Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вариабельность генома вирусов гриппа А при циркуляции в природе адаптации к измененным условиям репродукции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Вариабельность генома вирусов гриппа А при циркуляции в природе адаптации к измененным условиям репродукции"



лкшлы мжщсш наук cccp шютпут ai'ipyccjxonci им д.зитлнозского

На прагах йукопиои y;Ut 578.857.1

ШШЮВ Александр Александрович

МРПШЛШрГЬ ГЕЖЖ Е IP/СОВ ГРИППА А ПР!Г ЦИРКУЛЯЦИИ В ПРИРОДЕ АДАПТАЦИИ К ИЗ.ЕНЕШШ УСЛОЛШ РЕПРОДУКЦИИ

03.00.03 - Молекулярная биология

ДОКЛАД

обобщающий опубликованные научные уаботы на соискание учено!! степени доктора биологических наук

Москва - 1991

Рабата выполнена е лаборатории физиологии Епрусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР.

НАУЧНИЛ КОНОУЛЪТАНТ-

член-корреспондэнт jU.il! СССР, доктор мед.наук, профессор Н.В.Каверин.

ОйЦИАЛКЕК ОППОНЕНТЫ:

член-корреспондент АН СССР, доктор биологических наук, профессор Ю.З.Ильин;

доктор ;.!едшгинскзх наук, профессор В.А.Зуев доктор биологических: наук, профессор Г.А.Гплегсв"

1ЩШЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Всесоюзный 1СПГ гриппа :!3 СССР

Запита состоится г. в часов на

заседании Специализированного Соезтэ'Д ОС 1.20 Л'I при Институте вирусологии им. л.И.ИваноЕского .Ш СССР. Москва, 123С93, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией ложно ознакомиться е библиотеке Института вирусологии им. Д.П.Пванорского А1Ш СССР.

Авторе Герат разослан "/г?" ¿рр 1991 г.

УчентИ секретарь Специализированного Сонета, кандидат гедпггшскпг наук

А.Н.1уК0ВСК1П

Актуальность проблемы.

Значительный интерес, проявляемый к изучению биологии вирусов гриппа, определяется в первую очередь исключительно важной ролью этих вирусов в инфекционной патологии человека и.животных. Известно, что вирулентные для человека вирусы гриппа А способны вызывать эпидемии и пандемии, охватывающие большую часть населения. Вирусы гриппа являются уникальными среда возбудителей инфекционных-заболеваний человека вследствие его способности быстро изменять антигенную специфичность, преодолевать иммунный барьер и менять спектр хозяев. Природа необычайно высокой изменчивости вирусов гриппа, многообразие серо-подтипов и широкий спектр хозяев, а такав пути возникновения новых эпидемических штаммов продолжают оставаться актуальными вопросами современной биологии этих вирусов.

Значимость изучения молекулярно-генетических закономерностей циркуляции вирусов гриппа А в природе, молекулярных основ вирулентности, и адаптации, к новому хозяину, антивирусного действия химиоте-рапевтических препаратов определяется нерешенностью ряда принципиальных вопросов:

- недостаточным пониманием закономерностей эволюции вирусов гриппа в природе, еоциркуляции вирусов гриппа человека, животных и птиц и путей возникновения новых эпидемических штаммов. Расширение спектра знаний в этой области поможет своевременному, прогнозированию потенциально возможных эпидемий и созданию своевременных и эффективных профилактических препаратов;

- нерешенностью вопроса о генетических маркерах вирулентности и факторах, влияющих на вирулентные свойства и уровень репродукции, вируса в различных клеточных системах и организмах. Решение этих вопросов поможет разработать подходы к созданию эффективных и безопасных вакцинных препаратов на основе различных адаптированных или ат-тенуированных вариантов вирусов, а также сконструированных генетических рекомбинантов;

- недостаточной изученностью механизмов антивирусного действия химиотерапевтических препаратов, а также механизмов селекции вирусных вариантов, устойчивых к их действию. Прогресс в этом направлении даст возможность разработать более эффективные антивирусные химио-терапептические препараты, а также, возможно, разработать пути комплексной химиотерапии гриппозной инфекции.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования заключалась в изучении некоторых общих закономерностей изменчивости генома при циркуляции вирусов гриппа А в природе; изучении ыолекулярнс-генетических основ вирулентности и адаптации к новому хозяину; изучении молекулярных механизмов приобретения вирусами гриппа устойчивости к действию химиотерапевта-ческих препаратов и факторов повышенной и. пониженной иммуногенной активности вирусов.

