Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние искусственно гидрофобизованных антивирусных антител на репродукцию вируса гриппа в культуре клеток

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние искусственно гидрофобизованных антивирусных антител на репродукцию вируса гриппа в культуре клеток"

РГВ 00

* млп юеп

' ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

На правах рукописи

УДК 616.921.5. 616.9—085.37.

СУЗДАЛЬЦЕВА Юлия Геннадиевна

ВЛИЯНИЕ ИСКУССТВЕННО ГИДРОФОБИЗОВАННЫХ АНТИВИРУСНЫХ АНТИТЕЛ НА РЕПРОДУКЦИЮ ВИРУСА ГРИППА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК

Специальность: 03. 00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва — 1993

Работа выполнена в департаменте химии биополимеров Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения (ВНЦМДЛ) и лаборатории физиологии вирусов института вирусологии им. И. Д. Ивановского РФ.

Научные руководители:

д. х. н., директор департамента химии биополимеров ВНЦМДЛ А. В. Кабанов;

д. б. н., в. н. с. лаб. физиологии вирусов НИИ вирусологии РАМН О. П. Жирнов.

Официальные оппоненты:

д. х. н. А. В. Левашов;

к. б. н. М. В. Иванов.

Ведущая организация: НИИ общей и судебной психиатрии им. В. П. Сербского, МЗ РФ.

Защита состоится 1 апреля 1993 г. в часов на заседании специализированного Совета Д 074.51.01 при Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения по адресу: Москва, Симферопольский бульвар, 8. ВНЦМДЛ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке (ВНЦМДЛ)

Автореферат разослан « » февраля 1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета,

к. б. н. * В. В. Отраднова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Успехи современной иммунобиотехнологии стимулируют интерес к пассивной серопрофилактике и серотерапии инфекционных болезней. В то же время антивирусные антитела практически не используются для лечения инфекционных заболеваний, подавления репродукции вируса Исключая несколько случаев успешного применения антител для подавления вирусних инфекций,,, описанных в, литературе, во многих случаях терапевтическая эффективность препаратов антивирусных антител являетея низкой.

Ключевые стадии репродукции вируса происходят внутри клетки, в то время, как антивирусные антитела не способны проникать внутрь клетки. Нативные иммуноглобулины, будучи неспособными преодолевать мембранный барьер и проникать в цитоплазму клетки, не в состоянии блокировать репродукцию вируса

В качестве одного из альтернативных подходов для решения этой проблемы недавно был предложен метод искусственной гидрофобизации белков путем ацилирования остатками жирных кислот в системе обращенных мицелл. Такая модификация ведет к усилению мембранной активности белка и, в частности, обеспечивает его транслокацию через модельные бислойные мембраны. В экспериментах на клетках было показано (Слепнев, 1992), что модификация остатками жирных кислот приводит к существенному усилению связывания белков (в том числе иммуноглобулинов) с клеточной мембраной, а также их эффективному зндоцитозному захвату внутрь клеток.

На примере вирусов гриппа, респираторно-синциткального вируса и вируса герпеса было показано, что такая искусственная гидрофобизация придает антивирусным антителам способность подавлять репродукцию вирусов в инфицированных клетках. В экспериментах in vivo показано также, что модификация остатками жирных кислот существенно усиливает терапевтический эффект моноклональных антител к гликопротеину D вируса простого герпеса при лечения герпетического менингоэнцефалита • и генерализованной инфекции. Механизмы этих эффектов подавления многом не ясны.

ОСНОВНОЙ ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ является изучение влияния модификации иммуноглобулинов остатками жирных кислот на их биологические свойства, а также исследование механизмов усиления антивирусной активности гидрофобизованных антител. , .

