Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение регуляции протонных помп тонопласта и их связь с транспортом

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение регуляции протонных помп тонопласта и их связь с транспортом"

На правах рукописи

РГБ ОД

Прадедова Елена Владимировна • 1 7 < гм

• ' к;.г

Изучониэ регуляции прогонных помп тоногшаота и их связь о

транспортам

03.00.12 Физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2ООО

Работа выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, Иркутск

Научный руководитель: члеи-корреспондеит РАН Р. К. Саляев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н. И. Рекославская кандидат биологических наук Л. И. Донская

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский Университете, кафедра физиологии растений.

Защита состоится "4" мая 2000 г в 10 ч на заседании диссертационного совета Д.003.25.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, Иркутск, а/я 1243, ул. Лермонтова, 132. Факс (3952) 31-07-54.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан " у} 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г. П. Акимова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Исследование регуляции транспортных процессов, протекающих на мембране вакуоли (запасающего компартмента клетки) представляет несомненный интерес, поскольку дает возможность установить пути управления накоплением биологически важных веществ в растительной клетке. Известно, что вакуолярная мембрана (тонопласт) содержит рад специализированных транспортных систем пассивного и активного переноса веществ. Системы активного переноса на тонопласте связаны с двумя протонными насосами: Н^-АТФазой и Н+-пирофосфатазой (Rea and Sanders, 1987). 05а фермента принимают участие в транспорте ионов, углеводов, аминокислот и других соединений в вакуоль (Briskin et al., 1985; Саляев и Катков, 1988; Martinoia and Rentsch, 1992; Davies, 1992). В связи с этим изучение регуляции активности Н+-АТФазьг и íT-пирофосфатазы представляет особый интерес.

Как установлено в настоящее время, процессы накопления веществ, в которых существенную роль играют системы активного транспорта мембран, контролируются фитогормонами (Полевой, 1989). Гормональная регуляция активного транспорта, в частности 1Г-АТФазы, довольно хорошо изучена на шшмалемме (Santoni et al., 1991; Терещенко, 1994, Шишова и саовт., 1998). В то же время, информации о влиянии фитогормонов на Н^-АТФазу и Н+-пирофосфатазу вакуолярной мембраны на сегодняшний день сравнительно мало. Имеющиеся в литературе результаты исследований гормонального воздействия на активность протонных насосов тонопласта, как правило, противоречивы и трудно воспроизводятся (Wang Bao-Shan and Haschhe, 1991; Kasai et al., 1993). На наш взгляд, это могло быть следствием неоптимальных условий экспериментов, при которых не всегда принимались во внимание онтогенетическая динамика активности ферментов и эндогенный уровень гормонов, а также ионный состав опытных сред мог не соответствовать условиям, необходимым для эффективного воздействия фитогормонов на ферменты. Не исключено, что поэтому в настоящий момент до конца не выяснен вопрос: "Могут ли фитогормоны регулировать актнвпость rf-АТФазы и Н^пирофосфатазы на уровне мембраны (т. е. минуя пути активации синтеза белков фермента)?" В этой связи остается также нерешенным вопрос о роли ионов при взаимодействии ферментов и фитогормонов. Не выяснена возможность рсгуляторного влияния фитогормонов на сопряженный с переносом протонов транспорт в вакуоль углеводов. Указанные вопросы, на наш взгляд, являются важным звеном в изучении на мембранном уровне механизмов регуляции процессов аттракции и накопления метаболитов в клетке.

Целью настоящей работы явилось изучение влияния фитогормонов и кннетина на гидролитическую активность Н*-АТФазы и Н*-пирофосфатазы мембран изолированных вакуолей корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) и на сопряженный с активным переносом протонов транспорт Сахаров в вакуоль.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить динамику гидролитической активности протонных насосов тонопласта и динамику накопления Сахаров в онтогенезе столовой свеклы (Beta vulgaris L.).

2. Исследовать на изолированных вакуолях, выделенных на разных фазах онтогенеза, влияние гибберелловой кислоты, абсцизовой кислоты, индолилуксусной кислоты и кинетина на активность Н+-АТФазы и }Г-пирофосфатазы вакуолярной мембраны.

3. Проанализировать роль ионов К+ и Mg2b в гормональной регуляции протонных насосов.

4. Изучить влияние фитогормонов на активное поглощение Сахаров изолированными вакуолями на разных этапах роста и развития растения.

Научная новизна. В настоящей работе получены новые данные о гормональной регуляции гидролитической активное™ Н^-АТФазы и Н+-пирофосфатазы тонопласта. На изолированных вакуолях продемонстрирована способность фитогормонов существенно изменять активность протонных насосов па уровне мембраны. Наряду с этим, выявлена зависимость гормональной регуляции ферментов от ряда факторов: а) от ионного состава опытных сред; б) от стадии роста и развития растения; в) от присутствия ионов-регуляторов ферментов. Проведены исследования, которые показали, что через регуляцию активности Н'-АТФазы и Н^-пирофосфатазы фигогормоны способны управлять транспортом Сахаров в вакуоль.

Практическая и теоретическая значимость работы определяется тем, что полученные результаты не только дополняют сведения о регуляции протонных насосов тонопласта, но и открывают новые возможности для дальнейшего исследования механизмов гормональной регуляции транспортных процессов на вакуолярной мембране и изучения механизмов аттракции.

В теоретическом плане особое значение имеет доказательство того, что фитогормоны могут регулировать активность rf-АТФазы и Н+-пирофосфагазы тонопласта на уровне мембраны. Большой интерес, как в теоретическом, так и в практическом аспекте, имеют сведения о способности фитогормонов управлять транспортом Сахаров в вакуоль через регуляцию активности протонных насосов.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на Международном симпозиуме "Plant hormone perception and transduction" (Москва, 1994), на Ежегодном симпозиуме "Physical-chemical basis of plant physiology" (Пемза, 1996), на IV Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1997), на Международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия'' (Москва, 1999), а также на научных сессиях (1994, 1996, 1998 г.) Сибирского института физиологии и биохимии растений.

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 12 печатных работах.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (143 наименования). Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, включает 3 таблицы и 15 рисунков.

Объект и методы исследования.

Объект. В качестве объекта исследования использовали корнеплоды столовой свеклы (Beta vulgaris L.) сорт Бордо. Растения выращивали на опытном участке института.

Корнеплоды отбирали на следующих фазах онтогенеза растения: 1) во время активного роста в первый год вегетации (эта фаза роста в зависимости от интенсивности накопления Сахаров поделена на два периода); 2) во время покоя (корнеплоды хранили при +4° - 45° С); 3) во второй год онтогенеза.