В связи, с от им были поставлен!» следушцие задачи:

- Изучить структурную изменчивость генов природных изолятов вирусов гриппа А серолодтипов НИМ и НЗЕ2 в первый период их совместной циркуляции с 1977 г.

- Выявить возможность лсяшения природных генетических реассор-тантов при. совместной циркуляции Еирусов гриппа Н1М1 и НЗК2.

- Выяснить степень генетического родства нового эпидемического вируса А/СССР/90/77 и ранее циркулировавших вирусов НИИ.

- Изучить особенности структурной организации М-белков вирусов гриппа человека и птиц.

- Изучить генетическую изменчивость и особенности репродукции вируса при адаптации к новому хозяину и формированию вирулентных свойств ( на примере адаптации опидемического вируса гриппа к легким мышей ).

- Установить функциональную роль гемагглютинина в процессах адаптации и формирования вирулентных свойств (на примере адаптации вируса А/СССР/SO/77 к легким мншей и культуре клеток ЭДСК).

- Выявить различия в структуре гемагглютинина вариантов вируса х'риппа с повышенной и погашенной иммуногенной активностью.

- Определить кутации в структуре гемагглютинина серии вариантов вируса гриппа A/FPT/Wsjbridge , устойчивых к действию антивирусного препарата норакин, и их возможную функциональную роль.

Научная новизна работа.

- Показало, что при совместной циркуляции в природе вирусов гриппа двух [.азннх сероподтипоЕ (на примере сооиркуляции вирусов ¡111,4 и кз:'2) одновременно и независимо друг от друга могут происходить антиггнгмй дрейф вирусов обоих, серолодтипов и перегруппировка по генам внутренних белков исхду вирусами разных серолодтипов.

- Показано, что эпидемический вирус гриппа НИИ А/СССР/90/77 можно рассматривать как реассортант гю PüK-сегмонту 7, кодирующему

М-белки. Альтернативам объяснением. различий в структуре М-геной и. антигенные различия ¡«1-белков вирусов А/СССР/90/77 и А/ЯЧ/1/50 макет быть генетический диморфизм в популяции штаммов, циркулировавших в 1950 или 1977 гг.

- Обнаружено, что в струзгтуре бедхоз М1 и М2 вирусов гриппа человека и. птиц существуют характерные аминокислотные позиции, в которых находятся строго определенные аминокислоты, специфичные для вирусов каждой группы.

- Показано, что мутации в структуре гемагглютинина, необходиг ыые для адаптации вируса к условиям репродукции в клеточной системе нового хозяина, оказывается недостаточным! для образования вирулентного вируса.

- Установлено наличие корреляции иммуногенной активности вируса гриппа А с рецептор-связывающей активностью его гемагглютинина и. стимуляцией пролиферации Т-хелперов и. Т-цитогоксических клеток.

- Впервые проанализирована структура гемагглютинина целой серии мутантов вируса гриппа А/РРУ/^Ьгицз » устойчивых к действию антихолинергического препарата норакин. Показано, что мутации могут дестабилизировать структуру гемагглютинина при рН 7,0, нарушая водородные связи и солевые мостики, ответственные за внутри- и межмоле-кулярша взаимодействия, а также дестабилизировать положение фьюжн (Хис1оп)- пептида, способствуя конформациоиным изменениям в структуре гемагглютинина в присутствии ингибитора, необходимым для слияния вирусной И: клеточной мембран.

Практическая ценность работы..

Полученные результаты позволяют глубкэ понять пути естественной изменчивости вирусов гриппа при циркуляции в природе, яснее представить механизмы образования ногых эпидемических штаммов и выявить роль рекомбинации б этой процессе.

Обнаруженные особешосш структурной организации М-белков вирусов гриппа человека и. птиц могут бить использована в качестве тест-критерия для установления видового источника происхождения 7-го сегмента вирионной РНК при' анализе генного состава вновь выделенных природных изолягов вирусов гриппа.

Б процессе проведения исследований были разработаны методичеа-кие рекомендации по применении молекулярно-биологйчоских методов изучения структуры вирусных геномов, которые были утверждены: 3£ц<ифц

