Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Теория линейного натяжения и взаимодействия липидных доменов в бислойных мембранах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Теория линейного натяжения и взаимодействия липидных доменов в бислойных мембранах"

на правах рукописи УДК 577.3

АКИМОВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ТЕОРИЯ ЛИНЕЙНОГО НАТЯЖЕНИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИПИДНЫХ ДОМЕНОВ В БИСЛОЙНЫХ МЕМБРАНАХ

Специальность 03.00.02. - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2005

Работа выполнена в Институте электрохимии им А. Н. Фрумкина РАН Научные руководители:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук Юрий Александрович Чизмаджев

старший научный сотрудник Петр Иванович Кузьмин

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Константин Вольдемарович Шайтан

доктор физико-математических наук Сергей Иванович Мухин

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится « 1о » июня 2005 г в {0 час. 90 мин. на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте по адресу:

141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., д. 9, МФТИ. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ. Автореферат разослан « \ М »_ул 0 ^_ 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидаг физико-математических наук

В Е Брагин

мое- г езеу-

з ¿МШ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение. Актуальность проблемы. Мембранным белкам для эффективного функционирования, как правило, требуется специфическое липидное окружение, состав и физико-химические свойства которого резко отличаются от интегральных свойств и состава плазматической мембраны. В частности, с белками ассоциированы участки бислоя (домены), обогащенные холестерином и сфингомиелином. Эти домены стабильны, т е существуют длительное время, и перемещаются в мембране, как единое целое. В англоязычной литературе эти микродомены носят название рафт ("raft"), что означает «плот». Большой интерес к исследованию рафтов связан с тем, что они необходимы для протекания многих жизненно-важных процессов, таких как внутриклеточная передача сигналов, эндоцитоз, сортировка и доставка белков из аппарата Гольджи в плазматическую мембрану и т.п. Исследование свойств рафтов in vivo сильно затруднено, поскольку их размер крайне мал и составляет 10 - 100 нм. Однако в искусственных бислойных мембранах, близких по составу к клеточным, но не содержащих белков, в результате фазового перехода возникают холестерин-сфингомиелиновые домены микронного размера Такие домены могут быть исследованы современными экспериментальными методами и используются, хотя и с некоторыми оговорками, в качестве модели рафтов клеточной мембраны. В экспериментах на искусственных бислойных мембранах было установлено, что рафты имеют практически круглую форму, бислойны, и липид в них находится в жидком состоянии. Круглая форма рафта довольно быстро (за секунды) восстанавливается после ее возмущения, что говорит о том, что на границе рафта имеется существенное линейное натяжение. Кроме того, толщина рафтов на 0,5-1 нм превышает толщину окружающей их мембраны.

Согласно последним данным, полученным методом ЯМР, в искусственных системах также возникают рафты, размеры которых составляют 10 - 100 нм. Несмотря на большое число экспериментальных и теоретических работ, посвященных исследованию рафтов, физические механизмы, определяющие возникновение и динамику рафтоЕ

кЖКВ бЯ(Ш0ММ1)хМАр 1ак и в СИВДИОТСКА I

а о»

искусственных системах до сих пор не выяснены. Это обуславливает актуальность теоретического исследования данного явления.

Пространственное распределение рафтов в мембране определяется конкуренцией граничной энергии и энтропии. Рост рафтов в размере и образование макроскопической фазы приводят к уменьшению суммарной длины их границы. С другой стороны, уменьшение числа доменов энергетически невыгодно, поскольку ведет к уменьшению конфигурационной энтропии, которая, напротив, стремится максимально диспергировать систему Таким образом, вопрос о величине линейного натяжения и его зависимости от размера рафта является ключевым для описания фазового разделения как в биотогических, так и в модельных системах

Поскольку белки присутствуют в плазматической мембране в составе рафтов, возможность их кластеризации во многом зависит от того, каким образом рафты взаимодействуют между собой. В связи с этим исследование механизмов взаимодействия рафтов становится особенно актуальным. Имеющиеся экспериментальные данные, полученные в модельных системах, указывают на то, что на коротких расстояниях между рафтами проявляется отталкивание, затрудняющее их слияние. Выяснение условий и причин такой кинетической стабилизации является важным для описания процессов кластеризации мембранных белков.

Цель и задачи исследования. Работа посвящена расчету линейного натяжения и энергии взаимодействия рафтов. Именно эти физические характеристики в первую очередь определяют стабильность как индивидуальных рафтов так и их ансамблей. В связи с различием толщины рафта и окружающей мембраны вблизи границы рафта возникают механические деформации, направленные на сглаживание скачка толщины. Энергия этих деформаций дает «упругий» вклад в линейное натяжение. Механические деформации вблизи границ двух близкорасположенных рафтов определяют энергию их взаимодействия. Подобный подход, основанный на анализе мембранных структур с точки зрения теории упругости, ранее позволил выявить существенные закономерности таких процессов, как слияние и деление мембран, образование пор в липидны.ч, бислоях и т.п. В настоящей работе этот подход применяется в

наиболее общем случае учета трех возможных деформаций мембраны: наклона углеводородных хвостов липидных молекул к поверхности мембраны, латерального растяжения/сжатия и изгиба.

Линейное натяжение границы и энергия взаимодействия рафтов должны зависеть от разности толщины, а также от механических свойств рафта и окружающей мембраны: модулей упругости и спонтанной кривизны их монослоев. Одной из задач данной работы является анализ влияния этих параметров на свойства границы, в частности, на ее механическую стабильность. Получение зависимости энергии взаимодействия рафтов от указанных параметров и от расстояния между рафтами необходимо для выяснения возможных механизмов стабилизации их ансамбля. Особый интерес представляет зависимость энергии границы от радиуса рафта. Для рафтов, размер которых существенно превышает характерную длину распространения деформаций в мембране, граничная энергия линейно зависит от радиуса. Однако при малых размерах естественно ожидать отклонения от линейности, что может сказаться на поведении популяции рафтов малого размера. Исследование этого круга вопросов также является задачей данной работы.

Методы вычислений. Бислойная липидная мембрана имеет ярко выраженное различие физических свойств в латеральном и нормальном направлениях, т.е. обладает анизотропией. Это свойство роднит ее с жидкокристаллическими средами. В своих вычислениях мы использовали форму записи свободной энергии, предложенную Хэммом и Козловым (Hamm and Kozlov, 2000). В этом выражении для энергии учитываются деформация наклона углеводородных хвостов липидных молекул к поверхности мембраны, а также деформация изгиба. Кроме этих деформаций, мы учли также растяжение/сжатие мембраны в латеральном направлении. Вычисления проводились в приближении малых деформаций, причем мембрана рассматривалась как сплошная локально объемно несжимаемая среда Пространственные распределения деформаций находились через минимизацию функционала энергии при фиксированных граничных условиях. Необходимые численные расчеты производились на коммерческом программном обеспечении Maplesoft Maple 7.

Научная новизна. В настоящее время накоплен большой объем экспериментального материала о рафтах в самых различных системах. Адекватное теоретическое описание существенных закономерностей данных систем разработано не было. В настоящей работе для анализа системы «рафт-окружающая мембрана» впервые применяется теория упругости жидких кристаллов. Предлагаемый подход позволяет связать линейное натяжение и энергию взаимодействия рафтов с измеряемыми, либо контролируемыми экспериментально параметрами- механическими свойствами мембраны и спонтанной кривизной ее монослоев, которая, в свою очередь, определяется липидным составом. Ранее такая связь не была выявлена. В рамках данной теории впервые удалось получить зависимость линейного натяжения от размера рафта и объяснить стабильность ансамбля нанорафтов, как с кинетической, так и с термодинамической точек зрения.