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В ходе работы был получен препарат иммуноглобулинов, модифицированных остатками стеариновой кислоты в системе обращенных мицелл и сохраняющих способность связывать антиген. Шказано, что гидрофобизация антител приводит к усилению их способности встраиваться; в модельные липидные мембраны и мембраны клеток. Получены результаты, подтверждающие усиление антивирусного действия гидрофобизованных антител к поверхностным антигенам вируса гриппа (гемагглютинину). Впервые получены данные по усилению антивирусной активности антител к. внутренним белкам вируса гриппа (Ш- и МР-белкам). Полученные результаты позволяют преложить механизмы усиления антивирусного действия гидрофобизованных антител как к внутренним , так и к поверхностным белкам вируса гриппа

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЕ Усиление биологической: активности иммуноглобулинов . с помощью искусственной гидрофобизации может служить одним из средств для решения проблемы подавления вирусной инфекции как на стадии заражения клеток, так и в уже зараженных клетках. Гидрофобизованные иммуноглобулины могут явиться также инструментом в изучении процессов, связанных с мембранами, и, в частности, механизмов репродукции вирусов.

апробация работы. Основные результаты были доложены и обсуждены на 2-ой международной конференции ЮНЕСКО "Иммунология, вирусология и общество", Киев (1991), международной конференции . "Иммунотерапия' инфекционных заболеваний", Берлин (1991)', • международном симпозиуме "Последние достижения в , области доставки лекарств", Солт Лейк Сити (1993).' ; '

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методов, . результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ; страницах машинописного текста и включает 8 . таблиц и 15 рисунков.

- 3 -

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

раздел 1. обзор литературы.

В этом разделе подробно рассмотрен процесс репродукции вируса гриппа в клетках: механизм заражения, транскрипция генома, синтез вирусных белков, процесс сборки и почкования вирионов. Описаны примеры модификации белков гидрофобными заместителями в Природе. Проведен анализ существующих методов искусственной гидрофобизации белков, рассмотрены их недостатки и преимущества. Рассмотрен вопрос о влиянии искусственной гидрофобизации на биологические ' свойства белков. Проанализированы известные данные по усилению антивирусной активности гидрофобиаованных антивирусных антител, их подавляющего действия на течение инфекционного процесса in vitro и in vivo.

РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В этом разделе описаны методики получения иммуноглобулинов,; модифицированных остатками жирных кислот в системе обращенных мицелл АОТ в октане. Приведены методы, харшстеризующие биологические свойства антител. Описаны методы, позволяющие описать усиление мембрано-активных свойств гидрофобивованных иммуноглобулинов по взаимодействию как с модельными мембранами, так и с мембранами клеток. Приведены используемые вирусологические методы определения инфекционной к гемагглютинирующей активности вируса гриппа, а также методы изучения физиологии вирусов по динамике синтеза вирусных белков. Описаны методы оценки токсичности препаратов гидрофобизованых антител для клеток, а также методики изучения антивирусной активности гидрофобизованных антител по изменению синтеза вирусных белков и инфекционности вирусного потомства.

РАЗДЕЛ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Глава 3.1 Характеристика иммуноглобулинов, модифицированных, остатками жирных кислот.

В работе использовали моноклональные антитела к вирусу гриппа: клон С-102 к НА штамма А/чайка/Казахстан/470/79 (H1N1), клон Н-12 к NP-белку штамма А/чайка/Казахстан/470/79 (HiNl),

клон F-81 к NP-белку штамш А/чайка/Казахстан/470/79 (H1N1), клон 41С4 к Ml-белку штамма А/Ленинград/80/385/R (H3N2), клон 24В4 к NP-белку штамма А/Ленинград/80/385/R (H3N2), клон 2Е5С1 к Ml-белку штамма A/PR/8/34 (H1N1), а также поликлональные антитела к гемагглютинину штамма А/чайка/Казахстан/470/79 (H1N1).

Моноклонзльные антитела получали из асцитной жидкости с помощью гельфильтрации в ультрагеле АсА-34. поликлональные - из сыворотки кроликов, иммунизированных гемагглютинином, высаливанием насыщенным раствором сульфата аммония , с последующей аффинной хроматографией.

Чистоту полученных иммуноглобулинов проверяли с помощью SDS-электрофореза в востанавливающих условиях. Как правило, на окрашенном геле очищенные иммуноглобулины имеют вид двух полос, соответствующих легким и тяжелым цепям, из которых состоят молекулы этих белков.

