Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление липид-белковых микродоменов (рафтов) на вакуолярной мембране

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Выявление липид-белковых микродоменов (рафтов) на вакуолярной мембране"

Нестеркина Ирина Сергеевна

ВЫЯВЛЕНИЕ ЛИПИД-БЕЛКОВЫХ МИКРОДОМЕНОВ (РАФТОВ) НА ВАКУОЛЯРНОЙ МЕМБРАНЕ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- ' ДЕК 2011

Иркутск, 2011

005004504

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, г. Иркутск

Научный руководитель:

доктор биологических наук Озолина Наталья Владимировна

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Осипова Светлана Владимировна

доктор биологических наук Илли Иван Экидиусович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева

Защита диссертации состоится «22» декабря 2011 г. в 10°° часов на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Учреждении Российской академии наук Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Факс (3952) 510754; e-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН. Текст автореферата размещен на сайте Института: http://www.sifibr.irk.ru

Автореферат разослан «15» ноября 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, Д 003.047.01

кандидат биологических наук аГ.П. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Интенсивное изучение строения биологических мембран привело к пониманию того, что клеточные мембраны крайне неоднородны. В настоящее время общепринятым является мнение о присутствии в мембранах липид-белковых микродоменов (рафтов). Рафты характеризуются как микродомены липидного бислоя клеточных мембран, обогащенные холестерином, сфинголипидами и насыщенными фосфолипидами. Большой интерес к исследованию рафтов связан с тем, что они необходимы для протекания многих жизненно важных процессов, таких как эндоцитоз, внутриклеточная передача сигналов, сортировка и доставка белков.

Не все изученные мембраны могут содержать рафты. Вакуолярная мембрана (тонопласт) - одна из наименее изученных мембран растительной клетки. Особенности биохимического состава и многообразие функций, выполняемых этой мембраной, позволило предположить, что тонопласт может содержать эти структуры. Есть все основания полагать, что обнаружение рафтов на вакуолярной мембране будет способствовать пониманию механизмов клеточной регуляции и передачи сигналов.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в выявлении и характеристике липид-белковых микродоменов (рафтов) тонопласта. В рамках этой цели были поставлены следующие задачи.

1. Методами флуоресцентной и конфокальной микроскопии показать присутствие на тонопласте липид-белковых микродоменов.

2. Подобрать методы выделения липид-белковых микродоменов из вакуолярной мембраны и доказать, что выявленные микродомены можно идентифицировать как рафты.

3. Охарактеризовать особенности состава рафтов тонопласта.

Научная новизна. Впервые на вакуолярной мембране показано

присутствие липид-белковых микродоменов - рафтов. Приведена система доказательств с использованием методов флуоресцентной и конфокальной микроскопии и специфических флуоресцентных меток, которые подтвердили, что выделенные структуры действительно обладают высокой упорядоченностью и повышенным содержанием стеринов. Изучены особенности липидного и белкового состава рафтов тонопласта, которые показали, что рафты вакуолярной мембраны имеют состав, характерный для рафтов из других растительных мембран.

Теоретическая н практическая значимость работы. Полученные результаты имеют большое значение для развития современных представлений

о принципах функционирования биологических мембран, так как вносят весомый вклад в понимание строения вакуолярной мембраны. Материалы диссертационной работы могут быть использованы при чтении курсов лекций по физиологии и биохимии растений в вузах на кафедрах соответствующего профиля. Данные, показывающие присутствие на вакуолярной мембране липид-белковых микродоменов, открывают дополнительные возможности изучения направленной регуляции процессов, в которых участвует вакуоль и вакуолярная мембрана.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 13-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2009); III Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз - Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010); III международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011); VII съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 104 страницах, содержит 4 таблицы и 12 рисунков; библиография включает 188 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект. Объектом исследования служили корнеплоды столовой свёклы (Beta vulgaris L.), сорт Бордо. Растения выращивали на опытном участке института СИФИБР СО РАН. Корнеплоды отбирали на следующих фазах онтогенеза растения: 1) в первый год вегетации (август) - период интенсивного роста корнеплодов, характеризующийся высокой активностью метаболизма; 2) в период покоя (корнеплоды хранили при температуре 4°С).

Выделение вакуолей. Выделение вакуолей и тонопласта из ткани корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) проводили методом, разработанным в лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР СО РАН (Саляевидр., 1981).

Инфракрасная спектроскопия. Суспензию везикул тонопласта и фракцию изолированных микродоменов наносили равномерным слоем на оптическую пластинку KRS-5 (TIJ-TIBr) и после высушивания в эксикаторе над прокаленным СаС12, записывали спектры на ИК-спектрофотометре FTIR

Spectrum One (Perkin Elmer, США). Интерпретацию полученных спектров проводили при помощи атласа фосфорорганических соединений, учебного пособия для студентов химических специальностей и монографии Мориса Кейтса (Кейтс, 1975; Шагидулин и др., 1984; Васильев и др., 2007).

Изучение и идентификация липидов тоноиласта и микродоменов. Экстракцию липидов проводили по методу Bligh, Dyer (Bligh, Dyer, 1959). Для разделения липидов использовали метод ТСХ (тонкослойная хроматография). Для идентификации, наряду с анализируемым веществом, на пластинки наносили стандартные свидетели. После обнаружения рассчитывали величину Rf для каждого проявившегося соединения.

Изучения жирнокислотного состава тонопласта и рафтов. Метиловые эфиры жирных кислот липидов тонопласта и микродоменов анализировали методом хромато-масс-спектрометрии на хромато-масс-спектрометре 5973 N/ 6890N MSD 6890N Agilent Technology (США). Для идентификации пиков метиловых эфиров жирных кислот использовали значение времени удерживания стандартов и индекс эквивалентной длины алифатической цепи (ECL) (Christie, 1988).

Определение количества белка. Содержание белка определяли методом Бредфорд (Bradford, 1976) в качестве стандарта использовали БСА.

Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ с ДДС-NA) по Лэммли. Преципитацию белков проводили 10%-ной ТХУ с последующим растворением осадков в 2%-ном ДЦС-Na. Электрофорез в ПААГ с ДДС-NA проводили в модифицированной системе Лэммли (Laemmli, 1970) на приборе Mini-PROTEAN 111 Electrophoretic Cell фирмы Bio-Rad (США). Использовали 12.5 % ПААГ. Молекулярные массы полипептидов определяли при помощи стандартов (Sigma,США).

Иммуноблоттинг (Вестерн-блоттинг). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Нитроцеллюлозную мембрану выдерживали в растворе (1:1000) первичных антител, затем обрабатывали вторичными антителами (1:1000). Окрашивали BCIP и NBT.

Флуоресцентная микроскопия. Стерин-обогащенные микродомены на вакуолярной мембране выявляли с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием маркера стеринов филипина (Fluka, США).

Конфокальная микроскопия. Определение генерализованной поляризации (GP), величина которой характеризует физическое состояние мембраны (упорядоченное или неупорядоченное), проводили при помощи

конфокальной микроскопии, с использованием флуоресцентного зонда лаурдана (Fluka, США).

Статистический анализ. Все эксперименты проводили в 3 кратных биологических и 3 - 5 кратных аналитических повторностях (п = 3 - 5). Полученные результаты были обработаны статистически: рассчитаны средние арифметические значения и их стандартные отклонения (Лакин, 1990). Достоверность различий анализировали по критерию Стьюдента. Для расчетов применялась программа MExcell.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выявление стерин-обогащенных (липид-белковых) микродоменов методом флуоресцентной микроскопии. Высокое содержание стеринов считается отличительной особенностью рафтов (Mongrand et al., 2004; Lefebre et al., 2007; Laloi et al., 2007). Для обоснования присутствия в тонопласте липидных рафтов использовали флуоресцентный маркер стеринов - филипин. В настоящее время установлено, что данный полиеновый антибиотик, обладающий собственной флуоресценцией с максимумом люминесценции при 482 нм (возб. = 340 нм) и взаимодействующий со стеринсодержащими участками мембран клеток, может быть использован как зонд на присутствие и гетерогенность распределения стеринов в биологических мембранах (Гармаза, 2008). В настоящее время филипин используют для доказательства присутствия рафтов в клеточных мембранах (Шевырева, 2008).

В наших экспериментах, проведённых на изолированных вакуолях, также был использован зонд филипин. С помощью флуоресцентного микроскопа (Axio observer ZI («Carl Zeiss», Германия) было получено изображение, свидетельствующее о присутствии в вакуолярной мембране стерин-обогащенных областей, которые, по-видимому, являются липид-белковыми микродоменами (рис. 1). Как и предполагалось, количество их значительно меньше, чем на плазматической мембране, и распространены они неравномерно, что также является отличительной особенностью рафтов, поскольку регуляция процессов, осуществляемых белками рафтов, может происходить через их взаимодействие. Способность к перемещению, слиянию - одна из характерных особенностей липид-белковых микродоменов.

2. Выделение липид-белковых микродоменов с использованием разных методов. Для экспериментов были выбраны два наиболее часто используемых метода.

Рис. I. Микрофотография изолированных вакуолей после инкубации с 10 мкМ филипина. Стрелками указаны зоны стерин-обогащенных микродоменов. Масштабная линейка = 5 мкм. Микрофотография получена при помощи флуоресцентного микроскопа Axio observer ZI («Carl Zeiss», Германия).

