Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Теоретическое исследование начальной стадии белок-индуцированного слияния мембран

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Теоретическое исследование начальной стадии белок-индуцированного слияния мембран"

На правах рукописи

! -т^-

\

Молотковский Родион Юлианович

ТЕОРЕ ТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НАЧАЛЬНОЙ СТАДИИ БЕЛОК-ИНДУЦИРОВАННОГО СЛИЯНИЯ МЕМБРАН

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

5 ДЕК 2013

Пущино-2013

005541838

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук Акимов Сергей Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Колесников Станислав Сергеевич

(зав. лаб. Молекулярной физиологии клетки ИБК РАН)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Защита диссертации состоится « 25 » декабря 2013 года в 15-30 часов на заседании Совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук, созданного на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, д. 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан« 25 » ноября 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор физико-математических наук, профессор Мухин Сергей Иванович

(зав. каф. Теоретической физики и квантовых технологий НИТУМИСИС)

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, лаборатория моделирования биомолекулярных систем.

кандидат физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Процесс слияния мембран играет важнейшую роль во многих биологических процессах, таких как экзоцитоз, оплодотворение, синаптическая передача и т.д (Evered and Whelan, 1984). Актуальность проблемы слияния мембран трудно переоценить; так, например, нервная деятельность поддерживается синаптической передачей возбуждений, которая реализуется при слиянии синаптических пузырьков с мембраной пресинаптического нейрона и выделении медиаторов в синаптическую щель. Изучить механизм слияния мембран в биологических системах трудно, поскольку соответствующая молекулярная машина включает множество белков, структура и функции которых недостаточно полно изучены (Jahn and Fasshauer, 2012). Подходом к решению проблемы явились исследования, проведенные на модельных мембранах, механизм слияния которых был установлен в 70-х годах (Leikin et ah, 1987; Chernomordik et al., 1987). Однако оставались сомнения в том, что этот механизм будет справедлив при слиянии биологических объектов. Огромную роль в решении проблемы сыграли исследования вируса гриппа, слияние которого с мембраной индуцирует всего один белок — гемагглютинин, структура эктодомена которого установлена с атомарным разрешением (Harris et al., 2006).

На основании экспериментальных данных предложена концепция, согласно которой слияние мембран происходит в несколько этапов (Chernomordik et al., 1987). Ключевым этапом является формирование сталка, — структуры, в которой контактные монослои мембран уже слились, а дистальные монослои — еще нет (Kozlov and Markin, 1983; Markin et al., 1984). Для того чтобы в системе из двух мембран образовался сталк, необходимо преодолеть энергетический барьер, связанный с деформацией и гидратационным отталкиванием мембран. Последнее обусловлено

отталкиванием слоев воды, ассоциированных с полярными головками липидов. Теоретические оценки показывают, что высота энергетического барьера как минимум на порядок превышает энергию, характерную для тепловых флуктуаций (Efrat et al., 2007). Это означает, что без дополнительного воздействия мембраны не сольются за разумное время в несколько секунд. В биологических системах таким воздействием являются специфические белки, называемые белками слияния. Белки слияния содержат домены, внедренные в обе сливающиеся мембраны. В настоящее время выдвинуты две гипотезы относительно механизма понижения высоты барьера белками (McMahon et al., 2010). Согласно первой гипотезе, белки слияния индуцируют в мембране ненулевую спонтанную кривизну. Согласно второй гипотезе, белковый комплекс изменяет свою конформацию и стягивает друг с другом домены, находящиеся в разных мембранах, в результате чего мембраны сближаются и сливаются. Под действием белков мембрана деформируется; энергия этих деформаций дает «упругий» вклад в энергетический барьер, который мембраны должны преодолеть на начальной стадии слияния. Кроме того, изменение формы мембран влияет на энергию гидрат-отталкивания между ними. Несмотря на большое число экспериментальных и теоретических работ, посвященных исследованию белков слияния (Martens and McMahon, 2008; Chernomordik and Kozlov, 2008, Jahn and Fasshauer, 2012), детальный механизм их функционирования до сих пор не выяснен. В частности, не ясен вклад двух механизмов: индуцирования спонтанной кривизны и прямого стягивания мембран. Выяснение механизма функционирования белков слияния является одной из важнейших задач биофизики мембран, поскольку позволяет определить способы воздействия на эти белки, в частности, блокирования начальной стадии вирусного слияния.

Поскольку слияние мембран в живых системах происходит достаточно быстро, энергетический барьер должен составлять несколько кТ, что сравнимо с величиной тепловых флуктуаций; его высота определяет скорость

течения всего процесса. Таким образом, вопрос о высоте энергетического барьера для перехода системы в состояние сталка и о влиянии на нее белков является ключевым для описания слияния мембран в биологических системах.

Цель и задачи работы. Целью работы является выяснение механизма инициализации белками слияния плотного контакта мембран на первой стадии процесса слияния. В соответствии с этим, решаются следующие задачи:

1. Расчет геометрических характеристик мембранной выпуклости, формирующейся под действием белков слияния, индуцирующих в ней ненулевую спонтанную кривизну.

2. Нахождение зависимости высоты энергетического барьера перехода в сталк от спонтанной кривизны, индуцируемой белками в мембране, и от усилия, которые белки к ней прикладывают.

3. Моделирование процесса формирования симметричного белкового комплекса из неупорядоченно расположенных единичных белков, опосредованного деформациями мембран.

4. Моделирование процесса порообразования и определение величины линейного натяжения кромки сквозной поры в липидном бислое.

Методы вычислений. Бислойная липидная мембрана имеет ярко выраженное различие физических свойств в латеральном и нормальном направлениях, т.е. обладает анизотропией. Это свойство роднит ее с жидкокристаллическими средами. В вычислениях использовалась форма записи свободной энергии, предложенная Хэммом и Козловым (Hamm and Kozlov, 2000). В этом выражении для энергии учитываются деформация наклона углеводородных хвостов липидных молекул к поверхности мембраны, а также деформация изгиба. Вычисления были проведены в приближении малых деформаций, мембрана считалась сплошной объемно несжимаемой средой. Пространственные распределения деформаций были

определены через минимизацию функционала энергии при фиксированных граничных условиях. Необходимые численные расчеты были произведены на программном обеспечении Maplesoft Maple 11, Ontario, Canada.