Полученные иммуноглобулины модифицировали N-сукцинмимдным эфиром или хлорангидридом стеариновой кислоты, используя в качестве ' среды для модификации систему обращенных мицелл аэрозоля ОТ в октане. Число введенных в молекулу иммуноглобулина жирнокислотных остатков (степень модификации), как видно из данных, приведенных в таб. 1, зависит от молярного соотношения С хлорангидрид] Л белок] в реакционной системе.

Модификация антител остатками жирных кислот приводит к тому, что антитела становятся бифункциональными. С одной стороны сохраняется их основное свойство - блокировать антиген, с другой - они приобретают способность взаимодействовать с клеткой. С увеличением числа включенных в молекулу антитела жирнокислотных остатков повышается ее гидрофобность, и следовательно, способность связываться с мембраной клетки. Однако, при этом снижается антигенспецифическая активность иммуноглобулинов, так как остатки жирных кислот могут присоединяться и в области активного центра. Б настоящей работе показано, что включение в молекулу антител более 3-х жирнокислотных остатков, как правило, приводит к значительному снижению или даже потере их специфической антивирусной активности (таб.1). Эта цифра, однако, не является универсальной и зависит от индивидуальных свойств конкретных иммуноглобулинов. В работе мы использовали антитела, модифицированные 1-2-мя остатками'жирных, кислот. .,

Таб. 1. Характеристика антигенных свойств гидрофобизованных иммуноглобулинов в зависимости от степени модификации.

клон Молярный избыток степень Титр В кол-во

хлорангидрида модифика- ELISA, экспери-

по отн. к белку ции (*) Z от ис- ментов

при модификации ходного

поли, Н12 1:2000 5,0 + 0,5 . Q,5Ti 7

F81, 41С4

2484

поли, С102 1:700 3,0 t 0,5 50% •>

Н12, 41С4 1:400 2,5 ± 0,5 66% 5

2Е5С1

F81, Н12, 1:200 1,1 + 0,1 1007. 5

2Е5С1, -

поли

поли 1:100 0,6 ± 0,1 100% 2

поли 1: 50 0,02 ± 0,01 100% 1

поли 1:20 0,00 не определяли

(*)- Определяли по радиоактивности антител, модифицированных 14С-стеариновой кислотой.

Усиление гидрофобных свойств иммуноглобулинов проверяли по их способности включаться в липосомы. Процентное отношение количества иммуноглобулинов, содержащихся во фракции липосом и фракции свободных иммуноглобулинов (разделенных в градиенте фиколла), к общему количеству иммуноглобулинов в образце представлено в таб. 2. Данные, представленные в этой таблице показывают, что с повышением степени модификации способность иммуноглобулинов включаться в липосомы усиливается. Иммуноглобулины, модифицированные 2-3 остатками жирных кислот, включаются в липосомы в 2 раза лучше, чем нативные. И только незначительное .количество иммуноглобулинов, имеющих степень модификации 10, остается в свободном состоянии.

Таб. 2. Процент включения иммуноглобулинов в липосомы в зависимости от степени модификации.

степень модификации иммуноглобулинов Доля свободных иммуноглобулинов, в X от общ. Доля иммуноглобулинов, включенных в липосомы, в X от общ.

0 88% 12%

(нативные)

2,5 77% 23% .

10 25% 75%

3.2. Связывание гидрофобизованных антител с мембранами клеток. /

Анализ связывания стеароилированных иммуноглобулинов с мембранами клеток проводили на культуре клеток ШСК, незараженных и зараженных вирусом гриппа. Для этого определяли радиоактивность лизатов клеток, предварительно инкубированных с 1251-меченными антителами к гемагглютинину вируса гриппа.