Метод выделения рафтов с детергентом Тритон Х-100. Выделение рафтов из вакуолярных мембран было начато с традиционного метода изолирования рафтов, которым является солюбилизация мембран неионным детергентом Тритоном Х-100 на холоде (4°С). Данным методом рафты были обнаружены в клетках растений и животных на плазматической мембране (Morel et al., 2006; Lefebre et al., 2007; Laloi et al., 2007), мембране аппарата Гольджи и мембране эндоплазматического ретикулума (Hansen et al., 2000; Bagnat et al., 2000; Sevlever et al., 2000). На мембране митохондрий рафтов не обнаружено (Foster, 2009). Обнаружение рафтов на вакуолярной мембране до наших исследований не проводилось.

В экспериментах были использованы вакуолярные мембраны (везикулы тонопласта), выделенные из корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris h.) методом, разработанным в нашей лаборатории (Саляев и др., 1981). Везикулы тонопласта солюбилизировали на шейкере буфером, содержащим 1 % Тритон Х-100, 50 мМ Трис-НС1, 3 мМ ЭДТА, 300 мМ сахарозы, 1 мМ PMSF, pH 7.5 (Mongrand et al., 2004), в течение 30 минут при температуре 4°С. Затем суспензию, содержащую разрушенные мембраны, вносили на дно центрифужной пробирки и сверху последовательно наслаивали растворы сахарозы 60 %, 45 %, 35 %, 25 %, 15 % для создания ступенчатого градиента. Такой градиент был нами выбран потому, что было неизвестно, в какой зоне градиента удастся обнаружить рафты вакуолярной мембраны. Пробирки с градиентом сахарозы центрифугировали в течение 18 ч. при 200 000 g на ультрацентрифуге Sorvall Discovery 90SE (Япония). После высокоскоростного

центрифугирования опалесцируюшая зона, характеризующая рафты (Mongrand et al., 2004), была обнаружена в области 25 % сахарозы (рис. 2). В то время как при выделении рафтов из плазматической мембран эта зона была выявлена на границе 30 % и 35 % сахарозы (Mongrand et al., 2004; Lefebre et al., 2007).

Белки и липиды из опалесцирующей зоны были использованы в дальнейших исследованиях.

Метод выделения рафтов без детергентов. Относительная устойчивость рафтов к детергентам была изначально фактически определением липидного рафта. Однако сейчас этот подход критикуется, так как обработка липидной мембраны детергентами способна влиять на свойства её компонентов (Shah, 2007). Поэтому кроме детергентного, в наших исследованиях был использован недетергентный метод выделения рафтов, разработанный Macdonald, Pike (Macdonald, Pike, 2005). Оба метода имеют между собой много общего (рис. 2). Существенным отличием этих методов является состав буфера, которым солюбилизируются везикулы тонопласта. Кроме того, в бездетергентаом методе выделения рафтов использовались более жёсткие условия разрушения мембранных везикул.

Корнеплоды _

свеклы

(А) Состав буфера: 1 %

Тритон Х-100, 50 мМ Трис-НС1, 3 мМ ЭДТА, 300 мМ сахарозы, 1 мМ PMSF, рН 7.5

(Б) Состав буфера: 20

мМ Трис-НС1, 1 мМ MgCl2, 1 мМ СаС12, 300 мМ сахароза, 0.2 мМ aminoethvl-benzene sylfonyl flyoride, 1мг/мл aprotinin, 10 мкМ bestatin, 3 мкМ Е-64, 10 мг/мл leupeptin, 2 мкМ pepstain,

Рис. 2. Схема выделения рафтов детергентным (А) и недетергентным (Б) методом.

Вакуоли

Везикулы тонопласта

** 15 %

20000(1 g, 18 ч

Стерин-обогащенные 25 % -микродомены

35%

45%

60%

Идентификация Идентификация белков липидов

Еще одна причина, по которой в наших исследованиях был использован бездетергентный метод выделения рафтов, связана с тем, что часть белков из липид-белковых микродоменов солюбилизировалась детергентом и оказывалась в нижней части сахарозного градиента. Мы провели измерение содержания белка в разных зонах сахарозного градиента при разных методах выделения рафтов. В итоге во фракциях 3 и 4 (25 % сахарозы), где обнаруживаются рафты, содержание белка при использовании детергентного метода выделения рафтов не превышало 5 % от общего содержания белка в градиенте. Содержание белка при использовании без детергентного метода в этих фракциях (3 и 4) составляло 10-15 %.

3. Обнаружение липид-белковых микродоменов методом конфокальной микроскопии. Для доказательства присутствия рафтов на вакуолярной мембране было необходимо определить ее фазовое состояние, так как считается, что рафты формируют жидкоупорядоченную фазу на поверхности мембранного бислоя, окруженную жидконеупорядоченной фазой из ненасыщенных глицерофосфолипидов. Фазовое состояние мембраны определяли при помощи конфокального микроскопа и липофильного зонда лаурдана (2-диметиламино-6-додиканоилнафталин) при комнатной температуре. Лаурдан - флуоресцентный зонд, в настоящее время широко используется в экспериментах по изучению особенностей структуры мембран. Он обладает способностью сдвигать свои спектры эмиссии в зависимости от растворителя или окружения (Sanchez, 2007). Эта способность лаурдана используется при изучении липидного бислоя мембран. Таким образом, по интенсивности эмиссии лаурдана в разных частях спектра можно рассчитать величину генерализованной поляризации (GP), которая отражает фазовое состояние мембраны, по формуле Parasassi (Parasassi, 1990), где I - это интенсивность эмиссии лаурдана.

Известно, что величина GP может принимать значение от -1 до +1. Эта величина для жидких областей мембраны варьирует приблизительно от 0.05 до 0.25, а для упорядоченных областей (доменов) мембраны от 0.25 до 0.55 (Gaus et al„ 2006).

Так, например, величина генерализованной поляризации, рассчитанная для фракции с низкой плавучей плотностью, обогащенной стеринами,

CP =

I(4i »Uli,м) 1(47! 1-530}

1(41 Ki-4f,0) I(470_530)

выделенной из плазмалеммы клеток этиолированных проростков гороха, равна от 0.31 до 0.70 при температурах от 40 до 10°С соответственно, что подтверждает вывод о преобладании в этой фракции плотно организованных и низкооводненных доменов (рафтов) (Белугин, 2010).

В наших экспериментах с помощью конфокального люминесцентного сканирующего лазерного микроскопа MicroTime 200 с пикосекундным временным разрешением (фирмы PicoQuant Gmbh, Германия) была получена серия изображений вакуолей, проинкубированных с лаурданом, и фракции изолированных белок-липидных микродоменов, выделенных из опалесцирующей зоны градиента сахарозы и также проинкубированных с лаурданом. На основе полученных изображений (рис. 3) проводили расчёт значений генерализованной поляризации (GP), используя формулу, приведенную выше.

Значение генерализованной поляризации для вакуолярной мембраны варьировало и составляло приблизительно 0.06, что говорит о ее жидкостности. Значение генерализованной поляризации фракции выделенных рафтов оказалось в пределах 0.7, что свидетельствует о том, что в этой фракции находятся упорядоченные (плотные) домены.

Рис. 3. Изображение генерализованной поляризации (GP) изолированных вакуолей (А) и фракции рафтов (Б). Цветная масштабная линейка от -1 до +1 (характеризует величину GP). Масштабная линейка = 5 мкм. Изображения получены при помощи конфокального люминесцентного сканирующего лазерного микроскопа MicroTime 200 с пикосекундным временным разрешением (фирмы PicoQuant Gmbh, Германия).

Таким образом, полученные нами величины генерализованной поляризации для тонопласта и фракции рафтов однозначно характеризуют

выделенную нами опалесцирующую зону сахарозного градиента как зону, содержащую высокоупорядоченные липиды, и подтверждают присутствие на вакуолярной мембране белок-липидных микродоменов.

4. Сравнительный анализ инфракрасных спектров липидных микродоменов вакуолярных мембран с тонопластом. Выделенные нами рафты анализировались на ИК спектрометре. Спектры полученных рафтов сравнивались со спектрами вакуолярных мембран, из которых они были изолированы. Полосы поглощения представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что в спектрах вакуолярных мембран выделяются интенсивные полосы поглощения, характеризующие ее липидные компоненты. Это полоса валентных и деформационных колебаний СНз, СН2-групп при ЗОЮ, 2924, 2854,1466, 1415, 1381, 885, 721 см"1, которая предполагает наличие алифатических группировок в структуре липвдов мембран (Макаренко, Саляев, 1998), Затем полоса при 1739 см'1, характеризующая эфиры С-0 колебания, полосы при 1240 и при 1076 см"1, отвечающие за Р=0, Р-0 валентные колебания. Белковым компонентам мембраны соответствуют полосы 3318, 1656, 1546 см"1, характеризующие валентные и деформационные колебания N-H группы.

