стресса у растений. Физиология растений, 47, 624-630.

21. Колупаев Ю.Е. (2007) Кальций и стрессовые реакции растений. Харьковский национальный аграрный университет им. В. В. Докучаева, 1 (10), 24-41.

22. Колупаев Ю.Е., Карпец Ю.В. (2009) Активные формы кислорода при адаптации растений к стрессовым температурам. Физиология и биохимия культ, растений, 41(2), 95-108.

23. Колупаев Ю.Е., Карпец Ю.В., Обозный А.И. (2011) Антиоксидантная система растений: участие в клеточной сигнализации и адаптации к действию стрессоров. ВестникХНАУ, серия биологическая, 1(22), 6-34.

24. Конарев В.Г. (1998) Морфогенез и молекулярно-биологический анализ растений. С.-Петербург.: 370с.

25. Кузеванов В .Я., Катков Б.Б., Саляев Р.К. (1985) Общие принципы выделения вакуолей и вакуолярных мембран. Структура и функции биологических мембран растений. Новосибирск: Наука, 93-107.

26. Кулаева О.Н. (1994) Физиологическая роль абсцизовой кислоты. Физиология растений, 41, 645-646.

27. Лакин Г.Ф. (1990) Биометрия. М.: Высшая школа, 352с.

28. Макаренко С.П., Коненкина Т.А., Саляев Р.К. (1992) Химический состав и структура липидов вакуолярных мембран. Биологические мембраны, 9(3), 290-300.

29. Макаренко С.П., Саляев Р.К. (1998) Структура вакуолярных мембран растений по данным РЖ-спектроскопии. Биологические мембраны, 15(3), 309-321.

30. Макаренко С.П., Коненкина Т.А., Саляев Р.К. (1999) Жирнокислотный состав липидов вакуолей высших растений. Физиология растений, 46, 643647.

31. Макаренко С.П., Коненкина Т.А., Дударева JI.B. (2007а) Жирные кислоты липидов вакуолей корнеплодов растений. Биологические мембраны, 24, 363-369.

32. Макаренко С.П., Коненкина Т.А., Хотимченко C.B. (20076) Жирнокислотный состав липидов вакуолярных мембран корнеплодов. Физиология растений, 54, 223-228.

33. Медведев С.С. (2005) Кальциевая сигнальная система растений. Физиология растений, 52(2), 282-305.

34. Медведев С.С. (2010) Клеточная сигнализация. Казань, 26-36.

35. Мелехов Е.И. (1985) Принцип регуляции скорости процесса повреждения клетки и реакция защитного торможения метаболизма (РЗТМ). Журнал общей биол., 46, 174-189.

36. Новикова Г.В., Мошков И.Е., Лось Д.А. (2007) Белковые сенсоры и передатчики холодового и осмотического стрессов у цианобактерий и растений. Молекулярная биология, 41, 478-490.

37. Нурминский В.Н., Корзун A.M., Розинов C.B., Саляев Р.К. (2004) Компьютерная цейтраферная видеосъёмка фракции изолированных вакуолей. Биомедицинская химия, 50(1), 180-187.

38. Обручева Н.В., Синькевич И.А. (2010) Аквапорины и рост клеток. Физиология растений, 57(2), 163-176.

39. Озолина Н.В. (2004) Протонные помпы тонопласта, их функциональная активность и связь с транспортом и накоплением метаболитов. Дисс. докт. биол. наук, Иркутск, 309с.

40. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Сапега Ю.Г. Саляев Р.К. (2005) Влияние глутатиона на гидролитичсекую активность Б^-пирофосфатазы вакуолярной мембраны растений. Биологические мембраны, 22(5), 427-428.

41. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. (2007) Редокс-регуляция клеточных функций. Биохимия, 72(2), 158-174.

42. Павловская О.С., Ильина О.В., Путилина Т.В., Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Саляев Р.К. (2008) АТФазы тонопласта в онтогенезе. Доклады академии наук, 418(3), 1-3.

43. Палладина Т.А. (1999) Роль протонных насосов плазмалеммы и тонопласта в устойчивости растений к солевому стрессу. Успехи современной биологии, 119, 451-461.

44. Палладина Т.А., Симчук Е.Е. (1990) Влияние стеринов на активность Н4"-АТФазы плазматических мембран клеток корней кукурузы. Докл. АН СССР, 314(4), 1018-1020.

45. Пахомова И.М., Чернов И.А. (1996) Некоторые особенности индуктивной фазы неспецифического адаптационного синдрома растений. Известия РАН сер. биол, 6, 705-715.