Полученные данные представлены на рис.1А. С одной стороны появление гемагглютинина на поверхности зараженных клеток приводит к увеличению связывания немодифицированных антител. Это объясняется специфическим взаимодействием антител с антигеном на клеточной поверхности. С другой стороны введение - остатков стеариновой кислоты в молекулы антител приводит к значительному увеличению связывания с клетками. Этот эффект более выражен для. зараженных клеток. В этом случае связывание стеароилированных антител в 3,3 раза выше, чем с незаряженными клетками. Более того, количество стеароилированных антител, связанных, с зараженными клетками, по крайней «ере в 3 раза выше суммы количеств немодифицированных антител, связанных с зараженными клетками, и гидрофобизованных антител, связанных с незараженными клетками.. ' "•

Независимый эксперимент показал, что константа связывания и число центров связывания свободной 114СЗ-стеариновой кислоты одинаковы, как для. зараженных, так и незаряженных клеток. Свя?анная с клетками Г14С1-стеариновая кислота не вытесняется

20-кратным избытком немеченной стеариновой кислоты (данные не приведены). На основании этого можно утверждать, что связывание остатков жирных кислот является неспецифическим и не опосредуется никакими рецепторами.

В

кол-во м-Л 1£/КЛ

К=5.5Е-9 пМ

Рис.1. Связывание нативных (1) и гидрофобизованных (2) поликлонадьньас антител к гемаггл»?йиину вируса группа с незаряженными (N3 и зараженными (I) вирусом гриппа А/чайка/Казахстан клетками МОСК.

A) Количество молекул антител на одну клетку. [Незаряженные и зараженные (12 ч. п. з.) клетки инкбуировали при +4 С 5 ч в растворе Хэнкса, содержащем 6,2 нМ 1251- меченных антител].

B) Определение константы и количества центров связывания антител с зараженными клетками.

В - количество связавшихся атител;-Т - общее количество антител.

Данные по связыванию немодифицированных и стеароилированных антител с зараженными клетками представлены в координатах_ Скэтчарда (рис. 1В). В условиях эксперимента ацилирование жирными кислотами не оказывает влияния на константу связывания антител с зараженными клетками, но приводит к 10-кратному увеличению числа центров связывания. В то же время число центров связывания стеариновой кислоты в 6 раз выше. Это, вероятно,

связано с различием геометрических размеров этих молекул. Количество центров связывания стеариновой кислоты, а также нативных и модифицированных антител к гемагглютинину на клетках ШСК приведено в таб. 3.

Таб. 3. Количество центров связывания стеариновой кислоты и иммуноглобулинов с незараженными и зараженными вирусом гриппа клетками ШСК.

Препарат

Количество центров связывания с клетками МЭСК, (молекул/клетку)

Количество центров связывания с клетками МОСК, зараженными вирусом гриппа, (молекул/клетку)

Стеариновая

кислота б*10б 6*10®

Шликлональные

антитела к ^

гемагглютинину 0,5*10 (*) 1,5*10

Стеароилированные

поликлональные

антитела б

к гемагглютинину 2.3*10 (*) 1,6*10

(*) - Эти цифры получены при одной фиксированной концентрации антител (6,2 нМ).

Для объяснения эффекта усиления связывания

гидрофобизованных антител с зараженными клетками мы предположили, что общее количество связанных с клетками антител состоит по крайней мере из трех частей. Часть антител включается в мембрану клетки только через жирный якорь. Часть антител специфически связывается с гемагглюгинином. Третья часть' антител связывается с клетками одновременно через остаток жирной кислоты и через антигенный сайт гемагглютинина. Вероятно также, что гидрофобизация сообщает антителам способность взаимодействовать с молекулами гемагглютинина, антигенные сайты которых недоступны для немодифицированных антител. • "

3. 3. Влияние модифицированных ' .антивирусных антител на

репродукцию вируса гриппа в культуре клеток.

Основной системой для изучения репродукции вируса гриппа служила культура клеток МССК, зараженная определенными штаммами вируса гриппа и подвергнутая в различные периоды репродукционного цикла воздействию изучаемых гидрофобизоЕалных антител. Влияние модифицированных антивирусных антител на репродукцию вируса гриппа оценивали по двум параметрам:

1. В зараженных клетках через определенные периоды времени определяли скорость синтеза вирусспецифических белков;

2. Через определенные промежутки времени определяли инфекционность вирусного потомства, полученного в среде культивирования зараженных клеток.