При сравнении спектров тонопласта и рафтов, выделенных из вакуолярных мембран, можно наблюдать, что многие полосы вакуолярных мембран встречаются в спектре рафтов, за исключением полос, которые характеризуют белки - 3318 см"1 и липиды ЗОЮ, 1466, 1381, 885, 721 см'1. Это подтверждает теорию строения рафтов в том, что они включают в себя часть мембранных липвдов и определенные мембранные белки, в зависимости от выполняемой рафтами функции.

По данным ИК спектров, возможно, посчитать липид/белковое отношение (Макаренко, Саляев, 1998). Для этого рассчитывали оптическую плотность полосы 1739 см"1, которая характеризует липиды и оптическую плотность полосы 1656 см'1, которая характеризует белки. Затем определяли отношение D1739 /D1656 (D - оптическая плотность). Липид/белковое отношение для вакуолярных мембран составляло 0.73, что свидетельствует о том, что используемая фракция тонопласта чистая, т.к. для неочищенной фракции тонопласта липид/белковое отношение составляет 0.5 - 0.6 (Макаренко, Саляев, 1998). Кроме этого, полученное значение подтверждает данные о том, что в составе тонопласта преобладают липиды. Для выделенных нами рафтов, липид/белковое отношение составляло 0.72, что говорит о том, что в составе рафтов вакуолярных мембран, так же как и в самих вакуолярных мембранах преобладают липиды.

Липид/белковое отношение рафтов вакуолярных мембран выше (0.72), по сравнению с липид/белковым отношением рафтов плазмалеммы (0.48) (Могщгапс! е1 а!., 2004). Возможно, это свидетельствует о том, что рафты тонопласта включают в себя больше молекул липидов, чем рафты плазмалеммы.

Таблица 1. Характерные колебательные частоты вакуолярных мембран и липидных микродоменов._

Диапазон Интенсивность Диапазон ' Интенсивность Функциональные

частот (см"'). поглощения частот (см"1). поглощения группы. Тип

Тонопласт полос Рафты полос колебания

3318 Сильн., шир. - - Амид А

ЗОЮ Слабая - - СН=СН деформаиион.

2924 Сильная 2926 Средняя СН2 деформацион.

2854 Средняя 2854 Слабая СН2 валентные

1739 Средняя 1739 Слабая С—О валентные

1656 Сильная 1655 Сильная Амид 1

1546 Сильная 1546 Средняя Амид II

1466 Слабая - - СН2-СН3

деформацион.

1415 Слабая 1413 Слабая, шир. СНг-СНз

деформацион.

1402 Слабая - - СНз деформацион.

1381 Слабая - - СНз деформацион.

1240 Средняя 1239 Слабая, шир. Р=0 валентные

1077 Сильная 1076 Слабая, шир. Р-0 валентные

- - 931 Слабая СН деформацион.

927 Слабая - - -

885 Слабая 886 Средняя СНг деформацион.

828 Слабая - - -

721 Слабая СНг маятниковые

5. Изучение белкового состава рафтов тонопласта. Для изучения особенностей белкового состава микродоменов тонопласта из опапесцирующей зоны, содержащей рафты, осаждали белки с помощью 10 % ТХУ при 4°С. В этих экспериментах выделение рафтов производили бездетергентным методом. Для анализа белкового состава липид-белковых микродоменов использовали метод электрофоретического разделения в ПААГ с ДДС-Ыа.

В рафтах плазмалеммы листьев табака при помощи электрофореза обнаружено 12 полипептидов, 6 из которых основные, остальные минорные. По результатам иммуноблоттинга, основные полипептиды были идентифицированы как Н+-АТР-аза, АТР-синтаза, реморин, карбонильная

ангидраза, аквапорины. Среди минорных полипептадов были выявлены белки теплового шока 70 кДа, элонгирующий фактор, элонгирующий фактор 1а, белки 14-3-3 семейства (Mongrand et al., 2004).

По результатам электрофоретического разделения в ПААГе с ДЦС-Na белков, выделенных из рафтов (рис 4) вакуолярных мембран, было выявлено 2 основных полипептида и 4 минорных с молекулярными массами от 17.1 до 68.9 кДа. По данным протеомного анализа, белки рафтов плазмалеммы с близкими молекулярными массами в основном относились к транспортным системам (Morel et al., 2006). Это позволяет предположить, что белки рафтов вакуолярных мембран также могут принимать участие в выполнении транспортных функций.

А Б

Рис. 4. Денатурирующий электрофорез в ПААГ с ДДС-Na, флуоресцентный краситель Oriol Fluorescent Gel Stain (Bio-Rad, США). А - маркеры, Б - белки из фракции рафтов,

В рафтах плазмалеммы были идентифицированы аквапорины и Н+-АТР-аза (Morel et al., 2006; Белугин и др., 2010). Мы провели иммунодетекцию белков, выделенных из фракции рафтов, используя антитела на аквапорины тонопласта (TIP 1:2; TIP 2:1; TIP 2:2), на субъединицу «с» Н -АТР-азы тонопласта (V-ATPase,c, 16 кДа), на Н+ -пирофосфотазу (V-PPase, 80 кДа). Результат иммуноблоттинга был отрицательным.

6. Изучение липндного состава микродоменов тонопласта. С помощью методов тонкослойной хроматографии был проведен анализ липидного состава микродоменов тонопласта корнеплодов столовой свёклы (Beta vulgaris L.), выделенных детергентным и бездетергентным методами. Для этого из опалесцирующей зоны градиента сахарозы экстрагировали липиды и идентифицировали их состав, используя стандартные свидетели.

На рисунке 5 показаны одномерная и двумерная тонкослойная хроматография полярных и нейтральных липидов тонопласта и рафтов. Среди нейтральных липидов рафтов вакуолярной мембраны были идентифицированы

свободные жирные кислоты, стерины, триглицериды и углеводороды. Спектр нейтральных липидов вакуолярных мембран оказался более насыщенным, по сравнению со спектром нейтральных липидов микродоменов. Такой же профиль нейтральных липидов рафтов был определен в рафтах плазматической мембраны и мембране аппарата Гольджи клеток растений (Мопдгапё е! а!., 2004; ЬеГеЬге й. а1., 2007). В рафтах клеток животных наблюдался подобный состав нейтральных липидов (Перевозчиков, 2008).

Полярные липиды рафтов (рис, 5) представлены глико- и сфинголипидами (галактозилдиглецериды, цереброзиды) и фосфолипидами (фосфатидилхолин). Среди фосфолипидов рафтов, выделенных из плазмалеммы растений, идентифицированы фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, а также следовые количества фосфатидилинозита, фосфатидилсерина и фосфатидной кислоты. В большом количестве обнаружены сфинголипиды. Однако подробный их состав не рассматривался, Содержание гликолипидов (дигалактозилдиглицерид) в рафтах плазматических мембран оказалось ниже по сравнению с содержанием фосфо- и сфинголипидов (Мог^гапс! е! а1., 2004; ЬеГеЬге е! а!., 2007; ЬаЫ е! а1., 2007).

Итак, в составе липидов рафтов вакуолярных мембран были идентифицированы липиды, характерные для рафтов, выделенных из других мембран. а 5

1211* 10 9 I

8 7 6 5 4 3 2

12 • 11 10 II

8 7 5 4 2 1

9

6 7

5 4 3

2

Ф < 0

I и

Рис. 5. Полярные (а) и нейтральные (б) липиды вакуолярных мембран: (I), стерин-обогащенных микродоменов (П).

а) 1- старт; 2; 5; 7; 8- цереброзиды; 3-фосфатидилинозит; 4-фосфотидилхолин; 6-фосфатидилэтаноламин; 9-фосфатидилглицерин; 10-11-моно - и дигалактозилдиглецериды; 12-нейтральные липиды;

б) 1-полярные липиды; 2- жирные кислоты; 3- стерины; 4-триглецериды; 5- высшие алифатические метилкетоны; 6-метиловые эфиры жирных кислот; 7-алкилдиглецериды; 8- эфиры стеринов; 9- свободные углеводороды.

7. Жирнокислотный состав микродоменов тонопласта. Известно, что рафты - это плотные структуры, которые перемещаются по мембране. Плотность рафтов зависит от их состава и обеспечивается в основном содержанием насыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов (фосфолипидов). Мы изучили жирнокислотный состав суммарных липидов вакуолярных мембран и рафтов, выделенных из корнеплодов, находящихся на стадии роста (данные представлены в таблице 2).

Из приведенных данных (табл. 2) видно, что содержание насыщенных жирных кислот в рафтах больше на 13%, а ненасыщенных меньше (также на 13 %), что говорит о том, что рафты более твердые (плотные) по сравнению с вакуолярными мембранами.

В липидах микродоменов, выделенных из плазматических мембран клеток листьев табака, наблюдалось то же самое, а именно, в липидах рафтов содержание насыщенных жирных кислот было больше, чем в плазмалемме, из которой они выделены (Mongrand et al., 2004). Об этом свидетельствует показатель - отношение суммы ненасыщенных жирных кислот к сумме насыщенных жирных кислот (£ненасыщ./£насыщенные жирные кислоты). В рафтах, выделенных из плазматической мембраны клеток растений, значение этого показателя составляет 1.24, в рафтах тонопласта 1.05. В мембранах, из которых получены рафты, указанное значение меняется: в плазмалемме оно составляет 2.6 (Lefebre et al., 2007; Laloi et al., 2007), а в тонопласте 1.81. Чем ниже значение показателя, тем больше содержится насыщенных жирных кислот. Следовательно, рафты тонопласта немного «плотнее», чем рафты плазмалеммы.