Выделение вакуолей. Выделение вакуолей из ткани корнеплодов проводили модифицированным макрообъемным методом, разработанным в нашей лаборатории (Саляев и соавт., 1981). Были использованы следующие растворы: 1) раствор для изолирования вакуолей - 800 мМ КС1, 20 мМ ЭДТА, 50 мМ Nal^PO,»/ КОН, рН 8,0; 2) раствор ресуспендирования - 1M КС1, 1мМ ЭДГА, 3 мМ MgCl2, 5 мМ Трис/HCl, рН 7,4. В том случае, когда нужно было уменьшить содержание ионов К* (1) или совсем исключить калий из раствора (2), использовали среды ресуспендирования следующего состава: 1) 70 мМ КС1, 800 мМ Р-аланина, 3 мМ MgClz, 5 мМ Трис/HCl, рН 7,4; 2) 100 мМ Триса или имадазола/HCI, 800 мМ Р-аланина, 3 мМ MgCl2> рН 7,4 (р=1,040 г/см3).

Определение гидролитической акпгоности исследуемых ферментов. Гидролитическую активность rf-АТФазы и ЬГ-пирофосфатазы определяли на изолированных вакуолях, которые инкубировали при 37°С в течение 35 мин (Rea and Sanders, 1987) в средах разного ионного состава (в зависимости от преследуемой цели):

а) при сравнении влияния высоких и низких концентраций ионов калия применяли среды с 700 мМ КС1 и с 70 мМ KCI плюс р-аланин (3 мМ MgCl2, 10 мМ сахарозы, 1мг/1мл ЧСА, 0,2 мМ молибдат аммония, 0,1 мМ 2-Меркаптоэтанола, 20 мМ Трис-МЭС (НС1), рН 8,0, плотность р=1,040 г/см3);

б) для оценки роли ионов К+ и Mgw в гормональной регуляции Н+-АТФазы и 1Г-пирофосфатазы, использовали растворы: 1)700 мМ (3-аланина, 100 мМ Трис-НС1 или имидазол-HCl, рН 8,0; 2) 3 мМ MgCk, 100 мМ Трис-HCl или имидазол-HCl, 700 мМ р-аланина, рН8,0; 3) 70 мМ КС1,700 мМ р-аланина, 20 мМ Трис-МЭС или имидазол-МЭС, рН 8.0; 4) 70 мМ КС1, 3 мМ MgCI2, 700 мМ р-аланина, 20 мМ Трис-МЭС или имидазол-МЭС, рН 8,0. Все растворы содержали 0,1 мМ 2-Меркаптоэтанола и 0,2 мМ молибдата аммония (ингибитора кислых фосфатаз).

Если исследовали гормональную регуляцию активности ферментов, то добавляли растворы фитогормонов (ГК3, ИУК, АБК) или кинетина, до конечной концентрации в суспензии от 10"'°до Ю^М.

Во все среды инкубации вносили субстраты ферментов: 3 мМ АТФ (натриевая соль, Sigma) или пирофосфата (ПФн) (натриевая или калийная соли, Sigma). Реакцию гидролиза субстратов останавливали 7% трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Затем центрифугировали 5 мин на микроцентрифуге Туре-320 (Poland) при 1200g. В надосадочной жидкости определяли количество бетацианинов (Кузеванов, 1983) и неорганического фосфора (Фн) методом Лоурн-Лоренса в модификации Скулачева (Никулина, 1965). Активность Н+-АГФазы и Н+-пирофосфатазы выражали в условных единицах - мкМ неорганического фосфора (Фн) поделенные на мМ бетацианина в час (Doll et al,, 1979). Изменение активности ферментов в присутствии гормонов или ионов К1" и Mg2+ выражали в процентах от контрольной активности.

Определение углеводов и ионов К*. Небольшой объем осадка вакуолей (0,2 мл) шокировали дистиллированной водой (1,8 мл). Нерастворимые примеси в суспензии осаждали на микроцентрифуге Туре-320 (Poland) в течение 5 мин при 1200g. Супернатант разбавляли водой еще в 10 раз. Содержание Сахаров определяли и в соке корнеплода. Для этого 10 г сырой ткани корнеплода натирали на пластмассовой терке, затем отжимали через капроновую сеть. Сок центрифугировали при 1200g 5 мин на микроцентрифуге Туре-320 (Poland). 0,5 мл надосадочной жидкости разбавляли в 100 раз дистиллированной водой. В полученных растворах сока определяли сахара антроновым методом (Туркина и Соколова, 1971).

Концентрацию ионов К^ определяли только в соке корнеплодов. 50 мкл сока

разбавляли в 20-500 раз, в зависимости от периода вегетации. Измерения проводили на пламенном фотометре (Flapho-4, Carl Zeiss Yena, GDR).

Определение знгптного поглощения 3Н-сахарозы на изолированных вакуолях. Вакуоли инкубировали в растворе 455 мМ KCl, 3 мМ MgCl2, 150 мМ ß-алашш, 0,2 мМ молибдата аммония, 1 мг/1 мл ЧСА, 20 мМ Трис-МЭС, pH 8,0, р=1,040 г/см3), который содержал 3 мМ АТФ или ПФн (натриевая и калийная соли, Sigma). К суспензии вакуолей приливали 20 мкл раствора фитогормонов (ИУК, АБК, ГК3) и кинетина, до конечной концентрации от Ю"10 до 10"8 М. В последний момент вносили 8 мкл меченой сахарозы (3Н-сахарозы). Удельная активность растворов сахарозы составила 0,32-0,4 МБК/мл.

Количество поглощенной сахарозы определяли в осадках вакуолей, полученных в результате центрифугирования суспензии (10 сек, 1200g). Активное поглощение сахарозы узнавали по разнице между концентрацией меченой сахарозы в опытных вариантах (содержали АТФ и ПФн, и инкубировались 35 мин при 37°) и в контрольных вариантах (не инкубировались и/или не содержали субстратов ферментов). Величину поглощения выражали в условных единицах в пересчете нМоль накопленной сахарозы на мМоль бетацианина в час (Leigh and Branton, 1976; Doll et al„ 1979).

В опытах с гормонами при определении активного транспорта сахарозы находили разницу в количестве поглощенной сахарозы между образцами с гормонами и без, и выражали в процентах от контрольного активного поглощения (т. е. в присутствии АТФ или пирофосфата).

Все опыты проводили в 3-5 биологических повторностях. В таблицах и рисунках указана стандартная ошибка.