Научная новизна. Впервые обнаружена связь между изменением формы мембраны и известными из экспериментов и теоретических оценок параметрами белков слияния: их геометрическими размерами, индуцируемой спонтанной кривизной и усилием, прикладываемым к мембране. Также впервые систематически изучено влияние размеров сливающихся везикул на форму образующейся на мембране выпуклости. Впервые обнаружена и теоретически исследована зависимость высоты энергетического барьера первой стадии мембранного слияния от индуцируемой белками спонтанной кривизны и усилием, прикладываемым ими к мембранам. Впервые доказана необходимость кооперативного воздействия белков слияния на мембрану по двум механизмам — механизму индуцирования в мембране спонтанной кривизны и механизму силового воздействия — для существенного понижения высоты энергетического барьера образования сталка. Впервые методами теории упругости мембран описан процесс формирования симметричного комплекса из единичных белков слияния и стабилизация этого комплекса за счет деформаций мембраны. Также впервые методами теории упругости мембран исследовано изменение формы мембраны под действием единичных белков слияния и найдена зависимость этого изменения от их геометрических характеристик.

Практическое значение работы. Результаты исследования дают возможность разработать методы количественной оценки, позволяющие определить влияние белков слияния на процесс слияния мембран в начальной стадии. В частности, появляется возможность определить способы блокирования начальной стадии вирусного слияния. Вычисленная в работе высота энергетического барьера формирования сталка является необходимым

параметром, используемым при анализе кинетики слияния мембран. Зависимость высоты барьера от свойств белков слияния позволяет усовершенствовать кинетическую теорию первых стадий мембранного слияния — сведения мембранных выпуклостей и образования стапка. Полученные в работе зависимости энергетического барьера перехода в сталк от измеряемых или контролируемых параметров дают возможность планировать будущие эксперименты и прогнозировать их результаты как в искусственных, так и в биологических системах. Разработанная теория позволяет систематизировать имеющиеся экспериментальные данные и обладает предсказательной силой.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на российских и международных конференциях: конференция молодых ученых ИФХЭ РАН (Москва, 2010, 2011, 2012), семинар лаборатории биоэлектрохимии ИФХЭ РАН, а также на: 9th International Frumkin Symposium (Moscow, 2010), 56th Annual Meeting of American Biophysical Society (San-Diego, California, USA, 2012).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в восьми печатных работах, в том числе в трех статьях в отечественных реферируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, и иллюстрирована рисунками. Диссертация состоит из Введения, обзора литературы (часть I, главы 1 и 2), основной части (четыре части и 9 глав, включая результаты исследований и их обсуждение) выводов и списка литературы. Список цитированной литературы включает источника, из них 3. на русском языке и ¿^иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Часть I. Обзор литературы Глава 1. Слияние мембран

В этом разделе рассматривается литература, посвященная экспериментальным и теоретическим исследованиям слияния мембран. Анализируется, как на основе теоретических вычислений и экспериментов по электронной микроскопии можно сделать вывод о необходимости локального контакта мембран в области их слияния.

Слияние мембран протекает в несколько этапов. Важнейшим из этапов является образование сталка — мембранной структуры, в которой контактные монослои мембран уже слились, а дистальные монослои — еще нет. Чтобы из мембран образовался сталк, системе необходимо преодолеть энергетический барьер, связанный с деформацией и гидратационным отталкиванием мембран. Показывается, что высота энергетического барьера намного превышает величину, характерную для энергии тепловых флуктуации. Это означает, что без дополнительного внешнего воздействия мембраны не сольются за физически разумное время. В биологических системах таким внешним воздействием являются белки слияния. Далее рассматриваются наиболее хорошо изученные белки слияния, к которым относятся гемагглютинин (ГА) вируса гриппа, а также комплекс SNARE и синаптотагмин, участвующие в экзоцитозе синаптических везикул.

Глава 2. Механика мембран и ее приложения

В этом разделе сформулированы основные предположения теории упругости мембран, которые используются в дальнейшем при вычислениях. Средняя ориентация анизотропных липидных молекул описывается полем единичных векторов п, называемых директорами. Деформации и форму монослоя относят к некоторой так называемой разделяющей поверхности, параллельной внешней границе монослоя. Малое отклонение мембраны от исходного состояния можно представить как суперпозицию деформаций

изгиба, наклона и растяжения/сжатия. Деформация изгиба количественно описывается дивергенцией директора вдоль разделяющей поверхности, div(n), а деформация наклона описывается вектором наклона t = n/(nN) - N » п - N. Деформация растяжения/сжатия характеризуется относительным изменением площади разделяющей поверхности, равным (а - а0)/а0, где а и а0 — площадь поверхности до и после деформации. Свободная энергия участка монослоя мембраны вычисляется в квадратичном приближении по малым деформациям. Далее в главе рассматриваются работы, в которых применяется разработанная теория. Показано, что представления о мембране как об упругой сплошной среде с успехом применяются для описания различных явлений, в частности, слияния и деления мембран, а также взаимодействия различных мембранных включений, опосредованного деформациями.

Часть II. Форма мембраны в приближении кольцевой розетки слияния

Вычислено изменение формы мембраны под действием симметричного комплекса белков, индуцирующих спонтанную кривизну. Предполагается, что структура комплекса стабилизирована за счет деформаций мембраны или белок-белковых взаимодействий.

Глава 1. Постановка задачи

Рассмотрены два механизма воздействия белков слияния на мембрану (McMahon, et al., 2010). Согласно первому механизму, белки слияния локально искривляют мембрану за счет неглубоких внедрений в мембрану, что равносильно индуцированию в мембране ненулевой спонтанной кривизны. Согласно второму механизму, при слиянии белковые молекулы меняют свою конформацию и передают усилие через трансмембранный домен непосредственно на мембрану. При этом мембрана рассматривается как однородная тонкая пленка, т.е. не учитывается наличие в ее составе двух различных монослоев. Кроме того, при вычислении энергии не учитывается деформация растяжения/сжатия в силу относительно большой величины

соответствующего модуля. В этом случае поверхностная плотность энергии деформированного участка может быть записана в виде:

Здесь В — монослойный модуль изгиба, К, —модуль наклона, ^ — спонтанная кривизна монослоя. Свободная энергия системы получается в результате интегрирования выражения (1) по поверхности мембраны.

Далее в общем случае описан алгоритм нахождения равновесной формы мембраны и изменения ее свободной энергии в процессе слияния. Изменение свободной энергии системы представлено в виде функционала на функциях, определяющих геометрию мембраны. Варьирование функционала энергии приводит к системе дифференциальных уравнений Эйлера-Лагранжа. Решения этих уравнений содержат неопределенные коэффициенты, которые определяются минимизацией с учетом граничных условий. Сначала на систему накладываются граничные условия, определяемые геометрией системы, из них находится часть коэффициентов. Затем энергия минимизируется по оставшимся коэффициентам. В итоге получается равновесная энергия как функция геометрических параметров системы.