Известно, что физические свойства мембран (текучесть, вязкость) в большей степени характеризуются индексом двойных связей (ИДС) (Лось, 2007). Таким образом, можно сказать, что вакуолярная мембрана - «жидкая» (ИДС составляет 1.19), а выделенные рафты - более «твердые» (ИДС составляет 0.86).

Жирнокислотный состав липидов микродоменов плазмалеммы растительных клеток и клеток животных оказался представлен в основном такими жирными кислотами, как С16:0 - пальмитиновая, С18:0 - стеариновая, С18:1со9 - олеиновая, С18:2ш6 - линолевая, С18:ЗыЗ - линоленовая (Mongrand et al., 2004; Chen et al., 2007). Перечисленные жирные кислоты также были обнаружены в составе липидов рафтов вакуолярных мембран.

Таблица 2. Сравнение жирнокислотного состава липидов вакуолярных мембран и микродоменов тонопласта корнеплодов столовой свеклы на стадии роста._

Обозначение, название жирных кислот Содержание жирных кислот, %

Тонопласт Рафты

С14-.0 1.58 ± 0,16 2.23 ± 0.70

С15:0 0.82 ±0.15 1.20 ±0.14

С16:0 пальмитиновая 30.16 ±0.20 31.71 ± 1.02

С 16:1 со 9 пальмитолеиновая 3.49 ±0.098 3.26 ± 1.59

С17:0 0.30 ±0.014 0.67 ±0.18

С18:0 стеариновая 2.73 ± 0.099 7.53 ± 0.86

С18-1со9 олеиновая 12.9 ±0.54 24.34 ±0.86

С18-1 со 7 цис-вакценовая 2.04 ±0.56 -

С18-2со6 линолевая 38.05 ± 0.907 28.54 ±0.52

С18-ЗсоЗ а-линоленовая 7.37 ± 1.05 3.61 ±0.22

С20:0 арахиновая - 1.07 ±0.05

С 20:1 со 11 гондоевая - 0.70 ±0.10

С22:0 - 0.49 ± 0.08

X насыщенных 35.63 ± 0.24 48.65 ±2.82*

2 ненасыщенных 64.9 ±0.25 51.34 ±2.82*

идс 1.19 ± 0.0 0.86 ±0.07*

Хненасыщ./£насыщенных 1.81 ±0.03 1.05 ±0.01*

жирных кислот

Приведены средние значения из трех биологических повторностей. * -достоверность различий с тонопластом, Р < 0.05.

ВЫВОДЫ

1. Впервые двумя различными методами из вакуолярной мембраны клеток корнеплодов красной столовой свеклы выделены липид-белковые микродомены (рафты).

2. Приведена система доказательств с использованием методов флуоресцентной и конфокальной микроскопии и специфических флуоресцентных меток, свидетельствующая о том, что выделенные структуры действительно обладают характерной для рафтов высокой упорядоченностью и повышенным содержанием стеринов.

3. Изучен липидный и белковый состав рафтов тонопласта, который показал, что рафты вакуолярной мембраны по своему составу соответствуют характерным особенностям липид-белковых микродоменов, выделенных из других растительных мембран.

Работа выполнена при поддержке Гранта РФФИ 09-04-00396-а

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Озолина Н.В., Нестёркина И.С., Нурминский В.Н., Степанов A.B., Колесникова Е.В., Турина В.В., Саляев Р.К. Обнаружение липид-белковых микродоменов (рафтов) в вакуолярной мембране // ДАН. - 2011. - Т.438, № 3. -С.419-421.

2. Нурминский В.Н., Озолина Н.В., Нестёркина И.С., Колесникова Е.В., Корзун A.M., Чернышов М.Ю., Тихонов Н.В., Тарков М.С., Саляев Р.К. Стабильность вакуолярных мембран растений при осмотическом стрессе и воздействии редокс-агентов // Биол. мембраны. - 2011. - Т.28, №3. - С. 224-229.

3. Нестёркина И.С., Озолина Н.В., Дударева Л.В., Донская Л.И., Саляев Р.К. Липиды тонопласта корнеплодов красной столовой свеклы (Beta vulgaris L.) при гиперосмотическом и гипоосмотическом стрессе // Тез. докл. III Всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз - Россия 2010»: Сб. тезисов (Нижний Новгород, 24-29 мая, 2010 г). - Нижний Новгород, 2010 - С.64.

4. Нестеркина И.С., Озолина Н.В., Саляев Р.К. Обнаружение на вакуолярной мембране стерин-обогащенных микродоменов (рафтов) -возможных сигнальных платформ // III международный симпозиум «Клеточная сигнализация у растений»: тезисы докладов (Казань, с 28 июня по 1 июля, 2011). -Казань, 2011 - С. 124.

5. Нестеркина И.С., Озолина Н.В., Саляев Р.К. Белок-липидные микродомены тонопласта // VII съезд общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий»: материалы докладов (в двух частях). Ч 2. (Нижний Новгород, 4-10 июля, 2011). - Нижний Новгород, 2011 - С. 502-503.

Для заметок

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нестеркина, Ирина Сергеевна

Список используемых сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы.

1. Общая характеристика вакуолярной мембраны.

2. Особенности липидного и белкового состава тонопласта.

2.1. Липидный состав вакуолярной мембраны.

2:2тгЖкрные~кислоты тонопластатгг. .ттттт^. .тгтттт. :.,7.г. .ттггт:. 77- • • • • .ттт11---:

2.3. Белковый состав тонопласта.

3. Липид-белковые микродомены - рафты.

3.1. Развитие концепции о рафтах.

3.2. Структура рафтов.

3.2.1. Липиды рафтов.

3.2.2. Белки рафтов.

3.3. Функции рафтов.

3.4. Механизмы формирования рафтов.

3.5. Локализация рафтов.

4. Обзор методов выделения рафтов.

5. Выводы из обзора литературы. Цели и задачи работы.

II. Материалы и методы исследования.

1. Характеристика объекта исследования.

2. Выделения изолированных вакуолей и вакуолярных мембран.

3. Инфракрасная спектроскопия.

4. Изучение и идентификация липидов тонопласта и микродоменов при помощи тонкослойной хроматографии.

5. Изучение жирнокислотного состава тонопласта и микродоменов.

6. Определение белка по методу Бредфорд.

7. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия по Лэммли.

8. Иммуноблоттинг (Вестерн-блотинг).

9. Флуоресцентная микроскопия.

10. Конфокальная микроскопия.

11. Статистический анализ.

12. Использованные реактивы.

III. Результаты и их обсуждение.

1. Выявление стерин-обогащенных микродоменов методом флуоресцентной микроскопии.—.-.-. .^т.

2. Изоляция липид-белковых микродоменов с использованием разных методов.

2.1. Метод выделения рафтов с детергентом Тритоном Х-100.

2.2. Метод выделения рафтов без детергентов.

3. Обнаружение липид-белковых микродоменов методом конфокальной микроскопии.

4. Сравнительный анализ ИК - спектров липидных микродоменов вакуолярных мембран с тонопластом.

5. Изучение белкового состава рафтов тонопласта.

6 Изучение липидного состава микродоменов тонопласта.

7. Жирнокислотный состав микродоменов тонопласта.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление липид-белковых микродоменов (рафтов) на вакуолярной мембране"

В настоящее время важным направлением в изучении липидов клеточных мембран является исследование липидных микродоменов (рафтов) мембран. Микродомены (рафты) - это структуры, в которых вокруг определённых белков возникают области, обогащенные гликосфинголипидами, стеринами и липидами с насыщенными жирными кислотами. Эти домены стабильны, т.е. существуют длительное время, и перемещаются в мембране как единое целое. Они отличаются от основной части мембраны как по белковому и липидному составу, так и по функциям, которые они выполняют (Harder, Simons, 1999; Brown, London, 2000).

Интерес к рафтам вызван тем, что появляется всё больше экспериментальных данных, подтверждающих их участие в таких жизненно важных клеточных процессах, как сортировка белков, их доставка в мембраны, межклеточная сигнализация и т.д. Полагают, что липидные рафты, плавая на поверхности липидного бислоя, могут взаимодействовать друг с другом, регулируя проведение сигнала снаружи внутрь клетки. Ответы при этом могут быть самые разнообразные: от активации клеточного деления до апоптоза.

Согласно современным представлениям о латеральной гетерогенности липидного бислоя, рафты имеют важное значение для связи плазматической мембраны и цитоскелета (Nebl et al., 2002; Brown, 2006).

Для молекулярной медицины рафты стали недостающим звеном в механизмах развития заболеваний, таких как атеросклероз и болезнь Альцгеймера (Simons, Ikonen, 1997; Mongrand et al., 2004).

Открытие рафтов в составе мембран позволило по-новому взглянуть на известную проблему современной мембранологии - зависимость функционирования мембранных белков от липидного состава мембран. Ряд данных свидетельствует, что ассоциация с рафтами может быть решающим фактором, определяющим активность интегральных мембранных белков, в том числе ионных каналов (Edidin, 2003; Brown, 2006).