Результаты и обсуждение

Динамика активности протонных насосов тонопласта в онтогенезе столовой свеклы. Динамику гидролитической активности ферментов на всех фазах онтогенеза изучали в сопоставлении с динамикой накопления Сахаров (Briskin et al„ 1985; Саляев и соавт., 1988; Андреев, 1992). Таким образом, мы смогли выявить и соотнести изменения в активности Н^-АТФазы и ЬГ1-пирофосфатазы на разных этапах роста и развития корнеплодов, которые тесно связаны: 1) с интенсивным накоплением Сахаров в первый год вегетации (50-100 сутки - 1 фаза); 2) с относительно слабо выраженным оттоком Сахаров в период покоя (140-350 сутки - 2 фаза); 3) с интенсивным оттоком углеводов во второй год онтогенеза (390^120 сутки - 3 фаза) (рис. 1).

600 п

500 -

400

о- 300

200 -

100 -

50 70 100

140 350 сутки

390 420

Рисунок 1. Динамика накопления Сахаров в онтогенезе столовой свеклы

го

О

500 т

400 -

5 300-

■ 200

100 ■

—ь-

50 100

140 350

390 420

сутки

Рисунок 2. Концентрация ионов калия в соке корнеплода в онтогенезе столовой саеклы

Поскольку, ранее была установлена отрицательная корреляционная связь между накоплением Сахаров и калия (Саляев и соавт., 1998), а протонные насосы тонопласта проявляли высокую чувствительность к ионам К1" (Rea and Sanders, 1987), возникла необходимость исследовать динамику накопления калия за весь период роста и развития корнеплодов.

Результаты этого исследования подтвердили ранее опубликованные данные и показали, что увеличение концентрации калия в соке корнеплода было связано с уменьшением концентрации Сахаров (рис. 2).

Если учесть, что протонные насосы тонопласта чувствительны к градиенту концентраций ионов (в частности, К4"), определяющих электрический потенциал вакуолярной мембраны (Davies et al., 1992; Тихонова, 1998), представлялось интересным и необходимым оценить гидролитическую активность ферментов в средах, поддерживающих возможно высокий и возможно низкий градиент этих ионов. С этой целью были использованы растворы с разными концентрациями KCL Высокая концентрация была равной 700 мм (плотность этого раствора р—1,035 г/см3 почти соответствовала плотности растворов выделения вакуолей). В средах на основе 700-800 мМ KCl отмечалась высокая стабильность изолированных вакуолей (Саляев и соавт., 1981), прн этом продолжительное время сохранялась не только целостность вакуолярной мембраны, но и активность ферментов (Катков, 1989). Концентрация 70 мМ KCl в нашем случае была минимально возможной (Rea and Pool, 1986; Катков, 1989). В этой среде также поддерживалась высокая стабильность органелл и ферментативная активность.

Активность ферментов, исследуемая в разных условиях, изображена на рисунке 3, из которого видно, что высокие концентрации иона К1" (700 мМ) в стабилизирующих средах снижали гидролитическую активность Н^-АТФазы и 1Г-Пирофосфатазы почти в 2 раза по сравнению с низкими концентрациями (70 мМ). Однако, в целом динамика активности ферментов по фазам онтогенеза совпадала, то есть, можно сказать, что в нашем случае она не зависела от экспериментальных условий.

Кинетические характеристики исследуемых ферментов также были различными в растворах с разным содержанием KCl (700 и 70 мМ). Так сродство Н4- АТФазы и }Г-пирофосфатазы к субстрату и скорость ферментативной реакции при низких концентрациях KCl были несколько выше чем при высоких. Например, в период покоя при 70 мМ KCl Км для ЬГ-АТФазы была равна 1,25±0,31 мМ, a v„=19 мкМ; для Н^-пирофосфатазы: Км=1,2±0,2 мМ и vm=22,5mkM. При 700 мМ KCl Км для Н^-АТФазы равнялась 1,95+0,11мМ, a vM соответствовала 11мкМ; для Н+-пирофосфатазы: К„=1,4±0,1мМ, vm=15,6mkM.

5> «

14

6 •

□ Н+-АТФаза ЕН+-ПФаза

700 мМ KCl

гЬ

В

50 100 140 350 390 420

сутки

35

30

25-

20

15

5 -

ьь

□ Н+-АТФаза НН+-ПФазэ

70 мМ KCl

50 100

140 350 сутки

330 420

Рисунок 3, Динамика активности Н+-АТФазы и Н<-пирофосфатазы в онтогенезе столовой свеклы: А - в среде инкубации с 700 мМ KCl; Б - в среде инкубации с 70 мМ KCl

0

Сопоставление величины и характера изменения активности ферментов в разных опытных условиях позволяет предположить, что изменение активности Н^-АТФазы и Н^-пирофосфатазы в онтогенезе, определяется, скорее всего, изменением количества единиц активного фермента на мембране. Доказательством тому, на наш взгляд, может служить отсутствие зависимости динамики активности (при сильной зависимости уровня активности) Н^АТФазы и Н^-пирофосфатазы от концентрации КС1 (возможно, от мембранного потенциала). Наше предположение о "количественном" изменении активности ферментов подтверждается данными литературы (Корзун и соав., 1990; Suzuki and Kasamo, 1993; Matsmirs-Endo Chie etal., 1997).

Изменение активности ферментов в первый год вегетации. Как видно из рисунка 3, в первый год вегетации активность протонных насосов тонопласта была максимальна на пятидесятые сутки роста растения. Гидролитическая активность ЬГ-АТФазы в эти дни значительно превышала (почти в 2,5 раза) активность 1Г-пирофоефатазы. При определении количества Сахаров на данном этапе было установлено, что высокая активность ферментов соответствовала наиболее интенсивному сахаронакоплению (рис. 1, 3).

К концу первого года онтогенеза (90-100 сутки) ферменты резко снижали свою активность: Н^-АТФаза - в среднем на 80%, а Н+-пирофосфатаза - на 5060%. В этот период скорость накопления Сахаров была несколько ниже (рис1,3).

С целью оценить вклад каждого из ферментов в процесс сахаронакопления, динамика активности Н*-АТФазы и Н^-пирофосфатазы в первый год вегетации была изучена более подробно. Данные представлены в таблице 1.

