Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование ранних стадий слияния биологических и искусственных мембран, индуцированного белком вируса гриппа гемагглютинином

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Самсонов, Андрей Владимирович, Москва

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи Самсонов Андрей Владимирович

УДК 577.352

ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ СТАДИЙ СЛИЯНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ И ИСКУССТВЕННЫХ МЕМБРАН, ИНДУЦИРОВАННОГО БЕЛКОМ ВИРУСА ГРИППА ГЕМАГГЛЮТИНИНОМ

03.00.02 - Биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: чл.-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Ю.А. Чизмаджев

Москва, 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................3

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

I. Введение.........................................................................................6

П.Слияние биологических мембран..........................................................7

III. Экспериментальные модельные системы для изучения механизмов слияния мембран...........................................................................................19

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

I. Клеточные линии............................................................................38

II. Подготовка клеток к эксперименту.....................................................38

III. Выделение, очистка и окраска вируса гриппа А штамма Japan/305/57.......................................................................................................41

IV. БЛМ................................................................................................41

V. Флуоресцентная видеомикроскопия......................................................42

VI. Метод ёмкостного контроля за стадиями слияния БЛМ.......................43

VII. Измерение электрической проводимости поры слияния......................45

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Исследование перераспределения гидрофобных зондов на ранних стадиях слияния 2-х плоских БЛМ............................................................................50

II. Слияние ГА-экспрессирующих клеток с эритроцитами и БЛМ.............58

III. Влияние липидного состава мембраны-мишени на картину слияния НАЬ2 клеток с БЛМ.....................................................................................65

IV. Предпробойные флуктуации проводимости БЛМ, индуцированные электрическим полем, качественно схожи с проводимостью поры слияния............................................................................................................92

V. Заключение..............................................................................................94

ВЫВОДЫ..........................................................................................97

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................98

Введение

Проблема слияния биологических мембран всегда привлекала к себе внимание, что обусловлено универсальностью явления: слияние лежит в основе целого ряда физиологических процессов, таких как экзоцитоз, секреция, образование вторичных лизосом, проникновение в клетку оболочечных вирусов. Известно, что все живые организмы (исключая вирусы) состоят из клеток, содержимое которых отделено от окружающей среды мембраной. Основой любой биологической мембраны является липидный бислой - бимолекулярная пленка, состоящая из двух монослоев амфифильных молекул, гидрофобные "хвосты" которых находятся внутри бислоя, а полярные гидрофильные части контактируют с окружающим раствором. Экспозиция гидрофобной области бислоя в полярную среду энергетически невыгодна, следствием чего является замкнутость бислой-ной поверхности, отсутствие краев. Гидрофобная область бислоя является препятствием для проникновения через мембрану гидрофильных молекул, что и лежит в основе главной физиологической функции биомембран -барьерной [1, 2]. Цитоплазматическая мембрана отделяет внутренний объем клетки от внешней среды, а внутренние мембраны разделяют его на множество компартментов, что позволяет создавать наиболее выгодные условия для биохимических реакций (оптимальный рН, необходимый набор ферментов и реагирующих веществ). Однако непременным условием жизнедеятельности любого организма является как внутриклеточный обмен веществом и энергией, так и обмен с внешней средой. Частично эту функцию в клетке выполняют мембранные белки, осуществляющие селективный транспорт через мембрану небольших гидрофильных молекул (неорганических ионов, Сахаров, аминокислот и т.д. ), но для транспорта крупных молекул и для их массовой доставки (секреция, экзоцитоз) в клетке работает иной механизм: целенаправленная транспортировка веществ в замкнутых мембранных везикулах и слияние их с внутренними компартментами клетки или с цитоплазматической мембраной [3, 4]. В основе этого процесса лежит способность биологических мембран сли-

ваться друг с другом. Этот процесс в клетке контролируется специальными белками, задача которых осуществить прочную адсорбцию везикулы в сайте слияния и объединить ее внутренний объем с объемом компартмен-та-мишени [5, 6, 7, 8].