Советом Института вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР и включены в составленные проблемной комиссией по общей вирусологии сборники: "Олигонуклеотидное картирование вирусных нуклеиновых кислот" (в сборнике "Методические рекомендации по применению современных методов исследований в общей и медицинской вирусологии", Москва, 1984, стр. 16-22) и "Определение первичной последовательности •. (секзенирование) вирусных РНК с помощью комплементарных сиятетиг чоских ДК-прайыеров" (б сборкике "Методы исследования а молекулярной, общей и. медицинской вирусологии^, Москва, 1987, стр. 5-13).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. При совместной циркуляции в природе вирусов гриппа двух разных сероподтипов (на примерз ооциркуляцин.начиная с 1977 г. эпидемических вирусов' НИИ и H3N2 ) антигенный дрейф вирусоа обоих сероподтипов и. перегруппировка г.о генам внутренних белков иеаду-вирусами, разных сероподтипов могут происходить одновременно и независимо друг от друга. Причем при такой реассортации может наблюдаться различная перегруппировка.генов внутренних белков сохранением, антигенной специфичности, характерной для га&дего сероподтипа. Это дает основание ■ рассматривать процесс пересортировки генов как-, один из механизмов возникновения новых эпидемических штаммов вирусов гриппа. . . ■

2. Вирусы гриппа А Н1Н1 , выделенные в IS77 г. а знаменовавшие собой повторную циркуляции вирусов данного сероподтипа, могут представлять собой реассортанты tío генам внутренних белков. На примере вируса гриппа А/СССР/90/77 показано, что его можно рассматривать как реассортант по НК-сэшенту 7, кодирующему М-белки. Альтернативным объяснением различий в структуре ;í~r-енов и антигенные различия HI-белков вирусов А/СССР/90/77 и л/FН/-1/50 может быть генетический' диморфизм в популяции штаммов, циркулировавших в 1950 или 1977 гг.

3. гак-сегмент 7 и кодируемые им белки MI и ЬЕ вирусов гриппа, выделенных от разных источников (птицы и человек) , имеют характерные структурные особенности. Существуют фиксированные позиции аминокислот в составе белков MI и М2, в которых находятся определенные аминокислоты, специфичные для вирусов птиц и вирусов человека, с которыми можно ассоциировать существенные биологические свойства вирусов, в частности.ограничение круга хозяев. Выявленная закономерность мокет служить в качестве тест-кратерия для установления, видового источника происхождения 7-го сегмента ьириенной РНК при анализе генного состава еноеь выделенных природных изолятов вирусов гриппа человека и. животных.

4. Структурная изменчивость речагглютинина может быть необ-

. ходиыой для адаптации вируса гриппа к условиям репродукции в клеточной системе нового хозяина, но, позидимому, недостаточной для , формирования вирулентных свойотв адаптированного вируса. При. адап-' тации вируса гриппа к новому хозяину ( на примере адаптации, вируса , А/СССР/90/77 к легким, штей) можно получить вирулентный и. авиру-лентный варианты вируса, прошедшие одинаковую пасеатаую историю в органе-мишени, которые имевт идентичные по структур гемагглютини-ны, но существенно различаются по уровня репродукции. Ыолко пред-■ полагать, что существенный фактором в формировании вирулентных : свойств вирусов гриппа в процесса адаптации является селекция мутантов по генам..внутренних белков, набор которых,может обеспечить более высокий уровень репродукции вируса.

5. Различия в уровна иммуногенной активности вариантов вируса гриппа, полученных от одного родительского вируса путем избирательной иммуноселекции, могут определяться различиям в рецептор-СБЯзывающей активности их гемагглютининов и степенью активацик пролиферации Т-клетог. вследствие произошедших мутаций в рецепт.ор-свя-аывающей области молекулы■гемагглютиНина;

6. Мутации в структуре гемагглютшпша вариантов вируса гриппа А, устойчивых к антивирусному действию антихолинергичаского препарата норакин, могуг дестабилизировать структуру гамггглютинина при. _эН 7,0, нарушая водородные связи, и солевые мостики, ответственные за внутриг и метсубъединичные взаимодействия, а также дестабилизировать положение фьюжк-пептида, Это способствует конформационным. изменениям в структура гемагглютшина, которые необходимы для слияния вирусной и меточной мембран в присутствии ингибитора.

Апробация работы.

Материалы диссертации бь:лк доложены на конференциях молодых учешх и специалистов Института вирусологии км. Д.И.Ивановского АМН СССР (1981, 1983, 1985 гг.) и Института молекултрной биологии АН СССР (1901 г.) конференции молодых ученых в г. Юрмала ( 1981 г.) конференции молодых ученых й г. Одесса (1989г.) ; на Всесоюзной конференции "Рекомбкнантные ДНК" (Пущино, 1982) ; на конкурсах научных раОот Института вирусологии им. Д.К.Ивановского АШ1 СССР (1Э85, Г£"?0 гг.); на 16-ой конференции $Э£0 (.'¿огкпа, 1984 ) ; на международных скмпсг пумах "Грипп и гепатит" (Носкьа, 1983, 1985 гг;

Суздаль, 1988) ; на ХУШ-ом съезде Всесоюзного научного общества микрсОиологов, эпидемиологов и паразитологов (Алма-Ата, 1989) ; на УИГ-ом международном вирусологическом конгрессе (Берлин, IS90).