Практическое значение работы. Практическая ценность работы заключается в разработке физической теории линейного натяжения на границе рафтов. Разработанный и примененный в диссертации подход может быть использован для описания и анализа широкого круга мембранных явлений, таких, как процессы слияния и деления мембран, образование пор в бислое и т.п. Вычисленное в работе линейное натяжение является необходимым параметром, используемым при анализе кинетики фазовых переходов в мембранах. Зависимость линейного натяжения от размера рафта позволит усовершенствовать кинетическую теорию первых стадий рафтообразования — нуклеации и независимого роста зародышей. Полученные в работе зависимости линейного натяжения и энергии взаимодействия рафтов от измеряемых или контролируемых параметров позволяют планировать будущие эксперименты и прогнозировать их результаты как в искусственных, так и в биологических системах. Разработанная теория позволяет систематизировать имеющиеся экспериментальные данные и обладает предсказательной силой.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на семинаре лаборатории биоэлектрохимии института электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН.

Публикации. За время работы над диссертацией опубликованы четыре статьи в международных и отечественных реферируемых журналах.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 174 страницах и иллюстрирована 36 рисунками. Диссертация состоит из введения, трех основных частей (девяти глав, включая обзор литературы), заключения и двух приложений. Список цитированной литературы содержит $2- наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Часть I. Обзор литературы.

Глава 1. Липидные и липид-белковые микродомены.

В этом разделе рассматривается литература, посвященная экспериментальным исследованиям рафтов в биологических и искусственных системах. Показана функциональная роль рафтов в таких важных клеточных процессах, как передача сигналов, эндоцитоз, накопление, сортировка и доставка белков из аппарата Гольджи в плазматическую мембрану и т.д. Особое внимание уделяется методам регистрации рафтов, в число которых входят: обработка мембран мягкими детергентами и выделение устойчивой к детергенту фракции; измерение коэффициента диффузии различных меток в составе рафта; флуоресцентная микроскопия; атомная силовая микроскопия; ядерный магнитный резонанс. Рассмотрены полученные этими методами физические свойства рафтов. Так, рафты являются жидкими, бислойными, обладают более упорядоченной структурой и большей толщиной, чем окружающая их мембрана. На границе рафта и окружающей мембраны имеется существенное линейное натяжение. При сближении двух рафтов между их границами, по-видимому, возникает короткодействующее отталкивание. Все приведенные свойства учитываются и используются при решении задач данной работы.

Глава 2. Механика мембран.

В этой главе рассматривается литература, посвященная теоретическим исследованиям механических свойств мембраны, как жидкокристаллической

системы Начала теории упругости жидких кристаллов заложены в классической работе Франка (Frank, 1958). Развитие и обобщение этого подхода применительно к мембранам представлено в работе Хельфриха (Helfrich, 1973). Однако в этой работе мембрана рассматривается как тонкая пленка, не имеющая внутренней структуры, и обладающая только изгибной жесткостью. Такое описание оказывается неадекватным для широкого круга явлений. Наличие у мембраны внутренней структуры приводит к необходимости введения дополнительной деформации — наклона углеводородных хвостов липидных молекул к поверхности мембраны. Кроме деформаций наклона и поперечного изгиба возможно растяжение/сжатие мембраны в латеральном направлении В этой же главе приводятся известные механические свойства мембран, обладающих более упорядоченной (рафты) и менее упорядоченной (окружающий бислой) внутренней структурой, а также рассмотрены некоторые теоретические исследования, использующие несоответствие толщины мембраны и различных включений для описания взаимодействия последних.

Часть II. Линейное натяжение и энергия взаимодействия в приближении прямой границы.

Этот раздел содержит описание вычисления линейного натяжения границы и энергии взаимодействия рафтов в приближении, что граница рафта и окружающей мембраны является прямой линией, вдоль которой система обладает трансляционной симметрией. Фактически это означает, что рассматриваются рафты достаточно большого размера.

Глава 1. Постановка задачи.

В этой главе сформулирована базовая модель работы, согласно которой основной вклад в линейное натяжение и энергию взаимодействия связан с тем, что толщина рафта отличается от толщины окружающей мембраны — модель несоответствия толщины. Если бы ориентация и длина липидных молекул вблизи границы была бы такой же, как и вдали от нее, на границе рафта существовал бы резкий скачок толщины, что приводило бы к контакту гидрофобной поверхности с водой на значительной площади. Энергия такого контакта была бы очень велика и соответствовала бы линейному натяжению ~

20—40 пН, в то время как экспериментальное значение составляет ~ 1 пН (Ваигт^аП е1 а1„ 2003).

Вблизи границы толщина рафта должна уменьшаться, а толщина окружающей мембраны — увеличиваться, за счет деформаций монослоев. Это приведет к росту энергии, связанному с деформациями, но одновременно и к уменьшению площади контакта гидрофобной и полярной сред. Упругие деформации будут сглаживать скачок толщины и минимизировать сумму упругой и гидрофобной энергий границы. Эта минимальная энергия на единицу длины границы рафта является «механической» частью линейного натяжения, которая в настоящей работе считается основной.

Когда в системе присутствует множество рафтов, деформации, вызываемые их границами, независимы, и соответствующие энергии аддитивны, если расстояние между ними достаточно велико. При сближении рафтов деформации перестают быть независимыми, и, начиная с некоторого расстояния, между рафтами появляется эффективное взаимодействие. В работе вычисляются линейное натяжение и энергия взаимодействия рафтов, обусловленные деформациями мембраны. Учитывается различие таких свойств рафта и окружающего бислоя, как толщина, упругие модули и спонтанная кривизна.

В Главе 1 также сформулированы основные предположения, в которых выполнены вычисления: 1) мембрана является сплошной локально объемно несжимаемой средой, обладающей зеркальной симметрией относительно границы раздела монослоев, которая считается плоской; 2) всеми остальными возможными вкладами в линейное натяжение, кроме механического, можно пренебречь. Заметим, что несмотря на то, что в данной модели не учитываются явно отличие межмолекулярных взаимодействий в рафте, окружающей мембране и на их границе, оно входит в расчеты косвенно поскольку взаимодействия молекул определяют различную равновесную толщину монослоев и их упругие модули. В работе рассматриваются только малые деформации наклона, изгиба и растяжения/сжатия, и энергия вычисляется во втором порядке по ним.

Для энергии деформаций, отнесенной к единице площади мембраны, в работе использовалось следующее выражение:

где п — проекция единичного вектора директора, характеризующего анизотропию элемента монослоя мембраны, на плоскость границы раздела монослоев; / = п - N — проекция вектора наклона, характеризующего отклонение директора п от вектора единичной нормали N к поверхности мембраны, на ту же плоскость; а — относительное локальное изменение площади мембраны; Л — спонтанная кривизна монослоя; В — модуль изгиба; К, — модуль наклона; Ка — модуль растяжения/сжатия монослоя. В силу трансляционной симметрии системы вдоль границы все деформации зависят только от координаты х, перпендикулярной границе. В работе явно учитывалась локальная объемная несжимаемость монослоев. Это условие связывает текущую толщину монослоя И с исходной равновесной толщиной И0 и испытываемыми деформациями:

где штрих обозначает производную по х. Монослои рафта и окружающей мембраны вдали от границы считались невозмущенными, а на границе сшивались, исходя из требований непрерывности директора и поверхности мембраны. Первое требование является следствием локальной объемной несжимаемости, т.е. постоянства плотности монослоя. Второе требование следует из того, что за счет деформаций несоответствие толщины компенсируется полностью, что доказывается в Приложении 1. Таким образом определяются граничные условия задачи.