Таблица 1

Изменение веса корнеплодов, концентрации Сахаров и активности Н+-АТФазы и ТГ-пирофосфатазы в первый год вегетации столовой свеклы

Скорость Старость АТФаза Пфаза

Сут- Вес кор- увеличен нзгопле-

ки неплод- иявеса Сахара ния Белок Бетзциа- (мкМФн/ (мкМФн/

ов Сахаров нины мМбетэ- мМбета-

(IP) (гр/суг.) (мМ) (мМ/сут) (мг/мл) (мМ) цианина) цианина)

50 0,32±0,1 1,18 55±11,7 11,1 2,4±0,53 4,6±1,2 17,1±3,1 6,1±1,3

60 2,3±0,9 4,1 157±18, 7,05 3,4±0,31 5,6±1,7 14,4±3,1 4,4±0,9

70 24,3±7,0 6,0 277±24, 3,5 3,3±0Д9 4,8+0,9 3±0,8 2,6±0,9

80 84,2±2,0 9,37 298±9,0 5,3 3,7±0,93 4,5+1,1 3,8±1,1 3,5+0,5

90 144,3±4 12,72 347+13, 5,7 4,1±0,1 4,5+1,5 4,6+1,9 3,5+1,1

100 271,5+9 404±28, 3,7±0,57 4,2±1,1 2,7+0,7 3,4±0,S

При сопоставлении динамики ферментативной активности со скоростью увеличения веса и скоростью изменения концентрации Сахаров, было установлено, что активность снижалась одновременно с уменьшением скорости накопления Сахаров. Кроме того, была обнаружена положительная корреляционная связь между изменением активности ферментов и скоростью •накопления Сахаров. Коэффициент корреляции для lf-АТФазы равен 0,92 (достоверен, при Р=0,01, t=5,25±0,05, tra6a.=4,604), для Н+-пирофосфатазы - 0,95 (достоверен, при Р=0,01, t=5,94±0,04, W"4,604).

Период покои. У покоящихся корнеплодов активность исследуемых ферментов снижалась (рис. 3). Значительных изменений в концентрации углеводов на данном этапе онтогенеза выявлено не было (рис. 1).

Второй год онтогенеза. В фазу генеративного роста (390-400 сутки) происходил отток Сахаров из вакуолей корнеплодов, который сопровождался повышением активности 1 Г-пирофосфат азы (в 3,5 раза) (рис. 1, 3).

На завершающем этапе эксперимента (в период цветения, 420 сутки), концентрация углеводов в корнеплодах уменьшалась (в сравнении с покоящимися корнеплодами) практически в 2 раза (рис. 1), а ферментативная активность возрастала. При этом, активность I Г-пирофосфатазы была несколько выше, чем в первый год вегетации и превышала активность Н+-ЛТФазы в 1,4 раза (рис. 3).

Если соотнести гидролитическую активность ферментов в фазу вегетативного и в фазу генеративного роста, то можно обнаружить, что активность 1Г-АТФазы была высокой в период интенсивного сахаронакопления и относительно низкой во время оттока углеводов из вакуолей, тогда как Н4"-пирофосфатаза была высоко активна, как в период накопления Сахаров, так и во время их оттока.

Есть все основания полагать, что транспорт углеводов через тонопласт зависит от осмотического потенциала вакуоли и сопряжен с транспортом солей (Андреев и соавт., 1992). Вероятно, для поддержания осмотического равновесия в первые дни формирования корнеплода (50-60 сутки) и для его восстановления при интенсивном оттоке Сахаров из вакуолей во второй год онтогенеза (390-420 дни роста) необходим компенсационный приток солей (Saftner and Wyse, 1980; Саляев и соавт,, 1997). Действительно, в первую (50 сут.) и третью (420 сут.) фазы онтогенеза отмечалось повышенное содержание калия в соке корнеплодов (рис. 2). Высокоактивная в эти моменты Н+-пирофосфатаза могла, на наш взгляд, энергетически поддерживать накопление ионов калия (Davies et al., 1992). Возможно, она в большей степени вовлечена в это г процесс, чем Н^-АТФаза, активность которой достигала своих максимальных значений в период

интенсивного сахаронакопления, а не во время накопления ионов калия.

Таким образом, сопоставление динамики активности ферментов с динамикой накопления Сахаров на разных фазах онтогенеза позволяет предположить, что ЬГ1"-АТФаза в большей степени вовлечена в процессы сахаронакопления, а Н+-пирофосфатаза - в транспорт солей, который, также связан с накоплением Сахаров (Андреев, 1992; Салясв и соавт., 1997), в частности, как компенсаторный путь поддержания осмотического потенциала вакуоли (Тихонова, 1998).

Влияние фитогормонов на гидролитическую активность FP-АТФазы и ГГ-ннрофосфзтазы. Сопоставление уровня гормональной регуляции в условиях высоких и низких концентраций KCL Прежде, чем приступить к более подробному изучению гормональной регуляции активности 1Г-АТФазы и II4-пирофосфатазы, необходимо было установить влияет ли ионный состав опытных растворов на восприимчивость ферментов к гормональному воздействию. С этой целью провели исследование воздействия фитогормонов на активность Н+-АТФазы и Н^-пирофосфатазы в средах инкубации вакуолей с разным содержанием KCl (700 мМ и 70 мМ). В работе использовали корнеплоды первого года вегетации в последние недели роста.

Результаты экспериментов показали, что все фитогормоны (ИУК, ГК, АБК) и кинетин были способны изменять гидролитическую активность Н+-АТФазы и Н4"-пирофосфатазы (рис. 4 и 5). Они чаше всего выступали в качестве стимуляторов, чем ингибиторов. При этом уровни стимуляции ферментов гормонами в разных средах оказались различными.

Н-А'ГФаза. В средах с 700 мМ KCl (рис. 4, А) фитогормоны и кинетин практически во всех концентрациях (от 10"!0 до Ю-4 М) в разной степени стимулировали активность Н+-АТФазы. Максимальная активация гидролиза наблюдалась: для ГК3 - на 50%, при концентрации 10"W-10"8M; для кинетина - на 60%, при -10'8 М; для ИУК - на 70-80%, в концентрации - 10"9-10'7 М, для АБК -на 130% (концентрация Ю"10 М). Когда исследовали влияние этих же фитогормонов на активность Н^-АТФазы в среде с 70 мМ KCl (рис. 5, А), то не обнаружили такой выраженной стимуляции активности. Например, ГК3 и ИУК, если и активировали фермент по-прежнему в низких концентрациях, то уровень активации был ниже почти в 2 раза (на 20-30%). Для того, чтобы активность Н+-АТФазы повысилась на 50% в присутствии кинетина, нужно было повысить его концентрацию до Ю^-Ю"4 М, то есть увеличить его содержание по меньшей мере в 100 раз. АБК как и в первом случае, сильнее других фитогормонов активировала фермент, но в концентрациях от 10~б до 10"4 М и самое большое - на

Концентрация гормона, М

Рисунок 4.'Активность ЬГ-АТФазы (А) и Н^-пнрофосфата-зы (Б) во второй период первого года вегетации свеклы в среде инкубации с 700 мМКС1.

Рисунок .5. Активность Н+-АТФазы (А) и П^-пирофосфата-зы (Б) во второй период первого года вегетации свеклы в среде инкубации с 70 мМ КС1.