46. Пестов Н.Б., Дмитриев Р.И., Шахиаронов М.И. (2003) Регуляция Са2+-АТФазы плазматической мембраны. Успехи биологической химии, 43, 99138.

47. Пятыгин С.С. (2008) Стресс у растений: физиологический подход. Журнал Общей биологии, 69(4), 294-298.

48. Ракитина Т.Я., Власов П.В., Жалилова Ф.Х., Кефели В.И. (1994) Абсцизовая кислота и этилен в мутантах Arabidopsis thaliana, различающихся по устойчивости к ультрафиолетовой (УФ-Б) радиации. Физиология растений, 41, 682-686.

49. Рахманкулова З.Ф., Усманов И.Ю. (2000) Морфофизиологические параметры проростков пшеницы устойчивых и высокопродуктивных сортов в норме и при стрессе. Физиология растений, 47, 608-613.

50. Саляев Р.К., Кузеванов В.Я., Хаптагаев С.Б., Копытчук В.Н. (1981) Выделение и очистка вакуолей и вакуолярных мембран из клеток растений. Физиология растений, 28, 1295-1306.

51. Саляев Р.К., Кузеванов В.Я., Озолина Н.В., Каменкова Л.Д., Пузанова H.A. (1982) Содержание липидов, белков и углеводов в мембране изолированных вакуолей красной свеклы. Физиология растений, 29, 933939.

52. Саляев Р.К., Хаптагаев С.Б., Кузеванов В.Я., Копытчук В.Н. (1983) Об ультраструктуре изолированных вакуолярных мембран. Цитология, 25(6), 643-649.

53. Саляев Р.К., Озолина Н.В., Прадедова Е.В. (1999) Влияние экзогенных фитогормонов и кинетина на гидролитическую активность протонных помп тонопласта в онтогенезе столовой свёклы. Физиология растений, 46(1), 5-8.

54. Сычев К.С., Даванков В.А. (2004) Материалы и методы пробоподготовки в хроматографии: твердофазное концентрирование и адсорбционная очистка. Сорбционные и хроматографические процессы, 4(1), 5-26.

55. Тарчевский И.А. (2002) Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука, 294с.

56. Трапезников В.К., Иванов И.И., Тальвинская Н.Г. (1999) Локальное питание растений. Уфа: Гилем, 260с.

57. Тимофеева O.A., Невмержицкая Ю.Ю., Московкина М.А. (2010) Активность и состав лектинов клеточной стенки пшеницы при действии низких температур и ингибиторов кальциевой сигнальной системы. Физиология растений, 57(2), 209-216.

58. Трифонова Т.В., Максютова H.H., Викторова Л.В., Галеева Е.И., Яфарова Г.Г., Минибаева Ф.В. (2010) Регуляция активности нитратредуктазы и ее вовлечение в образование оксида азота в листьях пшеницы. Доклады академии наук, 435(6), 846-849.

59. Ткачук В.А. (2001) Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций. Соровский образовательный журнал, Биология.

60. Чура М., Ребайи А. (2005) Идентификация и характеристика новых членов семейства вакуолярной КҐ-пирофосфатазьі из генома Oryza sativa. Физиология растений, 52(6), 926-930.

61. Удовенко Г.В. (1979) Механизмы адаптации растений к стрессам. Физиол. биохимия культ, растений, 11, 99-107.

62. Шахова Н.В. (2009) Биохимические свойства и функциональная роль протонных насосов вакуолярного типа в проростках кукурузы: Автореф. дисс. канд. биол. наук, Санкт-Петербург: С-ПбГУ, 18с.

63. Шакирова Ф.М. (1999) Участие фитогормонов и лектина пшеницы в ответе растений на стрессовое воздействие: Автореф. дисс. д-ра. биол. наук, Санкт-Петербург: С-ПбГУ, 44с.

64. Шакирова Ф.М. (2001) Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и её регуляция. Уфа: Гилем, 160с.

65. Askerlund P., Evans D.E. (1992) Reconstitution and characterization of a calmodulinstimulated Ca-pumping ATPase purified from Brassica oleracea L. Plant Physiol, 100, 1670-81.

66. Baltscheffsky M., Schultz A., Baltscheffsky H. (1999) H^-PPases: a tightly membranebound family. FEBS Lett. 457, 527-33.

67. Beloguroy G.A., Lahti R. (2002) A lysine substitute for K+. A460K mutation eliminates K+ dependence in H^-pyrophosphatase of Carboxydothermus hydrogenoformans. J. Biol. Chem., 277(51), 49651-4.

68. Bergmann B.O.R., Laxalt A.M., Riet B., Schooten B., Merquiol E., TesterinkC., Haring M.A., Bartels D., Munnik T. (2009) Multiple PLDs required for high salinity and water deficit tolerance in plants. Plant Cell Physiology, 50(1), 78-89.