Описан алгоритм вычисления линейного натяжения и энергии взаимодействия. Используя связь - И' и условие объемной

несжимаемости (2), можно выразить одну из трех деформаций через две оставшиеся. Вариация энергии по пространственному распределению этих двух деформаций при фиксированных граничных условиях в области рафта и в

И = Ип- -0- п - И„а,

'0-1

'0'

(2)

области мембраны приводит к системе дифференциальных уравнений Эйлера-Лагранжа. Решение системы содержит неизвестные постоянные коэффициенты, часть которых определяется из граничных условий. Оставшиеся коэффициенты находятся минимизацией по ним полной энергии, что эквивалентно условию отсутствия сил и моментов на границе.

Реализация этого алгоритма при учете всех трех деформаций в общем случае приводит к громоздким выражениям для энергий и распределений деформаций. В Главе 4 данная задача решена для практически важных частных случаев. В главах 2 и 3 линейное натяжение и энергия взаимодействия рафтов вычислены для пар деформаций — наклона и растяжения/сжатия (Глава 2), а также наклона и изгиба (Глава 3).

Глава 2. Деформации наклона и растяжения/сжатия.

В этом разделе линейное натяжение у и энергия взаимодействия рафтов W, вычисляются с учетом деформаций наклона и растяжения/сжатия согласно описанному в Главе 1 алгоритму. Полученные выражения приводятся ниже (в расчете на монослой):

S2

wfih-ir--j—, (4)

где 8=hr-h, — разность равновесных толщин монослоев рафта (hr) и фона (/г,) вдали от границы; ho ~ (hr + hs)/2 — средняя толщина монослоев рафта и окружающей мембраны; L — расстояние между границами взаимодействующих рафтов; верхний или нижний индекс «г» соответствует рафту (raft), а «5» — окружающей мембране (surround). Согласно экспериментальным данным, полученным на мембранах с большим содержанием холестерина, KJ > К/, однако неизвестно, в какой мере такие

мембраны моделируют механические свойства рафтов. Точное значение величины К' также неизвестно, но есть основания полагать, что К', « К,' (Hamm and Kozlov, 2000). В связи с этим линейное натяжение и энергия взаимодействия рассматриваются в двух предельных случаях: 1) «мягкий» (soft) рафт, называемый ниже s-рафт, KJ = Ка1 = 100 мН/м, К,г = К' = 40 мН/м, 2) бесконечно «жесткий» (perfectly rigid) рафт, называемый ниже рг-рафт, KJ » К J = 100 мН/м, К,г » К,1 = 40 мН/м. Зависимость линейного натяжения (в расчете на бислой) от величины несоответствия толщины 8приведена на рис ! Горизонтальная кривая соответствует экспериментально измерянному значению линейного натяжения ~ 1 пН (Baumgart et al., 2003). Это значение достигается при 8 ~ 1,5 А для рг-рафта и при 8 ~ 2,3 А для 5-рафта. Обе величины плохо согласуются с имеющимися экспериментальными данными.

2у, пН

Рисунок 1. Зависимость линейного натяжения границы рафта (в пиконьютонах) от величины несоответствия толщины 8 (в ангстремах) для случаев и рг-рафтов. Значения параметров: И, = 1,5 нм; для ¿-рафта: Каг = Ка* = 100 мН/м, К[ = К/ = 40 мН/м, для рг-рафта: К/ = 100 мН/м и К, = 40 мН/м.

На рис. 2 приведена зависимость энергии взаимодействия рафтов (в расчете на бислой) 2]У, от расстояния I между их границами для рассматриваемых предельных случаев.

Рисунок 2. Зависимость энергии взаимодействия рафтов (в пиконьютонах) от расстояния между их границами (в нанометрах) в расчете на единицу длины границы для случаев и рг-рафтов. Значения параметров как на рис. 1.

В случае промежуточной жесткости рафта значения у и IV, лежат между двумя предельными. Энергия взаимодействия отрицательна и монотонно убывает с уменьшением Ь, т.е. между рафтами действует сила притяжения. Следовательно, рафты должны самопроизвольно сливаться. Это действительно наблюдается в модельных системах. Однако в работе (Загшопоу е1 а!., 2001) обнаружено, что слияние рафтов происходит значительно реже, чем их столкновения, по-видимому, из-за короткодействующего отталкивания границ. Приведенный выше вид энергии взаимодействия (4) не позволяет объяснить этих экспериментальных данных, а также существования ансамблей малых рафтов в модельных и клеточных мембранах.

Глава 3. Деформации наклона и поперечного изгиба.

В этом разделе выведено выражение для энергии единицы площади деформированной мембраны с учетом наклона и изгиба применительно к рассматриваемому нами случаю малых деформаций практически плоской мембраны

(5)

которое является частным случаем выражения для энергии, полученного в работе (Hamm and Kozlov, 2000). Выражение (5) используется для вычисления

линейного натяжение у и энергии взаимодействия рафтов с учетом деформаций наклона и изгиба согласно описанному в Главе 1 алгоритму.

При учете этих деформаций выражение для линейного натяжения рафта (на один монослой) имеет вид:

В связи с тем, что точное значение Вг неизвестно, а определен только его возможный диапазон, в работе рассматривается несколько случаев соотношения упругих модулей рафта и окружающей мембраны: 1) «мягкий» s-рафт (Вг = В, = 10 кТ~ 4-10"20 Дж, АГ,Г = К' = 40 мН/м); 2) «средний» (Нгт)/-рафт — Br « 4В, = 40 кТ, К; = К," = 40 мН/м; 3) «жесткий» (rigid) г-рафт — Br * 4BS = 40 кТ, К[ = 4К' = 160 мН/м. Зависимость линейного натяжения (в расчете на бислой) от величины 8 приведена на рис. 3 для случая /-рафта. Линейное натяжение максимально при Jr = 0 (кривые 1-3). В этом случае величина спонтанной кривизны мембраны Js практически не влияет на у. Заметим, что при нулевых спонтанных кривизнах значение у для рассматриваемой пары деформаций почти в два раза ниже, чем при учете деформаций наклона и растяжения/сжатия для тех же <5(см. рис. 1), что значительно лучше согласуется с опытом (Baumgart et al, 2003). Таким образом, деформации изгиба более энергетически выгодна, чем деформация растяжения/сжатия. Кривые 2 и 3 для J, = ± 0,1 нм~' идентичны и почти совпадают с кривой 1 для Js = 0. Однако при Jr * 0 (кривые 4-6) ситуация изменяется. Когда Jr Ф 0 (J, = +0,1 нм~' для кривых 4-6), появляется область значений S, в которой линейное натяжение отрицательно. Это связано с тем, что монослой с ненулевой спонтанной кривизной имеет внутренние напряжения в исходном плоском состоянии. Наличие границы рафт/монослой приводит к росту энергии, связанному с несоответствием толщины S, однако одновременно энергия понижается за счет релаксации начальных напряжений.

(6)

»

2у, пН

-2

О

4

2

6

4

:, 3

О

2 3 4 5 6 7

8, А

Рисунок 3. Зависимость линейного натяжения У^рафта (в пиконьютонах) 01 величины 5 (в ангстремах) при различных значениях спонтанной кривизны Кривая 1 —Л = ^ = 0; кривые 2 и 3 — Jr = Q,Js = ±0,\ нм"1; кривая 4 — Jr = Js = +0,1 нм"'; кривая 5 — Jr- +0,1 нм"1, ./5 = 0; кривая 6 — Уг = +0,1 нм"1, .Л = -0,1 нм"1. Здесь и всюду ниже /г0 = 2 нм.