Глава 2. Изменение формы и кривизны мембраны под действием белков, индуцирующих спонтанную кривизну, с учетом одной деформационной моды

Вычислено изменение формы мембраны и ее свободной энергии под действием белков, индуцирующих спонтанную кривизну. Белки слияния моделируются как участки мембраны с положительной спонтанной кривизной У0. Возникновение в мембране таких участков приводит к ее деформации и к связанному с этим изменению свободной энергии. Предполагается, что начальное состояние мембраны представляет собой сферу заданного радиуса Яс. Затем на мембрану адсорбируется белковое

(1)

кольцо шириной 2R0 при радиусе R], При этом учитывается лишь упругий вклад в свободную энергию. Предполагается, что мембрана деформируется только в сферическом сегменте радиуса Яг > Rt. Изменение свободной энергии мембраны при этом равно разности упругих энергий сегмента радиуса W = fV2 - где И\ — энергия невозмущенного сферического сегмента с адсорбированным на него белковым кольцом, IV2 — энергия сегмента, деформированного белками. Энергии W\ и W2 отсчитываются от плоского состояния. Для возможности сравнения различных состояний системы с одной и той же спонтанной кривизной необходимо, чтобы площадь белкового кольца была одинакова. Постоянство площади при изменении

5

радиуса Л, означает, что ^ = —, где S0 = const.

Вводится цилиндрическая система координат с осью Or, лежащей в плоскости а, отделяющей рассматриваемый сегмент от остальной сферы и осью Oz, направленной перпендикулярно а. Симметрия задачи позволяет считать ее эффективно одномерной, т.е. считать, что все величины зависят только от координаты г. Для расчета энергии деформаций бислоя мембраны применено выражение (Helfrich, 1973):

Здесь ./ — полная кривизна мембраны в данной точке, 3, — спонтанная кривизна, Во — бислойный модуль изгиба, аК — элемент площади поверхности мембраны. Поскольку деформации предполагаются малыми, интегрирование по поверхности мембраны заменимо интегрированием по проекции поверхности мембраны на плоскость а, отклонения мембраны от которой предполагаются малыми. Применением алгоритма, описанного в главе 1, вычисляется свободная энергия системы и зависимость равновесной формы мембраны от радиуса белкового кольца. Для удобства положение

(2)

мембраны отсчитывается от ее положения в невозмущенном сферическом состоянии, согласно выражению

я(г)=А,(Г)-л/^7+ДГ1^- (3)

Получающаяся выпуклость характеризуется высотой и кривизной. Высота выпуклости определяется как положение мембраны Н{г) при г - О, т.е. Я, = h¡(0)-Rc + - 2. Также вычисляется относительная кривизна выпуклости, т.е. кривизна вьшуклости, отсчитываемая от кривизны сферы, равной 1!ЯС. Наибольший интерес представляет влияние спонтанной кривизны /о на отклонение формы мембраны от равновесного состояния. Кроме того, получена зависимость формы мембраны от радиуса белкового кольца Ль Эта зависимость представлена на рис. 1 для спонтанной кривизны У0 = 0.1 им"' (а) и 70 = -0.1 нм"1 (б). Остальные параметры, кроме радиуса К2, одинаковы в обоих случаях: Яс = 100 нм, 50 = 10 нм2.

Рис. 1. Форма мембраны Н(г), отсчитанная от состояния сферы и рассчитанная при разных значениях радиусов белкового кольца Ли для случаев: а — положительной, и 6 — отрицательной спонтанной кривизны белкового кольца Кривые построены для R\ = 5, 10, 15 и 20 нм. Области мембраны с белком выделены жирной линией. В первом случае (а) высота выпуклости монотонно уменьшается с ростом Ri, во втором случае (б) — монотонно увеличивается. Параметры: So = 10 нм2, Rc - 100 нм. В первом случае (а) радиус R2 принимает значения 19.5,20.0,21.5 и 23.5 нм; во втором случае — 14.5,14.0, 16.0 и 20.6 нм.

Из графиков видно, что большую и сильно искривленную выпуклость можно получить только в том случае, если белки слияния индуцируют в мембране отрицательную спонтанную кривизну, в случае же положительной спонтанной кривизны выпуклость получается вогнутой вниз. Далее, как следует из полученных графиков, радиус сшивки со сферой Кроме

того, из постановки задачи следует, что Ло « Разложение в ряд по соответствующим малым параметрам позволяет получить компактное выражение для высоты выпуклости На и ее кривизны

* АКС 0 Л, 2

_ Д;-/?| 5Я, -ЗЛ,

ял 0 0 Д3 ■

(4)

Полученные аналитические формулы дают хорошее количественное соответствие с численными расчетами при отрицательном значении У0 и удовлетворительное — при положительном значении Из формул (4) следует, что уменьшение спонтанной кривизны белков приводит к увеличению высоты и кривизны выпуклости. Кроме того, уменьшение радиуса сферы Яс, т.е. увеличение моментов, приложенных к системе, приводит к увеличению высоты и кривизны выпуклости вне зависимости от знака спонтанной кривизны ./о- Анализ зависимости упругой энергии системы от радиуса /?] показывает, что белковое кольцо стремится увеличить свой радиус. В случае больших значений формулы (4) допускают дальнейшее упрощение и могут быть приведены к виду

//^-ЛА, (5)

Из соотношений (5) следует, что при положительной спонтанной кривизне белкового кольца выпуклость имеет постоянную отрицательную высоту и отрицательную кривизну, стремящуюся к нулю при Л] —» со. Появление в такой выпуклости гидрофобных дефектов, необходимых для формирования сталка, представляется маловероятным. Поэтому можно сделать вывод, что в рамках данной модели индуцирование положительной спонтанной кривизны белками недостаточно для образования сталков.

В качестве усложнения модели рассмотрен случай абсолютно жестких белков. Тогда средняя кривизна области мембраны с адсорбированными на ней белками не может отличаться от спонтанной кривизны индуцируемой белками. Однако в этом случае в пределе больших значений получаются те же формулы (5). Таким образом, учет жесткости белков ситуацию принципиально не меняет.

Глава 3. Изменение формы и кривизны мембраны под действием белков, индуцирующих спонтанную кривизну, при учете двух деформационных мод

Приводятся вычисления, аналогичные вычислениям в главе 2, с учетом не одной, а двух деформационных мод — изгиба и наклона. В результате получаются зависимости относительной кривизны и высоты выпуклости от для различной спонтанной кривизны, индуцируемой белками слияния в кольцевой области контактного монослоя (рис. 2).