69. Besson-Bard A., Courtoris C., Gauthier A., Dahan J., Dobrowolska G., Jeandroz S., Pugin A., Wendehenne D. (2007) Nitric oxide in plants:Iproduction and cross-talk with Ca signaling. Mol. Plant. 1(2), 218-228.

70. Besson-Bard A., Pugin A., Wendehenne D. (2008) New insights into nitric oxide signaling in plants. Annu. Rev. Plant Biol., 59, 21-39.

71. Beyenbach K.W., Wieczorek H. (2006) The V-type FT ATPase: molecular structure and function, physiological roles and regulation. Journal of experimental biology, 209, 577-589.

72. Bleecker A.B. (1999) Ethylene perception and signaling: an evolutionary perspective. Trends Plant Sci., 4(7), 269-274.

73. Bonza MC, Luoni L. (2010) Plant and animal type 2B Ca2+-ATPases: evidence for a common auto-inhibitory mechanism. FEBS Lett., 584(23), 4783-8.

74. Boursiac Y., Harper J. F. (2007) The origin and function of calmodulin regulated Ca pumps in plants. Bioenerg Biomembr., 39, 409-414.

75. Bowman E. J., Siebers A., Altendorf K. (1988) Bafilomycins: A class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Biochemistry. 85, 7972-7976.

76. Bredford D.P. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilising the principl of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248-254.

77. Brini F., Gaxiola R.A., Berkowitz G.A., Masmoudi K. (2005) Cloning and characterization of a wheat vacuolar cation/proton antiporter and pyrofosphatase proton pump. Plant Physiol Biohem., 43(4), 347-354.

78. Carter C., Pan S., Zouhar J., Avila E.L., Girke T., Raikhel N.V. (2004) The vegetative vacuole proteome of Arabidopsis thaliana reveals predicted and unexpected proteins. Plant Cell, 16 (12), 3285-3303.

79. Chanson A. (1993) Active transport of proton and calcium in higher plant cell. Plant Physiol. Biochem, 31(6), 943-955.

80. Churchill K., Sze H. (1983) Anion-sensitive, -pumping ATPase in membrane vacuoles vesicles from oat roots. Plant Physiol.,71(3), 610-617.

81. Cipriano D.J., Wang Y., Bond S., Hinton A., Jefferies K. C., Qi J., Forgas M. (2008) Structure and regulation of the vacuolar ATPases. Biochim Biophys Acta., 1777(7-8), 599-604.

82. Cooley M.B., Yang H., Dahal P., Mella R.A., Downie A.B., Haigh A.M., Bradford K.J. (1999) Vacuolar H*-ATPase is expressed in response to gibberellin during tomato seed germination. Plant Physiology, 121, 1339-1348.

83. Corpas F.J., Barroso J.B. (2006) Constitutive arginine-dependent nitric oxide synthase activity in different organs of pea seedlings during plant development. Planta, 224, 246-254.

84. Courtous C., Besson A., Dahan J., Bourque S., Dobrowolska G., Pugin A., Wendehenne D. (2008) Nitric oxide signaling in plants: interplays with Ca and protein kinases. J Exp Bot., 59(2), 155-163.

85. D'Auzas J. (1975) Characterization d une ATPase membrane en presence d une phosphatase acid dans les lutoides latex d Hevea brasiliensis. Phytochemistry, 14(7), 671-675.

86. Dawson R.J.P., Höllenstein K., Locher K.P. (2007) Uptake or extrusion: crystal structures of full ABC transporters suggest a common mechanism. Molecular Microbiology, 65(2), 250-257.

87. De Nisi P., Dell'Orto M., Pirovano L., Zocchi G. (1999) Calcium-dependent phosphorylation regulates the plasma-membrane H+-ATPase activity of maize (Zea mays L.) roots. Planta, 209,187-194.

88. Dietz K.J., Heber U., Mimura T. (1998) Modulation of the vacuolar ff-ATPase by adenylates as basis for the transient C02-dependent acidification of the leaf vacuole upon illumination. Biochimica et Biophysica Acta., 1373, 87-92.

89. Domgall I., Venzke D., Luttge U., Ratajczak R., Böttcher B. (2002) Tree-dimensional map of plant V-ATPase based on electron microscopy. J Biol Chem., 277(15), 13115-13121.

90. Dordas C., Rivoal J., Hill R.D. (2003) Plant haemoglobins, nitric oxide and hypoxis stress. Ann. Bot., 91(2), 173-178.