Изучение рафтов в клеточных мембранах растений начато сравнительно недавно, в основном на плазмалемме. На тонопласте подобных исследований не проводилось. Изученный в нашем Институте липидный состав тонопласта показал наличие стеринов и гликолипидов (Макаренко и др., 1992), которые обнаружены в рафтах плазмалеммы (Мог^гапс! а1, 2004). Это позволило предположить, что вакуолярная мембрана, так же, как и плазматическая, может содержать рафты.

Изучение особенностей липидного состава тонопласта может быть необходимым для направленной регуляции функций и процессов, выполняемых вакуолью и вакуолярной мембраной.

Автор выражает сердечную благодарность научному руководителю работы доктору биологических наук Озолиной Наталье Владимировне за всестороннюю помощь в работе и ценные замечания при написании рукописи. Глубокая благодарность всем сотрудникам лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР СО РАН за помощь в работе и обсуждение результатов. Отдельная благодарность сотрудникам лаборатории физико-химических методов исследования СИФИБР СО РАН; сотрудникам Иркутского филиала института лазерной физики СО РАН.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Нестеркина, Ирина Сергеевна

V. выводы

1. Впервые двумя различными методами из вакуолярной мембраны клеток корнеплодов красной столовой свеклы выделены липид-белковые микродомены (рафты).

2. Приведена система доказательств с использованием методов флуоресцентной и конфокальной микроскопии и специфических флуоресцентных меток, свидетельствующая о том, что выделенные структуры действительно обладают характерной для рафтов высокой упорядоченностью и повышенным содержанием стеринов.

3. Изучен липидный и белковый состав рафтов тонопласта, который показал, что рафты вакуолярной мембраны по своему составу соответствуют характерным особенностям липид-белковых микродоменов, выделенных из других растительных мембран.

IV. Заключение

В настоящее время после пересмотра общепринятых представлений о строении мембран, одной из важных характеристик мембран признается их способность к образованию микродоменов (рафтов). Способность образовывать эти мембранные структуры связана, в первую очередь, с определённым составом липидного компонента мембраны, который должен в достаточном количестве содержать такие липиды как стерины, гликосфинголипиды, фосфолипиды с насыщенными жирными кислотами. Изучая особенности липидного состава тонопласта, мы пришли к заключению, что эта уникальная растительная мембрана, имея в своём составе стерины, глико- и сфинголипиды и высокое содержание насыщенных жирных кислот, может содержать липид-белковые микродомены. Для доказательства, что вакуолярная мембраны действительно может содержать рафты, были проведены эксперименты с использованием флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентный зонд филипин, способный специфически взаимодействовать в мембране с зонами, обогащёнными стеринами, в наших экспериментах избирательно связывался с определёнными участками вакуолярной мембраны. Это дало нам основание с его помощью показать существование рафтов на тонопласте.

После тщательного анализа методов, которые в настоящее время используются другими исследователями, мы выбрали 2 метода выделения рафтов. Один с использованием неионного детергента Тритона Х-100, другой без использования детергентов. Проведённые эксперименты позволили нам выделить в градиенте сахарозы опалесцирующую зону, характеризующую стерин-обогащённые микродомены. Она отличалась по расположению в градиенте сахарозы от рафтов, выделенных из плазматической мембраны. Если из плазматической мембраны рафты, в виде опалесцирующей зоны, обнаруживались на границе 30 и 35 % сахарозы, то из вакуолярных мембран эта зона выявлялась в районе 25 % сахарозы. Эти отличия, по-видимому, связаны с особенностями липидной составляющей тонопласта, которая отличается от таковой у плазмалеммы.

Для доказательства, что выделенные нами микродомены обладают высокой степенью упорядоченности липидной составляющей, характерной для рафтов, был использован метод конфокальной микроскопии и ещё один флуоресцентный зонд лаурдан. По интенсивности эмиссии этого зонда была рассчитана величина генерализованной поляризации, которая характеризует фазовое состояние липидного бислоя мембран. Эта величина также показала значительно более высокую степень упорядоченности липидов в выделенных рафтах, по сравнению с вакуолярной мембраной. Это позволило нам говорить о том, что вакуолярная мембрана содержит рафты.

Анализ липидной составляющей микродоменов показал, что полярные липиды рафтов тонопласта представлены гликолипидами (моно- и дигалактозилдиглицериды), сфинголипидами (цереброзиды) и фосфолипидами (фосфатидилхолин). Среди нейтральных липидов рафтов вакуолярной мембраны идентифицировали свободные жирные кислоты, стерины, триглицериды и углеводороды. Все перечисленные липиды присутствуют в липидном спектре рафтов, выделенных из плазмалеммы различных растительных объектов. В липидах вакуолярных микродоменов содержится больше насыщенных жирных кислот, чем в самой вакуолярной мембране, что свидетельствовало о том, что выделенные микродомены были более плотные по сравнению с тонопластом.

Проведённые исследования белков микродоменов позволили выявить 2 основных полипептида и 4 минорных с молекулярными массами от 17.1 до 68.9 кДа. Предварительная идентификация выявленных белков позволяет предположить их важную роль, особенно в выполнении транспортных функций вакуолярной мембраны.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нестеркина, Ирина Сергеевна, Иркутск

1. Акимов С.А., Фролов В.А., Кузьмин П.И. (2005) Линейное натяжение и функция распределения нанорафтов по размерам в бислойных липидных мембранах. Биологические мембраны, 22 (5), 413-426.

2. Акимов С.А., Фролов В.А., Кузьмин П.И., Коэн Ф.С., Циммерберг Д., Чизмаджев Ю.А. (2006) Модель липид-белковых нанорафтов, возникающих в условиях неполного смачивания. Биологические мембраны, 23, 510-524.

3. Алаудинова Е.В., Миронов П.В., Репях С.М. (2000) Жирные кислоты мембранных липидов живых тканей почек лиственницы сибирской. Химия растительного сырья, №2, 41-45.

4. Алаудинова Е.В., Миронов П.В. (2009) Хвойные Сибири в условиях низкотемпературной адаптации: структурно-химические изменения липидов. Красноярск: СибГТУ, 175с.

5. Андреев И.М. (2001) Функции вакуоли в клетках высших растениях. Физиология растений, 48 (5), 777-787.

6. Архипова К.А., Рыбко В.А., Землякова В.В., Близнюков О.П., Мартынков Д.В., Губина Г.И., Зборовская И.Б. (2009) Экспрессия кавеолина-1 в опухолях мягких тканей. Вестник РОНЦ им. Блохина H.H., 20 (1), 4-9.

7. Белугин Б.В., Жесткова И.М., Трофимова М.С. (2010) Сродство PIP-аквапоринов к стерин-обогащенным доменам плазмалеммы клеток этиолированных проростков гороха. Биологические мембраны, 27 (5), 394-403.

8. Бондарь О.П. (1984) Структурные особенности мембран эритроцитов с различным содержанием холестерина в норме и при развитии атеросклероза: дисс. канд. биол. наук, Киев. 180 с.

9. Валиахметов А.Я. (2008) Геометрия мембран и функции белков. Биологические мембраны, 25 (2), 83-96.

10. Валитова Ю.Н. (2008) Липидные рафты в растительных мембранах: изменения в составе гликоцерамидов при связывании стеринов. Тезисы докладов. Международный симпозиум «Липиды растений» г. Казань, 65 с.

11. Васильев A.B., Гриненко Е.В., Щукин А.О., Федулина Т.Г. (2007) Инфракрасная спектроскопия органических и природных соединений. Санкт-Петербург: СПбГЛТА, 54 с.

12. Васьковский В.Е. (1997) Липиды. Соросовский образовательный журнал, № 3, 32-37.

13. Гармаза Ю.В. (2008) Холестерин и Zn-индуцированные изменения мембран. Наука и инновации, 9 (67), 40-42.

14. Гринштейн С.В., Кост O.A. (2001) Структурно-функциональные особенности мембранных белков. Успехи биологической химии, 41, 77-104.

15. Дятловицкая Э.В, Кандыба А.Г.(2004) Биоэфекторные сфинголипиды как стимуляторы роста и выживаемости клеток. Биоорганическая химия, 30 (3), 227-233.

16. Ершов П.В., Васекина A.B., Вобликова В.Д., Таранов В.В., Рослякова Т.В., Бабаков A.B. (2007) Идентификация гомолога К+/Н+- антипортера в ячмене: экспрессия в сортах, отличающихся по устойчивости к NaCl. Физиология растений, 54 (1), 22-30.

17. Ивков В.Г., Берестовский Т.Н. (1982) Липидный бислой биологических мембран. М.: Наука, 224 с.

18. Ипатова О.М. (2005) Фосфоглиф: механизмы действия и применение в клинике. М: ГУ НИИ Биомедхим. РАМН, 318 с.

19. Кейтс М.: пер. с англ. В. Вавера (1975) Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. М.: МИР, 322 с.

20. Кесслер И. (1964) Методы инфракрасной спектроскопии в химическом анализе. М: МИР, 328 с.