Рис. 2. Зависимости относительной кривизны (а) и высоты (б) выпуклости от радиуса белкового кольца при разных значениях спонтанной кривизны Л контактного монослоя. В обоих случаях нижний правый график соответствует У„ = О, средний правый график — ^ = 0.1 нм"1, верхний правый график — Л = 0.15 нм"1. Значения остальных параметров: Вс = 100 им, 50= 10 им2.

Как видно из представленных графиков, кривизна выпуклости отрицательна при всех значениях а высота выпуклости положительна только при Л] < 10 нм. В области больших величин кривизна стремится к нулю снизу, а высота уменьшается.

Таким образом, как следует из полученных зависимостей, ни при каких рациональных значениях параметров белки, индуцирующие в мембране положительную спонтанную кривизну, не способны создать в центре мембраны выпуклость существенной кривизны. Это означает, что такие белки сами по себе не помогают мембране преодолевать энергетический барьер для образования сталка. Поэтому в дальнейшем рассматривается возможность приложения белками механического усилия непосредственно к мембране.

Часть III. Вычисление высоты энергетического барьера формирования сталка

В данном разделе производится вычисление высоты энергетического барьера, который необходимо преодолеть системе из двух мембран и белков слияния, чтобы контактирующие монослои двух мембран слились. Определяется зависимость энергетического барьера от величин спонтанной кривизны и развиваемого белками усилия.

Глава 1. Введение

Описываются различные факторы, учитывающиеся при вычислении энергетического барьера перехода в сталк. К ним относятся: энергия деформации мембран, гидратационное отталкивание между мембранами, притяжение гидрофобных дефектов, энергия, связа1шая с работой белков слияния и энергия, связанная с гауссовой кривизной. Энергия гидратационного отталкивания вычисляется по формуле

w, = Р0Ц

ехр

& .

dS, (6)

где г(г) — расстояние между мембранами как функция радиальной координаты г, и — константы, определяемые экспериментально.

Энергия притяжения гидрофобных дефектов равна 1айжр'

1-ехр

I

- Ы

,где£

— характерная длина гидрофобного притяжения, / — расстояние между

гидрофобными дефектами, р — радиус дефектов, а0 — натяжение на границе

вода-масло. Гауссова энергия, связанная с разностью значений директора на

2

границе с дефектом и на бесконечности, дается формулой =-лКа—т, где

п

Ка — соответствующий упругий модуль, а И — толщина монослоя мембраны. Также кратко описывается последовательность действий для вычисления высоты барьера.

Глава 2. Зависимость высоты энергетического барьера формирования сталка от числа белков в кольце

Вычисляется энергетический барьер формирования сталка для двух мембран с внедренными в них одинаковыми белками, находящимися на небольшом расстоянии друг от друга; описывается система и процедура нахождения барьера. Далее находится зависимость параметров барьера от совокупного белкового усилия А при разных значениях совокупной спонтанной кривизны белкового кольца. Также для большей наглядности результатов находится зависимость параметров барьера от числа белков N в белковом кольце. При этом мы считаем, что величины А и Л пропорциональны N.

Рис. 3 .а — зависимость высоты энергетического барьера от величины суммарного усилия А, приложенного белковыми молекулами к мембране. Параметром графиков является величина спонтанной кривизны Уо, индуцированной белковым кольцом в контактном монослое мембраны. Для верхнего графика Л> = 0.12 нм"1; для среднего /о = 0.2 нм"1; для нижнего Уо - 0-47 нм"1. б — зависимость высоты энергетического барьера от числа молекул белка Параметром графиков является усилие Ао, развиваемое одним белком. Треугольниками отмечены точки, соответствующие Ац = 10 кТ/ни; кружками — точки, соответствующие Ао - 50 кТ/нм; квадратами — точки, соответствующие Ао = 100 кТ/нм. Константа гидратационного отталкивания Ра для обоих графиков равна 25 кТ1нм3.

Зависимость высоты барьера от величины суммарного белкового усилия А при разных значениях спонтанной кривизны белка ./о представлена

на рис. 3 а. Зависимость высоты барьера от числа белков представлена на рис. 3 б. Как следует из представленных графиков, вне зависимости от величины спонтанной кривизны У0 при достаточно больших значениях А барьер уменьшается, т.е. переход мембраны в состояние сталка происходит спонтанно. С другой стороны, при заданном значении усилия А барьер уменьшается с ростом спонтанной кривизны J0. Также из приведенных графиков следует, что при небольшом числе белков (а, следовательно, и при небольшой спонтанной кривизне, индуцируемой белками) вне зависимости от усилия А0, создаваемого одним белком, барьер понижается очень слабо.

Глава 3. Зависимость высоты энергетического барьера формирования сталка от начальной кривизны мембраны

Рассматривается зависимость высоты энергетического барьера формирования сталка от начальной кривизны мембран в системе, состоящей из двух одинаковых сферических везикул радиуса Rc каждая. Белковые кольца в везикулах фиксируются на расстоянии R\ от центра выпуклости; предполагается, что белки не индуцируют спонтанную кривизну в мембранах, а только прикладывают к ним стягивающее усилие. В вычислениях фиксируется радиус Rc везикул и определяется зависимость высоты энергетического барьера от силового воздействия белков. Радиус R\ и размер Ro белкового кольца фиксированы; их значения принимаются равными соответственно 8.5 нм и 2 нм. Варьируя радиус R„ можно определить влияние кривизны мембраны на высоту барьера.

Из результатов расчетов следует, что высота энергетического барьера уменьшается с ростом кривизны сливающихся мембран, равной 2/Rc- Это подтверждает тезис, часто встречающийся в литературе (Frolov and Zimmerberg, 2010): чем больше начальная кривизна мембран, тем легче идет слияние. В цитированной работе этот тезис подкреплен качественной оценкой, в данной же работе он обоснован физическим расчетом.

Часть IV. Формирование розетки белков слияния

Описывается формирование симметричной розетки белков слияния из неупорядоченно расположенных единичных белков. Рассмотрен частный случай белков, прикладывающих к мембране усилие и не индуцирующих спонтанную кривизну. Показано, что в определенных условиях такие белки могут самооргаиизовываться в симметричную структуру.

Глава 1. Введение

Рассмотрены две гипотезы относительно сил, удерживающих белки слияния в симметричном комплексе. Согласно первой гипотезе, эти силы обусловлены специфическими белок-белковыми взаимодействиями. Согласно другой точке зрения, взаимодействие белков опосредовано упругими деформациями мембраны: белкам выгодно принять симметричную конфигурацию, поскольку в ней минимизируется энергия деформаций мембраны. В представленной модели не учитывается прямое белок-белковое взаимодействие между белками слияния, хотя возможность этого не отрицается; в реальности оно может оказывать дополнительный агрегирующий эффект.