Для анализа воздействия гидрофобизованных антител на репродукцию вируса в клетках важно разделить специфическое антивирусное их действие и неспецифическое токсическое влияние на процессы метаболизма клеток, следствием которого может, явиться нарушение синтеза вирусных белков и процесса сборки.

При совместном инкубировании незараженных и зараженных клеток с гидрофобизованными иммуноглобулинами было выявлено, что высокие концентрации иммуноглобулинов оказывают токсический эффект, видимый по снижению скорости или отсутствию включения радиоактивной метки в вирусспецифическиё белки (данные не приведены). Токсичность гидрофобизованных иммуноглобулинов определяется главным образом способом их очистки от компонентов модификационной системы.

• Дня изучения специфического - воздействия модифицированных иммуноглобулинов на репродукцию вируса гриппа в культуре клеток необходимо придерживаться концентраций'не превышающих предел, за которым препарат становится токсичным для клеток. На основании проведенных опытов установлено, что препараты иммуноглобулинов, концентрация которых не превышает . 100 мкг/мл, не оказывают токсического действия на клетки.

Скорость синтеза вирусспецифических белков определяли по включению 14С-меченных аминокислот. Исследование динамита накопления вирусных белков в зараженных клетках показало, ' что модифицированные антитела к внутренним белкам вируса гриппа (клоны М2 И 2Е501), добавленное до и:во время заражения, в

отличие от ^модифицированных подавляют синтез вирусных белков на ранних стадиях инфекции (до 4-х ч после заражения). На поздних стадиях инфекционного процесса уровень синтеза вирусных белков в образцах, обработанных как нативными, так и модифицированными антителами, выравнивается во всех пробах (данные не приведены). В этих же экспериментах было установлено, что модифицированные иммуноглобулины не влияют на синтез белков вируса везикулярного стоматита, относящегося к семейству рабдовирусов и не имеющего антигенного родства с вирусами гриппа, в период до 4 ч после заражения. Это подтверждает специфическое подавление модифицированными . иммуноглобулинами синтеза вирусспецифических белков штамма, к белку которого эти антитела были получены. ' .

Подавление синтеза вирусспецифических белков в зараженных клетках зависит от концентрации модифицированных антител в среде. Чем выше концентрация модифицированных иммуноглобулинов, тем сильнее подавление синтеза вирусных белка. При этом включение 14С в вирусные белки в зараженных клетках, инкубированных с нативными и контрольными иммуноглобулинами, остается неизменным вне зависимости от концентрации (данные не приведены).

На следующем этапе исследовали влияние модифицированных антител к внутренним белкам вируса гриппа на инфекционность вирусного потомства. Для этого монослой клеток ШСК инкубировали с натиными, контрольными и гидрофобизованными иммуноглобулинами в различные периоды репродукционного цикла: до заражения, на ранних стадиях после заражения и на поздних стадиях репродукционного цикла вируса гриппа Клетки заражали тем штаммом вируса, к белкам которого были получены антитела Урожай ' вирусного потомства собирали через 20 ч после заражения и определяли его инфекционность, используя тест бляшкообразования. Для сравнения использовали вирус везикулярного стоматита, не имеющего антигенного родства с вирусами гриппа.

Как видно из таб. 4, обработка монослоя клеток модифицированными антителами к Ш-белку (клон 2Е5С1) до заражения и на ранних стадиях после заражения приводит к снижению титра инфекционности вирусного потомства приблизительно в £0 раа. Натисние н контрольные антитела к этому белку не оказывают блияния на 'инфекционность вирусного потомства.

Инкубирование зараженных вирусом гриппа клеток как с наткЕ.чымл. так и с гидрофобизованными атителами на поздних стадиях репродукционного цикла не влияет на инфекционность вирусного потомства. Антитела к М1-белку не влияет на репродукцию г и руг:; везикулярного стоматита ни на ранних, ни на поздних стадиях репродукционного цикла.

Таб. 4. Инфекционный титр вируса, полученного через 20 ч пс^ле заражения клеток, инкубированных с антителами к М1-белку (клон 2Е5С1)в различные периоды репродукционного цикл?..

