Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протонные помпы тонопласта, их функциональная активность и связь с транспортом и накоплением метаболитов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Протонные помпы тонопласта, их функциональная активность и связь с транспортом и накоплением метаболитов"

На правах рукописи

Озолина Наталья Владимировна

ПРОТОННЫЕ ПОМПЫ ТОНОПЛАСТА, ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ И СВЯЗЬ С ТРАНСПОРТОМ И НАКОПЛЕНИЕМ МЕТАБОЛИТОВ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Иркутск, 2005

Работа выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск

Научный консультант: член-корреспондент РАН

Р.К.Саляев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Глянько А.К.

доктор биологических наук, профессор Илли И.Э.

доктор биологических наук, профессор Родченко О.П. Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургский государственный университет

Защита состоится «21» апреля 2005 г в 10 ч на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, Иркутск, а/я 1243, ул. Лермонтова, 132 Факс (3952) 51-07-54; E-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН

Автореферат разослан « 1 » марта 2005 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Q^WJje/.^ Г.П.Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение механизмов мембранного транспорта представляют особый интерес с точки зрения возможности направленного воздействия на накопление метаболитов, однако менее всего в настоящее время эти механизмы изучены применительно к специфичной для растений вакуолярной мембране. На сегодня известно, что вакуолярная мембрана содержит ряд специализированных систем пассивного и активного переноса веществ: каналы, переносчики, протонные помпы. Основной вклад в системы активного транспорта на тонопласте вносят две протонные помпы: ЬГ-АТФаза (ЕС 3.6.1.34) и Н*-пирофосфатаза (ЕС 3.6.1.1.)(Rea, Sanders, 1987). Оба фермента способны преобразовывать освобождённую при гидролизе АТФ и неорганического пирофосфата энергию в перенос протонов через тонопласт. Генерируемая разность электрохимического потенциала расходуется на вторичный транспорт ионов, Сахаров, аминокислот, который осуществляется через каналы и переносчики. Таким образом, Н+-АТФаза и Ь^-пирофосфтаза являются ключевыми ферментами в системе переноса углеводов и других соединений в антипорте с протоном (Briskin et al., 1985; Саляев, Катков, 1988).

Основным метаболитом, запасаемым в растении, является сахароза. Процессы синтеза и транспортировки сахарозы по растению в настоящее время изучаются. Но каким бы способом ни транспортировалась сахароза (по симпласту или по апопласту), конечный этап дальнего транспорта - вакуолярная мембрана, которая содержит переносчик сахарозы и протонные помпы, обеспечивающие процесс транспорта. Путь к тонопласту идёт по донорно-акцепторным градиентам, а скорость поступления сахарозы в вакуоль, которая зависит от активности протонных помп тонопласта, может являться одним из определяющих звеньев, регуляция которого будет определять процесс аттракции.

Особый интерес вызывает изучение регуляции протонных помп тонопласта в связи с тем, что изменение их активности может определять интенсивность процессов транспорта и запасания метаболитов и выступать одним из регуляторов донорно-акцепторных отношений в растении. Многообразны механизмы, которые могут принимать участие в регуляции этих ферментов. Они уже неплохо изучены на протонных помпах других, более доступных мембран. Регуляция, в том числе гормональная, активности протонных помп тонопласта и транспортных процессов, которые они обеспечивают, в настоящее время изучена явно недостаточно. Однако можно ожидать, что детальное изучение взаимосвязи между фитогормонами, активностью протонных помп и обеспечиваемыми ими механизмами транспорта метаболитов помогут раскрыть важные стороны акцепторных механизмов накопления и аттракции в целом.

Целью настоящей работы явилось изучение функциональной

активности протонных помп тонопласта и их роль в процессах

транспорта и накопления метаболитов.

Для достижения поставленной цели были определены следующие

задачи:

1. Выяснить роль протонных помп тонопласта (и механизмов вторично-активного транспорта) в процессах активного транспорта метаболитов через тонопласт;

2. Изучить участие белков с переменной аффинностью в переносе сахарозы через тонопласт;

3. Исследовать активность протонных помп тонопласта в связи с динамикой накопления углеводов в онтогенезе столовой свёклы (Beta vulgaris L.);

4. Изучить изменение функциональной активности протонных помп методами протеолиза и редокс-регуляции;

5. Изучить влияние фитогормонов на функциональную активность протонных помп тонопласта в онтогенезе;

6. Проанализировать соотношение изменения функциональной активности протонных помп тонопласта под влиянием ионов и фитогормонов;

7. Изучить влияние фитогормонов на активное поглощение Сахаров изолированными вакуолями на разных фазах онтогенеза;

8. Оценить связь гормонального статуса корнеплода в онтогенезе с особенностями изменения функциональной активности протонных помп тонопласта под влияниея фитогормонов;

9. Оценить влияние фитогормонов на сахаронакопление в экспериментах на целом растении.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Основная часть процессов активного транспорта сахарозы на тонопласте (более 90%) осуществляется с участием протонных помп.

2. Протонные помпы тонопласта отвечают за поступление сахарозы в вакуолях (корнеплод), а изменение их активности связано с изменением сахаронакопления.

3. Регуляция протонных помп тонопласта осуществляется разными путями: изменением редокс-условий, ионного окружения, протеолизом, фитогормонами. Почти всегда, когда активируется одна протонная помпа, вторая либо не меняет своей активности, либо ингибируется.

4. Фитогормоны способны изменять активность протонных помп тонопласта и сахаронакопления. Этот процесс существенно зависит от онтогенеза и на всех фазах развития растения обеспечен фитогормонами в необходимых соотношениях. Научная новизна. В работе впервые показано, что более 90%

транспорта и накопления углеводов в вакуолях и корнеплоде происходит по механизму вторично-активного транспорта, главное звено которого -протонные помпы тонопласта. Изменение их активности может осуществляться различными путями, при этом почти всегда изменение касается только одной протонной помпы, что позволяет говорить о гибкости регуляторного механизма транспортных процессов на вакуолярной мембране. Изучение гормонального влияния на разных фазах роста и развития растения показало, что чувствительность протонных помп к фитогормонам существенно зависит от стадии онтогенеза на которой в момент эксперимента находилось растение. На разных стадиях один и тот же фитогормон мог из стимулятора превратиться в ингибитор активности протонных помп. От онтогенеза существенно зависит и наиболее действенная концентрация фитогормона. Проведено сравнение двух видов регуляции -гормональной и ионной - и показано, что их роль у протонных помп отличается. Гормональная регуляция более значима для Н+-АТФазы, а ионная - для Н+-пирофосфатазы. Установлено, что фитогормоны способны поддерживать активность Н+-АТФазы и If пирофосфатазы в условиях ионного дефицита и даже в условиях стрессовых по ионному составу. Изучение влияния фитогормонов на поступления сахарозы в изолированные вакуоли в сопоставлении с влиянием фитогормонов на протонные помпы тонопласта позволило выдвинуть положение о возможном механизме регуляции сахаронакопления через изменение активности ферментов, обеспечивающих транспорт метаболитов через тонопласт. Впервые изучена динамика содержания фитогормонов в корнеплоде на разных фазах онтогенеза. Это позволило практически обосновать возможность гормональной регуляции in vivo. В результате исследований предложена вероятная схема регуляции аттракции в корнеплоде столовой свёклы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты существенно дополняют сведения о роли протонных помп тонопласта в процессах сахаронакопления и о изменении функциональной активности протонных помп тонопласта в онтогенезе. Они "открывают возможности для дальнейших исследований в изучении механизмов мембранного транспорта метаболитов и механизмов регуляции процессов аттракции. Особое значение в теоретическом плане имеет доказательство связи изменения процессов накопления метаболитов с изменением активности протонных помп тонопласта in vivo. В практическом плане выполненная работа обосновывает ряд приёмов направленных на накопление метаболитов в растении.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на международном симпозиуме «Plant hormone signal perception and transduction» (Москва, 1994), на Ежегодном симпозиуме "Physical-chemical basis of plant physiology" (Пенза, 1996), IV Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений»

(Москва, 1996), V Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1997), Международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 1999), Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), 12th Congress of the FESPP (Budapest, 2000), V съезде общества физиологов растений России (Пенза, 2003), а также на научных сессиях (1994, 1996, 1998, 2000, 2002, 2004) Сибирского института физиологии и биохимии растений.

Публикации. По материалам работы опубликовано 50 работ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (семь глав), заключения, выводов и списка литературы (469 источник, в том числе 356 иностранный). Работа изложена на 309 страницах, содержит 52 рисунка и 18 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растительный материал. В качестве объекта исследования использовали корнеплоды столовой свеклы (Beta vulgaris L.) сорт Бордо, которые выращивали на опытном участке института. Столовая свёкла -растение двулетнее, поэтому весь период его роста и развития может быть поделён на следующие фазы: I фаза - первый год вегетации, время активного роста. Эта фаза была разбита нами на два периода: 1 период -первые недели роста и развития корнеплода (6-9-ая недели или 50-60-ые сутки роста). В этот промежуток времени происходило усиленное накопление Сахаров. 2 период - 11-15-ая недели роста корнеплода (70100-ые сутки). Накопление Сахаров за это время, по сравнению с первыми неделями роста, было менее интенсивным. II фаза - фаза покоя. В этот период корнеплоды хранили в овощехранилище в течение нескольких месяцев при +4° - +5°С. Эта фаза также состояла из двух периодов: 1 период - осень (начало покоя), 2 период - весна (выход из покоя). III фаза - второй год вегетации. Эта фаза роста тоже была поделена на два периода: 1-ый период - рост и развитие листьев до образования цветоносов, 2-ой период - рост и развитие цветоносов (в работе использовали цветущие растения до плодоношения).

Выделение вакуолей из ткани корнеплодов проводили модифицированным макрообъемным методом, разработанным в лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР СО РАН (Саляев и др., 1981). Все этапы выделения проводили при комнатной температуре, за исключением центрифугирования, при котором температура составляла 4°С. На центрифуге К-70 и К-23 (Janetzki,GDR) использовались бакет-роторы 4 х 500 мл и 4 х 100 мл соответственно.

Выделение тонопласта. Для получения фракции тонопласта 1 мл

осадка вакуолей ресуспендировали в 10 мл гипотонического раствора, содержащего 1мМ Трис-HCI рН 7,4, 1мМ MgCI2 и 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола, что вызывало осмотический шок вакуолей и образование везикул вакуолярных мембран. Полученную суспензию фильтровали через двойной слой капрона и центрифугировали 15 мин при 5000g на препаративной центрифуге К-24 (Janetzki,GDR). Надосадочную жидкость, содержащую везикулы тонопласта в разбавленном гипотонической средой вакуолярном соке, центрифугировали 60 мин при 6000g (УПР-8, СССР). Надосадок удаляли, осадок извлекали из пробирок, перемешивали до гомогенного состояния и хранили во льду до начала проведения опытов.

Аффинная хроматография сахарозосвязывающих белков. Для выделения сахарозосвязывающих белков тонопласта синтезировали аффинный сорбент на основе полиакриламида по методу, разработанному в Волгоградском противочумном институте. Для создания условий, приводящих к депротонированию, работа на колонке проводилась в буферной системе, содержащей 50 мМ KHjPO/j/NaOH рН 7,4, 0,35 М KCl, а для создания условий протонирования - с буфером 60 мМ рН 5,5. На колонку вносили 2-3 мг белков тонопласта, солюбилизированных дезоксихолатом натрия. После 1 ч. инкубации белки, не связанные аффинным лигандом, с колонки вымывали. Для специфической элюции сахарозосвязывающих белков в элюирующий раствор вносили 0,5 М сахарозу. Сахарозосвязывающий белок анализировали гель-электрофорезом.

Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле проводили по модифицированному методу (Laemmli, 1970). Для улучшения разделения белки после солюбилизации алкилировали по методу Лана (Lane, 1978) с йодацетамидом. Денситограммы получали прямо с гелей на сканирующем денситометре ИФО-451.

Определение белка. Для определения концентрации белка в присутствии детергентов использовали метод В. Шафнера и С. Вейсмана (Shafener, Weismann, 1973). При определении гидролитической активности ферментов в расчёте на белок определение проводилось по методу Бредфорда (Bradford, 1976).

Определение гидролитической активности ферментов на изолированных вакуолях. В 2-мл пластмассовые пробирки вносили по 20-30 мкл изолированных вакуолей и добавляли 0,25 мл среды инкубации, состав которой менялся в зависимости от преследуемой цели. Если мы изучали динамику активности ферментов или воздействие фитогормонов, то использовали, с целью сравнения влияния различных концентраций ионов К+, два раствора инкубации с 700 мМ КС1 и с 70 мМ КС1 плюс Р-аланин (3 мМ MgCl2, 10 мМ сахарозы, 1мг/1мл ЧСА, 0,2 мМ молибдат аммония, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола, 20 мМ Трис-МЭС (НС1), рН 8,0, плотность р=1,038г/см3). В том случае, когда оценивалась роль ионов К+ и Mg2+ в гормональной регуляции Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы, использовали растворы инкубации следующего состава: 1) 700 мМ

Р-аланина, 100 мМ Трис-HCl или имидазол-HCl, pH 8,0; 2) 3 мМ MgCl2, 100 мМ Трис-HCl или имидазол-HCl, 700 мМ ß-аланина, рН8,0; 3) 70 мМ КС1, 700 мМ р-аланина, 20 мМ Трис-МЭС или имидазол-МЭС, рН 8,0; 4) 70 мМ КС1, 3 мМ MgCl2, 700 мМ р-аланина, 20 мМ Трис-МЭС или имидазол-МЭС, рН 8,0. Все растворы содержали 0,1 мМ 2-Меркаптоэтанола и 0,2 мМ молибдата аммония. Осмотическая концентрация растворов была равна 1300 мОсМ. В том случае, когда изучали активность Н+-АТФазы во все среды инкубации вносили в качестве субстрата 3 мМ АТФ (натриевая соль, Sigma), а при изучении активности Н+-пирофосфатазы добавляли 3 мМ пирофосфата (ПФн) (натриевая или калийная соли, Sigma). Если исследовалась гормональная регуляция активности ферментов, в пробирки добавляли по 10 мкл раствора гормона (ГК, ИУК, АБК или кинетина), доводя до конечной концентрации в суспензии от 10'10 ДО 10"4 М. Инкубацию проводили при 37°С в течение 35 мин (Rea and Sanders, 1987). Реакцию гидролиза субстратов останавливали 7% трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Затем центрифугировали 5 мин на микроцентрифуге Туре-320 (Poland) при 1200g. В надосадочной жидкости определяли содержание неорганического фосфора (Фн) методом Лоури-Лоренса в модификации Скулачёва (Никулина, 1965) и количество бетацианинов (Кузеванов и др., 1983). Активность Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы выражали в условных единицах: мкМ Фн, поделенные на мМ бетацианина в час (Doll et al., 1979). Изменение активности ферментов в присутствии гормонов или ионов выражали в процентах от контролвной активности. Определение биохимических характеристик протонных помп тонопласта проводили по общепринятым методам. При проведении ингибиторного анализа в инкубационные среды вводили специфические ингибиторы: для Н+-АТФазы - бафиломицин (670нМ) и KNO3 (50мМ), а для Н+-пирофосфатазы - KF (1мМ) и CaSO4 (ЗОмМ).

Определение углеводов и ионов К*. Небольшой объем осадка вакуолей (0,2 мл) шокировали дистиллированной водой (1,8 мл). Нерастворимые примеси в суспензии осаждали на микроцентрифуге Туре-320 (Poland) в течение 5 мин при 1200g. Супернатант разбавляли водой еще в 10 раз. Содержание Сахаров определяли антроновым методом (Туркина, Соколова, 1971). Концентрацию ионов К+ определяли в соке корнеплодов, которые отбирали на разных фазах роста растения. 50 мкл сока разбавляли в 20-500 раз, в зависимости от периода вегетации. Измерения проводили на пламенном фотометре (Flapho-4, Carl Zeiss Yena, Germany).

Определение активного поглощения 3Н-сахарозы на изолированных вакуолях. В 2,5-мл конические микропробирки вносили 50 мкл суспензии вакуолей и 0,5 мл раствора инкубации (455 мМ КС1, 3 мМ MgCl2, 150 мМ аланина, 0,2 мМ молибдата аммония, 1 мг/1 мл ЧСА, 20 мМ Трис-МЭС, рН 8,0), которая содержала 3 мМ АТФ или ПФ (натриевые соли, Sigma, USA). К смеси вакуолей и среды инкубации

приливали 20 мкл раствора гормонов (ИУК, АБК, ГК или кинетина) до конечной концентрации от 10'8 ДО Ю"10 М. В последний момент вносили 8 мкл меченой сахарозы (3Н-сахарозы). Удельная активность растворов сахарозы составляла 0,32-0,4 МБК/мл. Количество поглощённой сахарозы определяли в осадках вакуолей, полученных в результате центрифугирования суспензии (10 сек, 1200g). Активное поглощение сахарозы узнавали по разнице между концентрацией меченой сахарозы в опытных вариантах (содержали АТФ или ПФ и инкубировались 35 мин при 37°С) и в контрольных вариантах (не инкубировались и/или не содержали субстратов ферментов). Величину поглощения выражали в условных единицах в пересчете нМоль накопленной сахарозы на мМоль бетацианина в час (Doll et al., 1979; Leigh and Branton, 1976). В опытах с гормонами при определении активного транспорта сахарозы находили разницу в количестве поглощенной сахарозы между образцами с гормонами и без (контроль) и выражали в процентах от контрольного активного поглощения.

Изучение транспортной активности протонных помп тонопласта. Транспортную функцию ферментов оценивали по изменению рН везикул тонопласта методом флуоресцентных зондов. За сдвигами рН следили по изменению флуоресценции хинакрина при длине волны возбуждаемого и испускаемого света 440 и 510 нм соответственно. Эксперименты проводили на спектрофлуориметре (Клыба, 1983) в 3-мл кювете с длиной оптического пути 1 см при температуре 20°С. Образец перемешивали встроенной в прибор микромешалкой. В кювету поэтапно вносили 2,5 мл инкубационного раствора и 0,1 мл осадка везикул тонопласта. Инкубационный раствор содержал: 25 мМ Трис/МЭС, 50 мМ KCI, 250 мМ сорбита, 5 мкМ хинакрина, 5 мМ MgSO 4, рН 7,2 (Doll et al., 1979). В среднем на 0,1 мл образца приходилось 150 мкг белка. В среду инкубации вносили 5 мМ пирофосфата или 5 мМ АТФ (Трис) и гормоны в разных концентрациях (ЭБ - 10 *П М, ГК и ИУК-10 '8 М).

Обнаружение автоингибиторного домена у Н+-АТФазы тонопласта. Эксперименты проводили на изолированных вакуолях и вакуолярных везикулах, выделенных из корнеплодов столовой свёклы в период покоя. Протеолитическую обработку проводили по методу Соммарин (Sommarin et al., 1994) путём введения протеолитических ферментов (трипсина и химотрипсина) в среду инкубации изолированных вакуолей или везикул тонопласта перед определением гидролитической и транспортной активности протонных помп тонопласта. Протеолиз проводили при 20°С в течение 15 мин. Останавливали протеолиз добавлением к среде инкубации специфических ингибиторов: соевого ингибитора трипсина или ингибитора трипсина-химотрипсина фирмы «Sigma». Результаты выражали в процентах. За 100% принимали гидролитическую и транспортную активность, полученную на необработанных протеолитическими ферментами мембранах.

Изучение редокс-регуляции протонных помп тонопласта.

Эксперименты проводили на изолированных вакуолях, выделенных из корнеплодов столовой свёклы в период покоя. В среду инкубации, содержащую изолированные вакуоли, добавляли редокс-агенты -глютатион окисленный и глютатион восстановленный - в концентрациях 1-20 мМ и инкубировали в термостате при 37°С в течение 35 мин. Активность ферментов выражали в процентах к активности контрольных вариантов, которые не содержали в среде инкубации редокс-агентов. Определение концентрации гормонов в корнеплоде столовой свёклы

Определение свободной ИУК проводили на жидкостном хроматографе ХЖ 1311, снабженным С18 микроколонкой (250 х 0,7мм) и спектрофлуориметрическим детектором, используя изократический режим элюирования смесью 45% ацетонитрила в 1 % уксусной кислоте. Экстракцию растительного материала проводили по методу (Рекославская и др., 1994).

Определение АБК. Экстракцию проводили по методу, рекомендованному Институтом ботаники им. Н.Г. Холодного (1986). Количественное определение АБК проводили на жидкостном хроматографе ХЖ 1311, снабженным С18 микроколонкой (250 х 0,7мм) и спектрофлуориметрическим детектором, используя изократический режим элюирования смесью 45% ацетонитрила в 1 % уксусной кислоте.

Определение цитокининов. Проводилось определение только свободных цитокининов - зетина и зеатинрибозида. Для этого растительный материал гомогенезировали и элюировали трижды 96% этанолом. Объединённые экстракты упаривали под вакуумом на роторном испарителе при 30°С до водной фазы. Для очистки экстракта водный осадок подкисляли до рН 3,0 и экстрагировали N-этилацетатом. Эфирные фракции упаривали досуха и анализировали на жидкостном хроматографе ХЖ 1311, снабженным С18 микроколонкой (250 х 0,7мм) и спектрофлуориметрическим детектором, используя изократический режим элюирования смесью 45% ацетонитрила в 1 % уксусной кислоте.

Определение гиббереллиноподобных веществ (ГПВ). Выделение гиббереллинов из корнеплодов свёклы, очистку и фракционирование экстракта проводили по методу (Волынец, Пальченко, 1976). Идентификацию ГПВ проводили методом тонкослойной хроматографии (Муромцев, Агнистикова, 1973). Для количественного анализа гиббереллинов были использованы следующие биотесты. 1. По удлинению гипокотиля проростков салата в модификации Агнистиковой; 2. По стимуляции амилолитической активности эндосперма ячменя (Муромцев, Агнистикова, 1973).

Методика проведения полевых экспериментов. Полевые эксперименты проводили в течение трёх вегетационных периодов (20002002 гг.) на опытном поле института. Опытный участок составлял 250 м2. Растения столовой свёклы (Beta vulgaris L.) сорт Бордо высаживались на отдельные участки по количеству вариантов опыта не семенами, а выровненной рассадой в фазе 2-4 листьев. В каждом варианте

высаживалось 25-30 растений. Растения в фазе 6-8 листьев два раза, с интервалом в неделю, обрабатывали фитогормонами: ЭБ в концентрации 10-6М, ИУК, АБК, ГК и кинетином в концентрации 10- М, с добавлением поверхностно-активного вещества Tween-20 в концентрации 0,1%. В 2002 году, кроме опрыскивания, для обработки фитогормонов был применён метод аппликации, при котором на каждый корнеплод накладывали ланолиновую пасту, содержащую фитогормоны в тех же концентрациях. После снятия опыта рассчитывали вес корнеплодов и содержание сахара, которое определяли антроновым методом (Туркина, Соколова, 1971). Для измерения веса отбирали с каждого участка по 20 корнеплодов. Из них в 10-ти средних измеряли содержание сахара.