Глава 2. Стабилизация розетки слияния из нескольких белков

Показано, что деформации мембраны, возникающие в ней в результате внедрения нескольких белков, сами по себе могут привести к формированию из белков структуры, обладающей кольцевой симметрией. Для этого сначала следует рассмотреть единичный белок, внедренный в плоскую мембрану на глубину бислоя, и найти деформацию мембраны, возникающую при наклоне такого белка, а затем рассмотреть случай двух белков. В работе делается предположение, что, кроме наклона относительно вертикали на угол Т, каждый из белков поворачивается на угол а1 (/ = 1, 2) против часовой стрелки относительно линии, соединяющей белки. Эти два угла задают ориентацию белков друг относительно друга. Полная деформация мембраны представляется в виде суперпозиции деформаций, являющихся решением для единичного белка. Взаимодействие белков осуществляется путем

17

перекрывания областей, в которых деформации от каждого из белков существенны. При вычислении энергии деформации мембраны учитывается одна деформационная мода изгиба. Минимум энергии системы соответствует величинам а, = 0, а2 = ж, а максимум достигается при а2 = ах. Это означает, что система достигает минимума энергии в симметричной конфигурации.

Была определена явная форма зависимости энергии от углов и а2 и от расстояния между белками R. Это позволило решить задачу об ориентации друг относительно друга произвольного количества белков в предположении парного взаимодействия белков. Предполагается, что белки взаимодействуют только с ближайшими соседями. С учетом этого предположения показано, что если в белковом кластере находится меньше пяти белков, то вне зависимости от их начального положения в мембране они будут иметь тенденцию к образованию симметричной структуры. При этом нельзя утверждать, что, когда белков больше четырех, симметричная конфигурация белков будет неустойчивой.

Также найдена зависимость высоты формируемой выпуклости от количества белков в системе. Было показано, что высота растет нелинейно с увеличением числа белков.

Глава 3. Стабилизация розетки белков слияния по радиусу

Рассмотрена стабилизация розетки белков слияния по радиусу. Предполагается, что деформации мембраны могут определять геометрические размеры розетки белков слияния вне зависимости от наличия белок-белковых взаимодействий. В ходе решения задачи рассмотрено образование мембранной выпуклости под действием симметричного белкового кольца и вычислена энергия, необходимая для образования между мембранами плотного контакта, т.е. для того, чтобы нейтральные поверхности контактных монослоев мембран сблизились на расстояние 1 нм. В вычислениях учитываются две деформационные моды — изгиба и наклона.

В расчетах учтено, что стенка белкового кластера проницаема для липидов и непроницаема для белков (в трехмерных системах это приводит к появлению осмотического давления). Соответствующая добавка к свободной

энергии равна = кт > где ^ — среднее расстояние между

белками вне белкового кольца, /?1 — радиус белкового кольца. Суммарная энергия системы равна = 1ГгЬтс + , где — упругая составляющая энергии. Результаты представлены на рис. 4.

а б

Рис. 4. а - зависимость упругой составляющей энергии системы Wart радиуса R\ белкового кластера при разных значениях спонтанной кривизны контактного монослоя Л. Графики соответствуют случаям: 1 — Jb = -0.2 нм"1; 2 — Л = -0.1 нм'1; 3 — Jb = 0 нм"1. б -зависимость различных составляющих энергии системы от радиуса белкового кластера для случая спонтанной кривизны контактных монослоев, равной Jj = 0 нм"1. Пунктиром показаны графики зависимостей для деформационной составляющей энергии Weiasiic и осмотической составляющей энергии WOM,c. Сплошной линией показан график зависимости суммарной энергии

Как видно из графиков, представленных на рис. 4 а, рассчитанная равновесная энергия деформаций мембран уменьшается при уменьшении спонтанной кривизны контактных монослоев. Кроме того, из графиков, представленных на рис. 4, следует, что зависимость энергии системы от R\ имеет минимум. Это означает, что деформации мембраны стабилизируют белковый комплекс по радиусу. Учет осмотического давления приводит к сдвигу равновесного радиуса в область меньших значений.

Часть V. Вычисление линейного натяжения кромки поры

В этом разделе в рамках теории упругости мембран вычисляется линейное натяжение кромки поры. Рассмотрены различные модели структуры кромки поры: модели цилиндрической формы с заданным радиусом и оптимальным радиусом, «экстраполяционная» модель, «двухкоординатная» модель, модель с гидрофобной полостью («войдом»). Модели можно условно разделить на два класса. Первый класс формируют модели, в которых монослои мембраны всюду находятся в контакте друг с другом. Модели второго класса допускают появление между монослоями гидрофобной полости. Модели первого класса дают значения линейного натяжения у, сильно отличающиеся от известных из литературы (-10 пН). В то же время, модель с полостью при поверхностном натяжении на границе липидных хвостов, близкому к нулю, дает значение у -10 пН, хорошо согласующееся с литературными данными.

Заключение. В работе мембрана рассматривалась как сплошная упругая среда, подверженная деформациям. На основании имеющейся гипотезы (МсМаЬоп е! а!., 2010), согласно которой белки слияния могут индуцировать в мембране спонтанную кривизну, была разработана модель, описывающая деформацию мембран под действием подобных белков. Показано, что в представляющем биологический интерес случае индуцирования белками положительной спонтанной кривизны, при физически разумных значениях параметров невозможно создать выпуклость, обладающую большой кривизной и высотой. В соответствии с этим представляется маловероятным, чтобы плотный контакт монослоев сливающихся мембран произошел только за счет действия таких белков. Была рассчитана высота энергетического барьера, который мембранам необходимо преодолеть для установления плотного контакта. Найдено изменение высоты энергетического барьера под действием белков, индуцирующих в мембране спонтанную кривизну и одновременно прикладывающих к ней механическое усилие. Результаты вычислений свидетельствуют о том, что при отсутствии приложения силы со стороны белков, высота барьера практически не понижается. В то же время, приложение силы уменьшает высоту барьера тем больше, чем больше величина индуцируемой белками спонтанной кривизны. Из этого можно

сделать вывод о необходимости для белков кооперативного воздействия на мембрану по двум механизмам.