21. Крысанова Н.В., Сивко Р.В., Крупко O.A., Борисова Т.А. (2007) Метил-Р-циклодекстрин, снижая содержание мембранного холестерола, влияет на процесс транспорта глутамата в нервных окончаниях головного мозга. Украинский биохимический журнал, 79 (3), 29-37.

22. Лакин Г.Ф. (1990) Биометрия. М.: «Высшая школа».

23. Лось Д.А. (2001) Восприятие сигналов биологическими мембранами: сенсорные белки и экспрессия генов. Соровский образовательный журнал, 7 (9), 14-22.

24. Макаренко С.П., Коненкина Т.А., Саляев Р.К. (1992) Химический состав и структура липидов вакуолярных мембран. Биологические мембраны, 9 (3), 290-300.

25. Макаренко С.П., Саляев Р.К. (1998). Структура вакуолярных мембран растений по данным ИК-спектроскопии. Биологические мембраны, 15 (3), 309321.

26. Макаренко С.П., Коненкина Т.А., Саляев Р.К. (1999) Жирнокислотный состав липидов вакуолей высших растений. Физиология растений, 46 (4), 643647.

27. Макаренко С.П., Коненкина Т.А., Хотимченко C.B. (2007) Жирнокислотный состав липидов вакуолярных мембран корнеплодов. Физиология растений, 54 (2), 223-228.

28. Минибаева Ф.В. Апопластный контроль редокс-сигналов в растениях при стрессе. Всероссийский симпозиум « Растение и стресс» 9-12 ноября 2010, тезисы докладов. Москва. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН,425.

29. Мяделец О.Д., Стефаненко Е.В., Кухновец O.A. (2009) Морфологическая характеристика липидосодержащих и липидопродуцирующих структур кожного покрова человека в норме и при холодовой смерти. Морфология, 135 (2), 62-65.

30. Назаренко JI.B. (2008) Некоторые особенности криосохранения биологических объектов. Вестник Московского городского педагогического университета. Серия: Естественные науки. 1, 53-59.

31. Обручева Н.В., Синькевич И.А. (2010) Аквапорины и рост клеток. Физиология растений, 57 (2), 163-176.

32. Озолина Н.В. (2004) Протонные помпы тонопласта, их функциональная активность и связь с транспортом и накоплением метаболитов: Дисс. докт. биол. наук, Иркутск: СИФИБР, 309 с.

33. Остерман JI.A. (1985) Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 279 с.

34. Перевозчиков А.П. (2008) Стеролы и их транспорт в развитии животных. Онтогенез, 39 (3), 165-189.

35. Побежимова Т.П., Колесниченко A.B., Грабельных О.И. (2004) Методы изучения митохондрий растений. Полярография и электрофорез. М.: НПК Промэкобезопасность, 98 с.

36. Райко М.П., Кропотова Е.С. (2004) Распределение изоформ белка NC AM в рафтах мембраны нервных окончаний. Материалы межвузовскойнаучно-технической конференции. 4.5: С. 84-85. Санкт-Петербургский политехнический университет.

37. Саляев P.K., Кузеванов В.Я., Хаптагаев В.Я., Копытчук В.Н. (1981) Выделение и очистка вакуолей и вакуолярных мембран из клеток растений. Физиология растений, 28, 1295-1305.

38. Саляев Р.К., Кузеванов В.Я., Озолина Н.В., Каменкова Л.Д., Пузанова

39. H.A. (1982) Содержание липидов, белков и углеводов в мембране изолированных вакуолей красной свеклы. Физиология растений, 29 (5), 933939.

40. Саляев Р.К., Хаптагаев С.Б., Кузеванов В.Я., Копытчук В.Н. (1983) Об ультраструктуре изолированных вакуолярных мембран. Цитология, 25 (6), 643-648.

41. Фролов В.А. (2008) Биоэлектрохимия нанодоменов в модельных и клеточных мембранах: Автореферат дисс. канд. физ.-мат. наук, Москва: Институт физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина РАН, 24 с.

42. Хохлова Л.П., Макарова М.В. (2006) Реорганизация цитоскелета при действии на растениях низких температур. Ученые записки Казанского университета. Серия: Естественные науки, 148 (3), 65-88.

43. Чиркова Т.В. (1997) Клеточные мембраны и устойчивость растений к стрессовым воздействиям. Соросовский образовательный журнал, 9,12-17.

44. Шагидулин P.P., Чернова A.B., Виноградова B.C., Мухаметов Ф.С. (1984) Атлас ИК-спектров фосфорорганических соединений (интерпретированные спектрограммы). М: Наука, 336 с.

45. Шапигузов А.Ю. (2004) Аквапорины: строение, систематика и особенности регуляции. Физиология растений, 51, 142-152.

46. Шевченко О.Г. (2010) Роль холестерина в структурной организации мембран эритроцитов. Вестник Института биологии Коми НЦ УрО РАН, 152 (6), 10-14.

47. Шевырева Т.А. (2008) Везикулярный транспорт PIP-аквапоринов в растительной клетке при осмотическом стрессе. Автореферат дисс. канд. биол. наук. Москва: ИФР, 26 с.

48. Шишкина JI.H., Хрустова Н.В. (2006) Кинетические характеристики липидов тканей млекопитающих в реакциях автоокисления. Биофизика, 51 (2), 340-346.

49. Шижнева И.А. (2007) Участие аквапоринов в поступлении воды в осевые органы прорастающих семян. Дисс. канд. биол. наук, Москва, 117с.

50. Шмиголь И.Б. (2003) Изучение липидных микродоменов лейкоцитов человека с помощью проточной цетометрии: дисс. канд. биол. наук. Москва: Г.Н.Ц. «Институт иммунологии федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем», 119 с.

51. Шпаков А.О. (1999) Структурно-функциональная характеристика гетеродимерных фосфатидилинозитол-3-киназ и молекулярные механизмы их сопряжения с другими компонентами сигнальных систем. Цитология, №11, 975-99.

52. Юрина Н. П., Одинцова М. С. (2010) Сигнальные системы митохондрий растений: ретроградная регуляция. Физиология растений, 57 (1), 9-22.

53. Albertti L.A., Macedo A.M., Chiari E., Andrews N.W., Andrade L.O. (2010) Role of host lysosomal associated membrane protein (LAMP) in Trypanosoma cruzi invasion and intracellular development. Microbes Infect. Sep., 12 (10), 784-789.

54. Anderson R. G. W. (1998) The caveolae membrane system. Biochem., 67, 199-225.

55. Anderson R.G. W., Jacobson K. (2002) A role for lipid shells in targeting proteins to caveolae, rafts, and other lipid domains. Science, 296, 1821-1825.

56. Bagnat M., Keranen S., Shevchenko A., Shevchenko A., Simons K. (2000) Lipid rafts function in biosynthetic delivery of proteins to the cell surface. Proc Natl Acad Sci USA, 97, 3254-3259.

57. Biltonen R.L., Estep T.N., Mountcastle D.B., Barenholz Y., Thompson

58. T.E. (1979) Thermal behavior of synthetic sphingomyelin-cholesterol dispersions. Biochemistry, 18 (10), 2112-2117.

59. Bligh E.G., Dyer W.J. (1959)A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiojol., 37, 911-917.

60. Bohner H., Jencen R., (1996) Strategies for engineering water-stress tolerance in plant. Trend Biotechnology, 14, 89-97.

61. Brown D., London E. (1998) Functions of lipid rafts in biological membranes. Cell Dev. Biol., 14, 111-136.

62. Brown D., London E. (2000). Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol. Chem, 275 (23), 17221-17224.

63. Brown D. (2002) Structure and function of membrane rafts. J Med Microbiol., 291 (6-7), 433-437.

64. Brown D. (2006) Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals. Physiology, 21, 430-439.

65. Brown R.E. (1998) Sphingolipid organization in biomembranes: what physical studies of model membranes reveal. J Cell Sci., Ill, 1-9.

66. Brugger B., Sandhoff R., Wegehingel S., Gorgas K., Malsam J., Helms J.B., Lehmann W.D., Nickel W., Wieland F.T. (2000) Evidence for segregation of sphingomyelin and cholesterol during formation of COPIcoated vesicles. J Cell Biol., 151,507-518.

67. Bradford M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Protein Utilising the Principal of Protein. Anal. Biochem., 72, 248-254.

68. Chanson A. (1993) Active transport of proton and calcium in higher plant cell. Plant Physiological Biochemistry, 31 (6), 943-955.

69. Carreau J.P., Dubacq J.P. (1978) Adaptation of macro-scale method to the micro-scale for fatty acid methyl transesterification of biological lipid extracts. J. Chromatogr., 151, 384-390.

70. Carter C., Pan S., Zouhar J., Avila E.L., Girke T., Raikhel N.V. (2004) The vegetative vacuole proteome of Arabidopsis thaliana reveals predicted and unexpected proteins. Plant Cell, 16 (12), 3285-3303.

71. Chen X., Morris R., Lawrence M. J., Quinn P.J. (2007) The isolation of structure of membrane lipid rafts from rat brain. Biochemie, 89, 192-196.

72. Christie W.W. (1988) Equivalent chain lengths of methyl ester derivatives of fatty acids on gas chromatography: a reappraisal. J. Chromatogr., 447, 305-314.