Когда 5= кг - невелико, выигрыш в энергии за счет релаксации перекрывает проигрыш, связанный с деформациями, направленными на компенсацию 6, и у оказывается отрицательным. В этом случае рафт оказывается нестабильным, если только различные молекулярные взаимодействия, не учитываемые в данной модели, не приведут к тому, что суммарное линейное натяжение окажется положительным. Иными словами, отрицательная часть линейного натяжения может оказаться скомпенсированной положительными вкладами других (химического, Ван-дер-Ваальсового, водородных связей и т д.) взаимодействий. Таким образом, в окрестности у = 0 используемая в работе модель становится неприменима.

В отличие от случая У, = 0, при Л * 0 величина влияет на у. Линейное натяжение максимально, когда знаки Уг и У, одинаковы (кривая 4) и минимально — когда они противоположны (кривая 6); у имеет промежуточное значение, когда ^ = 0 (кривая 5). Линейное натяжение определяет распределение рафтов по радиусам. Таким образом, возможен механизм регуляции появления, исчезновения и изменения размеров рафтов за счет локального изменения состава мембраны, что может иметь важное биологическое значение

В Главе 3 было получено, что распределение директора и форма

поверхности мембраны в переходной области вблизи границы изменяются не

монотонно, а осциллируют с затуханием. Наличие осцилляций связано с

деформацией поперечного изгиба при условии локальной объемной

несжимаемости липидного монослоя. При сближении рафтов их границы

начинают «конкурировать» за ориентацию директоров между ними, что

приводит к осцилляциям энергии двух рафтов величина IV зависит от

ртсстояния I между границами (рис. 4). Осцилляции приводят к появлению

энергетического барьера, который препятствует слиянию рафтов Заметим, что

слияние, тем не менее, энергетически выгодно, УУ(Ь = 0) < ЩЬ —» со), поскольку

при этом исчезают две границы рафтов и окружающего бислоя. /г, пН

Ь, нм

Рисунок 4 Зависимость энергии двух рафтов (на единицу длины границы, в пиконьютонах), разделенных полосой монослоя, от ширины полосы Ь (в нанометрах) для случая 5- (кривая I),/- (кривая 2) и г- (кривая 3) рафтов при Jr = JS = Q. Несоответствие толщины 5= 5 А.

В работе приведена оценка частоты столкновений рафтов, приводящих к слиянию:

где — мольная доля вещества рафтов в мембране; О — коэффициент диффузии рафта; Я — радиус рафта; / — эффективная длина границы, вдоль

которой взаимодействуют рафты, зависящая от /?; ЬМ — высота энергетического барьера. Величина ДЖ вычисляется в Главе 3 в приближении, что Л много больше характерной длины распространения деформаций Согласно этой оценке, среднее время ожидания слияния рафтов г ~ 1 / V составляет от 0,1 с для Д 1У = 2 пН до 1010 с для АУУ = 10 пН при Я ~ 10 им и -0,5. С увеличением Л время г резко возрастает. Высота барьера сложным образом зависит от параметров рафта и окружающей мембраны, в частности, от их спонтанной кривизны. Даже при незначительных изменениях высоты барьера характерное время ожидания слияния меняется существенно. Таким образом, отталкивание рафтов может приводить к кинетической стабилизации их ансамбля.

Глава 4. Деформации наклона, поперечного изгиба и растяжения/сжатия.

В этой главе линейное натяжение у вычисляется в самом общем случае наличия всех трех деформаций — наклона, поперечного изгиба и растяжения/сжатия — согласно описанному в Главе 1 алгоритму.

от величины несоответствия толщины 8 (в ангстремах), для случаев рг-рафта (кривая 1) и 5-рафта (кривая 3) при Л = У, = 0 Пунктирные кривые 2 и 3 соответствуют линейному натяжению рг- и 5-рафтов, вычисленному с учетом только деформаций наклона и изгиба (при Каг, Ка* -> со). Значения параметров для кривых 1 и 2: 5, = 10 кТ\ для кривых 3 и 4: В, = В1 = 10 кТ\. Значения остальных параметров, как на рис. 1.

Зависимость линейного натяжения от величины несоответствия толщины приведена на рис. 5 для 5- и рг-рафтов при нулевой спонтанной кривизне

Значение у - 1 пН достигается в диапазоне S от 2,7 до 4 А в зависимости от жесткости рафта, что согласуется с экспериментальными данными. Из графиков видно, что значения линейного натяжения, вычисленные с учетом трех деформаций, примерно в 1,5 раза меньше, чем для случая двух деформаций — наклона и поперечного изгиба (пунктирные кривые на рис. 5) при тех же значениях параметров. Эта разница связана с тем, что учет третьей деформации (растяжения/сжатия) дает дополнительную степень свободы при компенсации несоответствия толщины, что приводит к уменьшению энергии. Однако качественно результаты в этих двух случаях совпадают. В частности, форма мембраны в случае трех деформаций также оказывается осциллирующей с затуханием с незначительным изменением длины волны и длины затухания осцилляции. Энергетический барьер, препятствующий сближению двух рафтов, имеет место и при учете трех деформаций, хотя его высота несколько ниже.

Часть III. Рафт конечного размера.

Глава 1. Энергия границы рафта произвольного размера.

В этой главе вычисляется энергия границы рафта в соответствии с алгоритмом, описанным в Части II, обобщенным на случай рафта конечного размера. В этом случае система обладает цилиндрической симметрией относительно оси, проходящей через центр круглого рафта. Расчеты проводятся в тех же предположениях, что и в Части II работы. Ввиду показанного в четвертой главе второй части работы качественного совпадения результатов при учете всех трех деформаций и пары деформаций наклона и изгиба, энергия рафта конечного размера вычисляется с учетом только этой пары. Результаты этого раздела иллюстрируются в Главе 3 «Результаты и их обсуждение».

Глава 2. Распределение рафтов по размерам.

В этой главе найдено распределение рафтов по размерам в предположении, что рафт и окружающая его мембрана могут рассматриваться, как две несмешивающиеся жидкости. Считалось, что распределение по размерам определяется конкуренцией граничной энергии и энтропии. Распределение находилось, исходя из минимума свободной энергии, которая учитывает оба эти вклада. Постоянство суммарной площади рафтов Sr

учитывалось методом неопределенных множителей Лагранжа Значение множителя Лагранжа находилось численно в среде Maple 7. Предполагалось, что радиус рафта не может быть меньше некоторого минимального г„„„ Результаты получены численным расчетом, и проиллюстрированы графически в Главе 3.

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

В этой главе проиллюстрированы и проанализированы резутьгаты вычислений, описанных в предыдущих двух главах. На (рис. 6, а) приведена зависимость энергии границы W от радиуса рафтов при нулевой спонтанной кривизне. Из графиков видно, что Wявляется не линейной функцией радиуса, а осциллирует с затуханием около линейной, к которой асимптотически приближается при больших R. Величина у — WI(27tR) при R —» <я совпадает с линейным натяжением, полученным в приближении прямой границы (см. Часть

Рисунок 6. а — зависимость энергии границы рафта (в единицах кТ) от его радиуса (в нанометрах) для случаев г- (кривая 1),/- (кривая 2) и 5- (кривая 3) рафтов. б — соответствующие функции распределения рафтов по радиусам (в нанометрах). Jr = J5 = 0; здесь и всюду ниже г,„„, = 2 нм, = 10"7 м2.