Статистический анализ. Эксперименты проводили в 5-7 кратной повторностях. Полученные результаты были обработаны статистически. При статистической обработке материала использовали общепринятые характеристики: стандартное или квадратическое отклонение, коэффициент корреляции, критерий Стьюдента (для оценки достоверности коэффициента корреляции) первую производную (Лакин, 1990). В таблицах и рисунках нами приведены средние арифметические величины и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Характеристика изолированых вакуолей и фракции

изолированных мембран, использованных в экспериментах.

Ранее проведённые эксперименты позволили нам сделать вывод о том, что вакуоли, выделенные в раствор с высоким содержанием KCI, были нативными, сохраняли барьерные, ферментативные свойства тонопласта и способность к активному поглощению Сахаров (рис.1). Выделенные из этих вакуолей мембранные везикулы содержали элементы систем транспорта веществ и могли быть использованы в экспериментах по их изучению (рис.2).

Поступление метаболитов в вакуоль осуществляется по механизму вторично-активного транспорта в антипорте с протоном (Briskin et al., 1985; Катков 1989). Этот механизм связан с двумя протонными насосами -Н+-АТФазой и Н+-пирофосфатазой (Rea, Sanders, 1987), - которые создают протонный и электрохимический градиенты, являющиеся необходимым условием вторичного-активного транспорта через тонопласт по механизму антипорта с протоном. В последнее время на клеточных мембранах обнаружена еще одна транспортирующая система, которая способна использовать энергию АТФ для переноса метаболитов по механизму первично-активного транспорта, напрямую, без создания протонного и электрохимического градиента. Это так называемые АВС-транспортеры (Theodoulou, 2000).

Рис 1 Фракция изолированных вакуолей красной столовой свеклы, которая была использована в экспериментах по изучению регуляции гидролитической активности протонных помп тонопласта и гормональной регуляции сахаронакопления

Рис 2 Фракция вакуолярных мембран корнеплода столовой свёклы, которая была использована в экспериментах по изучению регуляции транспортной активности протонных помп тонопласта

Используя методы ингибиторного анализа, мы показали (рис. 3), что 10-15% АТФазной активности белков тонопласта являются ванацатчувствительными и могут принадлежать к классу АВС-транспортеров, т к. подавляются специфическим ингибитором для белков этого класса. Из данных, представленных на рис. 3, видно, что различные концентрации ванадата на разных этапах онтогенеза ингибируют около 10-15% гидролитической активности АТФаз тонопласта. Эта величина почти не зависит от концентрации ванадата в

диапазоне 10

100 мкМ и от стадии онтогенеза. Для

0 10 60 100 1 2 3

Кониеитрщ А ВЧ-ЧДПЭ И М ингибиторы

РИС 3 Влияние различных концентраций ванадата Рис 4 Влияние ингибиторов на на активность АТФаз тонопласта на разных АТФаз тонопласта в период роста фазах онтогенеза 1 Без добавления ингибиторов

2 С добавкой бафиломицина (670нМ)

3 Бафиломицин (670нМ) + ванадат (100 мМ)

подтверждения гипотезы о присутствии на тонопласте АВС-транспортеров была проведена ещё одна серия экспериментов, результаты которой приведены на рис 4. Специфическим ингибитором Н+-АТФазы тонопласта является бафиломицин (White, 1994). Из рис. 4 видно, что добавление ванадата к бафиломицину усиливает ингибирование активности АТФаз также на величину 10-15%, как и ингибирование одним ванадатом (рис. 3). Это позволяет говорить о том, что ванадат в этих опытах, скорее всего, подавляет активность АВС-транспортеров, которые присутствуют на вакуолярной мембране и не подавляются бафиломицином. Из этих экспериментов следует, что на тонопласте столовой свёклы присутствуют ABC-транспортеры и их активность составляет около 10-15% от активности АТФаз тонопласта. Очевидно, около 10-15% метаболитов может транспортироваться через тонопласт по механизму первично-активного транспорта. Другая часть метаболитов, вероятно, транспортируется механизмом вторично-активного транспорта в антипорте с протоном. На самом деле по механизму вторично-активного транспорта будет транспортироваться значительно больше метаболитов, если учитывать вторую протонную помпу - Н+-пирофосфатазу, которая присутствует на тонопласте и вносит свой вклад в транспортные процессы. Исходя из проведённых исследований, мы можем утверждать, что подавляющее большинство метаболитов на тонопласте столовой свёклы переносится через мембрану благодаря работе протонных помп тонопласта и изменение их активности будет, по-видимому, определять накопление метаболитов в вакуоли, а также процессы аттракции в корнеплоде.

Участие белков переменной аффинности в переносе сахарозы

через тонопласт.

В связи со сложностью выделения вакуолярной мембраны, расположенные на ней транспортные системы изучены значительно меньше, чем на других мембранах. На тонопласте до сих пор нет окончательно выявленных переносчиков для сахарозы и глюкозы (Martinoia et al., 2000). Саляевым и Катковым (1988) было выдвинуто предположение о переходе транспортной системы для сахарозы на тонопласте в функционально активное состояние в депротонированных условиях при рН 7,4, характерном для цитоплазмы. В этих условиях транспортная система способна связывать сахарозу. В протонированных условиях при рН 5,5, которая поддерживается внутри вакуоли, комплекс распадается и сахароза высвобождается. Для проверки этой гипотезы белки тонопласта вносили на аффинный сорбент, содержащий в качестве лиганда молекулы сахарозы в буферах с разной рН - 7,4 (депротонирующие условия) и 5,5 (протонирующие условия). Результаты этих экспериментов приведены на рис. 5. При проведении аффинной хроматографии в депротонирующих условиях (рН 7,4) белок связывался с аффинным лигандом (сахарозой) и после тщательного промывания

колонки буфером при специфической элюции 0,1 М раствором сахарозы происходило вытеснение сахарозо-связывающего белка с сорбента и он выходил с колонки одним пиком (рис. 5 А). В этих условиях сахарозо-связывающий белок, по-видимому, имел максимальное сродство к сахарозе. Другая картина наблюдалась, когда эксперименты проводились при величине рН 5,5, соответствующей вакуолярной стороне тонопласта. В этих условиях белок находился в протонированном состоянии, с аффинным лигандом не взаимодействовал и при специфической элюции белковый пик отсутствовал (рис. 5 Б). Это можно объяснить тем, что в протонированном состоянии сахарозо-связывающий белок имеет минимальное сродство к сахарозе. Полученные результаты согласуются с моделью транспорта сахарозы через тонопласт в антипорте с протоном, которая основана на переменном сродстве белка-переносчика к сахарозе в протонированной и депротонированной форме. Судя по соответствию аффинности в протонированном и депротонированном состояниях реальному градиенту протонов на тонопласте, выделенный белок может претендовать на роль переносчика сахарозы. Выход сахарозо-связывающего белка составлял 0,3-0,4 % от всех белков тонопласта, внесённых в колонку. После электрофоретического разделения этого белка в ППАГ с ДДС был выявлен ряд полипептидов с молекулярными массами 98,76,67,30 и 20 кД (рис. 6).

номер фракции

Рис. 5. Аффинная хроматография сахарозо-связывающих белков тонопласта. А - эксперимент проводился при рН 7,4; Б - при рН 5,5; 1 - белки тонопласта; 2 - 0,1 М сахароза

Рис. 6. Денситограмма сахарозо-связывающего белкового комплекса тонопласта, выделенного аффинной хроматографией в депротонирующих условиях после электрофоретического разделения в ПААГ с ДДС. Получена прямо с гелей на сканирующем денситометре ИФО-451.

Таким образом, на вакуолярной мембране красной столовой свёклы обнаружены сахарозо-связывающие белки, которые могут являться компонентами транспортной системы. Нас интересовало изучение регуляции этой транспортной системы, поскольку она обеспечивает существование такого важного феномена как аттракция.

Имелось два пути: 1) выделение сахарозо-связывающих белков, протонных помп тонопласта, встраивание их в липосомы и изучение механизмов регуляции и аттракции на этой модели; 2) изучение регуляции на изолированных вакуолях или мембранных везикулах, которые содержат транспортные системы в более нативном липидном окружении. Мы выбрали второй вариант.

Как следует из механизма транспорта сахарозы в антипорте с протоном, одну из ключевых ролей в транспорте играют протонные помпы тонопласта, создающие градиент протонов и задающие протонирующие и депротонирующие условия по разные стороны вакуолярной мембраны. Функционирование этих ферментов, очевидно, имеет сезонный характер и должно коррелировать с уровнем транспорта сахарозы и её накоплением в вакуолях. Поэтому первым шагом, сделанным нами, стало изучение онтогенетической динамики активности протонных насосов.

Динамика_гидролитической активности протонных помп

тонопласта и накопление сахарозы в онтогенезе столовой свёклы.

При сопоставлении динамики активности протонных помп тонопласта со скоростью увеличения веса корнеплодов и концентрации Сахаров было обнаружено, что гидролитическая активность ферментов снижалась одновременно с уменьшением скорости накопления Сахаров.

Количество Сахаров в течение первых десяти дней увеличивалось в 3 раза (табл. 1). Характерным для этих дней была и высокая активность Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы (50-60-ые сутки). Концентрация Сахаров в последующие тридцать дней (70-100-ые сутки) возрастала лишь в 2,6 раза. Ферментативная активность в эти дни резко снижалась. Мы попытались выявить корреляционную связь между интенсивностью прироста концентрации Сахаров и изменениями в гидролитической активности ферментов (рис. 7 и 8). В результате проведённого нами анализа было установлено, что динамика активности ферментов коррелирует с интенсивностью прироста концентрации Сахаров. Коэффициент корреляции для Н+-АТФазы равен +0,92 (достоверен при Р=0,01, г=5,25±0,05, ^.=4,604), для Н+-пирофосфатазы - +0,95 (достоверен при Р=0,01,1=5,9410,04, ^.=4,604).

0 -'--'---' ад 50 во 711 ео И) 1W

50 во та so «о юо

суш*

Рис 7. Динамика приращения количества Рис 8 Динамика активности ферментов Сахаров в первый год вегетации в первый год вегетации

Ранее в нашей лаборатории была установлена отрицательная корреляционная связь между накоплением Сахаров и калия (Саляев и др., 1997). Кроме того протонные насосы тонопласта проявляли высокую чувствительность к К+ (Rea, Sanders, 1987), поэтому возникла необходимость исследовать динамику накопления Сахаров и калия за весь период роста и развития корнеплодов.

Рис . 9. Динамика накопления Рис. 10. Динамика накопления калия в Сахаров в онтогенезе столовой онтогенезе столовой свёклы

Таблица 1.

Изменение веса, концентрации Сахаров и активности Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы у корнеплодов в первый год вегетации столовой свеклы (Beta vulgaris L.)

Вес кор- Ско- Концен- Ско- Концен- Концен- АТФаза ПФаза

Сут- непло- рость трация рость трация трация

ки дов увеличе- Сахаров накопле- белка бетациа- мкМФн/ мкМФн/

(гр) ния веса (мМ) ния (мг/мл) нинов мМ бета- мМ

d(fyd(x) Сахаров (мМ) цианина бега-

(гр/суг) d(f)/d(x) мМ/суг цианина

50 0,32+0,1 1,18 55± 11,7 11,1 2,4+0,53 4,6± 1,2 17,1±3,1 6,1±U

60 2,3± 0,9 4,1 157± 18, 7,05 3,4+0,31 5,6+1,7 14,4±3,1 4,4+0,9

70 24,3± 7,0 6,0 277+24, 3,5 3,3± 0,39 4,8± 0,9 3,0± 0,8 2,6± 0,9

80 84,2± 2,0 9,37 298+ 9,0 5,3 3,7+0,93 4,5± 1,1 3,8± 1,1 3,5± 0,5

90 100 144,3± 4, 12,72 347± 13, 5,7 4,1±0,1 4,5± 1,5 4,6± 1,9 3,5± 1,1

271,5+9, 404± 28, 3,7±0,57 4,2+ 1,1 2,7+0,7 3,4+0,8

140 350 сутки

Рис. 11. Динамика изменения активности протонных помп тонопласта в онтогенезе

Рассмотренные выше результаты позволяют заключить, что активность Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы в онтогенезе столовой свеклы меняется в зависимости от фазы роста растения: Н+-АТФаза более активна в первый год вегетации (в период интенсивного накопления Сахаров), Н+-пирофосфатаза - как в первые недели роста корнеплодов, так и во второй год онтогенеза растения (рис. 11).

Из проведённых нами экспериментов можно сделать следующие выводы:

1. Динамика активности ферментов хорошо коррелирует с динамикой накопления Сахаров в первый год вегетации растения.

2. Вероятно, оба протонных насоса (Н+-АТФаза и Н+-пирофосфатаза)

вовлечены в транспорт углеводов через тонопласт.

3. Сопоставление динамики активности ферментов на разных фазах онтогенеза позволяет предположить, что Н+-АТФаза в большей степени вовлечена в процессы сахаронакопления, а Н+-пирофосфатаза - в транспорт солей, который также связан с накоплением Сахаров, в частности, как компенсаторный путь поддержания осмотического потенциала вакуоли.

Изучение механизмов регуляции протонных помп тонопласта.

Регуляция активности протонных помп тонопласта будет в большой степени определять процесс накопления метаболитов в корнеплоде, поскольку активный транспорт на тонопласте столовой свёклы осуществляется главным образом по механизму, в котором определяющую роль играют эти ферменты. В настоящее время регуляция активности Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы тонопласта практически не изучена. На первом этапе наших исследований были предприняты попытки использовать подходы, которые позволили получить интересные результаты при изучении регуляции протонных помп других клеточных мембран.

Изучение регуляции активности протонных помп тонопласта методом протеолиза.

Одной из мембранных протонных помп растений, регуляция которой неплохо изучена, является Н+-АТФаза плазматической мембраны. Н+-АТФаза плазмалеммы также участвует в транспортных процессах, но отличается от Н+-АТФазы тонопласта по физико-химическим характеристикам и принадлежит к протонным насосам другого (Р) типа, осуществляющим транспорт метаболитов через мембрану по механизму вторично-активного транспорта в симпорте с протоном (ВтИп, 1989). У Н+-АТФазы плазмалеммы обнаружен С-концевой автоингибиторный участок, при удалении которого активность фермента существенно возрастала (8оттагт е! е1., 1994). Нами была проведена серия экспериментов по изучению возможности существования подобного автоингибиторного домена у протонных насосов тонопласта. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Влияние транспортную

протеолитической активность

Таблица 2. обработки на гидролитическую и протонных помп тонопласта (в % от контроля)

Активность

Н+-АТФаза

Н+-пирофосфатаза

трипсин

химотрипсин

трипсин

химотрипсин

Гидролитическая

205±7%

189±6%

112± 17 %

101±18%

Транспортная

183±51%

228±55%

92±23%

96±33%

Из таблицы хорошо видно, что при удалении протеолитической обработкой выступающих фрагментов полипептидной

цепи гидролитическая и транспортная активность Н+-АТФазы тонопласта увеличивались в два раза. Использование разных протеолитических ферментов существенного значения не имело.

При обработке протеолитическими ферментами второго протонного насоса - Н+-пирофосфатазы, - также расположенного на вакуолярной мембране, никаких изменений ни в гидролитической, ни в транспортной активности обнаружено не было. Н+пирофосфатаза, в отличие от Н+-АТФазы, обладает меньшей молекулярной массой, имеет другую структуру (Maeshima, Joshida, 1989; Fraichard et al., 1993), и её регуляция методом протеолиза, по-видимому, не осуществляется.

Из полученных результатов можно сделать вывод, что регуляция активности Н+-АТФаз разных типов (Р и V ), расположенных на разных мембранах (плазмалемма и тонопласт), имеет больше общих черт, чем регуляция активности протонных насосов, расположенных на одной мембране. Кроме того, эти результаты показали, что у Н+-АТФазы тонопласта присутствует автоингибиторный домен, удаление которого может в 2 раза увеличивать активность фермента и, вероятно, транспортные процессы, которые этот фермент обеспечивает.

Изучение регуляции активности протонных помп тонопласта методом редокс-регуляции.

Одним из способов регуляции активности ферментов in vivo является редокс-регуляция. Осуществляется этот тип регуляции активности ферментов через окисление - восстановление SH-групп полипептидов или липидного бислоя. Существует выраженная зависимость от редокс условий для протонных помп митохондриальной, хлоропластной и плазматической мембран. Для протонных помп вакуолярной мембраны высших растений возможность регулировать активность ферментов посредством редокс регуляции малоизучена. Существуют предположения о том, что растительные вакуолярные протонные помпы могут обратимо регулироваться изменением редокс-условий in vivo (Tavakoli et al., 2001).

Обнаружение влияния редокс-условий свидетельствует о вероятном участии в регуляции активности ферментов реакций тиол-дисульфидного обмена на уровне цистеиновых остатков в молекуле фермента. Этот факт хорошо согласуется с полученными ранее данными о блокирующем действии N-этилмалеимида (агента, модифицирующего SH-группы белков) на активность протонных помп тонопласта столовой свёклы. Формирование дисульфидных связей между цистеиновыми остатками каталитических центров может играть важную роль в регуляции АТФазной активности in vivo в растительной клетке.

В настоящее время при изучении редокс-регуляции наиболее часто используется физиологическая редокс-пара глютатиона, относительно которой известно, что она принимает участие в редокс-регуляции многих физиологических процессов в клетке in vivo (Dschida, Bowman, 1995). В

наших экспериментах проводилось изучение влияния различных концентраций окисленного и восстановленного глютатиона на гидролитическую активность протонных помп тонопласта. Результаты: этих экспериментов приведены на рис. 12.

Как видно из рис. 12 А, окисленный глютатион достоверно снижал гидролитическую активность обеих протонных помп тонопласта при концентрации 1-15 мМ. Ранее было установлено, что участок полипептида, ответственный за чувствительность к окислительно-восстановительным агентам, у Н+-АТФазы находится на каталитическом сайте периферического домена V фермента (субъединицы А и В). А и В субъединицы вакуолярной АТФазы содержат несколько цистеиновых остатков, три из которых локализованы на субъединице В, а один остаток цистеина - на субъединице А. Формирование дисульфидных мостиков между цистеиновыми остатками этих субъединиц, возможно, и является одной из причин, вызывающих снижение активности фермента (Dschida, Bowman, 1995). На сегодня существуют достаточно убедительные доказательства того, что формирование дисульфидного мостика может происходить также между субъединицами А и Е у вакуолярной АТФазы (Tavakoli et al., 2001; Kamanura et al., 2001). Действие глютатиона может быть направлено и на липидую составляющую мембраны через способность глютатиона окислять жирные кислоты. Изменения в ближайшем липидном окружении могут быть причиной конформационных изменений пептидов. Восстановленный глютатион (GSH), восстанавливая SH-группы белков, может снимать инактивацию фермента, а в отдельных случаях - и стимулировать его активность. Данные по влиянию восстановленного глютатиона на гидролитическую активность протонных помп тонопласта представлены на рис. 12 Б. Было обнаружено, что восстановленный глютатион также оказывал влияние на обе протонные помпы тонопласта, причём это влияние существенно зависело от его концентрации. При высокой концентрации (15-20 мМ) восстановленный глютатион стимулировал активность почти в 1,5 раза, но только у Н+-АТФазы. При низких концентрациях (5 мМ) обе протонные помпы достоверно ингибировались. Таким образом, восстановленный глютатион оказывал на активность ферментов разнонаправленное действие, снижая их активность при низких концентрациях и повышая - при высоких. Возможно, это связано с тем, что в растворах восстановленный глютатион очень быстро окисляется на воздухе, поэтому для получения восстанавливающего эффекта при работе в наших условиях требуются высокие концентрации.

Из проведённых нами экспериментов был сделан вывод о том, что протонные помпы тонопласта столовой свеклы (Beta vulgaris L.) могут изменять свою активность в зависимости от изменения редокс-условий, редокс-окружения. Этот способ регуляции может быть одним из основных in vivo, поскольку глютатион в больших количествах

1501 А ПАТФаза

ШПФаза

0 1 10 15 20 Концентрация гаотатиона, мМ

Концентрация гаотатиона, мМ

Рис. 12. Влияние окисленного (А) и восстановленного (Б) глютатиона на гидролитическую активность протонных помп тонопласта

обнаруживается в тканях, клетках и субклеточных компартментах высших растений. Редокс-регуляция - один из возможных путей, контролирующих и регулирующих активность протонных помп тонопласта.

Роль фитогормонов в изменении гидролитической и транспортной активностей протонных помп тонопласта в онтогенезе.

Основными предполагаемыми претендентами на роль аттрактантов в настоящее время являются фитогормоны. В наших экспериментах были использованы наиболее распространённые представители разных классов фитогормонов: ИУК, АБК, ГК, кинетин и ЭБ - в разных концентрациях. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность протонных помп тонопласта на всех фазах онтогенеза столовой свёклы представлено на рис. 13,14, и 15.

О _I_1_I_111« ¡1111111

ш-10 ]0-8 10-6 ,д-4 ш-10 10-8 ]д-4

Концентрация горисна, М

Рис. 13. Влияние гормонов на гидролитическую активность Н+-АТФазы тонопласта в онтогенезе: А - начало первого года вегетации; Б - конец первого года вегетации; В - период покоя; Г - второй год вегетации. 1- ИУК; 2 - АБК; 3 - ГК; 4 - кинетин

Рис. 14. Влияние гормонов на гидролитическую активность Н+-пирофосфатазы тонопласта в онтогенезе: А - начало первого года вегетации; Б - конец первого года вегетации; В - период покоя; Г - второй год вегетации. 1- ИУК; 2 - АБК; 3 - ГК; 4 - кинетин

Полученные результаты: по влиянию фитогормонов на гидролитическую активность протонных помп тонопласта позволили сделать следующие выводы.

1. Фитогормоны способны оказывать влияние на гидролитическую активность протонных помп тонопласта.

2. Фитогормоны в этом случае выступают чаще всего в качестве стимуляторов гидролитической активности протонных помп тонопласта.

3. Чувствительность протонных помп к фитогормонам меняется в ходе онтогенеза и максимальна на втором году вегетации.

Рис. 15. Влияние разных концентраций ЭБ на гидролитическую активность активность Н+-пирофосфатазы (а) и Н+-АТФазы (б) тонопласта: 1 - в период покоя; 2 - в период роста и накопления метаболитов (первый год вегетации); 3 - второй год вегетации

4. На каждой фазе онтогенеза максимально активирующее воздействие на гидролитическую активность оказывают разные фитогормоны.