штамм заража- тип мо- концен- Инфекционность вирусного потомства

вируса ющая дификации трация БОЕ/мЛ

доза, антител антител, Время инкубации клеток с антитела

БОЕ/кл мкг/мл 4 ч до заражения 0-6 ч после заражения 6-16 Ч нее. заражен и

РЯ8 о.е нат. 20 контр 20 гфб. (п-3,0) 20 3,6*106 9,05*105 9,05*10"* 6,35*106 ■3,6*10^ 2,54*10б '2,63*106 1,4*105 3,6*106 1,63*10й 2,32*10® 2,23*19б

У5У 5 - - 1,1 *109 1,1*Ю'] 1,1*10 9

нат. 20 б,35*10& 1,09*10^ 1.0*10«

контр. 20 1,1*109 1,09*109 8,6*10® 1,05*105 1.1*104

гфб. (п=3,0) 20 1.0*1 о'"

Предполагается следующий механизм блокирования заражения клеток с помощью модифицированных антител, специфических к' внутренним белкам . вируса гриппа. Внутренние белки в структуре вириона находятся под оболочкой. Ассоциированные с мембраной клетки антитела к внутренним белкам не могут взаимодействовать со специфическим антигеном, прикрытым оболочкой. В'.рион беспрепятственно адсорбируется на мембрану клетки и г^ин;:ка-;т внутрь по механизму рецепторно-зависимого зндсцитога. Вирусная частица оказьггавется включенной в эндоссмалькые компартм^нты внутри клетки. Предполагается, что мембрану эндоиктогк'.т-пузырька может образовывать часть мембраны клетки с гкл^1;•.!.:.■ •

- 12 - -

в нее антителами. Таким образом, ■ антитела оказываются внутри клетки в составе новой вакуоли одновременно с вирусной частицей. Пусковым фактором, индуцирующим слияние вирусной оболочки с мембраной эндосомы является кислая реакция среды с рН в районе 5,0-5,5, которая устанавливается в эндосоме спустя некоторое время после зндоцитоза В результате вирусный нуклеопротеид освобождается от ободочки. Вероятно, в этот момент для антител, включенных в мембрану эндосомы, открывается доступ к внутренним антигенам вируса Взаимодействие антител с внутренними антигенами блокирует дальнейшие события при заражении клетки.

Таб. 5. Инфекционный титр вирусного потомства через 20 ч ■ после заражения клеток МХЖ различными заражающими / , дозами вируса гриппа РР8. [Клетки инкубировали с антителами, специфичными к Ш-белку вируса гриппа РИЗ (клон 2Е5С1), во время заражения и 6 ч после •заражения)].

заражающая тип моди- концен- инфекционность

доза, БОЕ/КЛ фикации трация урожая вируса,

антител антител, БОЕ/мл

мкг/мл

0,2 - ' - . 3,6*10®

нат. . 20 2,54*10®

контр. .20 2,68*106

„ , . гфб. (п=3) 20 1,4*10®

5,0 '•-. - - 1,23*10®

нат. 40 7,25*105

контр. 40 1,0*10б

гфб.(п-1,1) 40 • 2,4*10® .

10,0 - - • 1,04*10® ^ .

нат. 40 ' 7,25*10*

контр. 40 5,95*104

гфб. (|>2,3) 40 1,0*105

Эффект снижения инфекционности вирусного потомства, полученного из зараженных клеток, обработанных модифицированными антителами к М1- белку до заражения и на ранних стадиях после заражения, зависит от множественности заражения клеток вирусом. Как видно из таб. 5, с увеличением множественности заражения клеток, способность модифицированных антител к М1-белку Еируса гриппа специфически влиять на инфекиионность вирусного потомства исчезает. Общее снижение титра инфекционности вирусного потомства при высокой . множественности заражения, вероятно, обусловлено образованием большого количества интерферирующих (дефектных) вирусных частиц.

Блокировать репродукцию вируса модифицировании« антителами к поверхностным антигенам (гемагглютйнину),- следуя стратегии репродукции вируса гриппа и исходя .из механизма взаимодействия антител с поверхностными белками вируса гриппа, возможно двумя основными путями: -,.-.■

1. блокировать заражение клетки вирусом,

2. блокировать сборку и почкование вируса с поверхности клеток.