Распределение рафтов по размерам при нулевой спонтанной кривизне (рис 6, б) имеет один пик в районе гт„. Это объясняется тем, что при У, = = О амплитуда осцилляций граничной энергии относительно мала, и распределение

по размерам определяется, в основном, энтропийным фактором. Однако характер распределения существенно изменяется при вариации величины Jr и .Л На рис 7, а для примера приведены зависимости энергии границы IV/- рафта от радиуса Я при Зг - +0.1 нм~' и = -0.1 нм~' для различных 8. Соответствующие функции распределения показаны на (рис. 7, б). При таких значениях параметров вид функции распределения качественно изменяется: практически исчезает пик в области гтт и одновременно возникает пик при /? ~ 6 нм, отвечающий минимуму граничной энергии при этом значении Я Наличие максимума функции распределения означает, что в системе появляется термодинамически стабильная популяция рафтов такого же среднего размера.

Рисунок 1а — зависимость энергии границы /-рафта (в единицах кТ) от его радиуса (в нанометрах) при 3= 0.56 нм (кривая 1), 0.58 нм (кривая 2) и 0.6 нм (кривая 3). Л = +0.1 нм"' и J, = -0.1 нм"' б — соответствующие функции распределения.

Этот результат качественно согласуется с имеющимися экспериментальными данными. Было показано, что в плазматической мембране культуры клеток ВНК-21 существуют стабильные белок-липидные рафты размером 26±13 нм (Pralle et al., 2000) Различие в размерах между нашей оценкой и результатом измерений не удивительно, так как мы рассматривали чисто липидные бислои. Наличие белка в составе рафта может существенно изменить зависимость граничной энергии от радиуса рафта, например, за счет несоответствия толщины между бислоем рафта и трансмембранным доменом белка Так, если

длина трансмембранного домена белка меньше толщины гидрофобной части бислоя, должна увеличиваться глубина четных минимумов граничной энергии — второго, четвертого и т.д., что, в свою очередь, приводит к появлению максимумов функции распределения, и, следовательно, возникновению популяций рафтов больших средних размеров.

Приложение 1. Непрерывность нейтральной поверхности на границе рафта.

В этом разделе доказывается, что возникающий на границе рафта скачок толщины мембраны и приводящий к экспонированию гидрофобной части мембраны в воду, настолько энергетически невыгоден, что полностью компенсируется за счет деформаций монослоев.

Приложение 2. Амплитуда тепловых флуктуации формы границы рафта.

Получена формула, связывающая средний квадрат отклонения радиуса рафта <ЗК2> вследствие тепловых флуктуации с величиной линейного натяжения /рафта радиуса /?:

Эта формула, в частности, позволяет экспериментально оценить упо амплитуде флуктуаций формы границы рафта.

Заключение. Здесь обсуждаются предположения и ограничения, использованные в работе.

1. Вычислено линейное натяжение рафта в модели мембраны как упругой среды с учетом деформаций растяжения/сжатия, изгиба и наклона углеводородных хвостов липидных молекул к поверхности мембраны при произвольных величинах упругих модулей и спонтанной кривизны

(8)

Выводы

монослоев. Полученные результаты объясняют наблюдаемую в модельных мембранах практически круглую форму рафтов. Найденные численные значения линейного натяжения (~1 пН при несоответствии толщины монослоев ~ 3,5 А) согласуются с экспериментальными данными.

2. Показано, что спонтанная кривизна, независимо от ее знака, приводит к уменьшению линейного натяжения. При достаточно больших, но экспериментально достижимых значениях спонтанной кривизны «упругая» составляющая линейного натяжения становится отрицательной, так что рафты не могут существовать, как самостоятельная фаза. Построена диаграмма механической стабильности рафта Диаграмма определяет границы применимости расчета линейного натяжения в модели мембраны, как упругой среды. Вне этой области становится необходим учет «химической» составляющей линейного натяжения.

3. Вычислена энергия взаимодействия рафтов достаточно большого размера, когда линейное натяжение не зависит от их радиуса. Показано, что на пути их сближения имеется энергетический барьер, приводящий к отталкиванию на малых расстояниях и препятствующий слиянию рафтов. Величина и знак спонтанной кривизны существенно влияют на взаимодействие рафтов: положительная спонтанная кривизна рафта и отрицательная — окружающей мембраны, приводит к увеличению энергетического барьера. При использовании известных из литературы значений физических параметров высота барьера (на единицу длины границы) оказывается достаточно большой (~ 2-10 пН), что позволяет объяснить наблюдаемую на опыте медленную коагуляцию крупных (~ 10 мкм) рафтов.

4. Вычислена граничная энергия наноскопических рафтов и функция их распределения по размерам. Показано, что при известных из опыта значениях параметров энергия рафта немонотонно зависит от его размера. При такой зависимости слияние рафтов может приводить не к уменьшению, а к увеличению их граничной энергии. Этот механизм приводит к

термодинамической стабилизации ансамбля нанорафтов, как в моле, чы>. так и в биологических мембранах.

Список публикаций

1. Akimov S. A, Kuzmin P. I., Zimmerberg J., Cohen F. S., Chizmadzhev Yu A., An elastic theory for line tension at a boundary separating two lipid monolayer regions of different thickness // Journal of Electroanalytical Chemistry, 2004 vol 564, p. 13-18.

2. С. А. Акимов, Ю. А. Чизмаджев, Дж. Циммерберг, Ф. С Kojh, П 11 Кузьмин, Линейное натяжение контакта двух плоских монослоев разной толщины // Биологические мембраны, 2004, том 21, № 2, с. 138-143

3. P. I. Kuzmin, S A. Akimov, Yu. A. Chizmadzhev, J. Zimmerberg, F S Cohen, Line Tension and Interaction Energies of Membrane Rafts Calculated from Lipid Splay and Tilt // Biophysical Journal, 2005, v. 88, p. 1120-1133.

4. С. А. Акимов, П. И. Кузьмин, Линейное натяжение границы рафт/фоновый монослой, вычисленное с учетом поперечного изгиба, наклона и растяжения/сжатия // Биологические мембраны, 2005, т. 22, №2, с. 137- 146.

Цитируемая ли гература

Baumgart Т., S Т. Hess, and W. W. Webb. 2003. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Nature 425 821-824

Frank F. C. 1958. On the theory of liquid crystals. Discuss. Faraday Soc 25:19-28

Hamm M. and M. M. Kozlov. 2000. Elastic energy of tilt and bending of fluid membranes. Eur. Phys. J. E. 3:323-335.

Helfrich W. 1973. Elastic properties of lipid bilayers: Theory and possible experiments. Z Naturforsch. 28c:693-703.

Pralle A., P. Keller, E.-L. Florin, K. Simons, and J. К. H. Horber. 2000. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells J Cell Bio! 148:997-1007.

Samsonov A. V., I. Mihalyov, and F. S. Cohen. 2001. Characterization of cholesterol-sphingomyelin domains and their dynamics in bilayer membranes Bioplhi J 81:1486-1500.

»10054

РНБ Русский фонд

2006-4 6367

АКИМОВ СЕРГЕЙ /

1ЕОРИЯ ЛИНЕЙНОГО НАТЯЖЬ _ .