Кроме того, в работе рассмотрено формирование розетки белков слияния из единичных белков и стабилизация этой розетки по радиусу. Показано, что одни только деформации мембраны, возникающие в ней в результате внедрения нескольких молекул белка, могут привести к формированию из белков симметричной структуры; деформации определяют равновесные геометрические размеры розетки белков слияния.

ВЫВОДЫ

1. Неупорядоченные белки слияния способны к агрегации при достаточной деформации мембраны. Возникающие механические напряжения способны стабилизировать белковый комплекс даже в отсутствие специфических белок-белковых взаимодействий.

2. В рамках двух основных механизмов действия белков слияния - (1) индуцирование спонтанной кривизны и (2) прямое стягивание мембран за счет приложения силы — невозможно получить выигрыш свободной энергии, достаточный для преодоления гидратационного барьера и слияния мембран при физически разумных и биологически правдоподобных значениях параметров.

3. Комбинированное воздействие белков слияния на мембрану по двум описанным выше механизмам способно обеспечить монослойное слияние мембран.

4. Расчетное натяжение кромки сквозной поры совпадает с экспериментально измеренным только в случае наличия в мембране гидрофобной полости.

Список публикаций

Статьи

1. Молотковский Р. Ю., Акимов С. А. Расчет линейного натяжения в различных моделях кромки поры в липидном бислое // Биол. мембраны. 2009. Т. 26. №2. С.149-158.

2. Молотковский Р. Ю., Батищев О. В., Кузьмин П. И., Акимов С. А. Изменение формы мембран на начальной стадии слияния под действием белков, индуцирующих спонтанную кривизну // Биол. мембраны. 2013. Т. 30. № 3. С. 1-9.

3. Молотковский Р. Ю., Акимов С. А. Стабилизация комплекса белков слияния деформациями мембраны // Биофизика. 2013. Т. 58. Вып. 5. С. 828-835.

Тезисы

1. Молотковский Р.Ю., Акимов С А. Стабилизация розетки слияния деформациями мембраны. Московская конференция — конкурс молодых ученых, аспирантов и студентов «Физикохимия-2009», 1 ноября - 4 декабря 2009 г., Москва. Тезисы докладов, с. 100.

2. Молотковский Р.Ю., Акимов СЛ. Исследование начальной стадии вирус-индуцированного слияния. V Конференция молодых ученых, аспирантов и студентов ИФХЭ РАН «Физикохимия-2010», 1-30 ноября 2010 г., Москва. Тезисы докладов, с. 110.

3. 9th International Frumkin Symposium. Moscow, 24 —29 October, 2010. Molotkovsky R. J., Akimov S. A. "Stabilization of fusion proteins rosette by membrane deformations" (book of abstracts, p. 274).

4. Молотковский P. Ю., Акимов С. А. Самоорганизация гемагглютинина на начальной стадии вирус-индуцированного слияния. VI Конференция молодых ученых, аспирантов и студентов ИФХЭ РАН «Физикохимия-2011», 1-30 ноября 2011 г., Москва. Тезисы докладов, с. 94.

5. Molotkovsky R.J., Zimmerberg J., Cohen F.S., Akimov S.A. A Quantitative model for formation of protein-mediated protrusions, based on continuum elasticity theory // Biophys. J., 2012, V. 102, P. 500a.

Подписано в печать:

21.11.2013

Заказ № 9195 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Молотковский, Родион Юлианович, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина

Российской академии наук

На правах рукописи УДК 577.3

04201450966

МОЛОТКОВСКИЙ РОДИОН ЮЛИАНОВИЧ

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НАЧАЛЬНОЙ СТАДИИ БЕЛОК-ИНДУЦИРОВАННОГО СЛИЯНИЯ МЕМБРАН

03.01.02 — Биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель:

старший научный сотрудник, кандидат физико-математических наук Сергей Александрович Акимов

Москва, 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Введение 3

Часть I. Обзор литературы 5

Глава 1. Слияние мембран 5

Глава 2. Механика мембран и ее приложения 15

Часть И. Форма мембраны в приближении кольцевой розетки слияния 23

Глава 1. Постановка задачи 23

Глава 2. Изменение формы и кривизны мембраны под действием белков, 30 индуцирующих спонтанную кривизну, с учетом одной деформационной моды

Глава 3. Изменение формы и кривизны мембраны под действием белков, 48 индуцирующих спонтанную кривизну, при учете двух деформационных мод

Часть III. Вычисление высоты энергетического барьера формирования сталка 62

Глава 1. Введение 62 Глава 2. Зависимость высоты энергетического барьера формирования сталка от 66 числа белков в кольце

Глава 3 Зависимость высоты энергетического барьера формирования сталка от 79 начальной кривизны мембраны

Часть IV. Формирование розетки белков слияния 81

Глава 1. Введение 81

Глава 2 Стабилизация розетки слияния из нескольких белков 83

Глава 3 Стабилизация розетки белков слияния по радиусу 94

Часть V. Вычисление линейного натяжения кромки поры 103

Заключение 118

Выводы 120

Список сокращений 121

Список публикаций 122

Список литературы 123

Введение

Процесс слияния мембран играет важнейшую роль во многих биологических процессах, таких как экзоцитоз, оплодотворение, секреция, синаптическая передача, вирусное слияние и др. (Evered and Whelan, 1984). На основании экспериментальных данных, полученных при исследовании слияния in vitro, была предложена концепция, согласно которой слияние мембран происходит в несколько этапов, ключевым из которых является формирование сталка — структуры, в которой контактирующие монослои мембран уже слились, а дистальные монослои — еще нет (Kozlov and Markin, 1983; Markin et al., 1984). Для того чтобы в системе из двух мембран образовался сталк, мембранам необходимо преодолеть энергетический барьер, связанный с деформацией и гидратационным отталкиванием. Теоретические оценки, проведенные в ряде работ, показывают, что высота барьера как минимум на порядок превышает энергию, характерную для тепловых флуктуаций (Kuzmin et al., 2001; Efrat et al., 2006). Это означает, что без дополнительного воздействия мембраны в живых системах не сольются за физически разумное время (несколько секунд). В биологических системах такое внешнее воздействие осуществляют специфические белки, называемые белками слияния. Белки слияния содержат домены, внедренные в обе сливающиеся мембраны, и воздействуют на мембраны для понижения высоты барьера. В настоящее время выдвинуты две гипотезы относительно механизма понижения высоты барьера. Согласно первому механизму, белки слияния индуцируют в мембране ненулевую спонтанную кривизну, что приводит к ее искривлению. Согласно второму механизму, белковый комплекс изменяет свою конформацию и стягивает друг с другом домены, находящиеся в разных мембранах, в результате чего мембраны стягиваются и сливаются. Несмотря на большое число экспериментальных и теоретических работ, посвященных исследованию белков слияния (Martens and McMahon, 2008; Chernomordik and Kozlov, 2008; Sudhof and Rothman, 2009), детальный механизм их функционирования до сих пор не выяснен. В частности, неясен относительный вклад двух механизмов — индуцирования спонтанной кривизны и прямого стягивания мембран — в обеспечение плотного контакта сливающихся мембран. Выяснение механизма функционирования белков слияния представляет одну из важнейших задач биофизики мембран, поскольку это позволяет определить возможные способы воздействия на эти белки. В частности, появляется возможность определить способы блокирования начальной стадии вирусного слияния. Это обуславливает актуальность теоретического исследования данного явления.