91. Drozdowicz Y.M., Rea P.A. (2001) Vacuolar proton pyrophosphatases: from the evolutionary backwaters into the mainstream. Trends Plant Sei., 6, 206-211.

92. Dschida W., Bowman B. (1995) The vacuolar ATPase: sulfite stabilization and the mechanism of nitrate inactivation. J. Biol. Chem, 270, 1557-1563.

93. Feng Y., Forgas M. (1994) Inhibition of vacuolar H^ATPase by disulfide bond formation between cysteine 254 and cysteine 532 in subunit A. Jornal of Biological Chemistry, 259, 13224-13230.

94. Ferrol N., Bennet A.B. (1996) A single gene may encode differentially localized Ca2+-ATPases in tomato. Plant Cell, 8(7), 1159-1169.

95. Forgas M. (1999) The vacuolar H+-ATPase of clathrin-coated vesicles is reversibly inhibited by S-nitrosoglutathione. Biol Chem., 274, 1301-1305.

96. Forgas M. (2000) Structure, mechanism and regulation of the clatrin-coated vesicle and yeast vacuolar H^-ATPases. J. Exp. Bot., 203, 71-80.

97. Forgas M. (2007) Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Mol Cell Biol, 8, 917-929.

98. Gao F., Gao Q., Duan X., Yue G., Yang A., Zhang J. (2006) Cloning of an ET-PPasegene from Thellungiella halophila and its heterologous expression to improve tobacco salt tolerance. J Exp Bot., 57, 3259-3270.

99. Gaxiola R.A., Li J.S., Undurraga S., Dang L.M., Allen G.J., Alper S.L., Fink G.R. (2001) Drought- and salt-tolerant plants result from overexpression of the AVP1 H^pump. Proc Natl Acad Sci., 98, 11444-11449.

100. Gomez L.D., Noctor G., Knight M.R., Foyer C.H. (2004) Regulation of calcium signalling and gene expression by glutathione. Journal of Experimental Botany, 55(404), 1851-1859.

101. Guo F.Q., Okamoto M., Crawford N.M. (2003) Identification of a plant nitric oxide synthase gene involved in hormonal signaliny. Science, 302, 100-103.

102. Han N., Shao Q., Lu C.M., Wang B.S. (2005) The leaf tonoplast V-H+-ATPase activity of a C3 halophyte Suaeda salsa is enhanced by salt stress in a Ca2+- dependent mode. Plant Physiol., 162(3), 267-274.

103. Higgins C.F. (1992) ABC transporters: from microorganisms to man. Annu. Rev. Cell Biol., 8, 67-113.

104. Huss M., Wieczorek H. (2009) Inhibitors of V-ATPases: old and new players. J.of Exp. Biology, 212, 341-346.

105. Inoue T., Forgac M. (2005) Cysteine-mediated cross-linking indicates that subunit C of the V-ATPase is in close proximity to subunits E and G of the Vj domain and subunit a of the V0 domain. J. of Biological Chemistry, 280(30), 27896-27903.

106. Ishida H., Vogel H.J. (2010) The solution structure of a plant calmodulin and the CaM-binding domain of the vacuolar calcium-ATPase BCA1 reveals a new binding and activation mechanism. J Biol Chem., 285(49), 38502-10.

107. Jasinski M., Ducos E., Martinoia E., Boutry M. (2003) The ATP-binding cassette transporters: structure, function, and gene family comparison between rice and Arabidopsis. Plant Physiol., 131(3), 1169-77.

108. Jefferies K.C., Cipriano D.J., Forgac M. (2008) Function, structure and regulation of the vacuolar (H+)-ATPases. Arch Biochem Biophys., 476(1), 33-42.

109. Jefferies K.C., Forgac M. (2008) Subunit H of the V-ATPase Inhibits ATP Hydrolysis by the Free VI Domain by Interaction with the Rotary Subunit F. J Biol Chem., 283(8), 4512-4519.

110. Jones P.M. (2004) The ABC transporter structure and mechanism: perspectives on recent research. P.M. Jones, A.M. George.Cell. Mol. Life Sci., 61, 682-699.

111. Kabala K., Klobus G. (2008) Modification of vacuolar proton pumps in cucumber roots under salt stress. J Plant Physiol., 165(17), 1830-7.

112. Kabala K., Janioka-Russak M. (2011) Differential regulation of vacuolar H(+)-ATPase and H(+)-PPase in Cucumis sativus roots by zinc and nickel. Plant Sci., 180(3), 531-9.

113. Kader M.A., Lindberg S. (2010) Cytosolic calcium and pH signaling in plants under salinity stress. Plant signaling Behavior, 5(3), 233-238.