73. Chung J-H., Lester R.L., Dicrson R.C. (2003) Sphingolipid recuirement for generation of a functional Vi component of the vacuolar ATPase. Biol.Chem., 278 (31), 28872-28881.

74. Crane J. M., Tamm L. K. (2004) Role of Cholesterol in the Formation and Nature of Lipid Rafts in Planar and Spherical Model Membranes. Biophysical Journal, 86, 2965-2979.

75. Dietrich C., Bagatolli L. A., Volovyk Z. N., Thompson N. L., Levi M., Jacobson K., Gratton E. (2001) Lipid Rafts Reconstituted in Model Membranes. J. Biophys,. 80, 1417-1428.

76. Drevot P., Langlet C., Guo X.J., Bernard A.M., Colard O., Chauvin J.P., Lasserre R., He H.T. (2002) TCR signal initiation machinery is preassembled and activated in a subset of membrane rafts. JEMBO, 21, 1899-1908.

77. Edidin M. (2003) The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Biophys Biomol Struct., 32, 257-83.

78. Estep T.N., Mountcastle D.B., Barenholz Y., Biltonen R.L., Thompson

79. T.E. (1979) Thermal behavior of synthetic sphingomyelin-cholesterol dispersions. Biochemistry, 18, 2112-2117.

80. Flannery A.R., Czibener C., Andrews N.W. (2010) Palmitoylation-dependent association with CD63 targets the Ca2+ sensor synaptotagmin VII to lysosomes. J Cell Biol., 191 (3), 599-613.

81. Forgac M. (2007) Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Mol Cell Biol., 8(11), 917-929.

82. Foster L.J., Zheng Y.Z., Berg K.B. (2009) Mitochondria do not contain lipid rafts, and lipid rafts do not contain mitochondrial proteins. J Lipid Res., 50 (5), 988998.

83. Foster L.J. Zheng Y.Z., Boscher C., Inder K.L., Fairbank M., Loo D., Hill M.M., Nabi I.R. (2011) Differential impact of caveolae and caveolin-1 scaffolds on the membrane raft proteome. Mol Cell Proteomics, 10 (10), 007-146.

84. Furt F., Koning S., Bessoule J.J., Sargueil F., Zallot R., Stanislas T., Noirot E., Lherminier J., Simons-PIas F., Heilmann I., Mongrand S. (2010)

85. Polyphosphoinositides are enriched in plant membrane rafts and form microdomains in the plasma membrane. Plant Physiol., 152, 2173-2187.

86. Gattolin S., Sorieul M., Frigerio L. (2010) Tonoplast intrinsic proteins and vacuolar identity. Biochem Soc Trans, 38 (3), 769-73.

87. Gaus K., Zech T., Harder T. (2006) Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy. Mol. Membr. Biol., 23, 41-48.

88. Goodsaid-Zalduondo F., Rintoul D.A., Carlson J.C., Hansel W. (1982) Luteolysis-induced changes in phase composition and fluidity of bovine luteal cell membranes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 79, 4332-4336.

89. Hancock J. F. (2003) Ras proteins: different signals from different locations. Nature Rev. Mol. Cell Biol., 4, 373-384.

90. Hansen G.H., Niels-Christiansen L.L., Thorsen E., Immerdal L., Danielsen

91. E.M. (2000) Cholesterol depletion of enterocytes. Effect on the Golgi complex and apical membrane trafficking. Journal of Biological Chemistry, 275 (7), 5136-42.

92. Harder T., Scheiffele P., Verkade P., Simons K. (1998) Lipid domain structure of the plasma membrane revealed by patching of membrane components. Cell Biol, 141 (4), 929-42.

93. Harder T., Simons K. (1999) Clusters of glycolipid and glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins in lymphoid cells: accumulation of actin regulated by local tyrosine phosphorylation. J Immunol., 29 (2), 556-562.

94. Haschke H.P., Kaiser G., Martinoia E., Hammer U., Teucher T., Dorne A.J., Heinz E. (1990) Lipid profiles of leaf tonoplasts from plants with different C02-fixation mechanisms. Bot. Acta, 103, 32-38.

95. Hein L.K., Duplock S., Hopwood J.J., Fuller M. (2008) Lipid composition of microdomains is altered in a cell model of Gaucher disease. J Lipid Res., 49 (8), 1725-1734.

96. Helms J.B., Zurzolo C. (2004) Lipids as Targeting Signals: Lipid Rafts and Intracellular. Trafficking Traffic, 5, 247-254.

97. Heyer A.G., Marten I., Hedrich R., Neuhaus H.E. (2010) Increased activity of the vacuolar monosaccharide transporter TMT1 alters cellular sugar partitioning, sugar signaling, and seed yield in Arabidopsis. Plant Physiol, 154 (2), 665-77.

98. Israelachvili J.N., Marcelja S., Horn R.G. (1980) Physical principles of membrane organization. Biophys., 13, 121-200.

99. Jaquinod M., Villiers F., Kieffer-Jaquinod S., Hugouvieux V., Bruley C., Garin J., Bourguignon J. (2007) A proteomics dissection of Arabidopsis thaliana vacuoles isolated from cell culture. Mol. Cell Proteomics, 3, 394-412.

100. Kaiser G., Martinoia E., Schmitt J., Hinche D., Heber U. (1986) Polypeptide pattern and enzymic character of vacuoles isolated from barley mesophyll protoplasts. Planta, 169 (3), 345-355.

101. Kaiser H.-J., Lingwood D., Leventala I., Sampaio J.L., Kalvodova L., Rajendran L., Simons K. (2009) Order of lipid phases in model and plasma membranes. Proc Natl Acad Sci USA, 106 (39), 16645-16650.

102. Karnovsky M.J., Kleinfeld A.M., Hoover R.L., Klausner R.D. (1982) The concept of lipid domains in membranes. Cell. Biol., 94, 1-6.

103. Kenworthy A.K., Nichols B.J., Remmert C.L., Hendrix G.M., Kumar M., Zimmerberg J., Lippincott-Schwartz J. (2004) Dynamics of putative raft-associated proteins at the cell surface. J. Cell Biol., 165 (5), 735-46.

104. Kusumi A., Suzuki K. (2005) Toward understanding the dynamics of membrane-raft-based molecular interactions. Biochim. Biophys. Acta., 1746, 234251.

105. Klemm R.W., Ejsing C.S., Surma M.A., Kaiser H.-J., Gerl M.J., Sampaio J.L., de Robillard Q., Ferguson C., Proszynski T.J., Shevchenko A., Simons K.

106. Segregation of sphingolipids and sterols during formation of secretory vesicles at the trans-Golgi network. J. Cell Biol., 185 (4), 601-612.

107. Kol M.A., van Laak R., Killian J.A. (2003) Phospholipid flop induced by transmembrane peptides in model membranes is modulated by lipid composition. Biochemistry, 42, 231-237.

108. Korlach J., Schwille P., Webb W.W., Feigenson G.W. (1999) Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA., 96, 8461-8466.

109. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. Nature, 227, 680-685.

110. Legler D.F., Micheau O., Doucey M.A., Tschopp J., Bron C. (2003) Recruitment of TNF receptor 1 to lipid rafts is essential for TNFa-mediated NF-kB activation. Immunity, 18, 655-664.

111. Lindblom G., Oradd G., Filippov A. (2006) Lipid lateral diffusion in bilayers with phosphatidylcholine, sphingomeelin and cholesterol. An NMR study of dynamics and lateral phase separation. Chem. Phys. Lipids, 141, 179-184.

112. Lichtenberg D., Goni F.M., Heerklotz H. (2005) Detergent-resistant membranes should not be identified with membrane rafts. Trends Biochem Sci., 30 (8), 430-436.

113. Lingwood D., Simons K. (2010) Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science, 327 (5961), 46-50.

114. London E., Brown D.A. (2000) Insolubility of lipids in triton X-100: physical origin and relationship to sphingolipid/cholesterol membrane domains (rafts). Biochim Biophys Acta., 1508, 182-195.

115. London E. (2002) Insights into lipid raft structure and formation from experiments in model membranes. Curr. Opin. Struct. Biol, 12, 480-486.

116. Lyons J.M., Weaton T.A., Pratt Y.K. (1994) Relationship between the Physical Nature of Mitochondrial Membranes. J. Plant Physiol., 143, 399-406.

117. Macdonald J.L., Pike L.J. (2005) A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts. J. Lipid Res., 46, 1061-1067.

118. Maeshima M. (2001) Tonoplast transporters: organization and function. Plant Physiol., 52, 469-497.

119. Magnin T., Frachard A., Trossat C. (1995) The tonoplast tf-ATPfase of Acer pstudoplatanus is a vacuolar -type ATPfase that operates with a phosphoinzyme intermediate. Plant Physiol, 109, 285-292.

120. Manes S., del Real G., Lacalle R.A., Lucas P., Gomez-Mouton C., Sanchez-Palomino S., Delgado R., Alcami J., Mira E., Martinez A.C. (2000) Membrane raft microdomains mediate lateral assemblies required for HIV-1 infection. EMBO Repors., 1, 190-196.

121. Marty F. (1978) Cytochemical studies on GERL, provacuoles, and vacuoles in root meristematic cell of Euphorbia. Cell Biology, 75 (2), 852-856.