ЛИПИДНЫХ ДОМЕНОВ в БИСЛОЙНЫХ МЕМБРАНАХ

Автореферат

Подписано в печать 29 04.05 Формат 60*90 Печать офсетная.Уел печать л 1 2 тираж 80 экч

Московский фи шка технический институт

(государственный университет) 141700,г Долгопрудный.Инстнтутский пер.9

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Акимов, Сергей Александрович

Введение

Часть I. Обзор литературы

Глава 1. Липидные и липид-белковые микродомены

Глава 2. Механика мембран

Часть II. Линейное натяжение и энергия взаимодействия в приближении прямой границы

Глава 1. Постановка задачи

Глава 2. Деформации наклона и растяжения/сжатия

Глава 3. Деформации наклона и поперечного изгиба

Глава 4. Деформации наклона, поперечного изгиба и растяжения/сжатия

Часть III. Рафт конечного размера

Глава 1. Энергия границы рафта произвольного размера

Глава 2. Распределение рафтов по размерам

Глава 3. Результаты и их обсуждение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Теория линейного натяжения и взаимодействия липидных доменов в бислойных мембранах"

Мембранным белкам для эффективного функционирования, как правило, требуется специфическое липидное окружение, состав и физико-химические свойства которого резко отличаются от интегральных свойств и состава плазматической мембраны. В частности, с белками ассоциированы участки бислоя (домены), обогащенные холестерином и сфингомиелином. Эти домены стабильны, т.е. существуют длительное время, и перемещаются в мембране, как единое целое. В англоязычной литературе эти микродомены носят название рафт ("raft"), что означает «плот». Большой интерес к исследованию рафтов связан с тем, что они необходимы для протекания многих жизненно-важных процессов, таких как внутриклеточная передача сигналов, эндоцитоз, сортировка и доставка белков из аппарата Гольджи в плазматическую мембрану и т.п. Исследование свойств рафтов in vivo сильно затруднено, поскольку их размер крайне мал и составляет 10 - 100 нм (Pralle et al., 2000). Однако в искусственных бислойных мембранах, близких по составу к клеточным, но не содержащих белков, в результате фазового перехода возникают холестерин-сфингомиелиновые домены микронного размера. Такие домены могут быть исследованы современными экспериментальными методами и используются, хотя и с некоторыми оговорками, в качестве модели рафтов клеточной мембраны. В экспериментах на модельных бислойных мембранах было установлено, что рафты имеют практически круглую форму, бислойны, и липид в них находится в жидком состоянии. Круглая форма рафта довольно быстро (за секунды) восстанавливается после ее возмущения, что говорит о том, что на границе рафта имеется существенное линейное натяжение. Кроме того, толщина рафтов на 0,5-1 нм превышает толщину окружающей их мембраны. Согласно последним данным, полученным методом ЯМР, в искусственных системах также возникают рафты, размеры которых составляют 10-100 нм.

Несмотря на большое число экспериментальных и теоретических работ, посвященных исследованию рафтов, физические механизмы, определяющие возникновение и динамику рафтов как в биологических, так и в искусственных системах до сих пор не выяснены. Это обуславливает актуальность теоретического исследования данного явления.

Распределение рафтов по размерам определяется конкуренцией граничной энергии и конфигурационной энтропии. Рост рафтов в размере и образование макроскопической фазы приводят к уменьшению суммарной длины их границы. С другой стороны, уменьшение числа доменов энергетически невыгодно, поскольку ведет к уменьшению конфигурационной энтропии, которая, напротив, стремится максимально диспергировать систему. Таким образом, вопрос о величине линейного натяжения и его зависимости от размера рафта является ключевым для описания фазового разделения как в биологических, так и в модельных системах.

Поскольку белки присутствуют в плазматической мембране в составе рафтов, возможность их кластеризации во многом зависит от того, каким образом рафты взаимодействуют между собой. В связи с этим исследование механизмов взаимодействия рафтов становится особенно актуальным. Имеющиеся экспериментальные данные, полученные в модельных системах, указывают на то, что на коротких расстояниях между рафтами проявляется отталкивание, затрудняющее их слияние. Выяснение условий и причин такой кинетической стабилизации является важным для описания процессов кластеризации мембранных белков.

Работа посвящена расчету линейного натяжения и энергии взаимодействия рафтов. Именно эти физические характеристики в первую очередь определяют стабильность как индивидуальных рафтов так и их ансамблей. В связи с различием толщины рафта и окружающей мембраны вблизи границы рафта возникают механические деформации, направленные на сглаживание скачка толщины. Энергия этих деформаций дает «упругий» вклад в линейное натяжение. Конкуренция механических деформаций, индуцированных границами двух близкорасположенных рафтов определяют энергию их взаимодействия. Подобный подход, основанный на анализе мембранных структур с точки зрения теории упругости, ранее позволил выявить существенные закономерности таких процессов, как слияние и деление мембран, образование пор в липидных бислоях и т.п. В настоящей работе этот подход применяется в наиболее общем случае учета трех возможных деформаций мембраны: наклона углеводородных хвостов липидных молекул к поверхности мембраны, латерального растяжения/сжатия и изгиба.

Линейное натяжение границы и энергия взаимодействия рафтов зависят от разности толщины, а также от механических свойств рафта и окружающей мембраны: модулей упругости и спонтанной кривизны их монослоев. Одной из задач данной работы является анализ влияния этих параметров на свойства границы, в частности, на ее механическую стабильность. Вычисление зависимости энергии взаимодействия рафтов от указанных параметров и от расстояния между рафтами необходимо для выяснения возможных механизмов стабилизации их ансамбля. Особый интерес представляет зависимость энергии границы от радиуса рафта. Для рафтов, размер которых существенно превышает характерную длину распространения деформаций в мембране, граничная энергия линейно зависит от радиуса. Однако при малых размерах естественно ожидать отклонения от линейности, что может сказаться на поведении популяции рафтов малого размера. Исследование этого круга вопросов также является задачей данной работы.

Работа состоит из введения, трех основных частей (девяти глав), заключения и двух приложений. Часть I содержит обзор литературы. Часть II посвящена вычислению линейного натяжения и энергии взаимодействия рафтов в приближении, что их размер намного превышает характерные длины распространения деформаций в мембране. В Части III линейное натяжение вычисляется в случае рафта произвольного размера. Теоретические результаты, полученные в настоящей работе, сопоставлены с экспериментальными данными.

Часть I. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Акимов, Сергей Александрович

Выводы

1. Вычислено линейное натяжение рафта в модели мембраны как упругой среды с учетом деформаций растяжения/сжатия, изгиба и наклона углеводородных хвостов липидных молекул к поверхности мембраны при произвольных величинах упругих модулей и спонтанной кривизны монослоев. Полученные результаты объясняют наблюдаемую в модельных мембранах практически круглую форму рафтов. Найденные численные значения линейного натяжения (~1 пН при несоответствии толщины монослоев ~ 3,5 А) согласуются с экспериментальными данными.

2. Показано, что спонтанная кривизна, независимо от ее знака, приводит к уменьшению линейного натяжения. При достаточно больших, но экспериментально достижимых значениях спонтанной кривизны «упругая» составляющая линейного натяжения становится отрицательной, так что рафты не могут существовать, как самостоятельная фаза. Построена диаграмма механической стабильности рафта. Диаграмма определяет границы применимости расчета линейного натяжения в модели мембраны, как упругой среды. Вне этой области становится необходим учет «химической» составляющей линейного натяжения.

3. Вычислена энергия взаимодействия рафтов достаточно большого размера, когда линейное натяжение не зависит от их радиуса. Показано, что на пути их сближения имеется энергетический барьер, приводящий к отталкиванию на малых расстояниях и препятствующий слиянию рафтов. Величина и знак спонтанной кривизны существенно влияют на взаимодействие рафтов: положительная спонтанная кривизна рафта и отрицательная — окружающей мембраны, приводит к увеличению энергетического барьера. При использовании известных из литературы значений физических параметров высота барьера (на единицу длины границы) оказывается достаточно большой 2-10 пН), что позволяет объяснить наблюдаемую на опыте медленную коагуляцию крупных (~ 10 мкм) рафтов.