На модельной системе 2-х бислойных липидных мембран (БЛМ) удалось показать, что процесс слияния двух искусственных мембран проходит через следующие последовательные стадии: 1) плоскопараллельный контакт, когда контактирующие мембраны (КМ) находятся на равновесном расстоянии друг от друга, 2) монослойное слияние (МС) - образование одного общего бислоя в области контакта двух мембран и формирование триламинарной структуры (ТС), 3) полное слияние (ПС) - объединение водных объемов и мембран.

В случае слияния биологических мембран, индуцированного специальными белками слияния (БС), не удалось прямыми экспериментальными методами зафиксировать возникновение ТС, предшествующее ПС. Примером является инфицирование клетки оболочечным вирионом, когда проникновение вирусного генома в клетку происходит в результате ПС мембран клетки и вируса и опосредовано вирусными БС, встроенными в липидную оболочку вируса. До сих пор не известно, какую роль при этом играют БС. Возможно, они лишь сближают липидные матриксы, и дальше процесс идет спонтанно, или же являются важными компонентами поры слияния и влияют на ее эволюцию? Так как весь цикл развития вируса происходит внутри клетки, лечение вирусных заболеваний лекарственными препаратами малоэффективно. Очевидно, что для предотвращения заражения вирусом наиболее действенной мерой было бы не дать вирусу слиться с клеткой. Для успешного решения этой задачи необходимо выяснить все стадии этого процесса. Знание механизмов слияния поможет также решить задачу прямой доставки внутрь клетки лекарств и генов в липосомах и ретровирусных векторах [9, 10, 11, 12, 13]. Вирусные БС индуцируют ПС мембран, однако детальный механизм этого явления остается неясным. Известно, что искусственные бислои, например БЛМ, могут сливаться спонтанно, если добиться достаточно плотного их кон-

такта (увеличив ионную силу раствора или добавив ионы Са2+ или ]У^2+ между КМ в случае заряженных мембран) [14]. Исходя из этого логично было бы предположить, что роль БС состоит лишь в сближении липидных матриксов КМ, далее же процесс протекает спонтанно. Однако из экспериментов по слиянию двух БЛМ известно, что ТС, возникающая между КМ, стабильна и ПС можно достигнуть лишь специально разрушив ее (например электрическим пробоем или механически) [15]. Таким образом можно предположить, что БС принимают активное участие в образовании поры слияния. Они, по-видимому, являются компонентами поры слияния, а липиды принимают в этом процессе пассивное участие, например, встраиваясь в стенки поры по мере ее расширения. В различных модельных системах была продемонстрирована чувствительность процесса слияния к изменению липидного состава мембран [16, 17, 18]. Присутствие в мембранах липидов, имеющих форму конуса, обращенного острием внутрь бислоя (например лизоформы липидов), ингибировало слияние, липиды же конической формы с малой площадью на полярную головку (острие конуса снаружи бислоя) промотировали слияние. Для слияния БЛМ была предложена теория сталков (локальных перемычек между контактными монослоями), объясняющая механизмы структурных перестроек липидных бислоев в процессе слияния [19, 20].

Доказательством применимости теории "сталков" к слиянию биологических мембран было бы обнаружение аналогичной последовательности стадий слияния и чувствительности их к липидному составу. Слияние, индуцированное белком вируса гриппа гемагглютинином (ГА) является наиболее изученным белок-индуцированным процессом и часто рассматривается в литературе как модель слияния клеточных мембран. Основной целью данной работы было исследование влияния липидного состава мембраны-мишени на различные стадии слияния, опосредованного БС и проверка применимости к этому процессу теории сталков. Была принята основная рабочая гипотеза, объясняющая как БС индуцируют структурные перестройки липидного матрикса: 1) БС в результате кон-формационных перестроек внедряют в мембрану-мишень гидрофобные

участки (пептиды слияния) и стягивают мембраны, 2) взаимодействие пептидов слияния с мембраной-мишенью индуцирует в ней образование локальных липидных структур типа сталков, 3) липиды конической формы с малой площадью сечения полярной головки увеличивают вероятность образования сталков, 4) в результате расширения сталков возникает локальная ТС, 5) пора слияния образуется в локальной ТС.