Следуя логике зкспертеента для того, чтобы блокировать процесс заражения клетки вирусом, их необходимо инкубировать с модифицированными антителами к поверхностным белкам вируса гриппа до заражения. Тогда, гидрофобизованные молекулы антител, включаясь в-мембрану клетки, блокируют заражение, взаимодействуя с вирусом. Для сравнения способности нативных и гидрофобизованных антител к поверхностным антигенам вируса гриппа влиять на процесс заражения использовали метод бляшек.

При таком подходе модифицированные поликлональние антитела к гемагглюгинину, добавление к клеткам до заражения, снижают заражающую дозу приблизительно.,в 15 раз (рис. 2). Нативнке антитела также снижают заражающую дозу вируса при добавлении к" клеткам до заражения, но значительно менее эффективно.

- -: Добавление нативных и модифицированных поликлональных антител против гемагглютинина к клеткам сразу после заражения также вызывает незначительное снижение множественности заражения (рис. 2). Это может быть связано с тем, что процесс заражения клеток вирусом продолжается во времени.

Предполагается.что гидрофобизованные антитела к

гемагглюгинину вируса гриппа, ассоциируются с мембраной клетка. •При заражении вирион, адсорбируясь на мембрану клетки.

встречается с включенным в нее антителом. Таким образом, вирион теряет свои инфекционные свойства. Нативные иммунглобулины плохо взаимодействуют с мембраной клетки. Поэтому после удаления среды, содержащей нативные антитела, вирус не встречает препятствий на мембране в процессе заражения.

количество образовавшихся

Рис. 2. Влияние модифицированных поликлональных антител к .гемагглютинину вируса гриппа на процесс заражения клеток вирусом. [Концентрация антител = 25 мкг/мл; степень модификации = 0,-6; множественность заражения = 25 БОЕ/мл]. 1 - Зараженные, клетки; 2 - клетки, инкубированные с нативными антителами 1 ч сразу после заражения; 3 - клетки, инкубированные с гидрофобизовайными антителами 1 ч сразу после заражения; 4 ~ клетки, инкубированные с нативными антителами 1 ч до заражения; 5 - клетки, инкубированные с гидрофобизованными антителами 1 ч до заражения.

Блокировать сборку и созревание вируса гриппа можно путем добавления антител, специфических к гемагглютинину вируса гриппа, в период, когда новосинтезированные поверхностные белки вируса пояляются на повер<ности клетки-хозяина.

Добавление мсдифицирозанных поликлональных антител против гемагглюткнина вируса гриппа, к зараженным клеткам на поздних стадиях инфекционного цикле вируса гриппа (новосинтезорованный

гемагглютинин появляется на поверхности клетки приблизительно через 3 ч после заражения) снижает инфекционность вирусного потомства. Как видно из таб. 7, гидрофобязованные антитела подавляют сборку и созревание вируса в 2-3 раза э$октигкео кативных антител. Нативные антитела в свою очередь снижают инфекционность вновь синтезированных вирусных частиц в 1,5-2 раза по сравнению с титром вируса, полученного из зараженных клеток, не обработанных антителами.

Гидрофобизованные моноклональные антитела, специфические к гемагглютинину вируса гриппа штамма КИ, в отличие от поликлоклональных не снижают инфекционный титр вирусного потомства при добавлении к зараженным клеткам на поздних стадиях инфекционного цикла (данные не приведены). ' Отсутствие подавляющего эффекта моноклональных антител к. гемагглютинину можно объяснить тем, что антигенный сайт, специфический для данных антител, в гемагглютинине, . экспонированном на мембране зараженной клетки, может быть недоступен для данных антител.

Таб. 7. Инфекционный титр потомства вируса гриппа штамма МЗМ, полученного из клеток, обработанных поликлональными антителами к гемагглютинину на поздних стадиях инфекционного цикла. С Клетки инкубировали с антителами с 3 до 8 ч г.осле заражения].