122. Matile P. (1982) Vacuoles come of age. Physiologia Vegetarum., 20, 303-310.

123. Moeller C.H., Mudd J.B. (1982) Localization of Filipin Sterol Complexes in the Membranes of Beta-Vulgaris Roots and Spinacia-Oleracea Chloroplasts. Plant Physiology (Rockville), 70, 1554-61.

124. Mongrand S., Morel J., Laroche J., Claverol S., Carde J., Hartmann M., Bonneu M., Simon-Plast F., Lessire R., Bessoule J. (2004) Lipid rafts in higher plant cells. Biol.Chem., 279 (35), 36277-36286.

125. Mongrand S., Stanislas T., Bayer E.M.F., Lherminier J., Simon-Plas F.2010) Membrane rafts in plant cells. Trends in Plant Science, 15 (12), 656-663.

126. Moreau A., Jacob J., Dupont J., Lance C. (1975) Electron transport in the membrane of lutoids from the Latex of Hevea brasiliensis. Biochim. Biophys. Acta., 396(1), 116-124.

127. Morel J., Claverol S., Mongrand S., Furt F., Fromentin J., Bessoule J., Blein J., Simon-Plast F. (2006) Proteomics of plant detergent-resistent membranes. Mol Cell Proteomics, 5 (8), 1396-1411.

128. Mishra S., Joshi P.G. (2007) Lipid raft heterogeneity: an enigma. J. Neurochem., 103, 135-142.

129. Nebl T., Pestonjamasp K.N., Leszyk J.D., Crowley J.L., Oh S.W., Luna E.J. (2002) Proteomic analysis of a detergent-resistant membrane skeleton from neutrophil plasma membranes. J Biol Chem., 277 (45), 43399-409.

130. Nichols B. (2003) Caveosomes and endocytosis of lipid rafts. J. Cell Sci., 116, 4707-4714.

131. Parasassi T., De Stasio G., d'Ubaldo A., Gratton E. (1990) Phase fluctuation in phospholipid membranes revealed by Laurdan fluorescence. Biophysical journal, 57 (6), 1179-1186.

132. Parton R.G., Hancock J.F. (2004) Lipid rafts and plasma membrane microorganization: insights from Ras. Trends Cell Biol., 14, 141-147.

133. Parton R.G. (2003) Caveola from ultrastructure to molecular mechanisms Nature Reviews Molecular Cell Biology, 4, 162-167

134. Pelkmans L., Kartenbeck J., Helenius A. (2001) Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nature Cell Biol., 3, 473-483.

135. Pike L.J., Han X., Chung K.-N., Gross R. (2002) Lipid rafts are enriched in plasmalogens and arachidonate-containing phospholipids and the expression of caveolin does not alter the lipid composition of these domains. Biochemistry, 41, 2075-2088.

136. Pike L.J. (2003) Lipid rafts: bringing order to chaos. Lipid Res, 44, 655-667.

137. Pike L.J. (2004) Lipid rafts: heterogeneity on the high seas. J. Biochem, 378, 281-92.

138. Pike L.J. (2005) Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: an evolving story. Biochim Biophys Acta, 1746, 260-73.

139. Pike L.J. (2009) The challenge of lipid rafts. J. Lipid Res., 50, 323-328.

140. Pierce S.K. (2002) Lipid rafts and B-cell activation. Immunol., 2, 96-105.

141. Pomorski T., Hrafnsdottir S., Devaux P.F., van Meer G. (2001) Lipid distribution and transport across cellular membranes. Semin Cell Dev Biol., 12, 139148.

142. Pralle A., Keller P., Florin E.-L., Simons K., Horber J.K.H. (2000) Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol, 148, 997-1007.

143. Qi J., Wang Y., Forgac M. (2007) The vacuolar (H+)-ATPase: subunit arrangement and in vivo regulation. J. Bioenerg Biomembr., 39 (5-6), 423-426.

144. Roy C.L., Wrana J.L. (2005) Clatrin- and non-clatrinmediated endocytic regulation of cell signaling. Molecular cell biology, 6, 112-126.

145. Saltiel A.R., Pessin J.E. (2003) Insulin signaling in microdomains of the plasma membrane. Traffic, 4, 711-716.

146. Sanchez S.A., Tricerri M.A., Gunther G., Gratton E. (2007) Laurdan Generalized Polarization: from cuvette to microscope, in: Mendez- VillasA., Diaz J. (Eds.), Modern Research and Educational Topics in Microscopy, Formatex, 10071014.

147. Saroussi S., Nelson N. (2009) The little we know on the structure and machinery of V-ATPase.JExp Biol. 212 (11), 1604-10.

148. Sengupta P., Baird B., Holowka D. ( 2007) Lipid rafts, fluid-fluid phase separation, and their relevance to plasma membrane structure and function. Semin. Cell Dev Biol., 18, 583-590.

149. Shah M.B., Sehgal P.B. (2004) Nondetergent isolation of rafts. J. Biochem., 378, 281-292.

150. Simons K., van Meer G. (1988) Lipid sorting in epithelial cells. Biochemistry, 27, 6197-6202.

151. Simons K., Ikonen E. (1997) Functional rafts in cell membranes. Nature, 387, 569-571.

152. Simons K., Toomre D. (2000) Lipid rafts and signal transduction. Mol. Cell Biol., 1, 31-39.

153. Simons K., Winchil L.C., Vaz W.L. (2004) Model system, lipid rafts, and cell membranes. Biophysics and Biomolecular Structure, 33, 269-295.

154. Singer S.J., Nikolson G.L. (1972) The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science, 175, 720-731.

155. Schuck S., Honsho M., Ekroos K., Shevchenko A., Simons K. (2003) Resistance of cell membranes to different detergents. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5795-5800.

156. Smart E.J., Ying Y.S., Mineo C., Anderson R.G. (1995) A detergent-freemethod for purifying caveolae membrane from tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 10104-10108.

157. Somerharju P., Virtanen J.A., Cheng K.H. (2009) The superlattice model of lateral organization of membranes and its implications on membrane lipid homeostasis. Biochim. Biophys. Acta, 1788, 12-23.

158. Stier A., Sackmann E. (1973) Spin labels as enzyme substrates. Heterogenous lipid distribution in liver microsomal membranes. Biochim. Biophys. Acta, 311, 400408.

159. Sudarikova A.V., Neguleaev Y.A., Morachevskaya E.A. (2006) Actin cytoskeleton disassembly affects conductive properties of strechfctivated cation channels in leukaemia cells. Biochim. Biophys. Acta, 1669, 53-60.

160. Tansey M. G., Baloh R. H., Milbrandt J., Johnson E. M. (2000) GFRa-mediated localization of RET to lipid rafts is required for effective downstream signaling, differentiation, and neuronal survival. Neuron, 25, 611-623.

161. Tavernier E. (1993) Lipid composition of the vacuolar membrane of Acer pseudoplatanus cultured cells. Biochim Biophys Acta, 1167(3), 242-24

162. Thorn M., Maretzki A., Komor E. (1982) Vacuoles from sugarcane suspension cultures. Isolation and partial characterization. Plant Physiol, 696, 13151319.

163. Thomas C.M., Smart E.J. (2008) Caveolae structure and function. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 12 (3), 796-809.

164. Toei M., Saum R., Forgac M. (2010) Regulation and isoform function of the V-ATPases. Biochemistry, 49 (23), 4715-4723.

165. Yoshida S., Uemura M. (1982) Lipid composition of plasma membrans and Tonoplast isolated from etiolated seedlings of Mung Bean. Plant Physiol, t807-812.

166. Veatch S.L, Keller S.L (2002) Organization in lipid membranes containing cholesterol. Phys Rev Lett., 89, 268101 (-1 )-268101 (-4).

167. Veatch S.L, Keller S.L. (2005) Seeing spots: complex phase behavior in simple membranes. Biochim Biophys Acta., 1746, 172-185.

168. Verkoek B., Haaz R., Wrage K., Linscheid M., Heinz E. (1983) Lipid and enzymatic activities in vacuolar membranes isolated via protoplast oat primary lieves. Z. Naturforsch, 38, 770-777.

169. Wagner G. (1981) Enzymes and protein character of tonoplast from Hippeastrum vacuoles. Plant Physiol., 68 (2), 499-503.

170. Wassail S.R., Stillwell W. (2009) Polyunsaturated fatty acid-cholesterol interaction: domain formation in membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1788, 24-32.

171. Tanida I. (2011) Autophagy basics. Microbiol Immunol, 55 (1), 1-11

172. Wheeler G., Tyler K. M. (2011) Widefield microscopy for live imaging of lipid domains and membrane dynamics. Biochim. Biophys. Acta., 1808(3), 634-641.

173. Zheng Y.Z., Boscher C., Inder K.R., Fairbank M.R., Loo D.R., Hill M.M., Nabi I.R., van Meer G., Voelker D.R., Feigenson G.W. (2008) Membrane lipids: where they are and how they behave. Mol. Cell Biol., 9 (2), 112-24.

174. Zhu D., Xiong W.C., Mei L. (2006) Lipid Rafts Serve as a Signaling Platform for Nicotinic Acetylcholine Receptor Clustering. The Journal of Neuroscience, 26 (18), 4841-4851.