5. Как правило, наибольшее воздействие оказывали минимальные концентрации гормональных препаратов. Действующие концентрации фитогормонов зависили от стадии онтогенеза: были минимальными в период активных ростовых и генеративных процессов и увеличивались в период покоя.

6. Наиболее чувствительной к гормональным воздействиям оказалась Н+-АТФаза. Максимальное увеличение её активности (до 200%) вызывал кинетин на втором году вегетации. Н+-пирофосфатаза была менее

чувствительной к воздействию фитогормонов; для неё наиболее эффективными стимуляторами служили ИУК и ЭБ.

7. Наиболее часто фитогормон, стимулируя одну протонную помпу, не оказывал влияния, или даже ингибировал, вторую протонную помпу. Например, кинетин в той или иной степени стимулировал Н+-АТФазу на всех фазах онтогенеза, а Н+-пирофосфатазу стимулировал только в период покоя, когда его воздействие на Н+-АТФазу было минимальным.

8. Самым постоянным стимулятором протонных помп тонопласта оказался ЭБ. По-видимому, он, по сравнению с другими фитогормонами, в наибольшей степени может претендовать на роль стабильного аттрактанта.

Изучение влияния фитогормонов на транспортную активность протонных помп тонопласта проводилось на фракции мембранных везикул методом флуоресцентных зондов. Эксперименты проводили на разных этапах онтогенеза: в период покоя (март, апрель) и в конце первого года вегетации, в период окончания роста и сахаронакопления (август, сентябрь). В экспериментах были использованы наиболее перспективные регуляторы гидролитической активности протонных помп тонопласта: ЭБ, ИУК и ГК - в концентрациях, оказывающих заметное влияние на гидролитическую активность: 10"8 - 10"11 М. Общая картина влияния фитогормонов на транспортную активность протонных помп тонопласта приведена в таблице 4.

Таблица 4.

Влияние фитогормонов на транспортную активность Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы тонопласта на разных фазах онтогенеза

Фитогормоны (конц) Транспортная активность

Н+-АТФаза Н+- пирофосфатаза

Начальная Начальная

Период покоя скорость тушения флуоресценции % Д мг белка мин % к контролю без гормонов скорость тушения флуоресценции % Д мг белка мин % к контролю без гормонов

Без гормона ЭБ (10 " М) ИУК (10 е М) ГК(Ю-'М) 3,1 ±0,4 5,6 ±0,2 5,8 ± 0,4 5,4 ±0,2 100 181 187 174 2,7 ±0,1 12,4 ±0,6 5,4 ±0,5 1,6 ±0,4 100 459 200 59

Период роста Без гормона ЭБ(10"'°М) ИУК(101ОМ) ГК(Ю'М) 3,9 ± 0,7 10,1 ±0,3 6,2 ± 0,5 5,9 ± 0,2 100 259 159 151 6,9 ±0,4 8,3 ±0,3 6,9 ±0,5 20,7 ±0,4 100 120 100 300

Из проведённых экспериментов по влиянию фитогормонов на транспортную активность протонных помп тонопласта можно сделать

следующие выводы.

1. Все изученные фитогормоны способны оказывать влияние на транспортную активность Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы тонопласта.

2. В большинстве экспериментов фитогормоны выступали в качестве стимуляторов транспортной активности протонных помп.

3. Наиболее эффективное воздействие на транспортную активность протонных помп тонопласта оказывал ЭБ.

4. Действие фитогормонов зависило от фазы онтогенеза, на которой находилось растение.

Сопоставляя влияние фитогормонов на гидролитическую активность протонных помп тонопласта в конце первого года вегетации и в период покоя (рис. 13, 14,15) с влиянием на их транспортную активность (табл. 4) можно сделать вывод о том, что по большей части регуляция обеих активностей совпадает. Обе активности, главным образом, стимулируются, и отличие в этих экспериментах заключается в величине стимуляции. Единственное исключение составляет регуляция активности ГК у Н+-пирофосфатазы в период покоя. ГК в этот период стимулирует гидролитическую активность (125%, рис. 12) и ингибирует транспортную (59%, табл. 4). Роль ГК, видимо, существенно отличается, и этот гормон может участвовать в разобщении гидролитической и транспортной функций у Н+-пирофосфатазы тонопласта. Связь между гидролизом АТФ или пирофосфата и переносом протона не всегда бывает тесной (Ballesteros et al., 1996; Davies, 1997).

Взаимодействие ионной и гормональной регуляции гидролитической активности протонных помп тонопласта.

На сегодняшний день относительно хорошо изучена регуляторная роль ионов металлов и неметаллов в функционировании Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы (Davies, 1997). Установлено, что оба протонных насоса являются ионзависимыми ферментами. Известно, что Н+-АТФаза и Н+-пирофосфатаза - Mg2+-зависимые и К+-чувствительные ферменты (Rea, Sanders, 1987). К+, как стимулятор, и Mg2+, как аллостерический активатор, являются основными регуляторами активности этих ферментов (Leigh et al., 1992; Maeshima, 2000). Мы попытались выяснить, способен ли магний влиять на уровень гормональной регуляции протонных помп тонопласта и может ли он, наряду с калием, изменять направленность гормонального воздействия. Была предпринята попытка выявить и сравнить изменения в активности Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы в присутствии и в отсутствии ионов калия и магния и выяснить, как скажется изменение ионного состава на чувствительности протонных насосов к воздействию фитогормонов. В условиях in vivo не всегда ионный состав в растении сбалансирован, что приводит к изменению активности ферментов.

Насколько нарушение оптимального соотношения основных ионов может сказываться на гормональной регуляции этих ферментов и насколько ионная и гормональная регуляция взаимозависимы?

Рис. 16. Изменение гидролитической активности протонных помп тонопласта в присутствии гормонов в средах с разным ионным составом: А - контроль; Б - без ионов (К+и М§2+); В - 3 мМ М§2+; Г - 70 мМ К+; Д -3 мМ М§2+ и 70 мМ К+; Е - 3 мМ М§2+, 70 мМ К+ и, 100 мМ и 8042-. 1-активность ферментов в среде без основных регуляторных ионов; 2 -активность ферментов в среде, содержащей 3 мМ М§2+; 3 - активность ферментов в среде, содержащей 70 мМ К+; 4 - активность ферментов в среде, содержащей 3 мМ М§2+ и 70 мМ К+; 5 - активность ферментов в среде, содержащей 100 мМ и Б042-.

Результаты этих экспериментов приведены на рис. 16. Из данных, представленных на этом рисунке, были сделаны следующие выводы.

1. Гидролитическая активность Н+-пирофосфатазы в большей степени, чем активность Н+-АТФазы, зависит от ионов, особенно от ионов магния. При этом ионная стимуляция для Н+-пирофосфатазы была более существенна, чем гормональная.

2. Гормональная регуляция может проявляться на неоптимальном

ионном фоне, но в этих неблагоприятных для фермента условиях гормональная регуляция существенно зависила от условий эксперимента, что может быть связано с высокой чувствительностью фермента к внешним воздействиям и малой величиной самой гидролитической активности.

3. Фитогормоны могут поддерживать активность Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы в условиях ионного дефицита или в условиях, стрессовых по ионному составу.

Роль фитогормонов в регуляции сахаронакопления в вакуолях.

Изучение транспорта сахарозы проводили на изолированных вакуолях, выделенных в первый год вегетации, в период активного роста и сахаронакопления, и на втором году вегетации, в период генеративного роста, для которого характерен отток сахарозы из вакуолей. Параллельно с изучением влияния фитогормона на поступление сахарозы в вакуоль измерялась гидролитическая активность протонных помп тонопласта и прослеживалось изменение этой активности под влиянием изучаемого фитогормона. Данные, приведённые в предыдущих разделах, не могли быть использованы в этих экспериментах в качестве контроля потому, что, как было показано ранее, гидролитическая активность очень сильно зависила от среды инкубации, а в экспериментах по изучению поступления сахарозы пришлось внести изменения в среду инкубации. В частности пришлось уменьшить содержание KCI для получения в экспериментах более нативного электрохимического потенциала. При изучении гормональной регуляции активного поглощения сахарозы в растворы без субстратов (контроль) и с субстратами (опытные варианты) добавляли гормоны в концентрациях, наиболее эффективно влияющих на активность протонных помп тонопласта (10-8 М - ИУК, АБК; 10-10 М -кинетин, ГК; 10-11 М -ЭБ). Результаты по влиянию фитогормонов на поступление 3Н-сахарозы в изолированные вакуоли и на активность Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы на разных фазах онтогенеза приведены в таблице 5.

Из приведённых в таблице 5 результатов можно сделать следующие выводы.

1. Фитогормоны могут влиять на поступление сахарозы в изолированные вакуоли. Механизм стимулирования сахаронакопления в частности может быть связан с увеличением активности протонной помпы тонопласта, обеспечивающей процессы активного транспорта. Так, АБК, ГК и ЭБ осуществляли стимуляцию поступления сахарозы на первом году вегетации одновременно с увеличением активности Н+-АТФазы.

2. Каждый фитогормон (за исключением ИУК, которая в наших экспериментах влияния не оказывала) на разных фазах роста по-своему воздействовал на поступление сахарозы: АБК оказывала стимулирующее воздействие, а кинетин - ингибирующее, но только на первом году вегетации; ГК и ЭБ - и на первом, и на втором году вегетации

оказывали существенное стимулирующее действие, причём ГК на первом году вегетации стимулировал как поступление сахарозы, так и увеличивал активность Н+-АТФазы, а на втором году вегетации усиление транспорта сахарозы было сопряжено с увеличением активности Н+-пирофосфатазы.

Таблица 5.

Влияние фитогормонов на транспорт 3Н-сахарозы в изолированные вакуоли и на активность ЬГ-АТФазы и Н+-пирофосфатазы на разных фазах онтогенеза.(Транспорт 3Н-сахарозы указан в нМ сахарозы/мМ бетацианина в час, а активность протонных помп в мкМ Фн / мМ бетацианина в час)

Фазы онтогенеза Первый год вегетации Второй год вегетации

Вариант опыта +АТФ +ИУК % + ПФ + ИУК % + АТФ + ИУК % + ПФ + ИУК %

транспорт 5Н-сахарозы 15,2 ±3,3 99 14,6 ±3,2 73 14,4 ±2,3 104 14,0 ±2,3 110

активность протонных помп 5,8 ±1,2 97 8,5 ±1,3 70 8,4±1,4 127 21,7 ±2,3 115

Вариант опыта +АТФ +АБК % + ПФ +АБК % + АТФ + АБК % + ПФ + АБК %

транспорт 3Н-сахарозы 19,9 ±3,0 131 20,8 ±3,0 104 10,2 ±2,0 74 13,4 ±2,0 105

активность протонных помп 7,8±1,0 129 10,9 ±1,0 90 7,2±1,0 108 23,6 ±1,3 125

Вариант опыта +АТФ + кин % + ПФ + кин % + АТФ + кин % + ПФ + кин %

транспорт 'Н-сахарозы 15,6 ±3,0 102 17,0 ±3,0 85 7,6 ±2,0 55 13,0 ±2,0 102

активность протонных помп 7,2±1,0 120 10,2 ±1,0 84 7Д±1,0 103 23,8 ±1,3 126

Вариант опыта + АТФ + ГК % + ПФ + ГК % + АТФ + ГК % + ПФ + ГК %

транспорт 3Н-сахарозы 19,6 ±3,0 128 19,0 ±3,0 90 5 ,8±2,0 42 18,0 ±2,0 129

активность протонных помп 8,2±1,0 136 11,9 ±1,0 98 7,2±1,0 111 25,5 ±1,3 135

Вариант опыта +АТФ + ЭБ % + ПФ + ЭБ % + АТФ + ЭБ % + ПФ + ЭБ %

транспорт 3Н-сахарозы 21,6 ±3,0 141 16,4 ±3,0 62 19,0 ±2,0 138 11,3 ±2,0 89

активность протонных помп 8,7±1,0 145 11,8 ±1,0 98 8,4±1,0 125 26,6 ±1,0 141

3. Наиболее эффективным из всех изученных фитогормонов оказался ЭБ. Он влиял на поступление сахарозы на первом и на втором году

вегетации, причём его стимулирующее влияние было коррелированно с увеличением гидролитической активности Н+-АТФазы на обеих фазах онтогенеза.

4. Наиболее существенное воздействие фитогормоны оказывали на первом году вегетации, что, вероятно, связано с их аттрагирующей функцией.

Гормональный статус корнеплода в онтогенезе и его связь с регуляцией активности протонных помп тонопласта и сахаронакоплением.

Данных в литературе по содержанию фитогормонов в корнеплоде столовой свёклы на разных фазах онтогенеза найти не удалось. Однако они были нужны для интерпретации наших результатов по гормональной регуляции гидролитической и транспортной активности протонных помп тонопласта и гормональной регуляции поступления меченой сахарозы в изолированные вакуоли, которые проводились in vitro. Необходимо было разобраться, что происходит в корнеплоде in vivo, какие фитогормоны и на какой фазе онтогенеза преобладают, и могут ли они действительно оказывать своё регулирующее влияние в изучаемый период. С этой целью было исследовано содержание в корнеплоде основных классов фитогормонов на первом году вегетации, в период покоя и на втором году вегетации. Результаты этих экспериментов приведены на рис. 17. В таблице 6 приведены соотношения фитогормонов в корнеплоде столовой свёклы на разных этапах онтогенеза. Соотношение гормонов - одна из наиболее важных характеристик, позволяющих оценить метаболическую активность органа. Так, смена акцепторной функции листа на донорную происходила на фоне снижения содержания ИУК и соотношения ИУК / АБК. На фоне более высокого отношения ИУК / АБК клубни картофеля характеризовались более быстрыми темпами роста и определёнными анатомо-морфологическими особенностями (размерами клеток коры, толщиной перидермы и др.) (Пузина, 1999). В корнеплоде столовой свёклы этот показатель, по-видимому, также может характеризовать скорость роста корнеплода и ряд других характеристик. Рассмотрев отношение ИУК /АБК в онтогенезе корнеплода столовой свёклы можно констатировать, что максимальные темпы роста соответствовали началу первого года вегетации. В этот же период корнеплод обладал и максимальной аттрагирующей способностью (акцепторной способностью), которая менялась на донорную в начале второго года вегетации, когда начинался отток сахарозы из корнеплода. При смене акцепторной способности на донорную соотношение ИУК / АБК минимально и составляло всего 0,04 (против 1,13 в начале первого года вегетации).

Другие соотношения также достаточно информативны. Повышение уровня суммы двух фитогормонов - ИУК и зеатин + зеатинрибозид -способствовало развитию подземных запасающих тканей у корнеплода редиса (Bukhov et.al., 1996) и усиливало запасание биомассы, что было

связано также с повышением уровня эндогенных гиббереллинов в корнеплоде (Дроздова и др. 1999). Ключевыми соотношениями фитогормонов, определяющими темпы роста, являлись: для стебля картофеля - ГК / АБК, для столонов - ИУК + ГК / АБК (Пузина, 1999).

Рис. 17. Динамика содержания фитогормонов в онтогенезе столовой свёклы: А - ИУК; Б- АБК; В - ГК; Г - цитокинины

В онтогенезе корнеплода столовой свёклы все рассмотренные соотношения фитогормонов имели максимальную величину в начале первого года вегетации (таблица 6). Выявленное соотношение фитогормонов позволяло на этой стадии онтогенеза осуществлять максимальную аттрагирующую функцию, которая резко падала в период покоя. Величина соотношения ЦК / АБК и ИУК + ЦК / АБК от начала первого года вегетации (1-1) к периоду покоя (II-1) падала в 6,5 раз, а соотношение ГК / АБК и ИУК + ЦК + ГК / АБК - в 8,5 раз. Ещё более резко падало соотношение фитогормонов при переходе на второй год вегетации и смене акцепторной способности по отношению к сахарозе на донорную с потерей аттрагирующей способности. Соотношение фитогормонов 1-1 / Ш-1 стадия онтогенеза ЦК / АБК и ИУК + ЦК / АБК падало в 25,6 раз, соотношение ИУК / АБК падало в 27,5 раз, соотношение ИУК + ЦК + ГК / АБК падало в 109,5 раз, а соотношение ГК /АБК в 122,4 раза.

Поэтому мы полагаем, что по соотношению фитогормонов можно оценить аттрагирующую способность корнеплода столовой свёклы. При

максимальной аттрагирующей способности в начале первого года вегетации соотношение ИУК, ГК, ЦК к АБК было наибольшим. В период оттока сахарозы это соотношение резко падало. Больше всего это падение отмечено для соотношения ГК / АБК.

Таблица 6.

Соотношение фитогормонов в корнеплоде столовой свёклы на разных этапах онтогенеза

Период онтогенеза I- 1 1-2 II-1 II-2 III-1 III-2

Соотношение ИУК/АБК 1,13 * 0,04 0,46

Соотношение ЦК/АБК 42,5 6,7 0,93 1,67 0,49

Соотношение ИУК+ЦК/АБК 43,6 6,7 0,93 1,7 0,95

ГК/АБК 1358,5 - 157,9 248,5 11,1 18,8

ИУК + ГК + ЦК/АБК 1402,6 - 164,5 249,4 12,8 19,7

* Прочерк ставится в том случае, когда один из гормонов

присутствует в следовых количествах или не определяется из-за низкого содержания и соотношение рассчитать нельзя

Из всего вышесказанного можно сделать вывод о том, что результаты исследований, проведённых in vitro по гормональной регуляции активности протонных помп тонопласта и поступлению меченой сахарозы в изолированные вакуоли, могут иметь место in vivo, так как для этого есть следующие необходимые условия:

1) достаточно высокое содержание в корнеплоде столовой свёклы в период сахаронакопления и максимальной аттрагирующей способности таких фитогормонов как ИУК, ГК и ЦК. Причём последний фитогормон в этот период онтогенеза содержится в максимальном количестве. Остальные два гормона тоже имеют на этой стадии онтогенеза пик количественного содержания;

2) максимальная аттрагирующая способность корнеплода обеспечивается оптимальным соотношением фитогормонов в корнеплоде. При потере аттрагирующей способности соотношения фитогормонов резко изменяются. Особенно существенно уменьшается соотношение ГК / АБК (в 122,4 раза).

Из экспериментов по изучению гормонального статуса корнеплода столовой свёклы можно сделать следующие выводы.

1. Все изученные фитогормоны имеют по два пика возрастания содержания в онтогенезе. Один, обычно менее выраженный (за исключением цитокининов), - в период активных ростовых процессов и сахаронакопления, второй же, более мощный, - в период подготовки и прохождения генеративных процессов.

2. Выявленная динамика содержания фитогормонов подтверждает возможность регуляции фитогормонами активности протонных помп

тонопласта и поступления сахарозы в вакуоли in vivo.

3. Первый пик содержания фитогормонов может принимать участие в регуляции процессов аттракции посредством стимуляции активности протонных помп тонопласта. Второй, вероятно, может участвовать в мобилизации сахарозы для осуществления репродуктивных процессов через активацию Н+-пирофосфатазы.

4. Выявленные соотношения фитогормонов могут обеспечить максимальную аттрагирующую способность корнеплода столовой свёклы. При максимальной аттрагирующей способности в начале первого года вегетации соотношение ИУК, ГК, ЦК к АБК было наибольшим. В период оттока сахарозы оно резко падало.

Влияние фитогормонов на изменение массы и содержание Сахаров в корнеплодах столовой свёклы в полевых экспериментах.

Для того чтобы установить, будут ли гормоны влиять на накопление Сахаров в корнеплоде столовой свёклы, были заложены эксперименты с обработкой растений столовой свёклы в фазе 6-8 листьев фитогормонами в полевых условиях. Определяли массу корнеплодов и содержание Сахаров в обработанных гормонами и контрольных растениях.

Эксперименты проводились в течение трёх лет. Из-за особенностей резко континентального климата Сибири внешние условия оказывали существенное влияние на массу корнеплодов столовой свёклы, что хорошо видно из таблицы 7 при сравнении контрольных вариантов за разные годы. Наиболее благоприятным был 2001 год, когда масса корнеплода в контроле более чем в 1,5 раза превышал этот показатель в 2000 и 2002 годах.

Рис. 18. Корнеплоды столовой свёклы, полученные в полевом эксперименте 2000 года: 1 - средний необработанный корнеплод (контроль); 2 - крупный корнеплод, обработанный ЭБ; 3 - средний корнеплод, обработанный ЭБ

Из данных таблицы 7 видно, что масса корнеплода у обработанных фитогормонами растений существенно отличается от контрольных. Особенно велико это отличие для растений, обработанных ЭБ. Такие растения в 2,25 раза превышают размер и массу контрольных растений (2000 год). Отсюда можно сделать вывод о том, что урожайность столовой свёклы может заметно увеличиваться после обработки фитогормонами, особенно стероидной природы (рис. 18).

В таблице 8 приведены данные по содержанию Сахаров на один корнеплод без обработки и после обработки фитогормонами. Неблагоприятные условия 2002 года негативно сказались не только на массе корнеплодов столовой свёклы, но и на содержании в них Сахаров. В контрольном варианте 2002 года содержание Сахаров значительно ниже, чем в предыдущие годы (таблица 8). При расчёте содержания Сахаров на 1 корнеплод после обработки фитогормонами в ряде случаев было отмечено увеличение содержания Сахаров. Наиболее стабильно увеличение Сахаров было выявлено после обработки растений ЭБ (149-160 %), но и другие фитогормоны в отдельные годы увеличивали этот показатель: на 146% (АБК-2000 г.), 139% (ИУК-2001г.), 132% (ГК -2000г.).

Таблица 7.

Масса корнеплодов столовой свёклы в полевых экспериментах

после обработке фитогормонами

Вариант 2000 год 2001 год 2002 год

масса <Х % масса <Х % масса о, %

(г) (г) (г)

Контроль 455±49 100 701±51 100 430±12 100

ЭБ 1027±10 226 960±54 137 534±16 124

АБК 801±71 176 768±52 110 623 ±3 0 145

ИУК 623±73 137 924±41 132 388±15 90

Кинетин 605±31 133 852±56 122 450±17 105

Гк 711±57 156 926±48 132 529±25 123

Таблица 8.

Содержание Сахаров в одном корнеплоде столовой свёклы в полевых

экспериментах после обработки фитoгopмoнaмИ

Вариант

2000 год

2001 год

г сах./ 1 <Х % г сах./1 % г сах./1 <Х %

корнеплод корнеплод корнеплод

Контроль 91±13 100 153±3 100 19,7±1,7 100

ЭБ 13&ЫЭ 149 245±9 160 21, 6±0,6 110

АБК 133±9 146 146±8 95 23,1±1, 4 118

ИУК 101±9 Ш 213±9 139 19,6±1,2 91

Кинетин 96±4 105 167±9 109 19,8±0,7 107

гк 120±8 132 186±8 122 19,0±1,2 97

2002 год

Полученные результаты показывают, что обработку фитогормонами в полевых условиях можно использовать для увеличения массы корнеплода, при этом одновременно будет возрастать такой показатель, как содержание Сахаров в одном корнеплоде.

Повышение массы корнеплода и содержания Сахаров в одном корнеплоде в наших экспериментах может быть связано с усилением процесса аттракции в корнеплодах столовой свёклы. Это усиление могло быть вызвано фитогормонами, которые претендуют на роль возможных регуляторов аттракции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая полученные результаты можно заключить, что накопление метаболитов в корнеплоде столовой свёклы происходит в основном по механизму вторично-активного транспорта. Важность этого процесса для растения определяет необходимость наличия 2-х протонных помп. Их регуляция существенно различается: способы, стимулирующие одну протонную помпу, почти всегда не воздействуют или ингибируют вторую. Регуляция протонных помп тонопласта осуществляется на разных уровнях, которые могут взаимодействовать и взаимозаменяться. Она существенно зависит от онтогенеза и может определять процесс аттракции в корнеплоде столовой свёклы. Вероятная схема регуляции этого процесса может быть представлена в следующем виде.

Ионы

Фигогормоны

Схема одного из возможных регуая торных механизмов аттракции.

выводы

1. Процессы активного транспорта на тонопласте осуществляются более чем на 90% по механизму вторично-активного транспорта с участием протонных помп тонопласта - Н+-АТФазы (ЕС 3.6.1.34) и Н+-пирофосфатазы (ЕС 3.6.1.1.).

2. На вакуолярной мембране обнаружены сахарозо-связывающие белки, которые претендуют на участие в системе транспорта Сахаров через тонопласт и обладают способностью обратимо связывать сахарозу в депротонирующих условиях при рН 7,4, характерном для цитоплазмы.

3. Динамика активности протонных помп тонопласта хорошо коррелирует с динамикой накопления Сахаров в первый год вегетации растения. Сопоставление динамики активности ферментов на разных фазах онтогенеза позволяет предположить, что Н+-АТФаза в большей степени вовлечена в процессы сахаронакопления, а Н+-пирофосфотаза - в транспорт ионов, который также связан с накоплением Сахаров, в частности как компенсаторный путь поддержания осмотического потенциала вакуоли.

4. Изменение активности протонных помп тонопласта может осуществляться через изменения редокс-условий, окружающих ферменты. Кроме того активность Н+-АТФазы может регулироваться протеолитическими ферментами, поскольку в её структуре обнаружен автоингибиторный домен, удаление которого стимулирует активность фермента.

5. Фитогормоны способны оказывать влияние (в основном стимулирующего характера) на транспортную и гидролитическую активность протонных помп тонопласта. Чувствительность протонных помп к фитогормонам менялась в ходе онтогенеза и была максимальной на втором году вегетации. Н+-АТФаза проявляла большую чувствительность к воздействию гормонов по сравнению с Н+-пирофосфатазой. Действующие концентрации фитогормонов зависили от стадии онтогенеза: были минимальными в период активных ростовых процессов и генеративных процессов и увеличивались в период покоя.

6. При сопоставлении изменения физиологической активности протонных помп тонопласта под влияние ионов и фитогормонов было установлено, что ионная регуляция для Н+-пирофосфатазы является более значимой, чем гормональная, а у Н+-АТФазы - наоборот. В условиях ионного стресса фитогормоны могут поддерживать активность протонных помп тонопласта.

7. Показано, что фитогормоны могут влиять на поступления сахарозы в изолированные вакуоли. Одновременное сопоставление гормонального влияния на поступление сахарозы и на изменение активности протонных помп тонопласта позволило выдвинуть предположение о том, что механизм гормонального влияния на сахаронакопление может быть опосредован гормональным воздействием на протонные помпы тонопласта, обеспечивающие процессы активного транспорта.

8. Динамика содержания фитогормонов в корнеплоде указывает на

возможность гормональной регуляции активности протонных помп тонопласта и сахаронакопления в вакуоли in vivo.

9. В экспериментах на целом растении использование метода обработки фитогормонами позволило увеличить массу корнеплода, а также такой показатель, как содержание Сахаров в одном корнеплоде.

10. На основании проведённых исследований создана обобщающая схема, из которой следует, что один из возможных механизмов аттракции в корнеплодах состоит в стимуляции активности протонных помп тонопласта - конечном пути дальнего транспорта метаболитов. А все вещества, усиливающие активность протонных помп тонопласта, можно отнести к аттрактантам.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Саляев. Р.К., Кузеванов В.Я., Озолина Н.В., Каменкова Л.Д., Пузанова Н.А. Содержание липидов, белков и углеводов в мембранах изолированных вакуолей красной столовой свёклы // Физиология растений. 1982. т. 29. вып. 5. С. 933-940.

2. Саляев Р.К., Озолина Н.В., Кузеванов В.Я. Особенности белкового и полипептидного состава изолированного тонопласта красной столовой свёклы // Физиология растений. 1983. т.ЗО. вып. 2. С. 241-246.

3. Саляев Р.К., Козаренко Т.Д., Озолина Н.В., Кузеванов В.Я., Аминокислотный состав изолированной вакуолярной мембраны // Физиология растений. 1983. т. 30. вып. 35. С. 487-492.

4. Salyaev R.K., Kuzevanov V.Ya., Ozolina N.V. Structure of vacuole membrane as related to its functions // II International Symposium. Sofia. Bulgaria. 1984. P. 13-20.

5. Salyaev R.K., Kuzevanov V.Ya., Ozolina N.V., Khaptagaev S.B. Chemical composition and ionic permeability of the isolated plant vacuole membrane // XIII International Biochemical Congress. Amsterdam. 1985. P.466.

6. Саляев Р.К., Кузеванов В.Я., Озолина Н.В., Хаптагаев СП., Макаренко СП. Особенности химического состава вакуолярных мембран // В сб. «Структура и функции биол. мембран растений». Новосибирск. Наука. 1985. С.119-130.

7. Salyaev R.K., Ozolina N.V., Katkov B.B., Nefedyeva T.V. Protein composition ofthe vacuolar membrane // 18-th FEBS Meeting. Ljubljana. 1987. Abs.P.164.

8. Озолина Н.В. Саляев Р.К. Углеводсвязывающая способность интегральных белков тонопласта и их вероятная роль в транспорте // ДАН. 199О.т.315.№З.С765-767.

9. Озолина Н.В., Саляев Р.К., Кузеванов В.Я. Изучение ферментативной активности тонопласта // Известия АН СССР. Серия биологическая. 1991. т. 6. С.434-439.

10. Саляев Р.К., Озолина Н.В. Выделение углеводсвязывающих

белков тонопласта - возможных компонентов систем транспорта Сахаров // В сб. "Биоэлектрогенез и транспортные процессы у растений" Нижний Новгород. 1991. С. 21-26.

11. Саляев Р.К., Озолина Н.В., Прадедова Е.В. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность фосфогидролаз тонопласта // ДАН. 1994. т. 339. № 2. С. 281-283.

12. Salyaev R.K., Ozolina N.V., Pradedova E.V. Effects of phytohormons on hydrolitic activity of phosphohydrolases of the tonoplast // Plant Growth Regulation. 1996.V. 19. № 2. P. 189-191.

13. Саляев Р.К., Озолина Н.В., Прадедова Е.В. Влияние гиббериллина на гидролитическую активность протонных помп тонопласта в онтогенезе красной столовой свеклы // ДАН. 1996. Т. 346. № 3. С. 410-412.

14. Саляев Р.К., Озолина Н.В., Прадедова Е.В. Регуляция гидролитической активности протонных помп тонопласта фитогормонами на первых фазах онтогенеза у красной столовой свеклы // ДАН. 1997. т. 352. № 1.С. 137-139.

15. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Дударева Л. В., Саляев Р.К. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на гидролитическую активность протонных помп вакуолярной мембраны // Биологические мембраны. 1997. т. 14. № 1. С. 125-127.

16. Саляев Р.К., Озолина Н.В., Прадедова Е.В. Влияние экзогенных фитогормонов и кинетина на гидролитическую активность протонных помп тонопласта в онтогенезе столовой свеклы // Физиология растений. 1999. т. 46. № 1.С. 5-8.

17. Прадедова Е.В., Озолина Н.В., Саляев Р.К., Юшкевич Т.Н. Динамика гидролитической активности Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы тонопласта в онтогенезе столовой свеклы // ДАН. 1999. т. 364. № 6. С. 835838.

18. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Реуцкая A.M., Саляев Р.К. Влияние брассиностероидов на протонные помпы тонопласта // ДАН. 1999. т.364. № 6. С. 929-830.

19. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Реуцкая A.M., Саляев Р.К. Обнаружение автоингибиторного домена у Н-АТФазы тонопласта // Биологические мембраны. 2000. т. 17. № 2. С. 247-249.

20. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Саляев Р.К. Взаимодействие ионной и гормональной регуляции протонных помп тонопласта // Биологические мембраны. 2000. т. 17. № 4. С. 395-398.

21. Прадедова Е.В., Озолина Н.В., Саляев Р.К., Корзун A.M. Действие эпибрассинолида на ативность Н-АТФазы и Н-пирофосфатазы в условиях высоких и низких концентраций KCI. // Биологические мембраны. 2002. т. 19. № 3. С. 216-220.

22. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Саляев Р.К. Динамика изменения гормонального статуса корнеплода столовой свёклы в онтогенезе и её связь с регуляцией активности протонных помп тонопласта // Вестник Харьковского национального аграрного университета. Серия Биология.

2003. № 3(2). С. 78-86.

23. Прадедова Е.В., Озолина Н.В., Саляев Р.К. Влияние фитогормонов на протонные насосы тонопласта корнеплодов столовой свёклы Beta vulgaris L в разных буферных системах // Биологические мембраны. 2004. т.21.№ 1. С.15-18.

24. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Платонова Т.А., Саляев Р.К. Обнаружение ванадат-подавляемой АТФазной активности на тонопласте столовой свёклы и её связь ABC-транспортерами // ДАН. 2004. т. 396. № 2. С. 270-272.

25. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Саляев Р.К. Влияние эпибрассинолида на активность протонных помп тонопласта и на поступление сахарозы в вакуоли столовой свёклы {Beta vulgaris L) в период активного роста и сахаронакопления // Вестник Харьковского национального аграрного университета. Серия Биология. 2004. вып. 1(4). С.34-39.

26. Сапега Ю.Г., Прадедова Е.В., Озолина Н.В., Саляев Р.К. Влияние редокс-агентов на гидролитическую активность Н+-АТФазы вакуолярной мембраны растений // ДАН. 2004. т. 398. № 6. С. 838-840.

27. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Саляев Р.К. Динамика изменения гормонального статуса корнеплода столовой свёклы {Beta vulgaris £,.) в онтогенезе и её связь с динамикой накопления Сахаров // Известия АН. Серия биологическая. 2005. № 1.

Автор выражает искреннюю благодарность научному консультанту советнику РАН, члену-корреспонденту РАН Р.К.Саляеву за внимание и ценные замечания, к.б.н. Е.В.Прадедовой и всем сотрудникам лаборатории за помощь в работе и поддержку, а также сотрудникам группы физических методов исследования, обеспечившим проведения ряда экспериментов.

¡ -,

«к —

ш

/ 1 1 1

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Озолина, Наталья Владимировна

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Вакуолярная мембрана и роль вакуоли в растительной клетке.

1.1. Функции вакуоли в клетках высших растений.

1.2. Тонопласт: особенности химического состава и физиологическая роль белков.

2. Процессы транспорта в растениях.

2.1. Механизмы мембранного транспорта на тонопласте.

2.2. Транспорт сахарозы в растении.

3. Протонные помпы тонопласта.

3.1. Н+-АТФаза (ЕС 3.6.1.34).

3.2. Н+-пирофосфатаза (ЕС 3.6.1.1.).

4. Регуляция активности протонных помп тонопласта.

5. Аттракция и донорно-акцепторные отношения. Роль фитогормонов в их регуляции.

6. Выводы из литературного обзора. Цели и задачи работы.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Характеристика изолированных вакуолей и фракции изолированных мембран, использованных в экспериментах.

2. Участие белков переменной аффинности в переносе сахарозы через тонопласт.

3. Динамика гидролитической активности протонных помп тонопласта и накопление сахарозы в онтогенезе столовой свёклы.

4. Изучение изменения физиологической активности протонных

4.1. Изучение изменения физиологической активности протонных помп тонопласта методом протеолиза.

4.2. Изучение изменения физиологической активности протонных помп тонопласта методом редокс-регуляции.

4.3. Роль фитогормонов в изменении гидролитической и транспортной активностей протонных помп тонопласта в онтогенезе.

4.3.1. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н+-АТФазы в начале первого года вегетации.

4.3.2. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность ЬГ^-пирофосфатазы в начале первого года вегетации.

4.3.3. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н+-АТФазы в конце первого года вегетации.

4.3.4. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н+-пирофосфатазы тонопласта в конце первого года вегетации.

4.3.5. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н*-АТФазы в период покоя.

4.3.6.Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н+-пирофосфатазы в период покоя.

4.3.7. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность ЬГ-АТФазы на втором году вегетации.

4.3.8. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н+-пирофосфатазы на втором году вегетации.186 4.4. Взаимодействие ионного и гормонального влияния на изменение гидролитической активности протонных помп тонопласта.

4.4.1. Влияние ионного состава среды инкубации на гидролитическую активность протонных помп тонопласта в разных буферных системах.

4.4.2. Изучение гормонального влияния в среде без основных регуляторных ионов (

§ и К ).

4.4.3. Изучение гормонального влияния в среде с ионами магния (Мв+2).

4.4.4. Изучение гормонального влияния в среде с ионами калия (К+).

4.4.5.Изучение гормонального влияния в среде с ионами магния и калия (

§ и К ).

4.5. Влияние фитогормонов на транспортную активность протонных помп тонопласта.

4.6. Сопоставление влияния фитогормонов на гидролитическую и на транспортную активности протонных помп тонопласта.

5. Роль фитогормонов в сахаронакоплении.

5.1. Влияние ИУК на поступление меченой сахарозы в изолированные вакуоли.

5.2. Влияние АБК на поступление меченой сахарозы в изолированные вакуоли.|.

5.3. Влияние кинетина на поступление меченой сахарозы в изолированные вакуоли.

5.4. Влияние ГК на поступление меченой сахарозы в изолированные вакуоли.

5.5. Влияние ЭБ на поступление меченой сахарозы в изолированные вакуоли.

6. Гормональный статус корнеплода в онтогенезе и его связь с физиологической активностью протонных помп тонопласта и сахаронакоплением.

6.1. Изменение количества ИУК в корнеплодах столовой свёклы на разных этапах онтогенеза.

6.2. Изменение количества АБК в корнеплодах столовой свёклы на разных этапах онтогенеза.

6.3. Изменение количества цитокининов в корнеплодах столовой свёклы на разных этапах онтогенеза.

6.4. Изменение количества гиббереллиноподобных веществ (ГПВ) в корнеплодах столовой свёклы на разных этапах онтогенеза.

6.5. Соотношение фитогормонов в корнеплоде столовой свёклы на разных этапах онтогенеза.

7. Влияние фитогормонов на изменение массы и содержание Сахаров в корнеплодах столовой свёклы в полевых экспериментах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Протонные помпы тонопласта, их функциональная активность и связь с транспортом и накоплением метаболитов"

Современный этап развития биологии характеризуется исследованиями в ряде приоритетных научных направлений, одним из которых является изучение механизмов мембранного транспорта. Менее всего в настоящее время изучены эти механизмы применительно к специфичной для растений мембране - вакуолярной.

Наличие вакуоли является отличительной особенностью растительной клетки. Её роль в жизнедеятельности растений достаточно велика. В настоящее время показано, что это полифункциональный компартмент, который занимает особое место в структурной и функциональной организации растительного организма. Трудно переоценить роль вакуоли в регуляции клеточного объёма, тургора, а также рН и ионного гомеостаза цитозоля, что обеспечивает работу ферментов цитоплазмы, в изоляции вторичных продуктов метаболизма и метаболических ядов, в трансдукции сигналов различной природы, в процессах апоптоза, в ответных защитных реакциях растения на стрессовое воздействие и т.д. (Андреев, 2001). Одна из важнейших функций вакуоли состоит в запасании метаболитов (Курсанов, 1976).

В выполнении указанных функций ключевая роль принадлежит уникальной клеточной мембране - тонопласту. На сегодня известно, что вакуолярная мембрана содержит ряд специализированных систем пассивного и активного переноса веществ: каналы, переносчики, протонные помпы. Основной вклад в транспорт на тонопласте вносят две протонные помпы: Н^-АТФаза (ЕС 3.6.1.34) и Н^-пирофосфатаза (ЕС 3.6.1.1.)(Rea, Sanders, 1987). Оба фермента способны преобразовывать освобождённую при гидролизе АТФ и неорганического пирофосфата энергию в перенос протонов через тонопласт. Генерируемая разность электрохимического потенциала расходуется на вторичный транспорт ионов, Сахаров, аминокислот, который осуществляется через каналы и переносчики. Таким образом, Н^-АТФаза и Н^-пирофосфтаза являются ключевыми ферментами в системе переноса углеводов и других соединений в антипорте с протоном (Биэкт е1 а!., 1985; Саляев, Катков, 1988). В связи с этим протонные насосы тонопласта привлекают постоянное внимание исследователей и интенсивно изучаются. Однако процессы регуляции активности этих ключевых ферментов изучены слабо и представляют особый интерес с точки зрения возможности управления транспортом метаболитов.

Основным метаболитом, запасаемым в растении (в отличие от глюкозы в животной клетке), является сахароза. Процессы синтеза и транспортировки сахарозы по растению в настоящее время изучаются. Но каким бы способом ни транспортировалась сахароза (по симпласту или по апопласту), конечный этап дальнего транспорта - вакуолярная мембрана, которая содержит переносчик сахарозы и протонные помпы, обеспечивающие процесс транспорта. Путь к тонопласту идёт по донорно-акцепторным градиентам, а скорость закачивания сахарозы в вакуоль, которая зависит от активности протонных помп тонопласта, может являться в этом процессе одним из определяющих звеньев, регуляция которого будет определять процесс аттракции.

Аттракция - давно известное в физиологии растений понятие, значимость изучения которого в последнее время существенно возросла, поскольку большая часть исследователей склоняется к мнению о ведущей роли аттракции в продуктивности (Ламан, Прохоров, 1999). Процессы онтогенеза обеспечивают постоянное существование в растении аттрагирующих центров, т.е. структурных зон с большим фондом активных генов, возникающих в ходе реализации генетической программы развития. В аттрагирующих центрах происходят либо интенсивная репликация генетического материала и новообразование структур, либо интенсивный однонаправленный синтез и накопление запасных веществ, В том и другом случаях состояние аттрагирующих центров и их метаболическая активность определяют потребность в ассимилятах, величину "запроса на фотосинтез", скорость и направление транспорта ассимилятов (Мокроносов, 1981).

Развитие корнеплодов свёклы тесно связано с процессами сахаронакопления. Конечным этапом дальнего транспорта сахарозы в период сахаронакопления является переносчик сахарозы на тонопласте в корнеплоде. Его аффинность и активность протонных помп тонопласта будут отвечать за процесс сахаронакопления. Поэтому нами была предпринята работа по изучению функциональной активности протонных помп тонопласта и процессов сахаронакопления, которые они определяют. Вначале нами были использованы подходы, которые оказались плодотворными при изучении других мембран растений, в частности плазматической, но в дальнейшем был сделан акцент на изучение гормонального влияния на протонные помпы тонопласта и процесс сахаронакопления. Прежде всего, это было сделано потому, что имеются данные, показывающие, что аттрагирующая способность акцепторов ассимилятов находится под гормональным контролем, т.е. фитогормоны обладают агграгирующем действием и претендуют на одну из ведущих ролей в процессе аттракции (Кузьмина, 1997; Роньжина, 1999).

Гормональная регуляция активности протонных помп тонопласта и сахаронакопления была нами изучена на изолированных вакуолях на всех этапах онтогенеза, а также на целом растении в полевых экспериментах, что дало возможность сделать ряд интересных выводов. Сопоставление регуляции активности протонных помп тонопласта с регуляцией сахаронакопления позволило выдвинуть гипотезу об одном из вероятных механизмов аттракции, который состоит в стимуляции протонных помп тонопласта - конечном этапе дальнего транспорта запасаемого метаболита.

При этом все вещества и способы, содействующие увеличению активности протонных помп тонопласта, могут претендовать на роль аттрагенов.

Работа выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).

Автор выражает благодарность научному консультанту советнику РАН, члену-корреспонденту РАН Р.К.Саляеву за внимание и ценные замечания, к.б.н., с.н.с. Е.В.Прадедовой и всем сотрудникам лаборатории за помощь в работе и поддержку, а также сотрудникам группы физических методов исследования, обеспечившим проведения ряда экспериментов.

Список часто применяемых в работе сокращений: АТФ - аденозинтрифосфат ПФн - неорганический пирофосфат Н^-АТФаза - Н+- аденозинтрифосфатаза Н+-ПФаза - Н+-пирофосфатаза ЭБ - эпибрассинолид ИУК - индолил-3 -уксусная кислота ГК - гибберелловая кислота ГПВ - гиббереллиноподобные вещества АБК - абсцизовая кислота Кинетин - 6-фурфуриламинопурин ДДС - додецилсульфат натрия ПХМБ - парахлормеркурийбензоат БАП - бензиламинопурин

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Основная часть процессов активного транспорта сахарозы на тонопласте (более 90%) осуществляется с участием протонных помп.

2. Протонные помпы тонопласта отвечают за поступление сахарозы в вакуолях (корнеплод), а изменение их активности связано с изменением сахаронакопления.

3. Регуляция протонных помп тонопласта осуществляется разными путями: изменением редокс-условий, ионного окружения, протеолизом, фитогормонами. Почти всегда, когда активируется одна протонная помпа, вторая либо не меняет своей активности, либо ингибируется.

4. Фитогормоны способны изменять активность протонных помп тонопласта и сахаронакопления. Этот процесс существенно зависит от онтогенеза и на всех фазах развития растения обеспечен фитогормонами в необходимых соотношениях.

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Озолина, Наталья Владимировна

VI. выводы

На основании результатов проведённой работы нами были сделаны следующие выводы.

1. Процессы активного транспорта на тонопласте осуществляются более чем на 90% по механизму вторично-активного транспорта с участием протонных помп тонопласта - Е^-АТФазы (ЕС 3.6.1.34) и ЬГ-пирофосфатазы (ЕС З.6.1.1.).

2. На вакуолярной мембране обнаружены сахарозо-связывающие белки, которые претендуют на участие в системе транспорта Сахаров через тонопласт и обладают способностью обратимо связывать сахарозу в депротонирующих условиях при рН 7,4, характерном для цитоплазмы.

3. Динамика активности протонных помп тонопласта хорошо коррелирует с динамикой накопления Сахаров в первый год вегетации растения. Сопоставление динамики активности ферментов на разных фазах онтогенеза позволяет предположить, что Н^-АТФаза в большей степени вовлечена в процессы сахаронакопления, а ЕГ-пирофосфотаза - в транспорт ионов, который также связан с накоплением Сахаров, в частности как компенсаторный путь поддержания осмотического потенциала вакуоли.

4. Изменение активности протонных помп тонопласта может осуществляться через изменения редокс-условий, окружающих ферменты. Кроме того активность Н+-АТФазы может регулироваться протеолитическими ферментами, поскольку в её структуре обнаружен автоингибиторный домен, удаление которого стимулирует активность фермента.

5. Фитогормоны способны оказывать влияние (в основном стимулирующего характера) на транспортную и гидролитическую активность протонных помп тонопласта. Чувствительность протонных помп к фитогормонам меняется в ходе онтогенеза и максимальна на втором году вегетации. Н+-АТФаза проявляла большую чувствительность к воздействию гормонов по сравнению с Н^пирофосфатазой. Действующие концентрации фитогормонов имели зависимость от стадии онтогенеза: были минимальными в период активных ростовых и генеративных процессов и увеличивались в период покоя.

6. При сопоставлении изменения физиологической активности протонных помп тонопласта под влияние ионов и фитогормонов было установлено, что ионная регуляция для ЬГ-пирофосфатазы является более значимой, чем гормональная, а у Н+-АТФазы -наоборот. В условиях ионного стресса фитогормоны могут поддерживать активность протонных помп тонопласта.

7. Показано, что фитогормоны могут влиять на поступления сахарозы в изолированные вакуоли. Одновременное сопоставление гормонального влияния на поступление сахарозы и на изменение активности протонных помп тонопласта позволило выдвинуть предположение о том, что механизм гормонального влияния на сахаронакопление может быть опосредован гормональным воздействием на протонные помпы тонопласта, обеспечивающие процессы активного транспорта.

8. Динамика содержания фитогормонов в корнеплоде указывает на возможность гормональной регуляции активности протонных помп тонопласта и сахаронакопления в вакуоли in vivo.

9. В экспериментах на целом растении использование метода обработки фитогормонами позволило увеличить массу корнеплода, а также такой показатель, как содержание Сахаров в одном корнеплоде.

10. На основании проведённых исследований создана обобщающая схема, из которой следует, что один из возможных механизмов аттракции в корнеплодах состоит в стимуляции активности протонных помп тонопласта - конечном пути дальнего транспорта метаболитов. А все вещества, усиливающие активность протонных помп тонопласта, могут быть отнесены к аттрактантам.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Было проведено изучение функциональной активности протонных помп тонопласта и процессов сахаронакопления in vitro. Исследования были начаты с изучения роли протонных помп в механизмах активного транспорта на тонопласте и позволили прийти к заключению, что основной поток метаболитов поступает в вакуоль с участием протонных помп тонопласта механизмом вторично-активного транспорта. Менее 10% активного транспорта осуществляется через ABC-транспортеры (Озолина и др., 2004а). На тонопласте нами были выявлены сахарозо-связывающие белки, которые принимают участие в системе транспорта Сахаров на вакуолярной мембране и обладают способностью обратимо связывать сахарозу в депротонирующих условиях при рН 7,4, характерном для цитоплазмы (Озолина, Саляев, 1990). Кроме того, была изучена динамика активности протонных помп тонопласта и показано, что она хорошо коррелирует с динамикой накопления Сахаров в первый год вегетации растений, а протонные помпы, по-видимому, вовлечены в процессы сахаронакопления. Причём если Н+-АТФаза в большей степени вовлечена именно в процессы сахаронакопления, то Н^-пирофосфатаза - в транспорт ионов, который также связан с накоплением Сахаров, в частности, как компенсаторный путь поддержания осмотического потенциала вакуоли (Прадедова и др., 1999). Эти результаты позволили сделать вывод о том, что функциональные изменения активности протонных помп тонопласта могут быть связаны с процессами накопления Сахаров в корнеплодах.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Озолина, Наталья Владимировна, Иркутск

1. Агулова Л.П. Проблемы и перспективы изучения космобиологических связей Биофизика. 1992. Т. 37, 3. 407-

2. Андреев И.М. Роль анион проводящих систем тонопласта Beta vulgaris в чувствительности АТФ-зависимой генерации АрН к осмотическому сжатию вакуолярной мембраны Биол. мембраны. 1992. Т. 9, 1. 19-25. 2. 3.

3. Андреев И.М. Функции вакуоли в клетках высших растений Физиология растений 2001 Т. 48, 5. 777-

4. Анисимов А.А., Булатова Т.А. Содержание

5. Багаутдинова Р.И. Реакция фотосинтетического аппарата на частичную деризоидацию Биол. науки. 1985. 2. 86-

6. Белоногов Д.Е., Калининская Т.А., Лихолат Т.В. Влияние гиббереллина и 6-бензиламинопурина на урожай семян и сухой массы клевера лугового Физиология растений. 1983. Т. 30, вып. 4. 724-730. 7.

7. Березкин В.Г., Бочков А.С. Количественная тонкослойная хроматография. Инструментальные методы. М,: Наука, 1989. -183 с. Борзенкова Р.А., Мокроносов А.Т. Эндогенные факторы, определяющие транспорт ассимилятов в клубни картофеля Труды Биол.почв. ин-та. Владивосток, 1973. Т. 20. 148-152.

8. Борзенкова Р.А., Лунева Е.О., Зорина М.В. Гормональная регуляция донорно-акцепторных ун-та, 1988.- 180 с.

9. Борзенкова Р.А., Собянина А.А., Багаутдинова Р.И., Федосеева Г.П., Поздеева А.А., Мичкова М.С. Содержание

10. Веселов А.П., Иудина К.А., Бушуева М.Н. Влияние распределения гиббереллинов на интенсивность метаболических процессов в стебле подсолнечника в связи с регуляцией транспорта ассимилятов Регуляция ферментативной активности у растений А.А.Анисимов. Горький: Издво Горьк. гос ун-т, 1986. 98 с.

12. Гамалей Ю.В. Надкл сточная организация растений Физиология растений. 1997. Т. 44, 6. 819-846.

13. Гамалей Ю.В., Пахомова М.В. Динамика транспорта и запасания углеводов в листьях растений с симпластной и апопластной загрузкой флоэмы в норме и при экстремальных воздействиях Физиология растений.-2000.-Т. 47, 1.-С. 120-142.

14. Девятков Н.Д., Зубкова СМ., Лапрун И.Б., Макеева Н.С. Физикохимические механизмы биологического действия лазерного излучения. Успехи современной биологии. 1987. Т. 103, 1, С, 31-43, 17. Дёрфлинг К. Гормоны растений. Системный подход. М: Мир, 1985, 303 с.

15. Дзагнидзе Ш.Ш., Долидзе М,Д., Чанишвили Ш.Ш. Влияние регуляторов роста на передвижение фотоассимилятов в побеге виноградной лозы Физиология растений. 1986. Т. 33, вып. 2 289-295.

16. Дроздова И.С, Бондар В.В., Егорова Е.А,, Котов А.А,, Котова Л.М., Маевская Н., Шугаев А.Г., Бухов Н.Г., Мокроносов А.Т. ДонорноА.П., Пальченко Л. А. Определение гиббереллинов в растительном материале Физиология растений. 1976. Т. 23, вып. 3.

17. Заякин В.В. Гормональная регуляция формирования генеративных органов люпина жёлтого: Автореф. дис. доктора биол. наук. Москва: МСХА, 1997.-35 с.

18. Карпов Е.А., Белозерова О.Л. Влияние регуляторов роста на фотосинтез и отток С-продуктов из листьев растений сои в репродуктивный период Физиология растений. 1985. Т. 32, вып. 3. 539-544.

19. Катков Б.Б,, Саляев Р.К. АТФазная и пирофосфатазная активность изолированных вакуолей растущего и хранящегося корнеплода Beta vulgaris L. Опер, информ. материалы СИФР1БР СО АН СССР. 1

21. Катков Б.Б. Антипорт сахарозы и Н" через вакуолярную мембрану клеток корнеплода свёклы Автореф. дис. канд. биол. наук. Иркутск.: СИФИБР СО АН СССР, 1989.-26 с.

22. Катков Б.Б., Корзун A.M., Саляев Р.К. Сохранение нативных свойств изолированных вакуолей корнеплода красной столовой свёклы, выделенных в растворах на основе KCI и сорбита Физиология растений. 1990. Т. 32. вып. 2. 362-370.

23. Кефели В.И., Коф Э.М., Власов П.В., Кислин Е.Н. Природный ингибитор роста абсцизовая кислота. М.: Наука, 1989. 184 с.

24. Киселёва И.С. Регуляция донорно-акцепторных отношений в системе колос-лист у ячменя в онтогенезе IV съезд общества физиологов растений России, Москва, 4-9 октября 1999. Тез. докл. Т. I. 126. 27.

25. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. М.: Мир, 1981. 2 т. 278 с. Клыба В. И. Спектрофлуориметр для исследования методом флуоресцентных зондов Опер, информ. материалы СИФИБР СО АН СССР. Иркутск, 1983. 32-34.

26. Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт. М.: Мир, 1980. 341 с.

27. Красавина М.С. Бурмистрова Н.А. О некоторых путях воздействия калия на процессы сахаронакопления Физиолого-биохимические основы продуктивности сахарной свёклы В.А. Борисюк Киев: ЦНИИС, 1989. 142-151.

28. Красавина М.С, Соколова СВ. Научная школа А.Л.Курсанова и развитие физиологии растений Физиология растений. 1997. Т. 44, Х2 6 809-818.

29. Кузеванов В.Я., Катков Б.Б., Кошкина СВ., Саляев Р.К. Влияние различных веш,еств на стабильность изолированных вакуолей растительных клеток Опер, информ. материалы СИФИБР СО АН СССР. -Иркутск, 1983.-С. 12-15.

30. Кузеванов В.Я., Саляев Р.К. Рецепторы лектинов на тонопласте и агглютинация изолированных вакуолей Физиология растений. 1984. Т.31,вып. 1.-С.73-81.

31. Кузьмина Г.Г., Нигматзянова Н.И., Чиков В.И. К вопросу о роли эндогенных фитогормонов в транспорте ассимилятов Доклады III всесоюз. конф. «Транспорт ассимилятов в растениях и проблемы сахаронакопления». Фрунзе, 1983. С 104.

32. Кузьмина Г.Г. Баланс эндогенных ИУК и АБК в листьях и репродуктивных органах на поздних этапах онтогенеза растений Физиология растений. 1997. Т. 44, 5. 769-774.

33. Кулаева О.Н. Влияние корней на обмен веществ листьев в связи с проблемой действия на лист кинетина Физиология растений. 1962. Т. 9, вып. 2 С 229-239.

34. Куликова А.Л. Структурные белки во флоэмном эксудате IV съезд общества физиологов растений России, Москва, 4-9 октября 1999. Тез. докл. Т. I. 129.

35. Курсанов А.Л. Транспорт ассимилятов в растении М.: Наука, 1976. 646 с.

36. Курсанов А.Л, Транспорт метаболитов и координация функций в организме растения Вестник АН СССР. 1984. 7. 39-47.

37. Курсанов А.Л., Прасолова М.Ф. Павлинова О.А. Пути ферментативного превращения сахарозы в корне сахарной свёклы в связи с его аттрагирующей функцией Физиология растений. 1989. Т. 36, вып. 4. С 629-641. 41.

38. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с. Ламан Н.А., Прохоров В.Н. Физиологические аспекты теории высоких урожаев сельскохозяйственных культур IV съезд общества физиологов растений России, Москва, 4-9 октября 1999. Тез. докл. Т. I. 268.

39. Лихачева А.В. Роль перекисного окисления липидов в регуляции систем поддержания клеточного гомеостаза у растений при стрессовых воздействиях. Автореф. дис. канд. биол. наук: Нижний Новгород: Нижегор. гос ун-т, 2002. 25 с.

40. Макаренко СП., Конёнкина Т.А,, Саляев Р.К. Химический состав и структура липидов вакуолярных мембран. Биол. мембраны. 1992. Т. 9, 3 С 290-300.

41. Макаренко СП., Саляев Р.К. Структура вакуолярных мембран растений по данным ИК-спектроскопии. Биол. мембраны. 1998. Т. 15, 3. 309-321. 46. 47.

42. Методические рекомендации по определению фитогормонов. Киев: Институт ботаники им, Н.Г.Холодного, 1986. 78 с. Мокроносов А.Т. Онтогенетический аспект фотосинтеза М.: Наука, 1981.- 195 с. Мокроносов А.Т. Донорно-акцепторные отношения в онтогенезе растений. Физиология фотосинтеза А.А.Ничипорович М.: Наука, 1982.- 235-251,

43. Мокроносов 64 с. А.Т. Фотосинтетическая функция целостность растительного организма: 42-е Тимирязевское чтение. М.: Наука, 1983.

44. Мокроносов А.Т. Взаимосвязь фотосинтеза и функций роста Фотосинтез и продукционный процесс А.А. Ничипорович. М.: Наука, 1988. 275 с.

45. Муромцев Г.С., Агнистикова В.Н. Гормоны растений гиббереллины. М.: Наука, 1973.-270 с.

46. Муромцев Г.С., Агнистикова В.Г. Гиббереллины М.: Наука, 1984 208 с.

47. Озолина Н.В., Кузеванов В.Я., Саляев Р.К. Изучение ферментативной активности тонопласта Известия АН СССР. Серия биологическая. 1991.-Т. 6 С 434-439.

48. Озолина Н.В. Саляев Р.К. Углеводсвязывающая способность интегральных белков тонопласта и их вероятная роль в транспорте ДАН. 1990. т. 315. №3.0.765-767.

49. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Реуцкая A.M., Саляев Р.К. Обнаружение автоингибиторного домена у Н-АТФазы тонопласта Биологические мембраны. 2000а. т. 17. 2. 247-249.

50. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Саляев Р.К. Взаимодействие ионной и гормональной регуляции протонных помп тонопласта Биологические мембраны. 20006. т. 17. 4. 395-398.

51. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Саляев Р.К. Динамика изменения гормонального статуса корнеплода столовой свёклы в онтогенезе и её связь с регуляцией активности протонных помп тонопласта Вестник Харьковского национального аграрного университета. Серия Биология. 2003. 3(2). 78-86.

52. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Платонова Т.А., Саляев Р.К. Обнаружение ванадат-подавляемой АТФазной активности на тонопласте столовой

53. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Саляев Р.К. Влияние эпибрассинолида на активность протонных помп тонопласта и на поступление сахарозы в вакуоли столовой свёклы сахаронакопления 60. {Beta vulgaris L.) в период активного роста и Вестник Харьковского национального аграрного университета. Серия Биология. 20046. вып. 1(4). 43-

54. Павлинова О.А., Туркина М.В. Биосинтез и физиологическуая роль сахарозы в растении Физиология растений. 1978. Т. 25, вып. 5. 1025-1041.

55. Павлинова О.А., Холодова В.П. Биохимические и мембранные аспекты сахаронакопления Новые направления в физиологии растений А.Л. Курсанов. М.: Наука, 1985. 252-274.

56. Палладина Т.А., Симчук Е.Е. Влияние стеринов на активность Н-АТФзы плазматических мембран клеток корней кукурузы Докл. АН СССР. 1990.-Т. 314,№4.-С. 1018-1020.

57. Палладина Т.А., Симчук Е.Е. Влияние брассиностероидов на процесс активного транспорта в плазматических мммембранах растительных клеток Тез. докл. сими. «Брассиностероиды 13-15 июня 1993, Минск. 4-5. 58. Палладина Т.А. Роль протонных насосов плазмалеммы и тонопласта в устойчивости растений к солевому стрессу Успехи современной биологии.-1999.-Т. 119, 5 С 451-461. 65. вв. Полевой В.В. Фитогормоны. Л.: изд-во ЛГУ, 1982. 248 с. Полевой В.В. Роль ауксина в системах регуляции у растений: 44-е Тимирязевское чтение. Л.: Наука, 1986. 79 с. биорациональные экологически безопасные регуляторы роста и продуктивности растений»

59. Прадедова Е.В., Озолина Н.В., Саляев Р.К., Юшкевич Т.И. Динамика гидролитической активности Н-АТФазы и Н-пирофосфатазы тонопласта в онтогенезе столовой свеклы ДАН. 1999. т. 364. 6. 835-838.

60. Приступа Н.А., Курсанов А.Л. Нисходящий ток ассимилятов и его связь с поглощающей деятельностью корня Физиология растений. 1957. Т. 4 С 417-424.

61. Приступа Н.А. Локализация продуктов кратковременного фотосинтеза в тканях листа кукурузы Физиология растений. 1972. Т. 19. 536544.

62. Прусакова Л.Д., Чижова СИ. Рост растений и брассиностероиды Тез. докл. сими. «Брассиностероиды биорациональные экологически безопасные регуляторы роста и продуктивности растений». 3-6 июля 1995, Минск. 9.

63. Пузина Т.И., Кириллова И.Г. Градиенты содержания свободных фитогормонов в стебле картофеля в связи с клубнеобразованием Физиология растений. 1996. Т. 43, 6 915-919.

64. Пузина Т.И. Гормональная регуляция как основа целостности и продуктивности растительного организма Автореф. дис. доктора биол. наук. Москва: МСХА, 1999. 32 с.

65. Пьянков В.И., Яшков М.Ю., Ламанов А.А. Транспорт и распределение ассимилятов и структура донорно-акцепторных отношений у дикорастущих видов Среднего Урала Физиология растений. 1998. Т. 4 5 4 С 578-586.

66. Рекославская Н.И., Собенин A.M., Барыкова О.М., Гамбург К.З., Саляев Р.К. Сравнение активности триптофансинтазы, содержания триптофана и ИУК в трансформированных и нормальных клетках моркови Докл. АН СССР. 1994. Т.38, 6. 830-832.

67. Роньжина Е.С., Мокроносов А.Т. Донорно-акцепторные отношения и участие цитокининов в регуляции транспорта и распределения

68. Роньжина Е.С, Соколова СВ., Мокроносов А.Т. Действие цитокининов на транспорт и распределение веществ в изолированных листьях.

69. Факторы, влияющие на реализацию эффекта цитокинина Физиология растений. 1995. Т 42, вып. 1. С 61-67.

70. Роньжина Е.С, Аттрагирующее действие регуляторов роста цитокининовой природы IV съезд общества физиологов растений России, Москва, 4-9 октября 1999, Тез. докл. Т. I. 134. 78.

71. Рэкер Э. Биоэнергетические механизмы: новые взгляды. М.: Мир. 1979. -214с. Савинский СВ., Григорюк, И.А., Ткачёв В.И. Гормональный статус листьев растений озимой пщеницы при воздействии полистимулина в условиях засухи Докл. АН Украины. 1992. 2. 134-137.

72. Сакало В.Д., Пономаренко СП., Киризий Д.А., Курчий В.М. Влияние регуляторов роста на метаболизм сахарозы в сахарной свёкле Физиология и биохимия культурных растений. 1998. Т. 30, 4. 271-278. 81.

73. Саляев Р.К. Поглощение веществ растительной клеткой. М.: Наука, 1969.-206 с. Саляев Р.К., Чернышов В.И. Особенности ультраструктуры и формирования поверхностных мембран у клеток растений Структура и функции биологических мембран А.С Трошин М.: Наука, 1975 108-119.

74. Саляев Р.К,, Кузеванов В.Я., Хаптагаев СБ., Копытчук В.Н, Выделение и очистка вакуолей и вакуолярных мембран из клеток растений Физиология растений, 1981. -Т. 28. С 1295-1306,

75. Саляев Р,К., Кузеванов В.Я., Озолина Н,В,, Каменкова Л.Д., Пузанова Н.А. Содержание

76. Саляев Р.К., Хаптагаев СБ., Кузеванов В.Я., Копытчук В.Н. Об ультраструктуре изолированных вакуолярных мембран Цитология. 1983а-Т. XXV, 6. С 643-649.

77. Саляев Р.К., Озолина Н.В., Кузеванов В.Я. Особенности белкового и полипептидного состава изолированного тонопласта красной столовой свёклы Физиология растений. 19836. Т. 30. вып. 2. С 241-245.

78. Саляев Р.К., Козаренко Т.Д., Озолина Н.В., Кузеванов В.Я. Аминокислотный состав белков изолированной вакуолярной мембраны Физиология растений. 1983в. Т. 30. вып. 3. 487-491.

79. Саляев Р.К., Катков Б.Б. Симпорт и антипорт сахарозы и ЕГ через плазмалемму и тонопласта универсальный принцип функционирования переносчика, связанный с его протонированием и депротонированием Докл. АН СССР. 1988. Т. 301, 1. 252-255.

80. Саляев Р.К., Ланкевич СВ., Кузеванов В.Я., Брук Т.А., Дударева Л.В. Сахарный и солевой статус тканей корнеплода Докл. АН. 1997 Т. 354, 5 С 710-712.

81. Саляев Р.К., Ланкевич СВ., Кузеванов В.Я., Брук Т.А., Дударева Л.В. Закономерности формирования «сахарного» и «солевого» статуса клетокв растительной ткани Докл. АН. 1999а. Т. 364, 1. 140-142.

82. Саляев Р.К., Озолина Н.В., Прадедова Е.В. Влияние экзогенных фитогормонов и кинетина на гидролитическую активность протонных помп тонопласта в онтогенезе столовой свёклы Физиология растений. 1999б.-Т.46,№1.-С. 5-8.

83. Сафонов В.И., Сафонова М.П. Исследование белков и ферментов растений методом электрофореза в полиакриламидном геле Биохимические методы в физиологии растений О.А.Павлинова М.: Наука.-1971.-113 с.

84. Соколова СВ. Транспорт и превращение Сахаров в проводящих тканях растений Автореф. дис. канд. биол. наук. М.: ИФР АН СССР, 1974. 27

85. Соколова СВ., Балакшина Н.О. Влияние фитогормонов на транспорт и распределение С-сахарозы в срезанных листьях сахарной свёклы Физиология растений. 1992. Т. 39, вып. 6 1088-1097.

86. Соколов О.И., Туркина М.В. Миозин II из флоэмы Heracleum sosnowskyi IV съезд общества физиологов растений России, Москва, 4-9 октября 1999. Тез. докл, Т. I. С 135-136.

87. Семененко 903-921. В.В. Молекулярно-биологические аспекты эндогеннеой регуляции фотосинтеза Физиология растений. 1978. Т. 25, 5. 97. Семёнов И.Л., Фэнсом Д.С, Томсон Р.Г. Природа колебаний в толщине листьев 98.

88. Beta vulgaris, измеренных с помощью линейного датчика Физиология растений. 1995. Т. 42, вып. 6 878-

89. Тихонова Л.И. Ионные каналы вакуолярной мембраны высших растений Биологические мембраны.- 1998. Т. 15, 3.- С 245-258 Туркина М.В. К вопросу о первых углеводах, образующихся в процессе фотосинтеза Докл. АН СССР. 1957. Т. 115, 6. 1142-1145.

90. Туркина М. В., Соколова В. Методы определения моносахаридов и олигосахаридов Биохимические методы в физиологии растений О.А.Павлинова М.: Наука, 1971. С 7-33.

91. Туркина М.В. Транспорт ассимилятов: факты и гипотезы Новые направления в физиологии растений А.Л. Курсанов М.: Наука, 1985. 231-252.

92. Туркина М.В., Павлинова О.А., Курсанов А.Л. Развитие исследований природы флоэмного транспорта: активность проводящих элементов Физиология растений. 1999. Т. 46, 5. 811-822.

93. Федосеева Г.П., Багаутдинова Р.И. Особенности структурной организации и функциональной активности фотосинтетического аппарата у картофеля разной степени окультуренности -х. биология. 1977. Т. 12 4. 545-553.

94. Холодова В.П. Локализация Сахаров в тканях запасающего корня сахарной свеклы. Физиология растений. 1967. Т. 14, вып. 3. 444450.

95. Холодова В.П.., Мещеряков А.Б., Чернявская Т.Н. Транспорт 3-0-метилД-глюкозы в клетки суспензионной культуры сахарной свёклы Физиология растений. 1982. Т. 29, вып. 5. 876-885.

96. Холодова В.П., Никитина Т.Н., Петрова Л.Н. Аккумулирование Сахаров в клетках суспензионной культуры корня сахарной свёклы Тез. докл. Всесоюз. конф. по культуре ткани. Кишинёв. -1983. 49.

97. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды Минск: Наука и техника, 1993. 287 с.

98. Чиков В.И. Фотосинтез и флоэмный транспорт М.: Наука, 1987. 186 с.

99. Шапигузов А.Ю. Аквапорины: строение, систематика и особенности регуляции. Физиология растений. 2004. Т. 51, 1.- 142-152. ПО. Шишова М.Ф., Инге-Вечтомова Н.И., Рудашевская Е.Л., Полевой В.В. Действие ауксина на транспорт катионов через мембрану везикул плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы Докл. АН. 1997. Т. 356. 700-704.

100. Щвец И.М., Опритов В.А., Калинин полипептиды плазматических мембран В.А. клеток Сахарозосвязывающие флоэмы Heracleum sosnowsku Докл. АН СССР. 1989. Т. 306, 1. 253-255.

101. Эллиот М., Чен Д., Фаулер М., Керби М., Кубалакова М., Скотт Н.. Слейтер А. Трансгеноз. Программа повышения продуктивности сахарной свёклы Физиология растений. 1996. Т. 43, 4. 620-628.

102. Яворская В.К., Драговоз И.В., Савинский СВ., Кучер А.А., Шендрик Л.Н. Фитогормональный статус почек и листьев сортов яблони на разных этапах онтогенеза Физиология и биохимия культурных растений. 1996. Т 2 6 1,-С. 36-39.

103. Abrahams J., Leslie А., Lutter R., Walker J. Structure at 2.8 A resolution of FlATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 1994. V. 370. P. 621628.

104. Achhireddy N.R. Kirkwood R.M., Vanden Berg G. The development of Pisum sativum explant systems for studies concerning cource sink activities Physiol. Plant-1984.-V. 61, 1 P. 130-134.

105. Adachi I., Arai H., Pimental R., Forgas M. Proteolysis and orientation on reconstitution of the coated vesicle proton pump. J. Biol, Chem. 1991. V. 265.-P. 960-966.

106. Agre P., Preston G., Smith В., Jung J., Raina S., Moon C, Guggino W., Nielsen S. Aquaporin CHIP: The archetypal molecular water channel Am. J. Physiol. -1993. V. 265. P. F463-F476.

107. Allen G., Sanders D. Control of ionic currents guard cell vacuoles by cytosolic and luminal calcium. Plant J. 1996. V.IO. P. 1055-1069.

108. Apse M., Aharon G., Snedden W., Blumward E. Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na/rf" antiport in Arabidopsis. Science. 1999. V 285.-P. 1256-1258.

109. Arai H., Terres G., Pink S., Forgac M. Topography and subunit stoichiometry of the coated vesicle proton pump. J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 87968802.

110. Ayala F., O Leary I., Schumaker K. Increased vacuolar avd plasma membrane IT*"-ATPase activities in Salicomia bigelovii Torr. in response to NaCI. J. Exp. Bot. 1996. V. 47, 294. P. 25-32.

111. Ballesteros E., Dnaiire J.P,, Belver A, Effects of salt stress on H*-ATPase and H-PPase activities of tonoplast-enriched vesicles isolated from sunflower roots Physiol. Plant. 1996. V. 97 P. 249-268.

112. Baltscheffsky H., Baltscheffsky M., Von Stedingk L. Inorganic pyrophosphate, bacterial photophosphorylation and evolution of biological energy transformation Progress in photosyntesis research ed.: Metzner H. Tubingen: Internetional Clarion of Biol. Sciences. 1969. V 3 P 1313-1318.

113. Barbier-Brygoo H., Vinauger M., Colcombet J., Ephritikhine G., Frachisse JM,, Maurel С Anion channels in higher plants: functional and physiological role Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1465. P. 199-218.

115. Basalach M.O. Effect of gibberellic acid on the transport of "C-sucrose in date palm seedlings (sv. Rotana) Fyton. 1993. V. 54, 1. P. 75-78.

116. Baugerth F., Aufhammer W., Baum O. lAA level and dry matter accumulation at different positions within a wheat ear Physiol. Plant. 1985. V.63, 1. P 121-125.

117. Baykov A.A., Sergina N.V., Evtushenko O.A., Dubnova E.B. Kinetic characterisation of the hydrolytic activity of the H*"-pyrophosphatase of Rhodospirillum rubrum in membrane-bound and isolated states Eur. J. Biochem. 1996. V. 236, 1. P. 121-127.

118. Bell C.I., Leigh R.A. Turgor and the regulation of sucrose and potassium transport in sugar beet storage roots J. Exp. Bot. 1996. V. 47, Special issue.-P. 1331.

119. Bennet A.B., О Neill S.D., Spanswick R.M. H-ATPase activity from storage tissue of Beta vulgaris L.

120. Identification and characterization of an anionsensitive H-ATPase Plant Physiol. 1984. V. 74, 3. P. 538-544.

121. Bennet A.B., Spanswick R.M. H-ATPase activity from storage tissue of Beta vulgaris. II. H*/ATP stoichiometry of an anion sensitive bf-ATPase Plant Physiol. 1984. V. 74, 3. P. 545-548.

122. Blumwald E., Aharon G. Apse M. Sodium transport in plant cells. Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 83. P. 884-887.

123. Boassa D., Yool A. A fascinating tail: cGMP activation of aquaporin-l ion channels Trend Pharmocol. Sci. 2002. V. 23. P. 558-562.

124. Bohnert H., Jencen R. Strategies for engineering water-stress tolerance in plants. Trends Biotechnol. 1996. V. 14. P. 89-97.

125. Boiler Т., Kende H. Hydrolytic enzymes in the central vacuole of plant cell. Plant Physiol. 1979. V. 63, 6 P 1123-1132.

126. Boudet A,, Ranjeva R. The vacuole: a potential store for second messengers in plant. Plant Biology Eds Boss W.F., Morre D.J. N.Y.: Liss, 1989. P.213225.

127. Bourbouloux A., Raymond P., Delrot S. Effects of salicylic acid on sugar sugar andamino acid uptake. J. Exp. Bot. 1998. V. 49. P. 239-247.

128. Bowman В., Oschida W. The vacuolar ATPase of Neurospora crassa contains an Fi like structure J. Biol. Chem. 1989. V. 264, 26. P. 1560615612.

129. Bowman E., Steinhart A., Bowman B. Isolation of the vma-4 gene encoding the 26 kDa subunit of the Neurospora crassa V-ATPase. Biochim. Biophys. Acta. -1995. V 1237.-P. 95-98.

130. Bowman E., O Neill P., Bowman B. Mutations of pma-1, the gene encoding the plasma membrane H-ATPase of Neurospora crassa, suppress inhibition of grow by concanamycin A, a specific inhibitor of vacuolar ATPases. J. Biol. Chem. -1997. V. 272, 3. P. 14776-14786.

131. Bradford D.P. A rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilising the principl of protein-dye binding //Anal. Biochem. 1976. V. 72, N 1 2 P 248-254.

132. Branton D., Deamer D. Membrane structure. Vienna, Springer-Verlag. 1972. 305 p.

133. Bremberg C, Luttge U. Dynamics of proton pumps and other tonoplast proteins of Mesembryanthemum crystallinum L. during the induction of Crassulacean acid metabolism Planta. 1992. V. 188, 4. P. 575-580.

134. Brenner M., Brun W., Schusser J., Cheilh N. Effects of endogenous and exogenous plant growth substances on development and yield of soybeans Plant growth substances, 1985 Ed. M. Bopp. B. Heidelberg: Springer, 1986. P 380-386.

135. Briskin D., Leonard R. Isolation of tonoplast vesicles from tobacco protoplasts Plant Physiol. 1980. V. 66, 4. P. 684-987.

136. Briskin R., Thomley W., Wyse R. Membrane transport in isolated vesicles from sugarbeet taproot.

137. Evidence for a sucrose/bL antiport Plant Physiol. 1985. V. 78, 4. P 871-875.

138. Briskin D. Transport in plasma membrane vesicles approaches and perspectives. The plant plasma membrane: structure, function and molecular biology С Larsson I. Moller. Berlin: Springer-Verlag, 1989. P. 154-181.

139. Bukhov N., Bondar V., Drozdova I., Kara A., Kotov A., Maevskaya S., Vasiiev A., Voevudskaya S., Voronin P., Mokronosov A. Development of storage roots in radish (Raphanus sativus) plants as affected by light quality J. Plant Physiol-1996.-V. 149. 3 4 P 915-919.

140. Burkle L., Hibberd J. M., Quick W.P., Kuhn C, Himer В., Frommer W.B. The ET-sucrose cotransport NtSUTl is essential for sucrose export from tobacco leaves//Plant Physiol.- 1998.-V. 118.-P. 59-68.

141. Buttner M., Sauer N. Monosaccaharide transporters in plants: structure, function and physiology. Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1465. P. 717-749.

142. Canut Н., Alibert G., Carrasco A., Boudet A. Rapid degradation of abnormal proteins in vacuoles from Acer pseudoplatanus L. cells Plant Physiol. 1986. V 8 1 P 460-463.

143. Carmen M.-C, Amparo S. Effect of hormones on sucrose uptake and on ATPase activity of Citrus sinensis L. Osbeck leaves Annu. Bot (USA). 1994.-V. 73, 3 P 331-335.

144. Chanson A., Taiz L. Evilness for an ATP-dependent proton pump on the Golgi of corn colyoptiles Plant Physiol. 1985. V. 78, 1. P. 232-240.

145. Chanson A., Fichman J., Spear D., Taiz L. Pyrophosphate-driver proton transport by microsomal membranes of com coleoptiles Plant Physiol. 1985.-V.79, L P 159-164.

146. Chanson A., Pilet P.E. sulfatepoliacrylamide gel Target molecular size and of sodium the dodecyl and electrophoresis analysis ATP- pyrophosphate-dependent proton pumps from maize root tonoplast Plant Physiol. 1989. V 74, 3. P. 643-650.

147. Chanson A. Active transport of proton and calcium in higher plant cell Plant Physiol. Biochem. 1993. V. 31, 6. P. 943-955.

148. Chatterjee D., Chacraborty M., Leit M., Neff L., Jamza-Kellokumpu S., Baron R. Sensivity to vanadate and isoforms of subunits A and В distinguish the osteoclast proton pump from other vacuolar tf-ATPases Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992.- V. 89, 14.- P. 6257-6261.

149. Checol N. Endogenous levels of some phytohormones in buds of seedless grapevine cultvars Bull. OIV. 1994. V. 67, 763-764. P. 78-92.

150. Chen Т., Hsu C Tsai P., Ho Y., Lin N. Heterotrimeric G-protein and signal transduction in the Nematode-trapping fungus Arthrobotrys dastyloides Planta. 2001. V. 212. P. 858-863.

151. Chiou Т., Buch D. Molecular cloning, immunochemical localization to the vacuole, and expression in transgenic yeast and tobacco of a putative sugar

152. Chiou Т., Buch D. Sucrose is a signal molecule in assimilate partitioning Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 4784-4788.

153. Chrispeeis M., Crawford N., Schroeder J. Proteins for transport of water and mineral nutrients across the membranes of plant cell Plant Cell. 1999. V. 11.-P. 661-675.

154. Churchill K., Sze H. Anion-sensitive, HT-pumping ATPase in membrane vacuoles vesicles from oat roots Plant Physiol. 1983. V. 71, 3. P. 610-617.

155. Claussen W., Biller E. Die Bedeutung der Saccharose und Starkegehalte der Blatter fur die Regulierung der Netto-Photosyntheseraten Ztschr. Pflanzenphysiol. 1977. V 8 3 S. P 189-198.

156. Cooley M., Yang H., Dahal P., Mella R., Downie A., Haigh A., Bradford K. Vacuolar H-ATPase is expressed in response to gibbereilin during tomato seed germination//Plant Phys.- 1999.-V. 121.-P. 1339-1348.

157. Cross P.Y., Taiz L. Gene duplication as a means for altering H/ATP rations during the evalution of FQFI ATPase and synthases FEBS Lett. 1990. V. 259.-P. 227-229.

158. Cross R., Duncan T. Subunit rotation in Biomembr. 1996. V. 2. P. 403-408.

159. Darley СР., Davies J.M., Sanders D. Chill-induced changes in the activity and abundance of the vacuolar proton-pumping pyrophosphatase from mung bean hypocotyls Plant Physiol. 1995. V. 109, 2. P. 659-665. 169. DAuzas J. Characterization d une ATPase membrane en presence d une phosphatase acid dans les lutoides latex d Hevea brasiliensis Phytochemistry. FIFQ-ATP syntheses as a means of coupling proton transport through Foto the binding changes in Fi. J. Bioenerg. 1975. V. 14. 7. P. 671-675.

160. Davies J., Poole R,, Rea P., Sanders D. Potassium transport into plant vacuoles enenrgized by a protonpumping inorganic pyrophosphatase Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89, 24. P. 11701-11705.

161. Davies J. Vacuolar energization: pumps, shunts and stress J. Exp. Botany. 1997. V. 48, 308. P. 633-641.

162. Deitz K., Rudloft S., Ageorges A., Eckerskom C Fischer K., Arbinger B. Subunit E of the vacuolar H-ATPase of Hordeum vulgare L. cDNA cloning expression and immunological analysis The Plant J. 1995. V. 8, 4. P. 521-529.

163. Dietz K., Tavacoli N., Kluge C Mimura Т., Sharma S., Harris G., Chardormens A., GoUdack D. Significance of the V-type ATPase for the adaptation to stressful growth conditions and its regulation on the molecular and biochemical level J. Exp. Bot. 2001. V. 52, №363. P. 1969-1980.

164. Dijkwel P., Kock P., Bezemer R., Weisbeek P., Smeekens S. Sucrose repress the developmentally controlled transient activation of the plastocyanin gene in Arabidopsis thahana seedlings Plant Physiol. 1996. V. 110 P. 455-463.

165. Delrot S., Atanassova R., Maurousset L. Regulation of sugar, amino acid and peptide plant membrane transporters Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1 4 6 5 P 281-306. 176. De Nisi P., DellOrto M., Zocchi G. Calcium-dependent phosphorylation regulates the plasma-membrane IT-ATPase activity of maize (Zea mays L.) roots. Planta. 1999. V. 209. P. 187-194.

166. Dinar M., Rudich J. Effect of heat stress on assimilate partitioning in tomato Ann. Bot. 1985. V. 56, 2. P. 239-248.

167. Doll S., Rodier F,, Willenbrink J. Accumulation of sucrose in vacuoles isolated from red beet tissue Planta. 1979. V. 144, 3. P. 407-411.

168. Dschida W., Bowman B. The vacuolar ATPase: sulfite stabilization and the mechanism of nitrate inactivation. J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 15571563.

169. Feng Y., Forgac M. Cysteine 254 of the 73-kDa A subunit is responsible for inhibition of the coated vesicle H-ATPase upon modification by sulfhydryl reagents. J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 5817-5822.

170. Fensom D., Williams E. On aliens suggestion for longdistance translocation in phloem of plants Nature. 1974. V. 250 P. 490-492.

171. Fischer-Schliebs E., Mariaux J.-B, Luttge U. Stimulation of H-transport activity of vacuolar bf"-ATPase in Kalanchoe blossfeldiana Biol. Plantarum. 1997. V 39, 2 P 169-177.

172. Forgas M. Structure, mechanism and regulation of the clatrin-coated vesicle and yeast vacuolar rf"-ATPases. J. Exp. Bot. 2000. V. 203. P. 71-80.

173. Fotiades D., Suda K., Tittman P., Jeno P., Philippsen A., Muller D., Gross H., Engel A. Identification and structure of a putative Ca -binding domain et the C- terminus of AQPl J. Mol. Biol. 2002. V. 31. P. 1381-1394.

174. Fraichard A., Magnin Т., Trossat C Pugin A. Properties of the proton pumping pyrophosphatase in tonoplast vesicleg of Acer pseudoplatanus. Functional molecular mass and polypeptide composition Plant Physiol. Biochem. 1993. V 3 1 P 349-359.

175. Fraichard A., Trossat C Magnin Т., Pugin A. Influence of ATPase activity on PPi-dependent H-transport in tonoplast vesicles of Acer pseudoplatanus Plant Science. 1994. V. 100, 2. P. 129-138.

176. Francois В., Dominique Т., Daniele M., Maryse C.Francis M. Tonoplast intrinsic proteins from cauliflower (Brassica olevacea L. var. botrytis): immunological analysis, cDNA cloning and evidence for expression in meristematic tissues Planta. 1998. V. 204. P. 335-344.

177. Frederica L. Plant ABC transporters Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1 4 6 5 P 79-103.

178. Gabathuler R., Cleland R. Auxin regulation of a proton translocating ATPase in pea root plasma membranes Plant Physiol. 1985. V. 79 P. 1080-1085.

179. Gambale F., Carpaneto A., Cantu A. Redox agents regulate ion channel activity in vacuoles from higher plant cells. FEBS Letters. 1999. V. 442. P. 129132.

180. Geiger D. Phloam loading: storage and circulation In: Encycl. Plant Physiol. N.S. Spring-Verlag 1975. V.l. P. 395-431.

181. Geiger D. Effects of translocation and accimilate damage on photosynthesis Canad. J. Bot. 1976. V. 54. P. 2337-2348.

182. Geisler M., Axelsen K., Harper J., Palmgren M. Molecular aspects of higher plant P-type Ca-ATPases. Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1465. P. 65-78.

183. Gersani M., Lips S. H., Sachs T. The influence of shoots, roots and hormones on sucrose distribution J. Exp. Bot. 1980. V. 30, 120. P. 177-184.

184. Gersani M., Kende H. Studies on cytokinin-stimulated translocation in isolated bean leaves J. Plant Growth Regul. 1982. V 1, 2. P 161-171.

185. Getz H.P. Sucrose transport in tonoplast vesicles of red beet roots is linked to ATP hydrolysis Planta. 1991. V. 185. P 261-268.

186. Getz H., Grosclaude J., Kurkdjian A., Levievre F., Maretzki A., Guem J. Immunological evidence for the existence of a carrier protein for sucrose transport in tonoplast vesicles from red beet (Beta vulgaris) root storage tissue Plant Physiology. 1993. V 102, №.3. P. 751-760.

187. Giaquinta R. Phloem loading of sucrose: pH dependence and selectivity Plant Physiol. 1977a. V. 59, 4. P. 750-755.

188. Giaquinta R. Possible role of pH-gradient and membrane ATPase in loading of sucrose into the sieve tubes Nature. 1977b. V. 267 P. 369-370.

189. Gibson SI. Sugar and phytohormone response pathways: navigating a signalling network J. Exp. Bot. 2004. V. 55(395). P. 253-264.

190. Girsch S., Peracchia С Calmodulim interacts with a C-terminus peptide from the lens membrane protein MIP26 Curr. Eye Res. 1991. V. 10. P. 839849.

191. Gordon-Weeks R., Steele S., Liegh R. The role of magnesium, pyrophosphate and their complexes as substrates and activators of the vacuolar H-pumping inorganic pyrophosphatase studies using ligand protection from covalent inhibitors. Plant Physiol. 1996. V. 111. P. 195-202.

192. Gordon-Weeks R., Koren kov V., Steele S., Leigh R. Tris is a competitive inhibitor of K". Activation of the vacuolar H-pumping pyrophosphatase Plant Physiol. 1997a. V 114, 3. P 901-905.

193. Gordon-Weeks R., Steele S., Leigh R. The role of magnesium, pyrophosphate, and their complexes as substrates and activators of the vacuolar LT-pumping inorganic pyrophosphatase studies using ligand protection from covalent inhibitors Plant Physiol. 1997b V.l 11, N 1 P. 195-202.

194. Grabe M., Wang H., Oster G. The mechanochemistry of V-ATPase proton pumps Biochemical J. V.78. P. 2798-2813.

195. Greenberg J. Programmed cell death: a way of life for plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 12094-12097.

197. Grob K., Matile P. Compartmentation of ascorbic acid in vacuoles of horseradish root cells. Note on vacuolar peroxidase Z. Pflanzenphysiol. 1980.-V. 9 8 P 235-243.

198. Hall A.L Assimilate source-sink relationschips in Capsicum annum L. IL Effects of fruiting and defloration on the photosynthetic capacity and senescence of the leaves Austral. J. Plant Physiol. 1977. V. 4, 5. P. 771-783.

199. Hara-Nishimura I., Maeshima M. Vacuolar processing enzymes and aquaporins. Annu. Plant Rev. 2000. V. 5. P. 20-42.

200. Harms K., Wohner R., Schilz В., Frommer W. Regulation of two p-type H ATPase genes from potato. Plant Mol. Biol. 1994. V 26. P. 997-988.

201. Harrington G., Nussbaumer Y,, Wang X., Tegeder M., Franceschi V., Frommer W., Patrick J., Offler C. Spatial and temporal expression of sucrose transportrelated genes in developing cotyledons of Vicia faba Protoplasma. 1997. V. 2 0 0 P 35-50.

202. Haschke H,, Kaiser G., Martinoia E., Hammer U., Teucher T. Lipid profiles of leaf tonoplasts from plants with different C02-fixation mechanism. Bot. Acta. -1990.-V. 1 0 3 P 32-38.

203. Hasenfrietz M.P., Tsou C.Z,, Wilkins T.A. Expression of two related vacuolar H-ATPase 16-kilodalton proteolipid genes is differentially regulated in a tissue specific manner. Plant Physiol. 1995. V. 188, 6.- P. 1395-1440.

204. Hedrich R., Neher E. Cytoplasmic calcium regulates voltage-dependent ion channels in plant vacuoles Nature. 1987. V. 329. P. 833-835.

205. Hein M., Brenner M.L., Brun W.A. Effect of pod removal on the transport and accumulation of abscisic acid and indole-3-acetic acid in soybean leaves Plant Physiol. 1984. V.76, 4. P. 955-958.

206. Henikoff S., Greene A., Pietrokovski S., Bork P., Attwood Т., Hood L. Genome families: the taxonomy of protein paralogs and chimeras. Science. 1997. V. 2 7 8 P 609-614.

207. Herold A. Regulation of photosynthesis by sink activity New Phytol. 1980. V 86, 2 P 131-144.

208. Herzog H. Relation of source and sink during grain filling period in wheat and some aspects of its regulation Physiol. Plant. 1982. V. 56, 2. P. 155160.

209. Heymann J., Engel A. Structural clues in the sequences of the aquaporins. J. Mol. Biol. 2000. V. 295. P. 1039-1053.

210. Higuchi H., Suga S., Tsuchiya Т., Hisada H., Morishima S. Molecular cloning, water channel activity and tissue specific expression of two isoforms of radish vacuolar aquaporin. Plant Cell. 1998. V. 39. P. 905-913.

211. Hinder В., Schellenberg M., Rodoni S., Ginsburg S., Vogt E., Martinoia E., Matile P. How plants dispose of сЫофрЬуЦ catabolites: directly energized uptake of tetrapyrrolic breakdown products into isolated vacuoles. J. Biol. Chem. 1996.-V. 2 7 1 P 27233-27236.

212. Hirshi K., Zhen R., Cunningham K., Rea P., Fink G. CAXl, an CaVH from Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 8782-9786.

213. Hirshi K., Korenkov V., Wilhanowsky N., Wagner G. Expression of Arabidopsis CAX2 in tobacco. Altered metal accumulation and increased manganese tolerance. Plant Physiol. 2000. V. 124. P. 125-134.

214. Ishikava Т., Li Z., Lu Y., Rea P. The GS-X pump in plant, yeast and animal cells: structure, function and gene expression. Biosci. Rep. 1997. V. 17, P. 189-207.

215. Jameson P.E., McWha J.A., Haslemore R.M. Changes in cytokinins during initation and development of potato tubers Physiol. Plant. 1985. V. 63 P. 53-57.

216. Jauh G., Fischer A., Grimes H., Ryan C Rodgers J. 5-tonoplast intrinsic protein defines unique plant vacuole functions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 12995-12999.

218. Johansson L, Larsson C Ek В., Kjellbom P. Major integral proteins of spinach leaf plasma membranes are putative aquaporins and are phosphorylated in response to Ca" and apoplastic water potential Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1181-1191.

219. Johansson I., Karlsson M., Shukla V., Chrispeels M., Larsson C Kjellbom P. Water transport activity of plasma membrane aquaporin PM28A is regulated by phosphorylation Plant Cell. 1998. V. 10. P. 451-459.

220. Johansson I., Karlsson M., Johansson U., Larsson C Kjellbom P. The role of aquaporins in cellular and whole plant water balance Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1465. P. 324-342.

221. Joumet E., Bligny R., Douce R. Biochemical changes during sucrose deprivation in higher plant cells J. Biol.Chem. 1986. V. 261. P. 31933199.

222. Junge W., Sabbert D., Engelbrecht S. Rotary catalysis: real time recording of intersubunit rotation. Ber. Bunsenges Phys. Chem. 1996. V, 100. P. 2014-2019.

223. Kaiser G., Martinoia E., Schmitt J., Hinche D., Heber U. Polypeptide pattern and enzymic character of vacuoles isolated from barley mesophyll protoplasts. Planta. 1986. V. 169. 3. P. 345-355.

224. Kaldenhoff R., KoUing A., Richter G. Regulation of the Arabidopsis thaliana aquqporin gene athH2 (PIPlb) J. Photochem. Photobiol. 1996. V. 36. P. 351-354.

225. Karlsson M., Johansson I., Bush M., McCann M., Maurell С An abundant TIP expressed in mature highly vacuolated cells. Plant J. 2000. V. 21. P. 8390.

226. Karmoker J., Van Stevenick R. The effect of abscisic acid on sugar levels in seedligs of Phaseolus vulgaris L. cv. Redland Pioneer Planta. 1979. V. 146-P. 25-30.

227. Kasai М,. Yamamoto Y., Maeshima M., Matsumoto H. Effects of in vivo treatment abscisic acid and/or cytokinin on activities of vacuolar IT-pumping of tonoplast-enriched membrane vesicles prepared from barley roots Plant Cell Physiol. 1993. V. 34, 7. P. 1107-1115.

228. Kasai M., Sato K, Ono Т., Tsuruta S., Kikuchi M., Yamazaki J., Kanazawa N., Savada S. Inhibitory effect of sucrose on the plasma membrane ЬГ pump activity and possible involvement of the C-terminal region in the sucrose effect J. Plant Research. 2000. V. 113, 1109. P. 97-102.

229. Kasamo K., Yamaguchi M., Nakamura Y. Mechanism of chilling-induced decrease in proton pumping across the tonoplast of the rice cells. Plant Cell Physiol. 2000. V. 41. P. 840-849.

230. Kawamura Y., Arakawa K., Maeshima M., Yoshida S. Tissue specificity of E subunit isoforms of plant vacuolar H-ATPase and existence of isotype enzymes. J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 6515-6522.

231. Kawamura Y., Arakawa K., Maeshima M., Yoshida S. ATP analogue binding to the A subunit induces conformation changes in the E subunit that involves a disulfide bond format in plant V-ATPase.// Eur.J.Biochem. 2001. V. 268, 1 0 P 2801-2809.

232. Kibak H., Van Eeckhout D., Cutler Т., Taiz S., Taiz L. Sulfite both stimulates and inhibits the yeast vacuolar IT-ATPase. J. Biol. Chem. 1993. V. 5. P.23325-23333.

233. Kirsch M., An Z,, Viereck R., Low R., Ranch T. Salt stress induces an increased expression of V-type IT-ATPase in mature sugar beet leaves Plant Mol. Biol. -1996. V. 32. P. 543-547.

234. Klein M., Weissenbock G., Dufaud A., Gaullard C PCreuz K., Martinoia E. Different energization mechanisms drive the vacuolar uptake of a flavonoid glucoside and a herbicide glucooside. J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 29666-29671.

235. Klein М,, Martinoia E., Weissenbock G. Directly energized uptake of [3- estradiol 17-(P-glucuronide) in plant vacuoles is strongly stimulated by glutathione conjugates. J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 262-270.

236. Kluge C Heining H. Untersuchungen uber den efflus von malat aus den vacuolen der assimiliren den zellen von Bryohyllum und mogliche einflusse dieses vorganges auf den CAM Planta. 1973. V. 113. P. 333-334.

237. Kluge C Golldac K., Dietz K. Subunit D of the vacuolar H-ATPase of Arabidopsis thaliana. Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1419. P. 105110.

238. Kockenberger W., Pope J., Xia Y., Jeffrey K., Komor E., Callaghan P. A noninvasive measurement of phloem and xylem water flow in castor bean seedlings by nuclear magnetic resonance microimaging Planta. 1997. V. 2 0 1 P 53-63.

239. Koda Y. Changes in leves of butanol and water-soluble cytokinins during the life cycle of potato tubers Plant and Cell Physiol. 1982. V. 23, 5. P. 843-849.

240. Kotyk A., Kaminek M., Pulkrabek J., Zahradnicek J. Effect of in vivo and in vitro application of the cytokinin N-6-(M-hydroxybenzyl)adenosine on respiration and membrane transport processes in sugar beet Biologia Plantarum. 1996. V. 38. №.3. P. 363-368.

241. Kramer R., Kopp F., Niedermeyer W., Fuhrmann G. Comparative studies of the structure and composition of the plasmalemma and the tonoplast in Saccharamyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 507, 3. P. 369-380.

242. Kuhn C, Franceschi V., Schulz A., Lemoine R., Frommer W.B. Macromolecular trafficking indicated by localization and turnover of sucrose transporters in enucleate sieve elements Science. 1997. V. 275 P. 12981300.

243. Kuhn С, Barker L., Burlkle L., Frommer W. Update on sucrose transport in higher plants. J. Exp. Bot. 1999. V. 50. P. 935-953

244. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature. 1970. V.227. 5259. P. 680-685.

245. Lalonde S., Boles E., Hellmann H., Barker L,, Patrick J., Frommer W., Ward J. The dual function of sugar carriers: transport and sugar sensing Plant Cell. 1999.-V. 11.-P. 707-726.

246. Lane L.C. A simple method for stabilizing protein sulfhudryl groups SDS gel electrophoresis Anal. Biochem. 1978. V. 86. 2. P. 655-664.

247. Lehr A., Kirsch M., Viereck R., Schiemann J., Rausch T. cDNA and genomic cloning of sugar beet V-type FT-ATPase subunit A and с isoforms: evidence for co-ordinate expression during plant development and co-ordinate induction in response to high salinity Plant Mol. Biol. 1999. V. 39. P. 463-475.

248. Leigh R., Branton D. Isolation of vacuoles from root storage tissue of Beta vulgaris L. Plant Physiol. 1976. V. 58, 4. P. 656-662.

249. Leigh R., Walker R. ATPase and acid phosphatase activites associated with vacuoles isolated from storage roots of red beet (Beta vulgaris L.) Planta. 1980.-V. 150, 3 P 222-229.

250. Leigh R,, Pope A., Jenning I., Sanders S. Kinetics of the vacuolar Hpyrophosphate from higher plants. The role of magnesium, pyrophosphate and their complexes as substrates, activators and inhibitors Plant Physiol. 1992. V 100, 3 P 1698-1705.

251. Lemoine R. Sucrose transporters in plants: update on function and structure Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1465 P. 246-262.

252. Leng X., Manolson M., Forgac M, Function of the COOH-terminal domain of Vphlp in activity and assembly of the yeast V-ATPase. J. Biol. Chem. 1998. -V. 273. P 6717-6723.

254. Leonard M., Kinet J.-M., Bodson M., Bemier G. Enhanced inflorescence development in tomato by growth substance treatments in relation C*assimilate distribution Physiol. Plant. 1983. V. 57, 1. P 85-89.

255. Lepp N., Peel A. Some effects of lAA and kinetin upon the movement of sugars in the phloem of willow Planta. 1970. V. 90. P. 230 235.

256. Lindoo S.I., Nooden L.D. Studies on the behavior of the senecence signal in Anoka soybeans Plant Physiol. 1977. V. 59, 6. P. 1136-1140.

257. Long A.R., WilHams L.E., Nelson S.J., Hall J.L, Localization of membrane pyrophosphatase activity in Ricinus communus seedlings J. Plant Physiol. 1995.-V. 1 4 6 P 629-638.

258. Loper-Carbonell M., Alegre L., Onckelen H. Changes in cell ultrastructure and endogenous abscisic acid and indole-3-acetic acid concentrations in Fatsia japonica leaves under polyethylene glycol-induced water stress Plant Growth Regulation.-1994.-V. 15, 2 P 165-174. 278. Low R., Rockel В., Kirsch M. Early salt stress effects on the differential expression of vacuolar H-ATPase genes in roots and leaves of Mesembryanthemum crystallinum L. Plant Physiol, 1996. V. 110. P. 259-265.

260. Luttge U., Ratajczak R., Rausch Т., Rockel B. Stress responses of tonoplast proteins: an axample for molecular acophysiology and search for ecoenzymes Acta Bot Neerl. 1995. V. 44 P. 343-362.

261. Maathus F., Ichida A., Sanders D., Schoeder J. Roles of higher plant K" channels Plant Physiol. 1997. V. 114. P. 1141-1149.

262. Macri F., Vianello A. ADP- or pyrophosphate-dependent proton pumping of pea stem tonoplast -enrichched vesicles FEBS Lett. 1987. V. 215, 1. P. 47-52.

263. Maeshima M., Joshida S. Purification and properties of vacuolar membrane proton-translocating inorganic pyrophosphatase from mung bean J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 20068-20073.

264. Maeshima М. Development of vacuolar membranes during elongation of cells in mung bean hypocotyls Plant Cell Physiol. 1990. V.31, 3. p. 311317.

265. Maeshima M. Vacuolar H-pyrophosphatase Biochim. 2000.-V. 1465-P. 37-51.

266. Maeshima M. Tonoplast transporters: organization and function Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. V. 52. P. 469-497.

267. Makarenko S.P., Konenkina T.A., Salyaev R.K. Characteristics of fatty asid composition of lipids in higher plant vacuolar membranes. Membr. Cell Biol. 2000. V. 13, 5. P. 687-695.

268. Mandala S., Taiz L. Proton transport in isolated vacuoles from com coleoptiles //Plant Physiol.-1985.-V.78,№ i p 104-109.

269. Mandala S., Taiz L. Characterization of the subunit structure of the maize tonoplast ATPase. Immunological and inhibitor binding studies J. Biol. Chem. 1986. V 261, 27. P 12850-12855.

270. Manolson M., Rea P., Poole R. Identification of catalytic and DCCD-binding subunits of tonoplast H-ATPases from Beta vulgaris L. Plant Physiol. 1985.-V. 77, 4 P. 86-92.

271. Manolson M., Proteau D., Preston R., Stenbit A., Roberts В., Hoyt M., Preuss D., MulhoUand J., Botstein D., Jones E. The vphl gene encoded a 95 kD integral membrane polypeptide requaed for in vivo assembly and activity of the yeast vacuolar if-ATPase. J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 1429414303.

272. Manolson M., Wu В., Proteau D., Taillon В., Roberts B. STVl gene encodes functional homologue of 95-kD yeast vacuolar if-ATPase subunit vphlp. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 14064-14074.

273. Marin B. Evidence for an electrogenic adenosine-triphosphatase Hevea tonoplast vesicles Planta. 1983. V. 157, 4. P. 324-

275. Marin В., Preisser J., Komor E. Solubilization and purification of the ATPse from the tonoplast of Hevea Eur. J. Biochem. 1985. V. 151, 1. P. 131-140.

276. Marrs K., Alfenito M., Lloyd A., Walbot V, Glutatione S-conjugate transferase involved in vacuolar transfer encoded by the Maize Bronze-

278. Marrs R. The functions and regulation of glutathione S-transferases in plant. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996. V. 47. P. 127-157.

279. Marth K., Gonzalez P., Echeverria E. Partial characterization of Htranslocating inorganic pyrophosphatase from 3 citrus varieties differing in vacuolar pH Physiol Plant. 2001. V. 111, 4. P. 519-526

280. Martinez-Cortina C, Sanz A. Effect of hormones uptake and on ATPase activity of Citrus sinensis L. Osbeck Leaves Annals of Botany. 1994. V. 73.- P. 331-335.

281. Martinoia E., Heck U., Wiemken A. Vacuoles as storage compartments for nitrate in barley leaves Nature. 1981. V. 289. P. 292-294.

282. Martinoia E., Grill E., Tommasini R., Kreuz K., Amrheyn N. An ATPdependent glutathione S-conjugate «export» pump in the vacuolar membrane of plants Nature. 1993. V. 364. P. 247-249.

283. Martinoia E., Massonneau A., Frangne N. Transport processes of solutes across the vacuolar membrane of higher plants Plant Cell Physiol. 2000. V. 41, №11.-P.1175-1186.

284. Martinoia E, Klein M., Geisler M., Bovet L., Forestier C, Kolukisaoglu U., MuUer-Rober В., Schulz B. Multifunctionality of plant ABC transporters more than just detoxifiers Planta. 2002. V. 214. P. 345-355.

285. Marty F. Analytical characterization of vacuolar membranes from higher plants In. Biochemistry and function of vacuolar Adenosine-Triphosphatase in fungi and plants. /B. Marin ed. Berlin -Heidelberg New York Tokyo: SpringerVerlag.-1984.-259p.

286. Masson F,, Szponarski W., Rossignol M. The heterogeneity of plasma membrane H-ATPase response to auxin Plant Hormone Signal Perception and Transduction A. Smith, A. Berry, N. Harpham eds. DordrechtBoston-London: Kluwer Academic Publishers, 1996 246 p.

287. Matile P., Winkenbach F. Function of lysosomes and lysosomal enzymes in the senescing corolla of the Morning Glory (Ipomoea рифигеа). J.Exp. Bot. 1971.-V. 2 2 P 759-771.

288. Matile P. The lytic compertment of plant cells. Wien-New York: SpringerVerlag, 1975.-183 p.

289. Matile P.,Wiemken A. Interaction between the cytoplasm and vacuoles. In: Encyclopedia of plant physiology. New series. Berlin-Heidelberg-New York: Springer-Vedag, 1976, V.3. P 255-287.

290. Matsuura-Endo C, Maeshima M., Yoshida S. Mechanism of the decline in vacuolar H-ATPase activity in mung bean hypocotyls during chilling Plant Physiol. 1992. V. 100. P. 717-722.

291. Matsuura-Endo C, Nakoyama S. Characterization of vacuolar H-ATPase and H-PPase from potato tubers Plant Cell Physiol. 1996. V. 37, Suppl. P.102.

292. Mattsson J., Li X., Peng S., Nilsson F., Andersen P., Lundberg L., Keeling D. Properties of three isoforms of the 116-kDa subunit of vacuolar H-ATPase from single vertebrate species. Cloning, gene expression and protein characterization of functionally distinct isoforms in Callus gallus. Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 4115-4126.

293. Maurel C, Tacnet F., Cuclu J., Guem J., Ripoche P. Purified vesicles of Tobacco cell vacuolar and plasma membranes exhibit dramatically different water permeability and water channel activity Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997.-V. 94.-P. 7103-7108.

294. Maurel С Aquaporins and water permeability of plant membranes. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. V. 48. P. 399-429.

295. Meinild A., Klaerke D., Zeuthen T. Bidirectional water fluxes and specificity for small hydrophilic molecules in aquaporins 0-5 J. Biol. Chem. 1998. V. 2 7 3 P 32446-32451.

296. Merzendorfer H., Graft R., Huss M., Harvey W.R. Wieczorek H. Regulation of proton-translocating V-ATPase J. Exp. Biol. 1997. V. 200, 2. P. 225235.

297. Miao G., Hong Z., Verma D, Topology and phosphorylation of Soubean nodulin-26, an intrinsic protein of the Peribacteroid membrane J. Cell Biol. 1992.-V. 1 1 8 P 481-490.

298. Mishra S., Gaur B. Modification of flag leaf senescence and yield characters in barley (Hordeum vulgare L.) by gibberellic acid and kinetin J. Plant Growth Regul. 1985. V. 4, 2. P. 63-70.

299. Mito N., Wimmers L.E,, Benne A.B. Sugar regulates mRNA abundance of H(+)-ATPase gene family members in tomato Plant Physiology. 1996. V.112.-P. 1229-1236.

300. Moalem-Beno D., Tamari G., Leitner-Dogan Y., Borochov A., Weiss D. Sugar-dependent gibberellin-induced chalcone syntase gene expression in Petunia corollas Plant Physiol. 1997. V. 113, 2. P. 419-424.

301. Montrichard F., Pugin A., Gaudemer Y. Inhibition of the vacuolar ATPase of Aser pseudoplannatanus cell vanadate. Biochemie. 1989. V. 71. 7. P. 813-817.

302. Moore D., Mollenhauer H. Interactions among cytoplasm, endomembranes and the cell surface. In. Encyclopedia of plant physiology. New series. BerlinHeidelberg-New York: Springer-Verlag. 1976. V. 3. P.288-344.

303. Moreau A., Jacob J., Dupont J., Lance C. Electron transport in the membrane of lutoids from the Latex of Hevea brasiliensis. Biochim. Biophys. Acta. 1975. V 396, 1 P 116-124.

304. Morillon R., Catterou M., Sangwan R., Sangwan В., Lassales J. Brassinolide may control aquqporin activities in Arabidopsis thaliana Planta. 2001, V. 2 1 2 P 199-204.

305. Moriyama Y., Nelson N. Cold inactivation of vacuolar proton ATPase J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 3577-3582.

306. Moyle J., Mitchell R., Mitchell P. Proton-translocating pyrophosphatase of Rhodospirillum rubrum FEBS Lett. 1972. V. 23. 2. P. 233-236.

307. Muller M.L., Jensen M., Taiz L. The vacuolar ET-ATPase of Lemon Fruits is regulated by variable Ы/АТР coupling and slip J. Biol.Chem.- 1999.- V. 274, 1 6 P 10706-10716.

308. Muller M., TaizL. Regulation of the lemon-frui V-ATPase by variable stoichiometry and organ acids. J. Membr. Biol. 2002. V. 185. P. 209220.

309. Mullins M. Hormon-directed transport of assimilates in decapitated intemodes of Phaseolus vulgaris //Ann. Bot. 1970. V. 34 P. 897- 909.

310. Nagar P. Changes in abscisic acid, phenols and indoleacetic acid in bulbs of tuberose (poliantes tuberosa L.) during dormancy and sprouting Scientia Horticultyrae. 1995. V. 63, 1-2. P. 77-82.

312. Nakamura Y., Yamaguchi M., Kasamo K., Kobayashi H. The effect of chilling temperature on membrane lipids and proton-pumps in tonoplast from cultured rice cells. Plant. Physiol. 1997. V. 114,

313. Suppl. P. 129. ions Plant Cell Physiol.

314. Narasimhan М., Bressan R., Hasegawa P. NaCI regulation of tonoplast ATPase 70-kilodalton subunit mRNA in tobacco cells. Plant Physiol. 1991. V. 97, №2. P. 562-569.

316. Nelson H., Mandiyan S., Nelson N. A bovine cDNA and a yeast gene (vma8) encoding the subunit D of the vacuolar H -ATPase. Proc, Natl. Acad. Sci. USA.- 1995.-V. 92. P 497-501.

317. Nishi Т., Forgas M. Molecular cloning and expression of three isoforms of the 100-kD a subunit of the mouce vacuolar proton-translocating ATPase. J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 6824-6830. 336. Niu X., Bressan A., Hasegawa P.M., Pardoy M. Homeostasis in NaCI stress environments Plant Physiol. 1995. V. 109, 2. P. 735-742.

318. Noji H., Yasuda R., Yoshida M., Kazuhiko K. Direct observation of the rotation of the Fl-ATPase. Nature. -1997. V. 386 P.299-302.

319. Obermeyer G,, Sommer A., Bentrup F. Potassium and voltage dependence of the inorganic pyrophosphatase of intact vacuolar from Chaenopodium rubrum. //Biochim. Biophys. Acta. 1996. V 1284. P 203-212.

320. Ogilvie I., Aggler R., Capaldi R. Crosslinking of the delta subunit to one of three alpha subunits has no effect on functioning of E. coli ATP synthase. J. Biol. Chem. 1997. V 272. P. 16652-16656.

321. Ofosuanim J., Kanyama Y., Yamaki S. Sugar uptake into strawberry fruit is stimulated by abscisic acid and indoacetic acid Physiol. Plantarum. 1996. V. 97, l P 169-174. 341. Oka Т., Toyomura Т., Honjo K., Wada Y., Futai M. Four subunit a isoforms of Caenorhabditis elegant vacuolar H-ATPase. J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P 33079-33085.

322. Oluwatosin Y., Kane P. Mutations in the CYS4 gene provide evidence for regulation of the yeast vacuolar H-ATPase by oxidation and reduction in vivo. //J. Biol. Chem. 1997. V 2 7 2 P 28149-28157. 343. ONeill S., Spanswick R. Effects of vanadate on the plasma membranes ATPase of red beet and com. Plant Physiol. 1984. V. 75. P. 586-591.

324. Overvoorde P., Grimes H. Topological analysis of the plasma membrane- associated sucrose binding protein from soybean J. Biol. Chem. 1994. V. 2 6 9 P 15154-15161.

325. Palmgren M., Sommarin M. Lysophosphatidylcholine stimulates ATP dependent proton accumulation in isolated Oat root plasma membrane vesicles. //Plant Physiol. 1989. V 90. P 1009-1014.

326. Parry R.V., Turher J.C., Rea P.A. High purity preparations of higher plant vacuolar tT-ATPase reveal additional subunits J. Biol. Chem. 1989. V. 264 P. 20025-20032.

328. Peres L.E., Kerbany G. B. High cytokinin accumulation following root tip excision changes the endogenous auxin-to-cytokinin ratio during root-to-shoot conversion in Catasetum fimbriatum Lindl (Orchidaceae) Plant Cell Reports. 1 9 9 9 V 1 8 P 1002-1006.

329. Pohl P., Saparov S., Borgnia M., Agre P. Highly selective water channel activity measured by voltage clamp: analysis of planar lipid bilayers reconstituted with purified AqpZ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 9 8 P 9624-9629.

330. Pope A.J., Leigh R.A. Some characteristics of anion transport at the tonoplast of oat roots, determined from the effects of anions on pyrophosphate-dependent proton transport Planta. 1987. V. 172, i. p. 91-100.

331. Preiss J., Kosuce T. Regulation of enzyme activity in photosynthetic systems Annu. Rev. Plant Physiol. 1970. V. 21 P. 433-366.

332. Puopolo K., Forgac M. Functional reassembly of the coated vesicle proton pump J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 14836-14841.

333. Puopolo K., Sczekan M., Magner R., Forgac M. The 40 kDa subunit enhances but is not required for activity of the coated vesicle proton pump. J. Biol. Chem. -1992. -V. 267. P 5171-5176.

334. Randall S., Sze H. Proterties of the partially purified tonoplast H*-pumping ATPase from oat roots J. Biol. Chem. 1986. V. 261, 3. P. 1364-1374.

335. Randall S.K., Sze H. Probing and catalytic subynit of the tonoplast H-ATPase from oat roots //J. Biol. Chem. 1987. V 262 P 7153-7141.

336. Ratajczalc R., Feussner I., Hause R., Bohm., Parthier В., Wastemack С Alteration of V-type H"- ATPase during methyljasmonate-induced senescence in barley (Hordeum vulgare L. ev. Salome) J. Plant Physiol. 1998. V. 152, 2 3 P 199-206.

337. Ratajczak R. Structure, function and regulation of the plant vacuolar H"translocating ATPase //Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1465 P. 17-36.

338. Raven J.A., Smith F.A. Intracellular pH and its regulation Annu. Rev, Plant Physiol. 1979.-V. 30, 3 P 289-311. 360. Ray S., Mondal W.A., Choudhuri M.A. Regulation of leaf senescence, grainfiUining and yield of rice by kinetin and abscisic acid Physiol. Plant. 1983. V 59, 3 P 343-346. 361. Rea P.A., Poole R.J. Proton-translocating inorganic pyrophosphatase in red beet (Beta vulgaris L.) tonoplast vesicles Plant Physiol. 1985. V. 77, 1. P. 46-52.

339. Reismeier J.W., Himer В., Frommer W.B. Potato sucrose transporter expression in minor veins indicates a role in phloem loading Plant Cell. 1993.-V. 5 P 1591-1598.

340. Reuveni M., Bennet A., Bressan R., Hasegawa P. Enhanced H" transport capacity and ATP hydrolysis 1 actvity of the tonoplast H-ATPase after NaCI adaptation. Plant. Physiol. 1990. V. 94. P. 524-530.

341. Robinson D.G., Haschke H.P., Hinz G., Hoh В., Maeschima M., Marty f Immunological detection of tonoplast polypeptides in plasma membrane of per cotyledons//Planta. 1996. V 198, 1. P 95-103.

342. Roblin G., Sakr S., Bommort J., Delrot 424.-P. 165-168.

343. Rockel В., Ratajczak R., Becker A. Changed densities and diameters of intramembrane tonoplast particles of Mesembryanthemum 318-324.

344. Saftner R., Wyse R. Alkali cation sucrose co-transport in the root tissue of sugar beet Plant Physiol. 1980. V. 66, 1. P. 884-889. crystallinum in correlation with NaCI-induced CAM. J. Plant Physiol. 1994. V. 143. P. S. Regulation of a plant plasma membrane sucrose transporter by phosphorylation FEBS Letters. 1998. V.

345. Saftner R.A., Dale J., Wyse R.E. Sucrose uptake and compartmentalization in sugarbeet taproot Plant Physiol. 1983. V. 72, 1. P. 1-6.

346. Saftner R.A., Wyse R.E. Effect of plant hormones on sugar uptake by root tissue of sugar beet Plant Physiol. 1984. V. 74, 4. P. 951-955.

347. Sakr S., Noubahni M., Bourbouloux A., Reismeier J., Frommer W., Sauer N., Delrot S. Cutting, ageing and expression of plant membrane transporters //Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1330, 2. P. 207-216.

348. Salyaev R.K. Plant vacuole membrane: structure and properties Biochemistry and function of vacuolar Adenosine-Triphosphatase in fungi and plants B. Marin. Berlin Heidelberg New York Tokyo:Springer-Verlag 1984. 259 p.

349. Sanders D., Brownlee C, Harpert J. Communicating with calcium. Plant Cell. 1 9 9 9 V 11.-P. 691-706.

350. Santoni V., Vansuyt G., Rossignol M. Differential auxin sensitivity of proton translocation by plasma membrane H-ATPase from tobacco leaves Plant Science. 1990. V. 68 P. 33-38.

351. Santoni V., Vansuyt G., Rossignol M. The changing sensitivity to auxin of the plasma membrane H-ATPase: relationship between plant development and ATPase content of membranes Planta. 1991. V. 185 P. 227-232.

352. Sarafian V., Kim Y., Poole R.J., Rea P.A. Molecular cloning and sequencing of с DNA encoding the pyrophosphate-energized vacuolar membrane proton pump of Arabidopsis thaliana Proc. Nat. Sci USA. 1992. V. 89 P. 17751779.

353. Schussler J.R., Brenner M.L., Brun W.A, Abscisic acid and its relationship to seed filling in soybeans Plant Physiol. 1984. V. 76, 2. P. 301-306.

354. Seth A., Wareing P. Interation between auxins,gibberellins and kinins in hormone-directed transport Life Sci. 1984. V.3. P. 1483-1486.

355. Shafener W., Weismann C, A rapid sensitive and specific method for the determination of protein in dilute solution Anal. Biochem. 1973. V. 56, 2.-P. 502-514.

356. Shakya R., Sturm A. Characterization of source- and sink-specific sucrose/H symporters from carrot Plant Physiol. 1998. -,V. 118, 4. P. 1473-1480.

357. Sheen J., Zhou L., Jang J. Sugars as signaling moleculs Current opinion in plant biology. 1999. V. 2, 5. P. 410-418.

358. Schobert C, Baker L., Szederkenyi J., Grossmann P., Komor E., Hayashi H., Chino M., Lukas W.J. Identification of immunologically related proteins in sieve-tube exudate collected from monocotyledonous and dicotyledonous plants Planta. 1998. V. 206 P. 245-252.

359. Schroeder JL, Hagiwara S. Cytosolic calcium regulates ion channels in the plasma membrane of Vicia faba guard cells Nature. 1989. V. 338. P. 427-430.

360. Shotton D. Freezeetch studies of membrane proteins: a review. Biochem. Soc. Trend. 1978. V. 6. P. 38-40.

361. Siefritz F., Biela A., Eckert M., Otto В., Uehlein N., Kaldenhoff R. The tobacco plasma membrane aquqporim NtAQPl J. Exp. Bot. 2001. V. 52. P. 1953-1057.

362. Smart C. Gene expression during leaf senescence. New Phytol. 1994. V. 126.-P. 419-448.

363. Smart C, Fleming A. Hormonal and enviromental regulation of a plant PDR5like ABC transporter. //J. Biol. Chem. 1996. V 271. P 19351-19357.

364. Smeekens S. Sugar-induced signal transduction in plants Annu. Rev. Physiol. PlantMol. Biol.-2000.-V. 5 1 P 49-81.

365. Smith FW., Rae AL., Hawkesford MG. Molecular mechanisms of phosphate and sulphate transport in plants Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1465. P. 236-245.

366. Sommarin M., Palmgren M., Larsson С Regulation of the plant plasma membrane H"-ATPase activity Биол. мембраны. 1994. T.ll, №3. 232-240.

367. Stadler R., Sauer N. The Arabidsopsis thaliana AtSUC2 gene is Specifically expressed in companion cells Bot. Acta. 1996. V. 109. P. 299-306.

368. Stark S. Photosynthesis and endogenous regulation of the source-sink relation in tomato plant Photosynthetica. 1983. V. 17, 1. P. 1-11.

369. Steffens J. The heavy metal-binding peptides of plants Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1990. V. 41. P. 553-575.

370. Stevens Т., Forgas M. Strucrure, function and regulation of the vacuolar H"ATPase Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1997. V. 13. P. 779-808.

371. Stolarek J., Zientara V. Dziafanie fitohormonow na potencjal membranowy, przyrost swiezej masy i pompe protonowa w komorkach koleoptyli Triticum vulgare L. Acta biol. siles. 1991. V. 17 P. 57-68.

372. Stout R.G., Cleland E.L, Evidence for a СГ stimulated MgATPase proton pump in oat root membranes Plant Physiol. 1982. V. 69. P. 798-803.

373. Struve I., Luttge U. Characteristics of MgATP-dependent electrogenic proton transport in tonoplast vesicles of the facultative crassulacean-acid-metabolism plant Mesembiyatheum crystallinum L. Planta. 1987. V. 170, 1. P. 111-120.

374. Sturgis J., Ruberty P. The effects of indol-3-yl acetic and flisicoccin on the kinetic parameters of sucrose uptake by discs from expanded primary leaves of Phaseolus vulgaris L. Plant Sci. Lett. 1982. V. 24 P. 319-326.

375. Suga S., Komatzu M., Maeshima M. Aquaporin isoforms responsive to salt and water stresses and phytogormones in radish seedling Plant Cell Physiol. 2 0 0 2 V 4 3 P 1229-1237.

376. Suzuki C Kazamo K. Effects of ageing on the ATP- and pyrophosphatedependent pumping of proton across the tonoplast isolated from pumpkin cotyledons Plant Cell Physiol. 1993. V. 34, 4. P. 613-619.

377. Swanson S., Jones R. Gibberellic acid induces vacuolar acidification in barley aleurone//Plant Cell.-1996. V. 8, 1 2 P 2211-2221.

378. Tanner W., Caspari T. Physiol. Plant Mol. Biol. 1996. V. 47 P. 595-626.

379. Taiz S.L., Taiz L. Ultrastructural comparison of the vacuolar and mitochondrial H-ATPase of Daucus carrota Bot. Acta. 1991. V. 104 P. 117-121.

380. Tavakoli N,, Kluge C, GoUdack D., Mimura Т., Dietz K.J. Reversible redox control of 51.

381. Theodoulou F.L. Plant ABC transporter Biophim. Biophys. Acta. 2000. №1465.-P. 79-103

382. Thorn M., Maretzki A., Komor E. Vacuoles from sugarcane suspension cultures. I. Isolation and partial characterization. Plant Physiol. 1982. V. 6 9 6 P 1315-1319.

383. Thome G.H., Koller H.H. Influence of assimilate domand on photosynthesis diflusive resistances translocation and carbohydrate levels of soybean leaves Plant Physiol. -1974. V. 54, 2. P. 201-207.

384. Tietz A., Ludewig M., Dingkuhn M., Dorffling K. Effect of abscisic acid on the transport of assimilates in barley Planta. 1981. V. 152, 6. P. 557-561.

385. Tommasini R., Vogt E., Fromenteau M., Hortensteiner S., Matile P., Amrhein N., Martinoia E. An ABC-transporters of Arabidopsis thaliana has both plant vacuolar H-ATPase activity related to disulfide bridge formation in subunit E as well as subunit A. Plant J. 2001. -V. 28. P. 28-

386. Toyoshima C Nakasano M., Nomura H., Ogawa H. Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic at 2.6 A resolution. Nature. 2000. V. 405. P 647-655.

387. Truemit E., Sauer N. The promoter of the Arabidopsis thaliana SUC2 sucroseTT symporter gene directs expression of B-glucuronidase to the phloem: evidence for phloem loading and unloading by SUC2 Planta. 1995. V. 1 9 6 P 546-570. 418. Tu S., Brouilette J., Nagahashi G., Brauer D., Nungesser E Temperature depevdence and mercury inhibition of tonoplast type IT-ATPase Arch. Biochim. Biophys. 1988. V. 266. P. 289-297.

388. Turkina M.V., KulikovaA.L., Sokolov O.I, Bogatyrev V.A., Kursanov A.L. Actin and miosin filaments from the conducting tissues of Heracleum Sosnowskyi Plant Physiol. Biochem. 1987. V. 25 P. 689-696.

389. Tzagoloff A., Rubin M., Sierra M. Boisyntesis of mitochondrial enzymes Biochim. Biophys. Acta. 1973. V 301, 1. P. 71-104.

390. Ueoka-Nakanishi H., Nakanishi Т., Tanaka Y., Maeshima M. Properties and molecular cloning of Ca /H antiporter in the vacuolar membrane of mung bean Eur. J. Biochem. 1999. V. 262. P. 417-425.

392. Vara F., Serrano R. Phosphorylated intermediate of the ATPase of plasma membranes J. Biol. Chem. 1973. V. 258, 9. P. 5334-5336.

395. Wagner G. Content and vacuole/extravacuole distribution of neutralsugars, free amino acids, and antocyanin in protoplasts. Plant Physiol. 1979. V. 64, 1.-P. 88-93.

396. Wagner G. Enzymes and protein character of tonoplast from Hippeastrum vacuoles. //Plant Physiol. 1981. V. 68, 2. P. 499-503.

397. Wagner G., Lin W. An active proton pump of intact vacuole isolated from Tulip petals Biochem. Biophys. Acta. 1982. V. 689, 2. P. 261-266.

398. Wagner G., Milready P. Characterization and solubilization of nucleotide740-\- specific, Mg -ATPase and Mg -pyrophosphatase of tonoplast Biochem. Biophys. Acta. 1983. V. 728, 2. P. 267-280.

401. Walker D., Leigh R., Muller A. Potassium homeostasis in vacuolated plant cells Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 10510-10514.

402. Walter Н., Stadelmann E. The physiological prerequisites for the transition of autotropic plants from water to terrestrial life Bioscience. 1968. V. 18, 1 7 P 694-701. 436. Wan C.Y., Wilkins T.A. Isolation of multiple cDNAs encoding the vacuolar H"-ATPase subunit В from developing cotton (Gossipium hirsutum L.) Plant Physiol. 1994. V. 106, 2. P. 393-394.

403. Wang Y., Leigh R., Kaestner K., Sze H. Electrogenic IT- pumping pyrophosphatase in tonoplast vesicles of oat roots Plant Physiol. 1986. V. 8 1 2 P 497-502.

404. Wang S., Moriyama Y., Mandel M., Hulmes J., Pan J., Danho W., Nelson H., Nelson N. Cloning of cDNA encoding a 32kD protein; an accessory polypeptide of the H"-ATPase from chromaffin granules J. Biol. Chem. 1988.-V. 2 6 3 P 17638-17642.

405. Wang B.-S., Haschhe H.P. The effect of Na", K" and abscisic acid on the ATPase activity of the tonoplast in barley roots treated with NaCI Acta Phytophys. S i n 1 9 9 1 V 17, 1.-P. 403-406.

406. Ward J.M., Sze H. Subunit composition and organization of the vacuolar H*ATPase from oat roots Plant Physiol. 1992. V. 99, 1. P. 170-179.

407. Wardlow I.F. The control and pattern of movement of carbohydrates in plants Bot. Rev. 1968. V. 68 P. 79-105.

408. Wardlaw J.F., Moncur L. Source, sink and hormonal control of translocation in wheat Planta. 1976. V. 128, 2. P. 93-100.

409. Wareing P.F., Khalifa M.M., Trehame K.I. Rate limiting prosesses in photosyntesis at saturating light intensities //Nature. 1968. V. 220, 5166. P 453-457.

410. Wayne R., Tazawa M. The actin cytoskeleton and polar water permeability in Characean cells Protoplasma. 1988. V. 2 Suppl. P. 116-130.

412. Weig A., Deswarte C Chrispeels MJ. The major intrinsic protein family of Arabidopsis has 23 members that form three distinct groups with functional aquaporins in each group Plant Physiol. 1997. V. 114. P. 1347-1357.

413. Wessler A., Wild A. Investigations on the content of indole-3-acetic acid in spruce needles and damaged trees of various sites J. Plant Physiol. 1993. V. 141, 5 P 615-620.

414. White R.W., Marshall J., Smith J.A. Substrate kinetics of the tonoplast Htranslocating inorganic pyrophosphatase and its activation by free Mg" Plant Physiol. 1990. V. 93, 4. P. 1063-1070.

415. White J.P. Bafilomycin Al is a non-competitive inhibitor of the H-ATPase of maize coleoptiles.// J. Exp. Hot. 1994. V. 45, 279. P. 1397-1402.

416. Wiebe H. The significance of plant vacuole Bioscience. 1978. V. 28, 6 5 P 327-331.

417. Williams L., Lemoine R., Sauer N. Sugar transporters in higher plants a diversity of roles and complex regulation Trends in plant science. 2000. V. 5, 7. P. 283-290.

418. Willenbrink J., Doll S. Characteristics of sucrose uptake system of vacuoles solated from red beet tissue. Kinetics and specifity of the sucrose uptake system. Planta. 1979. V. 147 P. 159-162.

419. Wyse R. Parameters controlling sugar content and yield of sugarbeet roots J. Amer. Soc. Sugar Beet Technol. 1979a. V. 20, 4. P. 368-387.

420. Wyse R. Sugar uptake by sugarbeet taproot tissue Plant Physiol. 1979b V 6 4 4 P 837-841. 455. Xie X., Crider В., Stone D. Isolation of a protein activator of the clatrin-coated 1 vesicle proton pump J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 25063-25067.

421. Yamada S., Katsuhara M., Kelly W., Michalowski C Bohnert H. Family of transcripts encoding water channel prpteins: tissue-specific expression in the common ice plant Plant Cell. 1995. V. 7. P. 1129-1142.

422. Yamaguchi M., Kasamo K, Modulation in the activity of purified tonoplast H"*"ATPase by tonoplast glycolipids prepared from cultured rice (Oryza sativa L. var. Boro) cells Plant Cell Physiol. 2001. V. 42. P. 516-523.

423. Yamanishi H., Kasamo K. Modulation of activity of purified tonoplast ЬГATPase from mung bean (Vigna radiate L.) hypocotyls by various lipids Plant Cell Phys. 1993.-V. 34. P. 411-419.

424. Yang H., Cooley M.B., Downie В., Mella R.A., Bradford K.Y. Isolation and characterization of GA-induced germination-specific genes in tomato seeds by different display Plant Physiol. 1996. V. 111, 2. P. 53-61.

425. Yang S., Maeshima M., Tanaka Y., Komatsu S. Modulation of vacuolar H"pumps and aquaporin by phytohormones in rice seedling leaf sheaths Biol. Pharm. Bull. 2003. V. 1. P. 88-92.

426. Yoshida S., Hotsubo K., Kawamura Y., Murai M., Arakawa K., Takezawa D. Alterations of intracellular pH in response to low temperature stress J. Plant Res. 1999. V. 112. P. 225-236.

427. Youmans S., Barry C. Bafilomycin Al at nanomolar concentrations saturably inhibit portion of turtle bladder acidification current J.Exp. Biol. 2001. V. 1 6 P 2911-2919.

428. Zeidel M., Nielsen S., Smith В., Ambudkar S., Maunsbach A., Agre P. Ultrastructure, pharmacologic inhibition, and transport selectivity of aquaporin channel-forming integral protein in proteoliposomes Biochemistry. 1994. V. 3 3 P 1606-1615.

429. Zhang J., Myers M., Forgac M. Characterizationof the VQ domain of the coated vesicle (H)-ATPase J. Biol. Chem. 1992. -V. 267. P. 9773-9778.

430. Zhang K.,Wang Z., Gluck S. Identification and partial purification of a cytosolic activator of vacuolar H-ATPases from mammalian kidney J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 9701-9705.

431. Zhang J., Feng Y., Forgac M. Proton conduction and bafilomycin binding by the Vo domain of the coated vesicle V-ATPase J. Biol. Chem. 1994. -V. 269.-P. 23518-23523.

432. Zimmermann U. Physics of turgor- and osmoregulation. Annu. Rev. Plant Physiol- 1978.-V. 2 9 P 121-148.

433. Zimmerman S.T., Thomie J., Guem J., Barbier-Brygoo H. An anion Current at the Plasma Membrane of Tobacco Protoplasts Showns ATP-Dependent Voltage Regulation and its Modulated by Auxin Plant J. 1994. V. 37. P. 840-846

434. Zingarelli L., Anzani P., Lado P. Enhanced K-stimulated pyrophosphatase activity in NaCI-adapted cells of Acer pseudoplatanus. Physiol. Plantarum. 1994.-V. 9 1 P 510-516. I-L