70%, то есть почти в 2 раза слабее, чем в средах с 700 мМ KCl и при концентрации, которая выше более чем в 100 раз.

Н+-пирофосфатаза. ЬГ-пирофосфзтаза, по сравнению с Н^АТФазой, слабо стимулировалась фитогормонами в среде инкубации на основе 700 мМ KCl (рис. 4, Б). Только ИУК и АБК в концентрации 10"8 М повышали активность фермента на 50% и 20%, соответственно. При добавлении фитогормонов в среды с 70 мМ KCl не было выявилено какого-либо стимулирующего эффекта (рис. 5, Б). Фитогормоны в этих условиях на Н+-пирофосфатазу не оказывали влияния.

В итоге, было установлено, что в условиях с низким содержанием KCl (70 мМ), когда ферментативная активность высока, гормональная стимуляция активности значительно ниже, чем в случае с высоким содержанием (700 мМ KCl), при котором активность ферментов относительно низка (рис.4, 5)

Снижение активности при 700 мМ KCl обусловлено, скорее всего, не влиянием высокой ионной силы раствора на ферменты, а разностью мембранного потенциала, который задается, градиентом ионов (возможно, ионов калия, относительный коэффициент проницаемости через тонопласт которого выше, чем у хлора) (Тихонова, 1998). Если бы снижение активности происходило за счет конформационных изменений белков (при действии "сильных ионов"), то повышение активности ферментов фитогормонами в присутствии этих ионов было бы маловероятным.

В дальнейшей работе были использованы среды инкубации вакуолей с высокой концентрацией KCl - 700 мМ, в которых активность ферментов несколько ниже (динамика активности остается неизменной) (рис. 3) и в которых, как мы полагали, можно получить более полную картину гормонального влияния на активность Н+-А'ГФазы и Н+-пирофосфатазы.

Влияние фитогормонов на гидролитическую активность [Г-ЛТФазы и ТГ-пирофосфатазы тонопласта на разных фазах онтогенеза. Исследование гормональной регуляции активности ферментов проводили на изолированных вакуолях, которые выделяли из корнеплодов на разных фазах онтогенеза растения. Первая фаза онтогенеза (первый год вегетации) была поделена на два периода по уровню активности ферментов: первый период (50-70 сут.) - высокая активность; второй период (80-100 сут.) - относительно низкая активность (рис.3).

Из результатов, приведенных на рисунках 6 и 7 видно, что исследуемые ферменты меняли свою активность при добавлении в инкубационный раствор фитоормонов (1 - ИУК, 2 - АБК, 3 - ГК3) и 4 - кинетика в разной концентрации (от Ю-10 до 10"4 М).

Рисунок 6". Влияние гормонов на активность Н+-АТФазы в онтогенезе: А - начало первого года вегетации; Б - конец первого года вегетации; В - период покоя; Г - второй год вегетации. 1 - ИУК; 2 - АБК; 3 - ПС3; 4 - кинетин.

Рисунок 7. Влияние гормонов на активность И+-пирофос-фатазы в онтогенезе: А - начало первого года вегетации; Б -конец первого года вегетации; В — период покоя; Г — второй год вегетации. I - ИУК; 2 - АБК; 3 - ГКз; 4 - кинетин.

Фитогормоны, как уже отмечалось, чаще всего выступали в роли активаторов. Самая сильная стимуляция Н+-АТФазы наблюдалась в фазу генеративного роста кинетином (на 200%) (рис. 6, Г).

Ингибировали фермент только АБК - на 30% (в начале первого года вегетации) (рис. 6, А), и ГК} - на 20% (в период покоя) (рис. 6, В).

11+-пирофосфотаза максимально активировалась ИУК - на 140%, также в фазу генеративного роста (рис. 7, Г). Ингибировали ее активность ГК3 и кинетин (тогда как ^Г-АТФазу - АБК) (рис.7, А, Б). Величина ингибирования тоже не превышала 30%. Можно заметить, что уровень гормональной активации ферментов в наших экспериментах значительно превосходил уровень ингибирования

В целом результаты этого исследования подтвердили предположение о том, что направленность (стимуляция или ингибирование) и уровень (активации) гормонального воздействия определяются фазой развития корнеплодов (БаЩот й а1., 1991). Действительно, один я тот же фитогормон на разных фазах онтогенеза мог выступать как активатором, так и ингибитором. Например, абсцизовая кислота в начале первого года вегетации снижала активность Н+-АТФазы (рис. б, А), а в конце этого же года, напротив, становилась одним из самых сильных стимуляторов этого фермента (рис. 6, Б). Синтетический регулятор роста кинетин ингибировал Н^-пирофосфатазу в первый год вегетации ( рис. 7, А) и активировал в период покоя (рис. 7, В). Если сравнить направленность воздействия некоторых фитошрмонов на НАТФазу и Н^-пирофосфатазу на одной фазе развития, то можно обнаружить, что один и тот же фитогормон мог одновременно повышать активность одного фермента и снижать активность другого. Например, АБК в начале первого года вегетации снижала активность Н^-АТФазы и повышала активность Н^пирофосфатазы (рис. 6 и 7, А), а Г*К3 в конце первой фазы онтогенеза, напротив, стимулировала НГ-АТФазу и ингибировала Н1-пирофосфатазу (рис. б и 7, Б). Кинетин оказывал сильное стимулирующее действие на Н+-АТФазу во второй год вегетации и не влиял на Н^-пирофосфатазу (рис. 6 и 7, Г).

При сопоставлении величины стимуляции было установлено, что наибольшую чувствительность к гормональному воздействию проявляла Н1"-АГФаза. Этот фермент во второй год вегетации активировался кинетином (10"10 М) почти на 200% (рис. 6, Г). Н^-пирофосфатаза, по сравнению с Н+-АТФазой, была менее чувствительна к воздействию фитогормонов. Её активность чаще всего стимулировалась меньше чем на 100%, за исключением второго года онтогенеза, когда ИУК (Ю*10 М) повышала активность фермент на 140% (рис. 7, Г).

Не исключено, что решающим фактором, определяющим чувствительность ферментов к гормональному воздействию на разных фазах роста и развития растения, мог быть гормональный статус, который, как полагают, способен обусловливать восприимчивость мембраны к фитогормону (наличие гормональных рецепторов) (Santoni et al., 1991).