Высота энергетического барьера формирования сталка определяет скорость течения всего процесса слияния. Поскольку слияние мембран в живых системах происходит относительно быстро, энергетический барьер должен быть достаточно мал. Таким образом, вопрос о высоте энергетического барьера для перехода системы в состояние сталка и о влиянии на нее белков слияния является ключевым для описания слияния мембран в биологических системах.

Часть I. Обзор литературы Глава 1. Слияние мембран

Биологические мембраны играют определяющую роль в процессе жизнедеятельности клетки. Они отделяют и защищают содержимое клетки от внешней среды, обеспечивают транспорт необходимых веществ внутрь и наружу клетки, являются опорой белков и рецепторов и т.д. Процесс жизнедеятельности клетки сопровождается разнообразными преобразованиями мембран: они сливаются, делятся, в них образуются поры и т.д. Особое место среди этих преобразований занимает слияние мембран, т.е. объединение мембран и заключенных в них водных объемов. Слияние мембран играет важнейшую роль во многих биологических процессах, таких как экзоцитоз, оплодотворение, секреция, синаптическая передача и т.д. (Evered and Whelan, 1984).

Хорошо изученным процессом с участием слияния мембран является экзоцитоз (Rothman, 1994; Sudhof and Rothman, 2009). В процессе экзоцитоза везикулы сливаются с цитоплазматической мембраной клетки для того, чтобы высвободить свое содержимое (например, гормоны или нейротрансмиттеры) в межклеточное пространство или чтобы встроить рецепторы, каналы и иные белки в мембрану. Также слияние мембран является ключевым этапом инфицирования клеток вирусом. В зависимости от природы вируса, слияние вирусной мембраны происходит или непосредственно с мембраной клетки (например, в случае вируса герпеса), или с эндосомальной мембраной после того, как клетка поглотила вирус путем эндоцитоза. Слияние по эндосомальному пути происходит, например, в случае вируса гриппа (Lakadamyali et al., 2004).

Слияние мембран играет важную роль и во внутриклеточных процессах. Активно изучается слияние мембран митохондрий, аппарата Гольджи, эндоплазматического ретикулума и вакуолей в клетках дрожжей (Chan, 2006; Jahn and Scheller, 2006; Martens and McMahon, 2008; Zerial and McBride, 2001). Кроме того, показано слияние цитоплазматических мембран клеток в ходе межклеточного слияния. Широкий спектр процессов мембранного слияния в клетке представлен на рис. 1.1.1.

Животная клетка

Инфицирование вирусом

Репарация цитоплазмагической мембраны

f // \

Jf Слияние

миюмшдрий ^^

Клетка дрожжей

о Комплексы SNARE о Регуляторные факторы

о Дисферлин, миоферлин о Ig-белки

А Вирусный белок слияния о Митофузин

в OPAl/Mgml в HOPS

© Синаптотагмин Актиновые цепи

Рис. 1.1.1. Процессы слияния мембран в клетке (Martens and McMahon, 2008). Представлены основные события, связанные со слиянием мембран в живой клетке, в т.ч. Ca -зависимый экзоцитоз и инфицирование клетки вирусом.

Во всех этих процессах происходит топологическая перестройка мембран, в результате которой две мембраны становятся одной. Такая перестройка не может быть осуществлена просто путем разрыва бислоев и последующего замыкания их в новой топологии. Если барьерная функция мембран нарушается, то это, как правило, свидетельствует о каком-либо патологическом процессе (Kroemer et al., 2007). Для слияния мембраны должны быть сближены друг с другом до образования плотного контакта, на что указывают экспериментальные данные. Так, в работе (da Silva and Nogueira, 1977) с помощью электронной микроскопии были получены изображения областей контакта мембран при слиянии везикул с зооспорами Phytophthora palmivora. Полученные изображения показывают, что мембраны контактируют друг с другом в нескольких отдельных местах; контакт мембран приводит к формированию и расширению бислойной мембранной диафрагмы при отсутствии посторонних частиц. Однако контакт больших областей мембран друг с другом невозможен, поскольку известно, что при сближении мембран на расстояние порядка нанометра между ними возникает сильное гидратационное отталкивание. Это отталкивание обусловлено взаимодействием упорядоченных слоев воды, связанных с липидными головками в сливающихся мембранах (Frolov and Zimmerberg, 2010). Экспериментальные исследования, проведенные на модельных липидных системах (Rand, 1981;

Chernomordik et al., 1985), помогли сформулировать концепцию, согласно которой слияние происходит в несколько этапов через локальные нестационарные контакты между взаимодействующими мембранами (Kozlov and Markin, 1983; Chernomordik et al., 1987; Leikin et al., 1987).

Согласно предложенной концепции, после беспрепятственного сближения на расстояние порядка 2-3 нм мембраны формируют локальные выпуклости друг напротив друга. В первых работах рассматривались модельные плоские мембраны и предполагалось, что формирующиеся выпуклости являются следствием тепловых флуктуаций (Leikin et al., 1987). Поскольку гидратационное отталкивание мембран пропорционально площади их контакта, небольшие выпуклости должны испытывать его в значительно меньшей степени, чем большие области бислоев. Локальное сближение мембран приводит к увеличению энергии системы. В результате становится энергетически выгодным локальное разрушение контактирующих монослоев мембран на вершинах выпуклостей и образование так называемых гидрофобных дефектов, т.е. областей мембран с экспонированными в воду углеводородными хвостами (Rand and Parsegian, 1986; Helm et al., 1989). Эти дефекты представляют собой зародыши будущего контакта цис-монослоев мембран, поскольку они локально разупорядочивают гидратационные слои, что приводит к притяжению между мембранами. Притяжение увеличивается с уменьшением расстояния между дефектами, что в конце концов приводит к их слиянию. В результате образуется структура в форме песочных часов, в которой контактирующие монослои мембран уже слились, а дистальные монослои — еще нет. Эта структура была названа сталком (Kozlov and Markin, 1983; Markin et al., 1984). Диаметр сталка увеличивается, в результате чего приходят в контакт дистальные монослои и образуется так называемая триламеллярная структура, или диафрагма слияния. Затем в ней образуется пора, и слияние мембран завершается. Стадии процесса слияния схематически показаны на рис. 1.1.2.