4. Вычислена граничная энергия наноскопических рафтов и функция их распределения по размерам. Показано, что при известных из опыта значениях параметров энергия рафта немонотонно зависит от его размера. При такой зависимости слияние рафтов может приводить не к уменьшению, а к увеличению их граничной энергии. Этот механизм приводит к термодинамической стабилизации ансамбля нанорафтов, как в модельных, так и в биологических мембранах.

Заключение

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Акимов, Сергей Александрович, Москва

1. Ландау, Л. Д. и Е. М. Лифшиц. 1976. Теоретическая физика. Том V Статистическая физика. Москва, Наука, Главная редакция физико-математической литературы.

2. Ландау, Л. Д. и Е. М. Лифшиц. 1987. Теоретическая физика. Том VII Теория упругости. Москва, Наука, Главная редакция физико-математической литературы.

3. Bagatolli, L. A., and E. Gratton. 2000. Two photon fluorescence microscopy of coexisting lipid domains in giant unilamellar vesicles of binary phospholipid mixtures. Biophys. J. 78:290-305.

4. Bagnat, M., S. Keranen, A. Shevchenko, A. Shevchenko, and K. Simons. 2000. Lipid rafts function in biosynthetic delivery of proteins to the cell surface in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U SA. 97:3254-3259.

5. Baumgart, Т., S. Т. Hess, and W. W. Webb. 2003. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Nature. 425:821-824.

6. Bohinc, К., V. Kralj-Iglic, and S. May. 2003. Interaction between two cylindrical inclusions in a symmetric lipid bilayer. J. Chem. Phys. 119:7435-7444.

7. Brown, D. A., and E. London. 1998a. Function of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. 14:111-136.

8. Brown, D. A., and E. London. 1998b. Structure and Origin of Ordered Lipid Domains in Biological Membranes. J. Membr. Biol. 164:103-114.

9. Brown, D. A., and E. London. 2000. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol. Chem. 275:17221-17224.

10. Chapman, D. 1975. Phase transitions and fluidity characteristics of lipids and cell membranes. Q Rev Biophys. 8:185-235.

11. Chen, Z., and R. P. Rand. 1997. The Influence of Cholesterol on Phospholipid Membrane Curvature and Bending Elasticity. Biophys. J. 73:267-276.

12. Cohen, F. S., and G. B. Melikyan. 2004. The energetics of membrane fusion from binding, through hemifusion, pore formation, and pore enlargement. J. Membr. Biol. 199:1-14.

13. Dan, N., and S. A. Safran. 1998. Effect of lipid characteristics on the structure of transmembrane proteins. Biophys. J. 75:1410-1414.

14. Dietrich, C., L. A. Bagatolli, Z. N. Volovyk, N. L. Thompson, M. Levi, K. Jacobson, and E. Gratton. 2001a. Lipid Rafts Reconstituted in Model Membranes. Biophys. J. 80:1417-1428.

15. Edidin, M. 2001. Shrinking patches and slippery rafts: scales of domains in the plasma membrane. Trends Cell Biol. 11:492-496.

16. Edidin, M., S. С. Kuo, and M. P. Sheetz. 1991. Lateral movements of membrane glycoproteins restricted by dynamic cytoplasmic barriers. Science. 254:1379-1382.

17. Evans, E., and W. Rawics. 1990. Entropy-Driven Tension and Bending Elasticity in Condensed-Fluid Membranes. Phys. Rev. Lett. 64:2094-2097.

18. Filippov, A., G. Oradd, and G. Lindblom. 2004. Lipid Lateral Diffusion in Ordered and Disordered Phases in Raft Mixtures. Biophys. J. 86:891-896.

19. Fournier, J.-B. 1999. Microscopic membrane elasticity and interactions among membrane inclusions: interplay between the shape, dilation, tilt and tilt-difference modes. Eur. Phys. J. B. 11:261-272.

20. Frank, F. C. 1958. On the theory of liquid crystals. Discuss. Faraday Soc. 25:19-28.

21. Fuller, N., and R. P. Rand. 2001. The influence of lysolipids on the spontaneous curvature and bending elasticity of phospholipid membranes. Biophys. J. 81:243-254.

22. Gandhavadi, M., D. Allende, A. Vidal, S. A. Simon, and T. J. Mcintosh. 2002. Structure, composition, and peptide binding properties of detergent soluble bilayers and detergent resistant rafts. Biophys. J. 82:1469-1482.

23. Ge, M., K. A. Field, R. Aneja, D. Holowka, B. Baird, and J. Freed. 1999. Electron Spin Resonance Characterization of Liquid Ordered Phase of Detergent-Resistant Membranes from RBL-2H3 Cells. Biophys. J. 77:925-933.

24. Gelles, J., B. J. Schnapp, and M. P. Sheetz. 1988. Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision. Nature. 331:450-453.

25. Hamm, M., and M. M. Kozlov. 1998. Tilt model of inverted amphiphilic mesophases. Eur. Phys. J. B. 6:519-528.

26. Hamm, M., and M. M. Kozlov. 2000. Elastic energy of tilt and bending of fluid membranes. Eur. Phys. J. E. 3:323-335.

27. Harder, Т., P. Scheiffele, P. Verkade, and K. Simons. 1998. Lipid domain structure of the plasma membrane revealed by patching of membrane components. J. Cell Biol. 141:929-942.

28. Heerklotz, H. 2002. Triton Promotes Domain Formation in Lipid Raft Mixtures. Biophys. J. 83:2693-2701.

29. Helfrich, W. 1973. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z. Naturforsch. 28c:693-703.

30. Hunter, R. J. 2001. Foundations of colloid science. Oxford University Press,

31. Israelachvili, J. N., D. J. Mitchell, and B. W. Ninham. 1977. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochim Biophys Acta. 470:185-201.

32. Jacobson, K., and C. Dietrich. 1999. Looking at lipid rafts? Trends Cell Biol. 9:87-91.

33. Janes, P. W., S. C. Ley, and A. I. Magee. 1999. Aggregation of lipid rafts accompanies signaling via the T cell antigen receptor. J. Cell Biol. 147:447-461.

34. Kozlov, M. M. 2001. Fission of biological membranes: interplay between dynamin and lipids. Traffic. 2:51-65.

35. Kozlov, M. M., S. Leikin, and R. P. Rand. 1994. Bending, Hydration and Interstitial Energies Quantitatively Account for the Hexagonal-Lamellar-Hexagonal Reentrant Phase-Transition in Dioleoylphosphatidylethanolamine. Biophys. J. 67:1603-1611.

36. Kozlovsky, Y., and M. M. Kozlov. 2002. Stalk model of membrane fusion: Solution of energy crisis. Biophys. J. 82:882-895.

37. Kozlovsky, Y., and M. M. Kozlov. 2003. Membrane fission: model for intermediate structures. Biophys. J. 85:85-96.

38. Krauss, K., and P. Altevogt. 1999. Integrin leukocyte function-associated antigen-1-mediated cell binding can be activated by clustering of membrane rafts. J. Biol. Chem. 274:36921-36927.

39. Kuzmin, P. I., J. Zimmerberg, Y. A. Chizmadzhev, and F. S. Cohen. 2001. A quantitative model for membrane fusion based on low-energy intermediates. Proc Natl Acad Sci U SA. 98:723540.

40. Ladbrooke, B. D., R. M. Williams, and D. Chapman. 1968. Studies on lecithin-cholesterol-water interactions by differential scanning calorimetry and X-ray diffraction. Biochim Biophys Acta. 150:333-40.

41. Lawrence, J. C., D. E. Saslowsky, J. M. Edwardson, and R. M. Henderson. 2003. Real-time analysis of the effects of cholesterol on lipid raft behavior using atomic force microscopy, Biophys J. 84:1827-32.

42. Leikin, S., M. M. Kozlov, N. L. Fuller, and R. P. Rand. 1996. Measured effects of diacylglycerol on structural and elastic properties of phospholipid membranes. Biophys. J. 71:2623-2632.

43. Mabrey, S., and J. M. Sturtevant. 1976. Investigation of phase transitions of lipids and lipid mixtures by sensitivity differential scanning calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73:38623866.

44. MacKintosh, F. C., and Т. C. Lubensky. 1991. Orientational Order, Topology, and Vesicle Shapes. Phys. Rev. Lett. 67:1169-1172.

45. Makherjee, S., Т. T. Soe, and F. R. Maxfield. 1999. Endocytic Sorting of Lipid Analogues Differing Solely in the Chemistry of Their Hydrophobic Tails. J. Cell Biol. 144:1271-1284.

46. Markin, V. S., and J. P. Albanesi. 2002. Membrane fusion: stalk model revisited. Biophys. J. 82:693-712.

47. May, S. 2002. Membrane Perturbations Induced by Integral Proteins: Role of Conformational Restrictions of the Lipid Chains. Langmuir. 18:6356-6364.

48. May, S., and A. Ben-Shaul. 1999. Molecular theory of lipid-protein interaction and the L-alpha-H-II transition. Biophys. J. 76:751-767.

49. Mouritsen, O. G., and M. Bloom. 1984. Mattress Model of Lipid-Protein Interactions in Membranes. Biophys. J. 46:141-153.

50. Needham, D., T. J. Mcintosh, and E. Evans. 1988. Thermomechanical and Transition Properties of Dimyristoylphosphatidylcholine/Cholesterol Bilayers. Biochemistry. 27:4668-4673.

51. Needham, D., and R. S. Nunn. 1990. Elastic deformations and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol. Biophys. J. 58:997-1009.

52. Niggemann, G., M. Kummrow, and W. Helfrich. 1995. The bending rigidity of phosphatidylcholine bilayers dependences on experimental method, sample cell sealing and temperature. J. de Physique II. 5:413-425.

53. Ostermeyer, A. G., В. T. Beckrich, K. A. Ivarson, К. E. Grove, and D. A. Brown. 1999. Glycosphingolipids Are Not Essential for Formation of Detergent-resistant Membrane Rafts in Melanoma Cells. J. Biol. Chem. 274:34459-34466.

54. Pralle, A., P. Keller, E.-L. Florin, K. Simons, and J. К. H. Horber. 2000. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148:997-1007.

55. Ravetch, J. V., and R. A. Clynes. 1998. Divergent roles for Fc receptors and complement in vivo. Annu. Rev. Immunol. 16:421-432.

56. Rawicz, W., К. С. Olbrich, Т. Mcintosh, D. Needham, and E. Evans. 2000. Effect of chain length and unsaturation on elasticity of lipid bilayers. Biophys. J. 79:328-339.

57. Ren, J., S. Lew, J. Wang, and E. London. 1999. Control of the transmembrane orientation and interhelical interactions within membranes by hydrophobic helix length. Biochemistry. 38:59055912.

58. Rinia, H. A., M. M. E. Snel, J. P. J. M. van der Eerden, and B. de Kruijff. 2001. Visualizing detergent resistant domains in model membranes with atomic force microscopy. FEBS Lett. 501:92-96.

59. Rukmini, R., S. S. Rawat, S. C. Biswas, and A. Chattopadhyay. 2001. Cholesterol Organization in Membranes at Low Concentrations: Effects of Curvature Stress and Membrane Thickness. Biophys. J. 81:2122-2134.

60. Saffman, P. G., and M. Delbruck. 1975. Brownian motion in biological membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. 72:3111-3113.

61. Samsonov, A. V., I. Mihalyov, and F. S. Cohen. 2001. Characterization of cholesterol-sphingomyelin domains and their dynamics in bilayer membranes. Biophys. J. 81:1486-1500.

62. Sharma, P., R. Varma, R. C. Sarasij, Ira, K. Gousset, G. Krishnamoorthy, M. Rao, and S. Mayor. 2004. Nanoscale organization of multiple GPI-anchored proteins in living cell membranes. Cell. 116:577-89.

63. Sheets, E. D., D. Holowka, and B. Baird. 1999. Critical role for cholesterol in Lyn-mediated tyrosine phosphorylation of FcepsilonRI and their association with detergent-resistant membranes. J. Cell Biol. 145:877-887.

64. Siegel, D. P. 1993. Energetics of intermediates in membrane fusion: comparison of stalk and inverted micellar intermediate mechanisms. Biophys. J. 65:2124-2140.

65. Silvius, J. R. 2003. Fluorescence energy transfer reveals microdomain formation at physiological temperatures in lipid mixtures modeling the outer leaflet of the plasma membrane. Biophys J. 85:1034-1045.

66. Silvius, J. R., D. del Guidice, and M. Lafleur. 1996. Cholesterol at Different Bilayer Concentrations Can Promote or Antagonize Lateral Segregation of Phospholipids of Differing Acyl Chain Length. Biochemistry. 35:15198-15208.

67. Simons, K., and E. Ikonen. 1997. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387:569-572.

68. Spiliotis, E. Т., Т. Pentcheva, and M. Edidin. 2002. Probing for membrane domains in the endoplasmic reticulum: retention and degradation of unassembled MHC class I molecules. Mol. Biol. Cell. 13:1566-1581.

69. Tang, Q., and M. Edidin. 2003. Lowering the Barriers to Random Walks on the Cell Surface. Biophys. J. 84:400-407.

70. Veatch, S. L., and S. L. Keller. 2002. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Phys. Rev. Lett. 84:268101.

71. Veatch, S. L., I. V. Polozov, K. Gawrisch, and S. L. Keller. 2004. Liquid Domains in Vesicles Investigated by NMR and Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 86:2910-2922.

72. Weikl, T. R., M. M. Kozlov, and W. Helfrich. 1998. Interaction of conical membrane inclusions: effect of lateral tension. Phys. Rev. E. 57:6988-6995.

73. Yuan, С. В., J. Furlong, P. Burgos, and L. J. Johnston. 2002. The size of lipid rafts: An atomic force microscopy study of ganglioside GM1 domains in sphingomyelin/DOPC/cholesterol membranes. Biophys. J. 82:2526-2535.

74. Yuan, С. В., and L. J. Johnston. 2000. Distribution of ganglioside GM1 in L-alpha-dipalmitoylphosphatidylcholine/cholesterol monolayers: A model for lipid rafts. Biophys. J. 79:2768-2781.

75. Zhang, W., J. Sloan-Lancaster, J. Kitchen, R. P. Trible, and L. E. Samelson. 1998a. LAT: the ZAP-70 tyrosine kinase substrate that links T cell receptor to cellular activation. Cell. 92:83-92.

76. Zhang, W., R. P. Trible, and L. E. Samelson. 1998b. LAT palmitoylation: its essential role in membrane microdomain targeting and tyrosine phosphorylation during T cell activation. Immunity. 9:239-246.