Влияние ионов К+ и Mg;* на гормональную регуляцию гидролитической активности 1Г-АТФ;пм и Н+-пирофосфатазы. Известно, что Н^-АТФаза и Н*-пирофосфатаза - Mg^-зависимыс и К^-чувствительные ферменты (Rea and Sanders, 1987). К*, как стимулятор, и Mg2+, как аллостерический активатор, являются основными регуляторами активности этих ферментов (Leigh et al., 1992; Davies et al., 1992; Gordon-Weeks et al., 1996). В связи с этим, в дальнейшем мы попытались выяснить, способен ли магний влиять на уровень гормональной стимуляции ферментов и может ли он, наряду с калием, изменять направленность гормонального воздействия.

На рисунке 8 отражено воздействие фитогормонов (ИУК- 10"SM, ГК - 1(Гб М, кинетина -10"8 М. АБК -10"8 М) па активность Н'-АТФазы и Н+-пирофосфатазы в инкубационных средах: Б) без ионов 1С и Mg2+; В) с Mg:+; Г) с К+; Д) с Mg2+ и Kf; Е) с Mg:+, К+, Na* и SO„2\

Характер изменения активности исследуемых ферментов без ионов-регуляторов (контроль, выраженный 100%) и с ионами (в процентах от контроля) демонстрирует рисунок 8 (А). Из рисунка видно, что ионы магния повышали активность Н'-АТФазы на 70%, а 1Г-пирофосфатазы - на 220%. В условиях нашего эксперимента калий не изменял активности ферментов. Если в среду одновременно вносили оба иона то стимуляция магнием в присутствии калия была несколько ниже: Н^-АТФазы - на 40%, 11+-пирофосфатазы - на 80%. Ионы натрия и сульфат-ионы снижали активность Н^-пирофосфатазы и Н+-АТФазы в среднем на 50%, соответственно. Активность ферментов, изображенная на рисунке 12 А, является контрольной (принята за 100%) для активности в присутствии гормонов, которая выражалась в процентах от этого контроля (рис. 8, Б, В,Г,Д, Е).

Основные результаты исследования, представленные на рисунке 8 Б, В, Г, Д, Е, показали, что ИУК и ГКз, могли поддерживать активность ЬГ-АТФазы и Н*-пирофосфатазы в условиях ионного дефицита (стимулировали активность в среднем на 30%). В тоже время характер гормонального воздействия на активность ферментов существенно зависел и от ионного фона среды. Присутствие ионов Mg2+ в опытных растворах меняло направленность

- ПФаза

И Н*--АТФаза Ш Ы-ПФаза

кинетин

В

ЗпИ

200

N00

г

70!ВМ К*

Гк кинетин АЕК

ИУК

Гк кдаетик АБК

Д

70шИ К' и ЗтМ

ш

70тМ К*. ЗтМ М,?'г и 100»М БО,"2

ИУК

Гк

ИУК

кинетин АБК

Рисунок 8 . Изменение гидролитической активности ферментов в присутствии гормонов в средах с разным ионным составом: А - контроль; Б - без ионов КГ и Мёг+; В - 3 мМ Г - 70 мМ КГ; Д - 3 мМ Г^2* и 70 мМ КГ; Е-ЗмМ, 70 мМ КГ, 100 мМ БОг" и Ыа+.

гормонального воздействия на Н+-пирофосфатазу (рис. 8, В). Так, Н*-пирофосфатаза при сильной стимуляции ионами магния ингибировалась ГК3 (на 30%), тогда как в отсутствии этого иона, напротив, стимулировалась этим фитогормоном. Что касается Н^АТФазы, то фермент всегда активировался ГК3> даже при выраженной стимуляции магнием (рис. 8, Б. В, Г, Д). ГК3 проявила себя как характерный стимулятор Н+-АТФазы.

И УК в условиях, при которых отсутствовали ионы-регуляторы или присутствовали два иона вместе (рис. 8, Б, В), активировала только Н+-пирофосфатазу (на 30%), в присутствии же только одного иона калия снижала активность этого фермента (рис. 8, Г).

АБК выступила в качестве сильного активатора для обоих ферментов только в стрессовой ситуации, во время ингибирования Na+ и S042" (рис. 8, Е). Этот гормон практически полностью восстанавливал активность ЬГ-АТФазы (на 70% от контрольной активности) и частично активность Н+-пирофосфатазы (на 30%).

Результаты этого эксперимента продемонстрировали более высокую чувствительность Н^-пирофосфатазы к ионному воздействию, чем гормональному (уровень стимуляции ионами, был намного выше, чем фитогормонами). На примере этого фермента хорошо видна регуляторная роль ионов при взаимодействии ферментов с гормонами. Так, изменяя уровень активности ферментов, ионы, в отдельных случаях, способны изменять и направленность (активация или ингибирование) гормонального воздействия.

Причина разной реакции ЬГ-АТФазы и 1Г+-ггирофосфатазы на воздействие фитогормонов, видимо, заключалась в механизме гормональной регуляции мембраносвязанных ферментов. Возможно, влияние фитогормонов опосредуется изменением мембранного потенциала, который, в свою очередь, может приводить к изменению активности потенциал-чувствительных протонных насосов. В настоящее время существуют достаточно убедительные доказательства высокой чувствительности протонных насосов к изменению мембранного потенциала (Geiz, 1991; Davies et al., 1992; Катков, 1989). Есть свидетельства и о влиянии фитогормонов на мембранный потенциал. Способность ИУК и АБК индуцировать колебания мембранного потенциала была продемонстрирована на плазматической мембране колеоптилей кукурузы (Zoocchi and Nisi, 1996; Шишова и соавт., 1997). В большинстве случаев изменение МП, вызванное ИУК, начиналось с первичной деполяризации, которая, в последствии, переходила к гиперполяризации мембраны. М. Ф. Шишова с сотр. показали прямое действие ауксина на катионные каналы плазмалеммы, обладающие избирательной проницаемостью для ионов кальция и калия (Са^К*). Авторы предположили, что изменение

концентрации этих ионов в цитозоде (деполяризация) при действии ауксинов первично по отношению к изменению активности 1Г-АТФазы (гиперполяризации мембраны).

АБК, в отличие от ИУК, вызывала устойчивую деполяризацию плазматической мембраны за счет активации истечения 1С и ингибирования активности if-АТФазы (Zoocchi and Nisi., 1996). В этот процесс, как полагают, могли быть вовлечены и анионы. Например, в присутствии АБК наблюдалось сильное ингибирование СГ-потоков (Zimmerman etal., 1994).

На изолированных вакуолях сахарной свеклы тоже была продемонстрирована способность АБК и ИУК изменять потенциалзависимую проводимость тонопласта воздействием на ионные каналы (медленные вакуолярные каналы) (Парфенова, 1993). Действие АБК на вакуолярную мембрану, которое сопровождалось повышением уровня цитоплазматического кальция и, как следствие, калия, более подробно изучено на замыкающих клетках устьиц (Тихонова и соотв. ссылки, 1998).