114. Kane P.M. (2006) The where, when, and how of organelle acidification by the yeast vacuolar H^-ATPase. Microbiol. Mol. Biol., 70, 177-191.

115. Kasama K., Yamaguchi M., Nakamura Y. (2000) Mechanism of the chilling- induced degrease in proton pumping across the tonoplast of the rice cell. Plant Cell Physiology, 41, 840-849.

116. Kaur N., Gupta A.K. (2005) Sugar signalling and gene expression in relation to carbohydrate metabolism under abiotic stresses in plants. JBiosci., 30(5), 76176.

117. Kawamura Y., Arakawa K., Maeshima M., Yoshida S. (2000) Tissue specificity of E subunit isoforms of plant vacuolar H+-ATPase and existence of isotype enzymes. J. Biol. Chem., 275, 6515-6522.

118. Kawamura Y., Arakawa K., Maeshima M., Yoshida S. (2001) ATP analogue binding to the A subunit induces conformation changes in the E subunit that involves a disulfide bond format in plant V-ATPase. Eur.J.Biochem., 268(10), 2801-2809.

119. Kramer R., Kopp F., Niedermeyer W., Fuhrmann G. (1978) Comparative studies of the structure and composition of the plasmalemma and the tonoplast in Saccharamyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta., 507(3), 369-380.

120. Lee C.H., Pan Y.J., Huang Y.T., Liu T.H., Hsu S.H., Lee C.H., Chen Y.W., Lin S.M., Huang L.K., Pan R.L. (2011) Identification of essential lysines involved in substrate binding of vacuolar ^-pyrophosphatase. J. Biol Chem., 286(14), 11970-11986.

121. Lee S.M., Kim H.S., Han H.J., Moon B.C., Kim C.Y., Harper J.F., Chung W.S. (2007) Identification of a calmodulin-regulated autoinhibited Ca2+-ATPase (ACA11) that is localized to vacuole membranes in Arabidopsis. FEBS Lett., 581(21), 3943-3949

122. Leitner M., Vandelle E., Gaupels F., Bellin D., Delledonne M. (2009) NO signals in the haze: nitric oxide signalling in plant defence. Curr Opin Plant Biol., 12(4):451-8.

123. Lin W., Wagner G.L., Siegelman H.W., Hing G. (1977) Membrane-bound ATPase of intact vacuoles and tonoplasts isolated from mature plant tissue. Biochem. Biophys. Acta., 465(1), 110-117.

124. Locher K.P. (2009) Sructure and mechanism of ATP-binding cassette transporters. Phil. Trans. R. Soc. B, 364, 239-245.

125. Lopez-Perez L., Martinez-Ballesta M. C., Maurel C., Carvajal M. (2009) Chenges in plasma membrane lipids, aquaporins and proton pump of broccoli roots, as an adaptation mechanism to salinity. Phytochemistry, 70 (4), 492-500.

126. Maeshima M. (2000) Vacuolar ^-pyrophosphatase. Biochim. Biophys. Acta, 1465,37-51.

127. Maeshima M. (2001) Tonoplast transporters: organization and function. Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 52, 469-497.

128. Manolson M.F., Wu B., Proteau D., Taillon B.E., Roberts B.T., Hoyt M.A., Jones E.W. (1994) STV1 gene encodes functional homologue of 95-kDa yeast vacuolar if-ATPase subunit Vph 1 p. J. Biol. Chem., 269, 14064-14074.

129. Martinoia E., Klein M., Geisler M., Bovet L., Forestier C., Kolukisaoglu U., Muller-Rober B., Schulz B. (2002) Multifimctionality of plant ABC transporters more than just detoxifiers. Planta, 214, 345-355.

130. Martinoia E., Maeshima M., Neuhaus H.E. (2007) Vacuolar transporters and their essential role in plant metabolism. Journal of Experimental Botany, 58(1), 83-102.

131. Meng X., Xu Z., Song R. (2011) Molecular cloning and characterization of a vacuolar ^-pyrophosphatase from Dunaliella viridis. Mol Biol Rep, 38, 33753382.

132. Meikel D., Michael B., Bettina B. (2008) Structural organization of the V-ATPase and its implications for regulatory assembly and disassembly. Biochem Soc Trans, 36, 1027-1031.

133. Merzendorfer H., Graf R., Huss M., R.Hapvey W., Wieczorek H. (1997) Regulation of proton-translocating V-ATPases. The Journal of Experimental Biology, 200, 225-235.

134. Moore D., Mollenhauer H. (1976) Interactions among cytoplasm, endomembranse and the surface. In. Encyclopedia of plant physiology. New series. Berlin-Heidelberg-New York: Springer-Verlag, 3, 288-344.