Литературный обзор

I. Введение

За последние годы опубликовано множество научных работ, посвященных проблеме слияния биологических и искусственных мембран. Интерес к этому явлению не случаен, объясняется он прежде всего универсальностью этого процесса в природе. Слияние биологических мембран регулируется специальными белками, но на модельных системах, например липосомах и БЛМ, показано, что сливаются и чисто липидные мембраны [21, 22, 23, 24]. Было исследовано большое количество веществ небелковой природы, которые индуцируют слияние как биологических, так и искусственных мембран. Не вызывает сомнений тот факт, что в основе этого процесса лежат фундаментальные свойства именно липидной компоненты биологической мембраны. Одна из гипотез, принятых для объяснения роли белков при слиянии биологических мембран предполагает, что БС являются лишь катализаторами процесса, сближают липидные компоненты мембран и далее процесс протекает спонтанно [25, 26]. Молекулярные перестройки липидного бислоя приводящие к слиянию контактирующих мембран были исследованы на различных модельных системах. В этом обзоре мы рассмотрим работы, в которых исследовалось слияние мембран, индуцированное различными БС, а также исследования слияния чисто липидных искусственных мембран. Проведен так же сравнительный анализ данных по чувствительности этого процесса к липидному составу мембран, подтверждающий схожесть молекулярных перестроек при слиянии

искусственных и биологических мембран. Один из разделов посвящен теории сталков, объясняющей молекулярные механизмы этого процесса. В основу этой теории легло представление об эффективной форме липидных молекул и спонтанной кривизне бислоя как сумме спонтанных кривизн молекул, его составляющих.

II. Слияние биологических мембран

11.1. Слияние внутриклеточных транспортных везикул

Внутренний объем любой эукариотической клетки разделен мембранами на многочисленные замкнутые компартменты: клеточное ядро, митохондрии, лизосомы, аппарат Гольджи и т.д. Эти мембранные структуры имеют свое собственное содержимое, отличное по составу, свойствам и функциям от гиалоплазмы. Мембраны, окружающие эти отсеки, выполняют барьерную функцию, позволяя создать в этих компартментах оптимальные условия для определенных биохимических реакций (набор ферментов, рН, концентрация реагентов). Известно, что синтез и посттрансляционная модификация (гликозилирование, ацилирование) таких сложных биологических молекул как белки происходит поэтапно, в разных компартментах клетки. Так синтез и начальное гликозилирование идет в гранулярном эндоплазматическом ретикулуме, а дальнейший рост полисахар идных цепей происходит в цистернах аппарата Гольджи [27]. Каким же образом продукты реакции попадают из одного отсека в другой? Исследования показали, что перемещение их происходит путем отщепления липидной транспортной везикулы от одного компартмента и слияния ее с компартментом-мишенью [28, 29]. Транспортировка везикул осуществляется с помощью трабекулярной сети гиалоплазмы [3, 30]. В клетке эти события происходят непрерывно и в большом количестве, слияние при этом строго специфично: все везикулы попадают строго по адресу, сливаются именно с нужным отсеком. Эта эффективность и безошибочность достигается благодаря своеобразной "машине слияния", действующей в клетке. Эта машина состоит из кооперативно работающих специальных белков.

Рис. 1.Гипотетическая схема сборки "машины слияния" при слиянии внутриклеточных

транспортных везикул.

Модель предполагает активацию SNARE-белков цитозоль-ными факторами SNAP и NSF (процесс АТФ-Зависим) (1) . Активность комплекса сохраняется путем связывания LMA1-белка (2) . Образование слиятельно-активного комплекса t-SNARE/v-SNARE происходит после связывания с ним белка Ypt7p (3) [32] .