Все эти данные, на наш взгляд, могут быть подтверждением важной роли ионов в гормональной регуляции прогонных насосов, особенно, если учесть, что системы транспорта ионов, в частности калия, и протонные насосы ассоциированы и способны взанморегулироваться (Davies, 1991; Тихонова, 1998). Через регуляцию активности ферментов фитогормоиы способны управлять транспортом Сахаров в вакуоль. Результаты исследования активного поглощения Сахаров изолированными вакуолями с использованием меченой сахарозы ещё раз подтвердили участие прогонных насосов в процессах транспорта этого соединения (Катков, 1989; Briskin et al., 1989; Getz, 1991, Андреев и соавт., 1991).

Оба фермента стимулировали поступление меченой сахарозы в вакуоль (табл. 2 и 3). В первый год вегетации вклад Н^-пирофосфатазы в транспорт Сахаров был несколько выше, видимо за счет того, что ее активность в 2 раза превосходила активность Н^-АТФазы (среды с 455 мМ КС1, 80-100 сутки роста). Во второй год онтогенеза, когда наблюдался отток Сахаров из корнеплодов (рис. 2), ферменты намного слабее, но по-прежнему стимулировали поступление меченой сахарозы в вакуоль. Несмотря на то, что в этот период гидролитическая активность ЬГ-пирофосфатазы практически в 3 раза превосходила активность II4-АТФазы (активность которой не изменилась), в присутствии ПФн радиоактивной сахарозы в вакуолях накапливалось меньше, чем в присутствии АТФ (12,7 нМ сахарозы/мМ бетацианина в час - при добавлении ПФн и 13,8 нМ сахарозы/мМ

Таблица 2.

Поглощение меченой сахарозы в присутствии АТФ, активность ГГ-АТФазы в первый н во второй годы онтогенеза растения

Активное Поглощение сахарозы, нМ сахара/ мМ бетацизшш. ч

Фазы роста Контроль без субстрата АТФ нМсахра/и Мбетаци аннна' час ЬГ-АТФаза Нмсахара/ Ммбспцп зшша.вчас £Г-АТФаза ИУК (10"*М) % Н*-АТФаза АБК (10* М) % ЬГ-АТФаза ГКз (10"ШМ) % 1Г-АТФаза кинетин (Ю',0М) %

Первый год 7,6 ± 2,3 15,3 ±3,7 72 ±23 130 ±22 144 ±15 129 + 9,0

Второй год 9,3 ± 3,2 1.3,8 ±2,9 114+8,0 90 ±21 67+21 53 ±9,0

Активность ЬГ-АТФазы икМ Фн/ мМ бетацнаиина в час, 455 иМ КС1

Фаза роста Н*-АТФаза мкМ Фн/ мМбеташи ннна ИУК (10* М) % АБК (10* М) % ПО (Ю'°М) % Кинетин (10"' М) %

Первый год 6 ± 1,8 97 ±11 130±15 136 ±19 120 ±14

Второй год 6,7 ±0,8 127 + 19 108 ±з,о 111 ±14 103 ±5,0

Таблица 3

Поглощение сахарозы в присутствии ПФи, активность Л -пяр<>фосфатазы в первый и во второй годы онтогенеза растения

Активное поглощение сахарозы нМ сахара/ мМ бетацяанита. ч

Фазы роста Контроль без субстрата ПФн нМсахзра/ мМбетади анина. час ЕГ-пиро-фосфатаза нМсахара/ мМбетациа нинэ. час Н*-гшро-фосфатаза ИУК (10* М) % Н*-пиро-фосфатаза АБК (10"'М) % ГТ-пиро-Фосфатаза ГК3 (10'°М) % Н*-пиро-фосфатаза Кинетин СЮ10М) %

Первый год 7,6 ±3,4 20 ±5,4 68 ± 8,0 88 ±14 95 ±4,0 89 ±10

Второй год 9,3 ±3,2 12,7+4,0 101+16 128 ±1б 147+25 135 ±17

Активность Н*-Пфазы, икМ Фн/иМ бетацишшиа в час, 455 мМ КС1

Фаза роста Н*-ПФаза мкМФн/ мМбетациа нннз. час Н*~ПФаза ИУК (Ю-'М) % Н^-ПФаза АБК (10"" М) % Н*-Пфаза ГКз (10'10М) % Н^-Пфаза Кинетин (10"ШМ) %

Первый год 12,1 ±4,1 70 + 11 90 ±7,0 98 ±21 84 ±3,0

Второй год 18,9 +5,1 115 ±13 125 ±19 135 ±3,0 126 ±16

бетацианина в час - при АТФ). Примечательно то, что активность НГ-пирофосфатазы во второй год вегетации была выше, чем в первый, однако активный транспорт сахаров при добавлении ПФн не увеличивался, напротив, несколько снижался по сравнению с первым годом вегетации (таблица 3). Можно предположить, что "задачи" вакуолей корнеплодов во второй год онтогенеза резко изменились, теперь их транспортирующие системы ориентированы на поглощение калия, для восстановления осмотического потенциала при оттоке Сахаров. Высоко активная Н^-пирофосфатаза могла транспортировать ион К\ Есть предположение, что при определенных обстоятельствах Н+-пирофосфатаза способна активно транспортировать вместо Н4" ионы К4" (Г)ау1ез а а1, 1992; РпсЬагс! а а1„ 1994). В таком случае, высокоактивный фермент, переносящий в большей степени ионы калия, чем водорода, будет вносить небольшой вклад в поддержание градиента рН на тонопласте, который, как известно, необходим для перехода системы, транспортирующей сахара, в активное состояние (ВпБкт е! а1., 1986; Саляев и Катков, 1988). Может быть поэтому, несмотря на высокую активность йР-пирофосфатазы во второй год онтогенеза, активный транспорт сахаров в присутствии ПФн был намного ниже, чем в первый год.

Активное поглощение Сахаров в присутствии фитогормонов. Следующая задача нашего исследования заключалась в выяснении, могут ли фитогормоны регулировать активный транспорт Сахаров.