135. Muntz K. (2007) Protein dynamics and proteolysis in plant vacuoles. Experimental Botany, 58(10), 2391-2407.

136. Neil S., Desikan R., Hancock J.T. (2003) Nitric oxide signaling in plants. New Phytol., 159(1), 11-35.

137. Neill S., Barros R., Brightl J., Desikan R., Hancock J., Harrison J., Morris P., Ribeiro D., Wilson I. (2008) Nitric oxide, stomatal closure, and abiotic stress. Journal of Experimental Botany, 59(2), 165-176.

138. Palmgren M., Sommarin M. (1989) Lysophosphatidylcholine stimulates ATP dependent proton accumulation in isolated Oat root plasma membrane vesicles. Plant Physiol., 90, 1009-1014.

139. Pan Y.J, Lee C.H., Hsu S.H., Huang Y.T., Lee C.H., Liu T.H., Chen Y.W., Lin S.M., Pan R.L. (2011) The transmembrane domain 6 of vacuolar H*-pyrophosphatase mediates protein targeting and proton transport. Biochim Biophys, 1807(1), 59-67.

140. Pittman J.K., Hirshi K.D. (2003) Don't shoot the (second) messendger: endomembrane transporters and binding proteins modulate cytosolic Ca levels. Curr. Opin. Plant Biol., 6, 257-262.

141. Planchet E., Kaiser W. M. (2006) Nitric oxide production in plant. Plant Signaling ¿¿Behavior, 1(2), 46-51.

142. Pottosin I.I., Schonknecht G. (2007) Vacuolar calcium channels. Journal of Experimental Botany, 58(7), 1559-1569.

143. Puopolo K., Sczekan M., Magner R., Forgas M. (1992) The 40 kDa subnit enhances but is not required for activity of the coated vesicle proton pump. J. Biol. Chem., 267,5171-5176.

144. Qi J., Forgac M. (2007) Celluar environment is important in controlling V-ATPase dissociation and its dependence on activity. J. Biol. Chem., 282(34), 24743-24751.

145. Qi J., Wang Y., Forgac M. (2007) The vacuolar (H+)-ATPase: subunit arrangement and in vivo regulation. Bioenerg Biomembr., 39, 423-426.

146. Queiros F., Fontes N., Silva P., Almeida D., Maeshima M., Geros H., Fidalgo F. (2009) Activity of tonoplast proton pumps and Na+/H+ exchangein potato cell cultures is modulated by salt. .JExp Bot,. 60(4), 1363-1374.

147. Ratajczaka R. (2000) Structure, function and regulation of the plant vacuolar H+-translocating ATPase. Biochim. Biophys. Acta., 1465, 17-36.

148. Raven J.A., Smith F.A. (1979) Intracellular pH and its regulation. Plant Physiol., 30(3), 289-311.

149. Rea P.A. (1999) MRP Subfamily ABC transporters frome plants and yeast. J. Exp. Bot., 50, 895-913.

150. Rea P.A. (2007) Plant ATP-binding cassette transporters. Plant Biology, 58, 347-375.

151. Rea P., Kim Y., Sarafian V., Poole R., Davies J., Sanders D. (1992) Vacuolar H^-translocating pyrophosphatase: a new category of ion translocase. TIBS, 17, 348-352.

152. Rea P.A., Poole R.J. (1993) Vacuolar H+-translocating pyrophosphatase. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol, 44, 157-80.

153. Rea P.A., Sanders D. (1987) Tonoplast energization: two HI pumps, one membranq. Physiol Plant, 71, 131-141.

154. Rees D.C., Johnson E., Lewinson O. (2009) ABC transporters:The power to change. Mol Cell Biol, 10(3), 218-227.

155. Reisen D., Marty F., Leborgne-Castel N. (2005) New insights into the tonoplast architecture of plant vacuoles and dynamics during osmotic stress. BMC Plant Biol., 5, 1-3.

156. Reuveni M., Bennett A.B., Bressan R.A., Hasegawa P.M. (1990) Enhanced ^-transport capacity and ATP hydrolysis activity of he tonoplast H^-ATPase after NaCl adaptation. Plant Physiology, 94. 54-530.

157. Rockel P., Strube F., Rockel A., Wildt J., Kaiser W.M. (2002) Regulation of nitric oxide (NO) production by plant nitrate reductase in vivo and in vitro. Journal of Experimental Botany, 53(366), 103-110.

158. Rouhier N., Lemaire S.D., Jacquot J.-P. (2008) The role of glutathione in photosynthetic organisms: emerging functions for glutaredoxins and glutethionylation. Plant Biol., 59, 143-166.