Часть из них интегральные и ассоциированы с мембраной транспортной везикулы (v-SNARE) и мембраной-мишенью (t-SNARE), другие водорастворимые (NSF, LMA1, Ypt7p) [31-34]. Процесс энергозависим, в сборке комплекса участвуют белки связывающие и гидролизующие АТФ (SNAP). Анализ аминокислотной последовательности и структуры белков, участвующих во внутриклеточном слиянии, и сравнение их между различными организмами показало их консервативность, что позволило выдвинуть предположение об универсальности "машины слияния" во всех эукариоти-ческих клетках (гипотеза "SNARE"). На Рис. 1 приводится гипотетическая схема сборки комплекса и инициации им слияния мембран.

Наиболее изучен в настоящее время только один из типов внутриклеточного слияния - это экзоцитоз, слияние секреторных гранул с внешней цитоплазматической мембраной клетки. С использованием современ-

ных биофизических методов, таких как метод измерения клеточного адмиттанса (метод Неера-Марти), было показано, что при экзоцитозе происходит именно полное слияние гранулы, при этом идет обмен как между водным содержимым гранулы, так и липидный обмен между мембраной везикулы и цитоплазматической мембраной. Слияние гранулы фиксировалось как увеличение площади клеточной мембраны. Так в работе [35] использовались тучные клетки, имеющие одни из самых больших секреторных гранул, размер которых достигал 0.8 мкм [36], а гранул тучных клеток beige mouse - 5 мкм [37]. Первым событием после индукции экзоцитоза (триггером является Са2+ или негидролизуемый аналог ГТФ-yS), было образование водной поры, соединяющей отсек гранулы и внешнюю среду, проводимость которой оценочно достигала 200 пС [38], причем наблюдались флуктуации проводимости вплоть до полного закрытия поры, так называемый "фликкер" [25]. Далее происходило быстрое расширение поры и выброс содержимого гранулы (катехоламинов, гепарина и т.п.) наружу. Для прямого измерения выхода секретируемого вещества используется амперометрический метод, основанный на измерении тока, вызываемого окислением или восстановлением секреторного гормона на поверхности угольного электрода [39]. С помощью этого метода было показано, что выход серотонина из гранул beige mouse происходит уже на этапе фликкера проводимости поры [40]. Таким образом, поры, которые могут полностью закрыться, являются все же достаточно большими, чтобы обеспечить выход гормона. Процесс был полностью обратимым, после выброса секрета гранула отщеплялась внутрь клетки, причем зачастую наблюдалось уменьшение площади клетки после одиночного цикла экзоци-тоз/эндоцитоз, что было интерпретировано как захват части клеточной мембраны отщепившейся везикулой [41]. Электронная микроскопия по методу замораживания - травления позволила увидеть начальные этапы этого процесса при экзоцитозе трихоцист в клетках Paramecium [42]. На ранних этапах, сразу после приложения триггера в сайтах слияния были

обнаружены локальные конические изгибы мембран навстречу друг другу, причем локальный контакт происходит в центре "розетки слияния" -радиально-симметричного комплекса внутримембранных частиц (ВМЧ) (см. рис. 2 [43] ).

Рис. 2 . Розетка слияния (110) , образованная из ВМЧ, в цитоплазматической мембране Рагащесл.шп перед экзоцито-зом. Пора слияния (Р) соединяет внутренний объем экэоци-тозной гранулы (трихоциста) с внешней средой [43].

Следующим этапом было открытие малой экзоцитозной поры диаметром 200-300 А в центре "розетки слияния" (стадия ПС), причем стенки этой поры по данным электронной микроскопии липидные [44, 45].

Таким образом, в этом случае не было выявлено образования локальной липидной диафрагмы (ТС), соединяющей КМ. Несмотря на то, что слияние катализируют именно белки, многочисленными эксперимен-

тами была доказана чувствительность этого процесса к изменению липид-ного состава как мембраны гранулы, так и мембраны-мишени. Так инкубация яйцеклеток морского ежа в среде, содержащей липид лизофосфати-дилхолин (ЛФХ) ингибировала слияние кортикальных гранул с цитоплаз-матичсской мембраной клетки, если экзогенный ЛФХ добавлялся до триггера слияния [46]. Инги