Контактные монослои

а б в г д

Рис. 1.1.2. Стадии процесса слияния мембран (Jahn and Fasshauer, 2012). а — сближение контактирующих мембран; б — локальная дестабилизация мембран и образование сталка; в — расширение сталка и формирование диафрагмы слияния; г, д — образование поры слияния и ее расширение.

Считалось, что именно образование сталка является скорость-лимитирующей стадией во время мембранного слияния, поэтому к этой стадии было привлечено повышенное внимание. В

ранних исследованиях сталк был гипотетическим интермедиатом, однако в дальнейшем были получены экспериментальные свидетельства в пользу его существования. Так, в работе (Frolov et al., 2000) с помощью электронной микроскопии наблюдалось формирование выпуклостей и их плотный контакт при слиянии мембран эритроцитов и клеток линии НАЬ2, экспрессирующих на своей мембране белок слияния вируса 1риппа гемагглютинин. Кроме этого, трехмерное распределение электронной плотности в сталке наблюдалось в серии экспериментов по дифракции рентгеновских лучей на липидной фазе, содержащей сталки (Yang and Huang, 2002; Aeffner et al., 2012). Наличие сталка было показано также в экспериментах по численному моделированию процесса слияния в различных системах при разных начальных условиях (Marrink et al., 2009; Baoukina and Tieleman, 2010). Более того, недавно полученные результаты указывают на формирование похожих структур в процессе мембранного деления (Bashkirov et al., 2008). В дальнейшем во многих моделях первоначальная концепция сталка подверглась некоторым изменениям. Так, в работе (Efrat et al., 2007) предполагается, что гидрофобные дефекты образуются в мембранах до начала их сближения, что приводит к характерной вулканообразной форме мембранных выпуклостей. В результате силы гидратационного отталкивания действуют на меньшей площади, что дает некоторый выигрыш в энергии. Численное моделирование методами молекулярной динамики указывает на возможную некруговую форму сталка (см, например, обзор (Markvoort and Marrink, 2011)). Существуют и полностью альтернативные гипотезы. Например, в работе (Lee, 2010) на основе электронно-микроскопических исследований был сделан вывод о том, что после сближения мембран вируса гриппа и клетки в мембране клетки образуется пора. Мембранная воронка с порой на конце соприкасается с мембраной вируса, что приводит к образованию структуры полуслияния и, затем, к полному объединению сливающихся мембран. Автор считает, что мембрана вируса не будет сильно деформироваться, поскольку она связана с жестким белковым каркасом. Тем не менее, в настоящее время концепция сталка как ключевого этапа в слиянии мембран является общепризнанной.

В теоретических исследованиях слияния мембран следует выделить две основных стратегии, применяющиеся для описания процесса слияния (Chernomordik and Kozlov, 2008). Первая стратегия — так называемый континуальный подход — основана на моделировании мембран как макроскопических объектов, которые могут быть описаны методами классической физики, в частности теорией упругости липидных монослоев или теорией самосогласованного среднего поля. Вторая стратегия — так называемый симуляционный подход — использует компьютерные симуляции процесса слияния мембран и основана на современных методах численного расчета, таких как молекулярная динамика крупночастичных или атомных моделей липидов или метод Монте-Карло. В обоих подходах сталк присутствует как ключевой этап в

последовательности событий при слиянии мембран, и они взаимно дополняют друг друга при исследовании их слияния. Так, континуальный подход позволяет объяснить экспериментально наблюдаемую зависимость среднего времени ожидания монослойного слияния от липидного состава сливающихся мембран. Было показано (Chernomordik et al., 1985), что при добавлении в контактный монослой мембраны из фосфатидилхолина лизолипида время ожидания резко увеличивается, а при добавлении фосфатидилинозита — уменьшается. Эту зависимость удалось объяснить, рассмотрев влияние геометрии различных липидов на характеристики мембраны в целом. В цитированной работе было сделано предположение о том, что форма монослоя, составленного из липидов определенного сорта, зависит от их геометрической характеристики, так называемого параметра упаковки f, определяемого как /= V/(ah), где V— молекулярный объем, а — площадь полярной головки, a h — максимальная длина углеводородного хвоста липида. Если / < 1 (например, в случае лизолипидов), то молекула имеет форму инвертированного конуса (см рис. 1.1.3,1а); если1, то молекула имеет форму цилиндра, как в случае диолеоилфосфатидилхолина (DOPC) (см рис. 1.1.3, IIa); если же/> 1, то молекула имеет форму конуса, как в случае диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE) (см рис. 1.1.3, Illa). Рассмотрим бислойную мембрану, составленную из липидов определенного вида. Если липиды, составляющие мембрану, имеют форму инвертированного конуса, то мембрана будет стремиться принять форму гидрофильной поры (см рис. 1.1.3, le); если липиды имеют форму цилиндра, то мембрана будет стремиться принять форму плоского бислоя (см рис. 1.1.3, Не); если же липиды имеют форму конуса, то мембрана будет стремиться принять форму полусталка (см рис. 1.1.3, Шв). Ясно поэтому, что чем больше параметр f, тем вероятнее слияние контактных монослоев мембран и образование сталка.

I II III

e игл

¿Pm UUDU VVVYV

Рис. 1.1.3. Форма липидных молекул и предпочтительные структуры монослоя и бислоя. а — эффективная форма липидных молекул; б — энергетически выгодные структуры, создаваемые липидами различной формы в монослое; в — энергетически выгодные структуры, создаваемые липидами различной формы в бислое. Римскими цифрами обозначены: I — липиды в форме обратных конусов (например, лизолипиды); II — липиды в форме цилиндров (например, DOPC); III — липиды в форме конусов (например, DOPE). Черным закрашены полярные головки липидных молекул.

Основной заслугой симуляционного подхода при исследовании процесса слияния мембран надо признать визуализацию сталка и остальных стадий слияния в различных системах (Kasson and Pande, 2007; Baoukina and Tieleman, 2010). Было найдено, что, в отличие от традиционного пути расширения симметричного сталка, могут наблюдаться и другие пути слияния. Например, в работе (Smeijers et al., 2006) использование симуляционного подхода позволило показать, что в окрестности сталка в мембране образуется пора; сталк со временем окружает эту пор