159. Salyaev R.K. (1984) Plant vacuole membrane: structure and properties. Biochemistry and function of vacuolar Adenosine-Triphosphatase in fungi and plants. B. Marin.-Berlin Heidelberg New York Tokyo:Springer-Verlag. 259 p.

160. Sarafian V., Kim Y., Poole R.J., Rea P.A. (1992) Molecular cloning and sequence of cDNA encoding the pyrophosphate energized vacuolar membrane proton pump of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 1775-79.

161. Saroussi S., Nelson N. (2009) The little we know on the structure and machinery ofV-ATPase. J. Exp. Bot., 212(11), 1604-10.

162. Schnitzer D., Seidel T., Sander T., Golldack D., Dietz K.-J. (2011) The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H^-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiol, 52(5), 946-56.

163. Segami S., Nakanishi Y., Sato M.N., Maeshima M. (2010) Quantification, organ-specific accumulation and intracellular localization of type II H(+)-pyrophosphatase in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol., 51, 1350-60.

164. Shi Q.H., Zhu Z.J., Khalid A.A., Liu H.Y., Yu L.Q. (2004) Effects of iso-osmotic salt stress on the activities of antioxidative enzymes, H+-ATPase and H*-PPase in tomato plants. Zhi Wu Sheng Li Yu Fen Zi Sheng Wu Xue Xue Bao, 30(3), 311-6.

165. Shi Q., Ding F., Wang X., Wei M. (2007) Exogenous nitric oxide protect cucumber roots against oxidative stress induced by salt stress. Plant Physiol. Biochem. 45, 542-550.

166. Shiratake K., Kanayama Y., Maeshima M., Yamaki S. (1997) Changes in H+-pumps and a tonoplast intrinsic protein of vacuolar membranes during the development of pear fruit. Plant Cell Physiol.; 38, 1039-45.

167. Shotton D. (1978) Freezeetch studies of membrane proteins: a review. Biochem. Soc. Trend, 6, 38-40.

168. Silva P., Geros H. (2009) Regulation by salt of vacuolar if-ATPase and H*-pyrophosphatase activities and Na+/H+ exchange. Plant Signaling & Behavior, 4(8), 718-726.

169. Song C.J., Steinebrunner I., Wang X., Stout S.C., Roux S.J. (2006) Extracellular ATP induces the accumulation of superoxide via NADPH oxidases in Arabidopsis. Plant Physiol., 140, 1222-1232.

170. Stevens T., Forgas M. (1997) Structure, function and regulation of the vacuolar H+-ATPase. Cell Dev. Biol., 13, 779-808.

171. Stohr C., Stremlau S. (2006) Formation and possible roles of nitric oxide in plant roots. Experimental Botany., 57(3), 463-470.

172. Szalai G., Kellos T., Galiba G., Kocsy G. (2009) Glutathione as an Antioxidant and Regulatory Molecule in Plants Under Abiotic Stress Conditions. J. Plant Growth Regul., 28, 66-80.

173. Sze H., Liang F., Hwang I., Curran A.C., Harper J.F. (2000) Diversity and regulation of plant Ca2+ pumps: insights from expression in yeast. Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol., 51, 433-62.

174. Takasu A., Nakanishi Y., Yamauchi T., Maeshima M. (1997) Analysis of the substrate binding site and carboxyl terminal region of vacuolar H*-pyrophosphatase of Mung bean with peptide antibodies. J Biochem, 122, 883889.

175. Tanaka Y., Chiba K., Maeda M., Maeshima M. (1993) Molecular cloning of cDNA for vacuolar membrane proton-translocating inorganic pyrophosphatase in Hordeum vulgare. Biochem Biophys Res Commun, 190, 1110-1114.

176. Tausz M., Sircelj H., Grill D. (2004) The glutathione system as a stress marker in plant ecophysiology: is a stress-response concept valid? Experimental Botany., 55(404), 1955-1962.

177. Tavakoli N., Kluge C., Golldack D., Mimura T., Dietz K.J. (2001) Reversible redox control of plant vacuolar H+-ATPase activity related to disulfide bridge formation in subunit E as well as subunit A. Plant J., 28(1), 28-51.

178. Toei M., Saum R., Forgac M. (2010) Regulation and isoform function of the V-ATPases. Biochemistry., 49, 4715-4723.

179. Tuteja N., Sopory S.K. (2008) Chemical signaling under abiotic stress environment in plants. Plant Signaling Behavior, 3(8), 525-536.