В первый год вегетации было установлено, что, стимулируя гидролитическую активность Н^-АТФазы, АБК (на 30%), ГК3 (на 36%) и кинстин (на 20%) одновременно усиливали АТФ-зависимое поглощение сахарозы на 30, 40 и 29%, соответственно). В то же время, гормоны не изменяли (не увеличивали) гидролитическую активность Н^-пирофосфатазы. В этом случае не происходило и увеличения ПФ-зависимого поглощения сахаров в их присутствии (табл. 2 и 3). Во второй год вегетации наблюдалась противоположная картина: АБК (на 28%), ГКз (на 47%) и кинетин (на 35%) активировали ПФн-зависимый транспорт сахаров и гидролитическую активность КГ-пирофосфатазы (на 25, 35 и 26%, соответственно), и не влияли, ни на транспорт сахаров в присутствии АТФ, ни на активность Н+-АТФазы (табл. 2 и 3). Следует заметить, что в этом опыте во второй год онтогенеза использовали корнеплоды, которые выращивались в сосудах, а не в полевых условиях. Также применяли растворы с 455 мМ КС1 и низкие концентрации фитогормонов (Ю-10 - 10"8 М). Возможно эти обстоятельства изменили чувствительность Н^АТФазы к гормональному воздействию и в результате мы не смогли выявить во второй год онтогенеза стимулирующее действие фитогормонов на активность этого фермента.

Таким образом, выявленная нами связь между гормональной стимуляцией активности ферментов и АТФ-, и ПФн-зависимым поглощением сахарозы дает возможность предположить, что фитогормоны могут управлять транспортом Сахаров через регуляцию активности протонных насосов. Неодинаковая чувствительность ферментов к гормональному воздействию в первый и во второй годы онтогенеза, может указывать на то, что на разных этапах роста фитогормоны, способны стимулировать транспорт Сахаров через активацию одного из ферментов. На наш взгляд это еще раз подтверждает участие Н^-АТФазы и 1Г1"-пирофосфатазы в транспорте Сахаров на тонопласте (Катков, 1988), только их долевой вклад в этот процесс определен фазой роста и развития растения.

Выводы

1. Активность I Г-АТФазы и Н^-пирофосфатазы тонопласта имеет выраженную онтогенетическую динамику.

2. Гибберолловая кислота, абсцизовая кислота, НУК и кинетин способны изменять активность Н+-АТФазы и Н^-пирофосфатазы на уровне мембраны.

3. Направленность и степень гормонального воздействия на протонные насосы тонопласта меняются в зависимости от фазы онтогенеза:

а) на разных фазах роста один и тоже фитогормон может выступать как в роли активатора, так и в роли ингибитора протонных насосов;

б) уровень стимуляции ферментативной активности одним и тем же фитогормоном на разных фазах онтогенеза может быть неодинаковым.

4. Степень активации ферментов фитогормоном существенно зависит от ионного состава опытных сред:

а) чувствительность IГ-АТФазы и НГ-пирофосфатазы к гормональному воздействию определяют ионы: К*" (активатор), Мд2+ (аллостерический регулятор), Ыа+ и 8042" (ингибиторы ферментов);

б) фитогормоны способны повышать активность исследуемых ферментов и в отсутствие ионов-регуляторов (в частности Н^-пнрофосфатаза), и в присутствии ионов-ингибиторов.

5. Н+-АТФаза и Н^-пирофосфатаза вовлечены в транспорт Сахаров на тонопласте: Активность ферментов коррелирует с изменением скорости накопления Сахаров (ферменты обладают высокой активностью во время интенсивного сахаронакопления).

6. При активации фитогормонами Н^АТФазы и ЬГ-пирофосфатазы поглощение сахарозы изолированными вакуолями усиливается. Управление транспортом Сахаров может осуществляться через регуляцию фитогормонами

активности протонных насосов.

7. На разных фазах онтогенеза фитогормоны стимулируют транспорт Сахаров через активацию преимущественно одного из протонных насосов: в первый год вегетации - через активацию FT-АТФазы; во второй год - ЬГ-лирофосфатазы. Основные публикации но теме диссертации

1. Ozolina N. V., Pradedova Е. V., Salyaev R. К. The effect of phytogormonos on the hydrolitic activity of phosphohydrolases of the tonoplast"// Inter, symposium on plant hormone signal perception and transduction - Moscow, 1994, Abstr., P. 64.

2. Озолина H. В., Прадедова E. В., Саляев P. К. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность фосфогидролаз тонопласта// ДАН, 1994, Т. 339, №2, С. 281-283.

3. Ozolina N. V., Pradedova Е. V., Salyaev R. К. Effects of phytohormons on hydrolitic activity of phosphohydrolases of the tonoplast // Plant Growth Regulation, 1996, V. 19, No 2, P. 189-191.

4. Озолина H. В., Прадедова E. В., Саляев P. К. Влияние гиббериллина на гидролитическую активность протонных помп тонопласта в онтогенезе красной столовой свеклы // ДАН, 1996, Т. 346, № 3, С. 410-412.

5. Ozolina N. V., Pradedova Е. V., Salyaev R. К. The effect of gibberillin on hydrolitic activity of tonoplast proton pumps in red beet-root ontogenesis // In annual sym-posium " Physical-chemical basis of plant physiology", Penza, 1996, Abstr., P. 54.

6. Озолина H. В., Прадедова E. В., Саляев P. К. Регуляция гидролитической активности протонных помп тонопласта фитогормонами на первых фазах онтогенеза у красной столовой свеклы // ДАН, 1997, Т. 352, № 1, С. 137-139.

7. Озолина Н. В., Прадедова Е. В., Дударева JI. В., Саляев Р. К. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на гидролитическую активность протонных помп вакуолярной мембраны // Биологические мембраны, 1997, Т. 14, № 1, С. 125-127.

8. Озолина Н. В., Прадедова Е. В., Саляев Р. К. Воздействие фитогормонов на протонные помпы тонопласта в онтогенезе красной столовой свеклы // IV Международная конференция "Регуляторы роста и развития растений", Москва, 1997, Тезисы докладов, С. 112.

9. Саляев Р. К., Озолина Н. В., Прадедова Е. В. Влияние экзогенных фитогормонов и кинетина на гидролитическую активность протонных помп тонопласта в онтогенезе столовой свеклы И Физиология растений, 1999, Т. 46, № 1, С. 5-8.

10. Прадедова Е. В., Озолиыа Н. В., Саляев Р. К., Юшкевич Т. И. Динамика гидролитической активности Н^АТФазы и Н^-пирофосфатазы тонопласта в онтогенезе столовой свеклы //ДАН, 1999, Т. 364, № б, С. 835-838.

11. Озолина Н. В., Прадедова Е. В., Саляев Р. К. Взаимодействие ионной и гормональной регуляции протонных помп тонопласта красной столовой свеклы // Международная конференция "Физиология растений - наука Ш тысячелетня", Москва, 1999, Тезисы докладов, С. 169.

12. Озолина Н. В., Прадедова Е. В., Реуцкая АМ., Саляев Р. К. Влияние брассиностероидов на протонные помпы тонопласта // ДАН, 1999, Т. 367, № б, С. 829-830.