заража- тип моди- конц. время инфекционность

ющая до- фикации антител, сбора вирусного по-

за, БОЕ/кл антител , мкг/мл уро.чоя потомства. БОЕ/мл

0,1 - - ' - 20 ч 5,95*1

нат. . 20 п. 3. 2,7*10*

гфб.(п=4,3) 20 1,0*10А

0,3 - - 18 ч 8.33*10*

нат. 20 П. 3. 5. 45*10*

гфб. (п=1.1) 20 1,6*103 "

Подавляющий эффект антител против гемагглютинина в этом случае можно обменить следующим образом. Оболочка вируса гриппа собирается на плазматической мембране клетки. Во второй половине инфекционного цикла на поверхности плазматической мембраны зараженной клетки появляются поверхностные белки вируса (гемагглютинин и нейраминидаза). Предполагается, что добавление антител, специфических к поверхностным белкам вируса гриппа на поздних стадиях репродукции препятствует процессу сборки и почкования вирионов с поверхности мембраны клетки . Вероятно также, что новосинтезированная вирусная частица может отпочковться от клетки, несмотря на наличие связавшихся с ней антител. В этом случае связавшиеся с вирусной частицей антитела может блокировать ее инфекционную активность.

4. ВЫВОДЫ.

1. Проведена Модификация антител к внутренним и поверхностным антигенам вируса гриппа остатками стеариновой кислоты в системе обращенных мицелл. Получены препараты антител, содержащее 1-2 остатка стеариновой кислоты на молекулу белка и сохраняющие способность связывать антиген. • Гидрофобизация антител остатками стеариновой кислоты приводит к усилению их способности встраиваться в липиднке мембраны (на примере липосом).

2. Изучены закономерности связывания гидрофобизованных антител к поверхностному антигену (гемагглюгинину) вируса гриппа с зараженными и незараженными клетками. Показано, что гидрофобизация приводит к усилению способности антител связываться как с незараженными, так и с зараженными клетками. Этот эффект наиболее выражен в случае зараженных клеток. Гидрофобизация не приводит к увеличению константы связывания антител с зараженными клетками. Это явление объяснено увеличением числа центров связывания. .

3. Введение гидрофобизованных антител к внутренним антигенам (Ш и МР-белкам) вируса гркппа непосредственно до и во время заражения приводи? к снижении уровня синтеза вирусспецифических белков в зараженных кле?к<1Х на ранних стадиях инфекционного цикла и' снижению инфекциоьности вирусного потомства. Высказано предположение, «о гшрофобизованные антитела способны в результате эндоцягоза зач'затываться одновременно с вирионом в

эндоцитозные компартменты, где они нарушают процесс проникновения вирусного нуклеокапсида в цитоплазму и, тем сама.!, блокируют заражение. В то же время добавление этих антител к зараженным клеткам на поздних стадиях инфекционного цикла на синтез вирусспецифических белков и репродукцию вируса не влияет. 4. Модификация антител против гемагглютинина вируса гриппа приводит к усилению их нейтрализующего действия (блокирование процесса заражения), что, по-еидимому, объясняется усиление-:,! связывания гидрофобизованных антител с мембраной клетки и поверхностью вириона

Б. Добавление гидрофобизованных антител против гемагглютинина к зараженным клеткам на поздних стадиях инфекционного иикла приводит к снижению инфекционности' вирусного потомства, вследствие нарушения процессов сборки и почкования новосинтезированных вирионов.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях.

1. N. S. Melik-Nubarov, Y. G. Suzdal tseva, Е. L. Priss, V.I. Slepnev, A. V. Kabanov, P. G. Sveshnikov. E. S. Sever in. Interaction of hydrophobizied antiviral antibodies with influenza virus infected MDCK cells (1993). BIMBO, v. 27, h'G, p. 1014-1022.

2. V.I. Slepnev, N. S. Melik-Nubarov, Y. G. Suzdaltseva. A. V. Kabanov, B. Goud, 6. Butt in. interaction of artificial hydropiiobizied proteins with mammalian cells (1993). Bioeonjug. Chemistry', in press. ' ' "