180. Tzeng C.M., Yang C.Y., Yang S.J., Jiang S.S., Kuo S.Y., Hung S.S., Ma J.T., Pan R.L. (1996) Subunit structure of vacuolar proton pyrophosphatase as determined by radiation inactivation. Biochem J., 316, 143-147.

181. Wang L., He X., Zhao Y., Shen Y., Huang Z. (2011) Wheat vacuolar H+-ATPase subunit B cloning and its involvement in salt tolerance. Planta, 234(1), 17.

182. Wagner G. (1981) Enzymes and protein character of tonoplast from Hippeastrum vacuoles. Plant Physiol., 68(2), 499-503.

183. Wagner G., Lin W. (1982) An active proton pump of intact vacuole isolated from Tulip petals. Biochem. Biophys. Acta., 689(2), 261-266.

184. Wagner G., Milready P. (1983) Characterization and solubilization of1.^ inucleotide-specific, Mg -ATPase and Mg -pyrophosphatase of tonoplast. Biochem. Biophys. Acta.,728(2), 267-280.

185. Walker J.E., Saraste M., Runswick M.J., Gray N.J. (1982) Distantly related sequneces in the a- and b-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other

186. ATP-requiring enzymes and acommnnycleotide binding fold. EMBOL J., 1, 945951.

187. White P.J. (1994) Bafilomycin A! is a non-competitive inhibitor of the tonoplast H^-ATPase of maize coleoptiles. Experimental Botany., 45(279), 13971402.

188. White P. J., Broadley M.R. (2003) Calcium in plants. Annals of Botany, 92, 487-511.

189. Xie X., Crider B., Stone D. (1993) Isolation of a protein activator of the clatrin-coated vesicle proton pump. J. Biol.Chem., 268, 25063-25067.

190. Xiong L., Schumaker K.S., Zhu J.-K. (2002) Cell signaling during cold, drought, and salt stress. Plant Cell, 14, 165-183.

191. Yamanishi H., Kasamo K. (1993) Modulation of activity of purified tonoplast H^ATPase from mung bean (Vigna radiate L.) hypocotyls by various lipids. Plant Cell Physiology, 34, 411-419.

192. Yamaguchi M., Kasamo K. (2001) Modulation of activity of purified tonoplast H^ATPase by tonoplast glycolipids prepared from cultured rice (Oryza sativa L. var. Boro) cells. Plant Cell Physiol., 42, 516-523.

193. Yamamoto A., Katou S., Yoshioka H., Doke N., Kawakita K. (2003) Nitrate reductase, a nitric oxide-producing enzyme: induction by pathogen signals. J Gen Plant Pathol, 69, 218-229.

194. Yamniuk A.P., Vogel H.J. (2004) Structurally homologous binding of plant calmodulin isoforms to the calmodulin-binding domain of vacuolar calcium-ATPase. J. Biol. Chem., 279(9), 7698-7707.

195. Yoshida S., Uemura M. (1982) Lipid composition of plasma membrans and tonoplast isolated from etiolated seedlings of Mung Bean. Plant Physiol., 807

196. Youmans S., Barry C. (2001) Bafilomycin A1 at nanomolar concentrations saturably inhibit portion of turtle bladder acidification current. J. Exp. Biol., 16, 2911-2919.

197. Zechmann B, Zellnig G, Muller M. (2006). Immunocytochemical localization of glutathione precursors in plant cells. J. Electron Microsc., 55, 173—

198. Zechmann B., Muller M. (2010) Subcellular compartmentation of glutathione in dicotyledonous plants. Protoplasma, 246, 15-24

199. Zhang J., Myers M., Forgas M. (1992) Characterization of the V0 domain of the coated vesicle (H^-ATPase. J. Biol. Chem., 267, 9773-9778.

200. Zhang J., Li J., Wang X., Chen J. (2011) OVP1, a vacuolar H^-translocating inorganic pyrophosphatase (V-PPase), overexpression improved rice cold tolerance. Plant Physiol Biochem., 49(1), 33-8.

201. Zhen R.G., Kim E.J., Rea P.A. (1997) The molecular and biochemical basis of pyrophosphate-energized proton translocation at the vacuolar membrane. Adv.Bot. Res, 25, 297-337.

202. Zingarelli L., Anzani P., Lado P. (1994) Enhanced K+-stimulated pyrophosphatase activity in NaCI-adapted cells of Acer pseudoplatanus. Physiol. Plantarum., 91, 510-516.812.81.

Информация о работе

Колесникова, Екатерина Владимировна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2011
ВАК 03.01.05

Диссертация

Влияние оксида азота и ионов кальция на функционирование протонных помп тонопласта при изменении редокс-статуса в онтогенезе и при стрессе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы