Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Распределение электрического потенциала на границах липидных мембран

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, доктора физико-математических наук, Ермаков, Юрий Александрович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Электрическое поле в клеточных мембранах и их окрестности

1.1. Равновесие ионов вблизи мембран: модели и факты

1.1.1.Распределение потенциала на границах мембраны.

1.1.2. Основные соотношения модели Гуи-Чепмена.

1.2. Дипольный потенциал - связь со структурой липидных мембран.

1.2.1. Электрическое поле и молекулярная структура мембран.

1.2.2. Дипольный скачокэкспериментальные факты.

1.2.3. Гидрофобные и амфифильные ионы.

1.3. Цель, задачи и объекты исследования.

1.4. Методы регистрации граничного потенциала плоских бислоев.

1.4.1. Электрострикция и вязкоупругие свойства БЛМ

1.4.2. Метод компенсации внутримембранного поля.

1.5. Измерение электрокинетической подвижности и размеров липосом и субклеточных частиц.

1.5.1. Принцип регистрации и анализа автокорреляционной функции светорассеяния.

1.5.2. Метод кумулянтов и распределение частиц по размерам.

1.5.3. Регистрация микроэлектрофореза в суспензии липосом.

1.6. Неэлектрические методы.

1.7. Материалы и методы

ГЛАВА 2. Определение параметров равновесия ионов вблизи поверхности мембран.

2.1. Эмпирический подход в оценке параметров диффузной части электрического двойного слоя

2.1.1. Асимптотическое поведение поверхностного потенциала в смешанном индифферентном электролите.

2.1.2. Распределение потенциала вблизи поверхности,: точное решение и приближенные формулы

2.1.3. Положение плоскости скольжения, литературные данные и состояние проблемы.

2.2. Методы определения степени ионизации поверхности мембран в присутствии одновалентных ионов.

2.2.1. Изотерма связывания ионов в асимптотическом приближении.

2.2.2. Метод независимого определения параметров связывания.

2.2.3. Ионизация полярных групп фосфатидилсерина, литературные и собственные данные

2.3. Параметры связывания двухвалентных катионов и оценка положения плоскости скольжения

2.3.1. Взаимодействие двухвалентных катионов с цвитерионными и заряженными липидами, модельные представления и факты.

2.3.2. Мембраны из фосфатидилсерина, точка нулевого заряда.

2.3.3. Адсорбция бериллия и других двухвалентных катионов на мембранах из фосфатидилхолина.

2.3.4. Экспериментальная оценка положения плоскости скольжения.

2.3.5. Стехиометрия связывания, предположения и точность эксперимента.

2.4. Катионы с высоким сродством кфосфолипидам: условие материального баланса.

2.4.1. Взаимодействие бериллия и 3-валентных металлов с мембранами: биологическое значение, факты, проблемы.

2.4.2. Условие материального баланса в системе с сильно развитой поверхностью.

2.4.3. Эффект накопления индифферентных ионов разной валентности вблизи поверхности.

2.4.4. Определение констант связывания 3-валентных катионов, пример гадолиния.

ГЛАВА 3. Влияние неорганических ионов и амфифильных молекул на дипольную компоненту граничного потенциала

3.1. "Не экранируемый" граничный потенциал и компенсационный эффект при адсорбции амфифильных молекул.

3.1.1. Адсорбция АНС

3.1.2. Компенсационный эффект.

3.1.3. Модель Козлова-Маркина.

3.1.4. Лекарственные препараты.

3.2. Сравнение граничного и дзета потенциалов в присутствии одно и двухвалентных ионов.

3.2.1. Применение перфузии

3.2.2.Граничный и дзета потенциалы при фазовом переходе. 131 3.2.3 Электрокинетический изотопный эффект.

3.3. Скачок дипольного потенциала при адсорбции гадолиния.

3.3.1. Учет обеднения растворов гадолиния в опытах с суспензией липосом и плоскими БЛМ.

3.3.2. Связь дипольного потенциала с числом адсорбированных катионов.

3.3.3. Влияние состава мембран и рН электролита.

3.3.4. Роль фосфатидилсерина.

ГЛАВА 4. Влияние ионов на межмолекулярные взаимодействия липидов в бислое.

4.1. Анионы с разными хаотропными свойствами в липидных мультислоях.

4.1.1. Гидратация ионов и ряды Гофмейстера

4.1.2.Расклинивающее давление в липидных мультислоях.

4.1.3.Адсорбция ионов и период повторяемости мультислоев по данным рассеяния нейтронов

4.2. Влияние катионов на латеральное разделение фаз в бислое.

4.2.1. Температура основного фазового перехода и изотопный эффект. Литературные данные.

4.2.2. Липосомы из фосфатидилхолина в присутствии двухвалентных катионов.

4.2.3. Влияние ионов с высоким сродством на гетерогенность суспензии.

4.2.4. Термодинамические характеристики гидратированных катионов

4.3. Сжимаемость и Вольта потенциалы липидных монослоев

4.3.1. Сравнение липидных монослоев и бислоев, литературные факты.

4.3.2. Диаграммы сжатия и Вольта потенциалы монослоев в присутствии гадолиния. Влияние липидного состава.

4.3.3. Взаимодействие "голов" и "хвостов" фосфолипидов эмпирические уравнения состояния.

4.3.4. Свободная энергия заряженного монослоя. Теория и эксперимент.

4.3.5. Монослои фосфатидилхолина и фосфатидилсерина - качественный анализ данных.

4.4. Влияние ионов на поверхностное натяжение и сжимаемость липидных бислоев.

4.4.1. Измерение поверхностного натяжения плоских БЛМ в присутствии гадолиния.

4.4.2. Блокирование механочувствительных каналов и липидный матрикс.

ГЛАВА 5. Влияние полиэлектролитов на электрические и термодинамические свойства липидных мембран.

Введение в проблему.

5.1. Проницаемость и граничные потенциалы плоских БЛМ при адсорбции иммуноактивных поликатионов.

5.1.1. Проницаемость БЛМ в присутствии поликатионов с разной структурой боковых гидрофобных участков.

5.1.2. Граничные потенциалы при адсорбции поликатионов

5.1.3. Влияние поверхностного заряда и фонового электролита.

5.2. Обратимость структурных изменений в суспензии липосом

5.2.1. Данные дифференциальной сканирующей калориметрии.

5.2.2. Электрокинетические свойства и агрегация липосом.

5.2.3. Обратимость агрегации и структурных изменений.

5.3. Распределение электрического поля в слое полимера, адсорбированного на поверхности мембран. Теоретический анализ.

5.3.1. Постановка задачи

5.3.2. Линейное приближение.

5.3.3. Анализ численных решений.

5.3.4. "Толстый" и "тонкий" слой 239 Заключительные замечания 242 Выводы 243 Приложение 1. Анализ высших гармоник емкостного тока 245 Приложение 2. Нерешенные и "некорректные" проблемы корреляционной спектроскопии. 252 Приложение 3. Хромафинные гранулы в условиях гипер- и гипоосмотического лизиса.

Публикации автора по теме диссертации

Цитированная литература

Введение Диссертация по биологии, на тему "Распределение электрического потенциала на границах липидных мембран"

Изучение клеточных мембран и их поверхностных характеристик является одной из важнейших проблем биологической физики. Решение этой проблемы стимулирует развитие методов измерения электрических полей в самой мембране и ее ближайшей окрестности, в том числе и в области гликокаликса. Основную роль при этом играет ионное окружение, хотя в последние годы становится очевидным, что влияние неорганических ионов не исчерпывается эффектами заряжения поверхности. Некоторые из этих ионов могут принимать прямое участие в изменении структуры бислойной части клеточных мембран, которое оказывается существенным фактором для функционирования мембранных белков, для фармакологической активности и токсичности различных веществ. Наиболее интересными в этом отношении являются ионы лантанидов, имеющие высокое сродство к фосфолипидам и известные как блокаторы механочувствительных каналов. Последние играют важнейшую роль в осмотической устойчивости клеток и в поддержании тонуса сосудистой стенки кровеносных сосудов. Блокирование неорганическими ионами имеет общие черты для каналов самых разных клеток и опосредованно, по-видимому, изменениями в их липидном окружении. Однако участие в этом процессе липидного бислоя, его связь с составом мембран и адсорбцией ионов требуют существенного уточнения. Эти и многие другие задачи биофизики мембран делают актуальным совершенствование физических методов анализа взаимодействия с поверхностью клеточных мембран неорганических ионов, особенно с высоким сродством к фосфолипидам, и органических молекул с разным сочетанием ионизованных групп, а также изучение молекулярной природы индуцированных ими изменений в структуре липидного матрикса. Традиционные для биофизики экспериментальные модели - плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ), липосомы и липидные монослои, предоставляют уникальные возможности для решения таких задач.

Межфазный скачок потенциала в области границ мембраны с водными растворами, граничный потенциал, включает в себя падение потенциала в диффузной части электрического двойного слоя, и так 7 называемую дипольную компоненту потенциала, которая непосредственно связана со структурой границы, включающей ориентированные у поверхности молекулы воды, адсорбированные ионы, органические вещества и макромолекулы. Дипольная компонента потенциала может служить поэтому индикатором эффектов, в которых изменения ионного равновесия сопряжено с изменением структуры мембран. Физическим мотивом таких эффектов служат межмолекулярные взаимодействия в липидном бислое, а потому они должны отражаться на его термодинамических и механических характеристиках. В данном исследовании использованы экспериментальные методы и подходы, которые позволяют зарегистрировать соответствующие явления, дать им количественную оценку и сделать определенные выводы относительно их молекулярной природы.

ГЛАВА 1

Электрическое поле в клеточных мембранах и их окрестности

Представление об активной роли липидной компоненты биомембран во многих биохимических процессах получило в последние годы существенную экспериментальную поддержку. Это связано с разработкой тонких методов биохимии и молекулярной биологии, которые сделали доступными для детального анализа индивидуальные свойства мембранных белков. При этом оказалось, что функции этих белков во многих случаях связаны не только с их конкретной структурой, но также с химическим составом и физическими характеристиками окружающего их липидного матрикса. Причин здесь может быть несколько и многие из них хорошо известны. Так, гидрофобное окружение и фазовое состояние прилегающих к белкам липидов является существенным условием их конформационной подвижности в мембране. Для работы транспортных систем особенно важно наличие поверхностного потенциала мембран, который в свою очередь зависит от степени ионизации поверхности, прежде всего полярных групп липидов. Неорганические ионы являются, очевидно, непременным участником этих явлений, а некоторые из них существенным образом влияют на межмолекулярные взаимодействия в мембранах и значительные изменения в клеточных мембранах. На работе мембранных белков не может не отразиться и фазовое разделение липидов, инициированное, например, присутствием высокомолекулярных веществ, которые могут приводить к латеральной неоднородности мембран, появлению кластеров и перераспределению липидов между двумя сторонами мембраны. Этот неполный список эффектов приводит к предположению, что изменение структуры и физических свойств липидного бислоя может служить одним из механизмов регулирования биохимических процессов в клеточных мембранах.

Большая часть исследований, проведенные в данной работе, направлены на экспериментальное подтверждение и детализацию гипотезы, согласно которой весьма значимым для функционирования многих мембранных систем является изменение фундаментальных физических характеристик липидного бислоя, и прежде всего распределения заряда и электрического поля внутри мембраны и ее ближайшей окрестности. Достаточно очевидно, что распределение электрического потенциала в клеточных мембранах существенным образом влияет на транспорт через мембрану ионов и заряженных молекул. Такие процессы конечно зависят от разности электрических потенциалов между водными фазами с обеих сторон мембраны на достаточно большом удалении от ее поверхности. Однако эта разность далеко не всегда совпадает с падением потенциала внутри самой мембраны и, конечно, не отражает реальную довольно сложную структуру электрического поля в мембране и в области ее границ с водными растворами. В то же время именно это электрическое поле принимает непосредственное участие в транспортных процессах и влияет на функционирование мембранных белков.

Электрическое поле на границе мембран с водными растворами в значительной степени определяется взаимодействием ионов электролита с липидами, формирующими бислойные мембранные структуры. По этой причине многие поверхностные свойства биологических мембран изучаются в опытах с липосомами, плоскими бислойными липидными мембранами (БЛМ) и липидными монослоями. Эти объекты привлекательны еще и потому, что в отличие от биомембран их химический состав, плотность поверхностного заряда и другие существенные для электростатических взаимодействий условия контролируются достаточно просто, а методы их исследования взаимно дополняют друг друга. Однако ценность такого подхода намного шире. В опытах с липидными мембранами проявляются общие закономерности распределения электрического поля на границе раздела двух фаз. Скачок потенциала на этой границе, граничный потенциал, включает в себя диффузную часть двойного электрического слоя, т.е. падение потенциала в омывающем мембрану растворе. Значительная часть граничного потенциала имеет дипольную природу и непосредственно связана с молекулярной структурой границы, и, конечно представляет наибольший интерес. Для большинства объектов физической и коллоидной химии хорошо изучена лишь первая, диффузная компонента граничного потенциала, доступная для измерений электрокинетическими методами Достоверные сведения о дипольной компоненте граничного потенциала можно получить только при сочетании независимых измерений потенциала в разных плоскостях, параллельных границе раздела. Соответствующие методы были разработаны, в том числе и автором данной работы, именно для липидных мембран, которые предоставляют поэтому уникальную возможность для изучения связи структурных факторов с распределением граничного потенциала.

Развитие экспериментальных методов исследования липидных и клеточных мембран имеет достаточно любопытную и долгую историю. Особые физико-химические свойства липидов, обусловленные сочетанием у этих молекул гидрофобных и гидрофильных участков, привлекали внимание исследователей и без какой-либо связи с их биологической ролью. Достаточно упомянуть пионерские исследования монослоев из органических кислот А.Н.Фрумкина (см. главу 4). Однако наибольшее развитие подобные исследования получили после того, как была осознана биологическая роль липидов - основного структурного элемента клеточных стенок. Два важнейших обстоятельства послужили импульсом к разработке новых методов изучения биомембран. Прежде всего это предложенная Митчеллом идея, в которой образование трансмембранного градиента ионов прямо связывалось с энергозатратными транспортными процессами [Рубин,А.Б. (1987)]. Попытки ее экспериментального подтверждения стимулировали развитие техники формирования плоских бислойных липидных мембран (БЛМ), удобной для регистрации электрических потенциалов и проводимости мембран [Кругляков,П.M.et al. (1978)] [hbkob,B.r.et al. (1981); hbkob,B.r.et al. (1982)].

С другой стороны, значительный прогресс в понимании физических процессов на поверхности мембран был достигнут с использованием данных электрокинетических измерений в суспензии липосом. Целый цикл таких исследований был проведен Стюартом Маклафлиным с группой соавторов. Ему, в частности, принадлежит один из первых и подробный обзор электростатических явлений в биомембранах [McLaughlin,S. (1977)], а также ретроспективный обзор исследований в этой области [McLaughlin,S. (1989)]. Работы с его участием выполнены и представлены в публикациях настолько глубоко и детально, что они безусловно стали в ряд классических образцов научной литературы. Полученные им результаты сложились в солидный фундамент, на котором строятся современные представления об электростатике биомембран. Не случайно именно эти работы стимулировали многих исследователей к разработке методов и изучению электростатических эффектов с применением плоских липидных мембран. К их числу относятся исследования, проводимые в нашей лаборатории (см. например, монографии [Богуславский,Л.И. (1978)] [Маркин,В.C.et al. (1974)] и диссертации [Абидор,И.Г. (1986)], [Белая,М.Л. (1981)]) в том числе и автором данного труда. Предваряя более подробное изложение материала таких исследований в последующих главах, мы сформулируем здесь общий подход и модельное представление о распределении электрического поля на границах липидных и биомембран. В обзорную главу включены лишь самые общие сведения о межфазном потенциале и методах его исследования. В каждой из последующих глав содержится краткий обзор исследований и результатов, которые имеют прямое отношение к материалам главы. К сожалению при этом не всегда удавалось избежать повторений.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Ермаков, Юрий Александрович

ВЫВОДЫ

1. Предложен метод независимого определения констант равновесия и плотности центров связывания; дано количественное описание ионного равновесия в рамках модифицированной модели Гуи-Чепмена-Штерна для ионов, различающихся по сродству к фосфолипидам более, чем на четыре порядка. Показано, что адсорбция некоторых из них (СЮ"4, ТМА+) приводит к изменению не только поверхностного заряда, но и способности фосфолипидов к ионизации.

2. Обнаружены и количественно описаны электростатические, изотопные и калориметрические эффекты, вызванные взаимодействием ионов, заряженных молекул и полиэлектролитов с липидным бислоем: погружение амфифильных молекул в липидный бислой; изменение состояния примембранной воды в присутствии ионов с разными хаотропными свойствами; изменение ориентации полярных групп фосфолипидов при адсорбции многовалентных катионов, латеральная сегрегация липидов в бислое и трансмембранный перенос заряженных липидов (флип-флоп) в присутствии заряженных макромолекул.

3. В опытах с амфифильными молекулами (флуоресцентные зонды, некоторые противоопухолевые препараты, порфирины) обнаружен компенсационный эффект: граничный потенциал мембран почти не меняется с концентрацией фонового электролита. Развита модель, в которой этот эффект связан с погружением молекул в бислой.

4. Показано, что адсорбция на поверхности мембран лантанидов (1а , Ос! , УЬ ) и катионов Ве , в отличие от других многовалентных катионов (Мд2+, Са2+, №2+) характеризуется высоким сродством к фосфолипидам (константы связывания Ве2+ и Ос13+ с мембранами из фосфатидилхолина, соответственно, 400 и 103М"1 и фосфатидилсерина - 103и 5104М"1, и сопровождается значительным изменением дипольной компоненты граничного потенциала и механических характеристик мембран. Предложен механизм, в котором блокирующее действие этих катионов на механочувствительные каналы связывается с их влиянием

244 на структуру липидного матрикса и с особой ролью ионизованных молекул фосфатидилсерина.

5. Проведен анализ распределения электрического поля в модели гликокаликса, представленном в виде слоя ионизованного полимера вблизи заряженной поверхности мембраны. Показано, что решение уравнения Пуассона-Больцмана для профиля электрического потенциала существенно зависит от поверхностного потенциала внешней границы слоя \|/8, и критического значения этого потенциала \|/*, выраженного через основные параметры слоя - плотность объемного заряда Р и концентрации анионов, п и катионов п+.