К К

Основные результата, изложенные в диссертации, получены з соавторстве с В.М.ЗДашвыы, 0.В.Чайка, Б.В.Снющыным, Й.А.^дне-вой, А.Г.Букринской, Я.Н.Селивановым, З.И.Робновой (Институт виг русологки им. Д.И.Ивановского АМН СССР); А.А.Баевым, О.В.Козло-еш, А.Г.Курыановой (Институт молекулярной биологии ш. В.А.31гель-гардта Ali СССР ); Ю.З.Рендоном, А.И.Клииовым, С.Г.Маркупшным (Московский НИИ вирусных препаратов АШ СССР ); Г.С.Окрипченко, А.И. Поноыаренко (НИИ вирусологии vi эпидемиологии ш.;. И.И.Мечникова, г. Одесса) ; З.К.Чуваковой, И.В.Демьяненко (Институт микробиологии и вирусологии АН Казахской ССР, г. Алма-Ата) ; С.Прёш, X.Хай-дер (Институт вирусологии, Университет Гумбольдта, г. Берлин) .

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы. ■'

В работе били использованы природные изоляты вир; . г гриппа А человека, животных и птиц; вирусы гриппа, адаптированные к клеточным культурам и, легким мышей, клонированные вирулентные и ави-рулентные варианты вирусов; мутанты вирусов гриппа, устойчивые к действию антивирусных химиотерапевтических препаратов (норакин, ремантадин) ; варианты вируса гриппа, различающееся по иммуноген-ной активности; белые беспородные шаш, культуры клеток животных (МДСК, фибробласгы эмбрионов кур) , куриные.эмбрионы.

Использовались различные вирусологические, иммунологические, молекулярно-биологичезкие и генноикженерные методы: культивирование, клонирование и пассирование вирусов гриппа в культуре клеток, на куриных эмбрионах и в легких мышей; постановка реакций РТА, РГГА, иммунс$ер.мектные методы с использованием поликлональных и моноклоналышх антител к поверхностным глккопротеикам и внутренним белкам вируса; концентрирование и очистка вирусов, выделение и препаративной электрофорез РШ в геле; обратная транскрипция к клонирование вирусных генов в состаге плазмидннх и фаговых Еекто-ров; елнгенуклеогздное картирование вирусных генов с использова-

кием системы двумерного электрофореза в полиакриламидном геле; ги-бридизационный анализ вирусных нуклеиновых кислот; секвенирование вирусных генов с помощью методов Каксама-Гилберта и Сэнгера; прямое секвенирование сегментов вирионной РНН о помощью синтетических ДНК-праймеров; компьютерный анализ аминокислотных позиций и аыинокист лотшх замен в структуре гечаггл^тишша с. использованием его трехмерной модели.

I. Структурная изменчивость генома вирусов гриппа А _при циркуляции в природе __

Вирусы гриппа являются уникалышш среди, возбудителей инфекционных заболеваний человека, так как они. даат цмрокий спектр генетических вариантов. Известно, что вирусы гриппа Л могут лретерпевать. два типа антигенных изменений по отношению к их поверхност>шм гли-копротеинам С гемагглютинину и нейраминидазе ) : антигенный дрейф, связанный, с небольшим модификациями в структуре поверхностных бел-коз,, и антигенный сдвиг,, связанный с существенными изменениям! поверхностных белков, вируса И' приводящий к возникновению эпидемически.» штаммов,, несущих новые поверхностные антигены.

Согласно существукхцим представлениям новые эпидемические штамг мы могут возникать либо из циркулирующих, в популяции вирусов человека или животных вследствие произошедоих мутаций, либо путем рекомбинации между вирусами человека и. животных, несущими отличные поверхностные антигены. Под рекомбинацией в* данном случае подразумевается обмен ( перераспределение ) генов вирусов человека и животных при. совместной инфекции одной клетки двумя разными вирусами, Б силу особенностей организации генома вирусов гриппа А, представленного восемью ковалентно не связанными сегмента.1^ одноцепочечной РНК, такая рекомбинация может осуществляться о высокой эффективностью.

В последние годи для изучения обитое закономерностей изменчивости генома вирусов гриппа разработан ряд эффективных молекулярно-биологических подходов. Для сравнительного анализа структуры РНК-генов природных изолятов вирусов гриппа А на первых этапах исследований наш бил использован метод олигонуклеотидного картирования индивидуальных генов ( сегментов вирионной РНК ) вируса. Принцип метода заключается е анализе распределения олигонуклеотидов, образующихся в результате гидролиза исследуемой молекулы РНК рибонуклеаг-

uoii 1'j, при разделении их в системе двумерного электрофореза в по-лг.акркл'иждшм голе, где п пприом направлении ( рН 3,5; 1(Ж-шй гель) разделение идет и основном за счет суммарной величина заряда олнгонуклеотида, а во втором направлении ( р!1 8,3; 22,8»-ный гель ) они разделяются по размеру. На полученной таким оОразсм олигонукле-отидной карте (Т^фингерпринтс) положение каждого олигонуклеотида строго зависит от ого длины и нуклостидлого состава. Следовательно, любая замена ссно1шшй в всследусмой РШ кожст быть оОп ipyxena по иомоиени» поло.;;енг.н, ВСЧ801ГОВСШЮ или поквлеиида ног."' с олигонукле-тида. Система двумерного электрофореза, испольгсга. -а нами, даег оптимальное разреиенио для олигокукдоотидо», hkci. . длину сшшс десяти нуклеотидов, а ввкду того, что олигонук.-.< -.луц статистически ¡кюяредолсяи по длине исследуемой молекулы ! ;5С, можно считать, что они равномерно '¡рпдеташишг всю последояа гольность анализируемой РгК. &<сиерак<шташшя процедура олигонуи-.еотидного картирования в основном соответствует усог>ер'ленстг.о;>анпому методу, описанному Pcderacn й HaceXtine (19Ю).

Елрус гриппа А имеет сегментирований геном, представленный восемью одноцепочечными НЖ отрицательной полярности, кодирупирши набор белкоЕ: полимеразныо белки (FBI, РВ2 и РА) , гемагглвтишш (НА ), нейраминидазу (НА) О'елок нуклеопротеина (И1) белки Ml л î.2 (И }и неструктурные белки ИЗ. Сегменты вирнонной РНК разделяли электрофорезом в полиакрила'.мдном, агарозном или сополиыерных гелях, содсркщих мочевину. Высокомолекулярные сегменты РНК, кодирующие полимеразнне белки (,в основном FBI и ГВ2) , как правило, не удавалось хорошо разделить, поэтому в большинстве случаев их анализировали вместе.

I.I. Вариабельность генома эпидемических штаммов вирусов гриппа А сероподтипов H1N1 и K3HZ _при совместной циркуляции. _

Известно, что в течение последних десятилетий в популяции людей циркулировали вирусы гриппа А сероподтипов Н"К1 (1947-1957 гг.) , \izv.z (1957-1968 г), ЯЗЯ2 (с IS68 г. по настоящее время ). Причем появление нового сероподтипа сопровождалось вытеснением ранее доминировавшего. В 1977 г. из популяции людей были вновь выделены вирусы сероподтипа к-им вначале в Китае, затеи в СССР и зимой

1977-1373 гг. от.;.-- часяаа к> т-г и :и;г;ус.:,!-л иполгдплась

по восау Сеьвдоюку ¡1. ущрш ^••.•¿«иг СонигчЛ). При

этом наблюдалась одновременная ссциркуяяци« вирусов ид:;; , что несколько противоречило гбцепрлкятш« прадстааяониям о сменяемости серолодтипов. В опытах по епежпшону трачению клеток эукариог дпу-11Я разными вируса>,я гриппа А установлено, что генетические реассор-тантн могут образоьпсаться с несьиа ш:со:со!1 частотой. Предстзвлн-лось важным выяснить, сколь о^Ьективно ото? процесс может происходить при совместной циркуляции в природе и, кроме того, оценить скорость накопления мутаций (замен оснований Р1Ю я геноме вируса. Поскольку с 1977 г. наблюдалась одноир^'.енн.ч.ч циркуляции ьирусов НИИ и НЗЯ2 , представляло интерес шшить возможные реассортан-тные варианты ьирусов этих двух оеролодтипоз.

Для сравнительного акциза были выбраны три изолята вирусов гриппа Н1И1 - А/СССР/90/77, А/Бразилии/П/78, А/СССР/61/79 и три изолята вирусов 1Щ2 - А/Гонконг/1/68, А/Техас/1/77 и А/СССР/165/79. В качестве референс-шт.аммов били выбраны изоляты СССР/90 и Гонконг. Вирус СССР/90 и сходные с ним варианты знаменовали собой повторное появление эпидемических вирусов чип , вирус Гонконг считается родоначальником дрейфого рада ьирусов НЭН2 . С целью оценки степени структурной изменчивости генов сравниваемых вирусов в процессе естественной циркуляции, определяемой по количеству накопившихся замен оснований в геномной РНК, было проведено сравнение структур сегментов вирионной РНК референс-ытаммов и более поздних изолятов вирусов каждого сероподтипа методом олигонуклеотидного картирования. Результаты количественного анализа олигонуклеотидных карт генов сра-' внимаемых вирусов представлены в Табл. I и 2. Оценку минимального числа замен оснований в анализируемой части сегмента РНК сравниваемых вирусов проводили как описано у НгЛся^иа ей я1., (1973). Такой расчет основан на статистически оправданном допущении, что одна мутация в 50Й случаев может приводить к исчезновению одного и появлению другого олигонуклеотида (парное изменение.) и в 5СЙ случаев ото происходит в результате двух независимых мутаций. Полученные таким образом Ееличины характеризуют минимальное число замен оснований, приходящихся на анализируемую часть исследуемой РНК (Таблицы I и 2, колонка 4) . Но поскольку доля гена, представленная совокупностью анализируемых олигонуклеотидсв,'для разных генов

различна (Таблицы I и 2, колонка 3) , логичнее оценивать степень структурного сходсгра сравниваемых РЩ ло процентной доле замечен -ных оснований (Таблицы I и 2, колонка 5) . Эта величина более строго характеризует степень структурного сходства сравниваемых РНК, так как отражает количество замен оснований, приходящееся на кавдые 100 нуглеотидов сравниваемых последовательностей.

Как ейдно из данных Табл. I, при сравнении вирусов HrvHI наибольшие структурные различия выявляются у сегментов РНК. кодирующих белковую часть гемагглютинина (НА) и М-беяки, а также у сегментов РНК, кодируюарк белки FBI-*FB2 (при сравнении пары вирусов СССР/90/77 и СССР/61/79J . Процентная доля замещенных оснований в этих случаях оказывается довольно высокой - около 254 и выше. Для гена НА она составляет 1,7 и 2,2, что в пересчете на размер гена составляет 30-40 замен оснований, а для М-гена - 20-30 замен оснований на весь ген.

Необходимо отметить, что почти у всех Генов вирусов СССР/90 и СССР/61 наблюдаются более выраженные сгрунтурнне различия, чем у вирусов СССР/90 и Бразилия. Это, повидимому, логично, объясняется тем, что вирус СССР/51 является более поздним по времени изолятом» чем вирус Бразилия, и, следовательно, эволвцмонно более отдаленным от родительского вируса СССР/90. Единственное исключение составляет ген KP вируса СССР/61, который оказывается более близким по структуре гену NP вируса СССР/SO, чем тот не ген вируса Бразилия» Наиболее консервативным среди, вирусов ШИ оказался ген Iis , для которого выявлено не более 4-х замен оснований на весь ген. Дня остальных генов (кроме генов PBI+FB2, НА и И) величина процентной доли замещенных оснований варьирует от 0,1 до 1,3.

Если считать, что время естественной эволюции вируса Бразилия/ II/78 от исходного вируса СССР/90/77 составляет примерно один год, то минимальная оценка скорости накопления мутаций в геноме вирусов гриппа А в процессе естественной циркуляции, рассчитанная на основе сравнительного анализа структурной изменчивости, гена полимераз-ного белка РА вирусов СССР/90 и Бразилия (см. Табл. I, колонка 5) будет составлять около 10"^ замен на одно основание в год. Эта пара сетеонтоп ьирионной РНК выбрана нами потоку, что она обнаруживает каибслыаую гомологи» з стхукгуре ¡:з ecux рассмотренных пар

Таблица I

Анализ олигонуклеотиднцх карг генов эпидемических итаммов вирусов гриппа сероподтмпа Н1М1 : Л/СССР/90/77, А/Бразилия/П/78, А/СССР/61/79.

Ген Сравниваемые сегмент пары

РЖ вирусов

Доля гена, Кмшшальное Процентная представлен- число замен доля

нал аналиэи- оснований'? замещенных

руемыш оли— оснований^ г'онуклеоти-даш, $¿1

рв1+рвп СССР/90-Еразилия СССР/90"С5СР/61 29 6 26 0,6 2,2

РА СССР/90-Бразилия ссср/90-с5ср/61 40 т 1 а 0,1 0,9

НА СССР/90-Бразллия СССР/90-СССР/ 61 32 9 12 1,7 2,2

ЯА СССР/90-Бразилия ссср/90-ссср/61 44 5 8 0,8 1,3

ЯР СССР/ 90-Еразилия СССР/90-СССР/61 41 6 3 1,0 0,5

м СССР/90-Бразилия СССР/90-СССР/61 39 8 13 2,0 3,2 ,

№ ссср/90 -Бразилия ссср/90 -ссср/61 55 1 2 оо

^Определяли, исходя из суммарного размера совокупности анализируй кых олигонуклеотидов и размера соответствующего сегмента РНК.

^Минимальное число замен оснований рассчитывали, согласно Наказа» еЬ а1. , (1970).

'-Процентная доля замещенных оснований рассчитана, исходя из доли последовательности данного сегмента РЖ, представленной анализируемыми олигонуклеотидами. Эта величина характеризует количество закон оснований, приходящееся на 100 нуклэотидов исследуемой последовательности, и отражает степень дивергенции сравниваемых РНК.

Таблица 2

Анализ олигонуклеотидных карт генов эпидемических штаммов вирусов гриппа серолодтипа 1Ш2 : А/Гонконг/1/68, Л/Техас/1/77, Д/СССР/165/79.

Ген сегмент РНК' ) ' 1 Сравниваете пары вирусов Доля гена, представленная аналивиру е;,наш оли-гонуклертп-дами, Кшшмальное число, замен оснований^ ! .......... ■ Процентная доля замещенных основанийЗ

ЕВ1+РВ2 Гонконг-Техас Гонконг-СССР/165 27 у • оо

РА Гонконг-Техас Гонионс-СССР/165 42 6 4 0,63 0,40

НА Гонконг-Техас ■ Гонконг-СССР/165 33 14 2,20 2,60

МА Гонконг-Техас Гонконг-СССР/165 43 2 5 0,30 0,90

№ Гонконг-Техас Гонконг-СССР/165 40 4 2 оо

и» и Гонконг-Техас Гонконг-СССР/165 16 5 5 1,10 1,10

Гонконг-Техас Гонконг-СССР/165 50 7 0,90 1,55

1«2,3 дояснегсяя см. в подписи к Таблице I,

генов. То есть данная пара генов содержит наименьшее количество замен оснований и» следовательно, их возникновение с наименьшей вероятностью модег быть связано с процессами перегруппировки генов при совместной инфешйи, но с наибольшей вероятностью та моя-но отаеетп за счет точечных мутаций в процессе естественной цирку-

ляции вирусов. Во-вгок."-, белок PA, ;;ais гнутрешшй белок вириона, в процессе естественной циркуляции.не подвержен давлению антител в частично иммунной популяции. Тем нз ке:ее, полученная величина минимальной скорости.накопления мутаций - 10"^ замен/нуклеотид/год -в миллион раз превышает скорость накопления мутаций в генах эукари-от (Gojobcri et al.,1935) и хорош соответствует литературном. данным о скорости накопления мутаций у РНК-содержащих вирусов и фагов. В среднем же эта величина для структурной изменчивости генов вирусов гриппа оказывается существенно выше и. может составлю 4-8x10"^замен/нуклеотид/год, что хорошо согласуется с. данными по сравнительному изучению первичных последовательностей генов в'ирусов гриппа, полученных в последние годи (saith &Ра1азв, 1989» Cos et al, 1989} Петров, 1991 ).

Аналогичный анализ бш? проведен для генов вирусов H3N2 (Табл.2) Как и. в случае вирусов ;Ш11 наиоолььио различия обнаружены при сравнении генов НА и М. Процентная доля замещенных оснований для гена НА составляет 2,2-2,6, что соответствует 39-46 заменам оснований на весь ген, для М-гена эта величина составляет II замен оснований. У вирусов этой группы, в отличие от i;:py.':ct ¡rail наиболее изменчивым оказался ген НА.

Необходимо отметить, что для генов поверхностных гликопротеи-нов (НА и НА)'вирусов обоих сероподтипов строго соблюдается корреляция между степенью структурных различий и интервалом во времени изоляции вирусов. Го есть гены крайних по времени изолятов обнарузсива-ют большие структурные различия, чем гены исходного и промежуточного вариантов. Можно предположить, что, поскольку гены НА и NA кодируют гликопротеины оболочки вируса, а направление антигенного дрейфа определяется, повидимому, давлением антител в частично иммунной популяции, то указанная ситуация может исключать для генов поверхностных белков возможность таких процессов как сохранение и накопление обратных мутаций. Это означает, что изменения в структуре генов, кодирующих поверхностные антигены, в процессе антигенного дрей£а могут идти лишь в прямом направлении (накопление мутаций) . Для генов внутренних белков, не подверженных иммунному воздействию, (как, например, для генов нр вирусов обоих сероподтипов, генов Р вирусов НЗН2 ), ситуация может быть иной.

Следует однако подчеркнуть, что количественная оценка струк-

гуркых различий, выполненная данным методом, наиболее достоверна при сравнении близких по структуре РНК. Считается, что при величине процентной доли замещенных оснований более 2, сравнение оказывается менее достоверным и мо.чет иметь место некоторое занижение степени различий сравниваемых РНК (Aaronson et al, 1982). Поэтому величины процентной доли замещенных основашй более 2 (см. Табл. I и 2 ) отражают минимальную величину замещенных оснований.

1.2. Перегруппировка генов между природными изоляталш вирусов гриппа НИИ и К3112

Для выявления возможных реассортантов, которые могли возникнуть при одновременной циркуляции вирусов обоих сероподтипов, мы аналогичным образом сравнивали мззду собой олигокуклеотидные карты генов вирусов Н1Н1 и H3U2 , Еыделекных в перио,; 1977-1979 гг. Поскольку основной целью был поиск возтхных peaceортантоЕ, мы не проводили оценку минимального числа заьен оснований и процентной доли замещенных оснований, а ограничились анализом количества совпадающих и несовпадающих олигонуклеогвдов на соответствующих 4ин-горпрннтах. Результаты такого "перекрестного" анализа приведены на Рис. I и в Табл. 3. Как показано вина (см. Табл. I) при сравнении генов вирусов НИИ у генов, кодирующих белки FBI+PB2 и М вируса СССР/61/79 выявлены существенные структурные отличия по сравнении с аналогичными генами вируса CCCF/90/77. При сравнении генов PBI+ FB2 вирусов СССР/61 и СССР/90 было выявлено 61 совпадающих и 34 несовпадающих олигонуклеотида (при общем числе анализируемых олиго-нуклеотидов, равным 77), тогда как сравнение этих генов вируса СССР/61 с соответствующими генами вирусов H3N2 - Техас и СССР/ 165 - выявило, соответственно, 69 и 70 совпадающих и всего 16 и 20 несовпадающих олигонуклеогидов (Табл. 3 ). Это явно свидетельствует о существенно больней структурной родстве генов H3I+EB2 вируса СССР/6Г к соответственным генам вирусов Н3112 , выделенных в период 1977-79 гг.

При сравнении Ы-гена вируса СССР/61 с М-геном вируса СССР/SO было выявлено 17 совпадающих и 16 несовпадающих олигонуклеотидов, тогда как при сравнения, с а-геном вирусов Техас и Гонконг выявлено, соответственно, 16 и 20 совпадающих и в обоих случаях всего 6 несовпадающих олигонуклеотидов (Табл. 3) . В этом случае М-ген виру

• * У- V

» » о" г

. .. »5

«• о»

•. . I*

• ОТУ/®/»-/}-^

"¡Г'

// :

к ото'дя/»*)

I

I > г

I ' • . Л» • V* *

» » вб, •

1 '

А 'У Т//

. сар/х/п-р/р,

1. *1> У'-'*

я? *

л ». • •

(а)

•г. V-" |

"Т"--" ^ЖГ

■•г --¿.ч'1 - От» :»"">':к.».¡(

г * * 'Л ' > ■ * ' ж * « " ' 1 ■ '

■ - * Г ш ■ . \ •• I •- ' -.(Г.^'МГ ..'V 'Й

•?•" • ' Л"V--

'.ЯГ

ч ■,

/ V..-;' , /;.

(б)

Рис. I. ОишгоиукИеотаднае карты генов РВ1»-РВ2 ,(а) вирусов григаа серотипов Н1Н1 (А/СССР/ЭС/77 и А/СССР/61/79) и Нз;12 (АДехао/1/77 и А/СССР/165/79) и генов М-белков (б) вирусов Н-Ш1' (А/СССР/90/77 к А/СССР/61/7Э) и Н3«2 (А/Гонконг/1/бв и А/Техас/1/77). .

Стрелка),ш обозначенк олигонуклеотидн, уникальные для генов данного штамма вируса; светлые кружки - олигонуклеотида специфичные для указанных генов Л'чуса А/СССР/61/79.

Таблица Э

Количество олигонуклеотидов в структуре генов вируса гриппа А/СССР/61/79 (Н1Н1), совпадающих и несовпадающих с олигонуклеоти-дами соответствующих генов вирусов Н1К1 (СССР/90) и ЕЗН2 (Гонконг, Техас и СССР/165)

Ген

Штамм лируса гриппа, сравниваемый с вирусом СССР/61

сегмент РНК СССР/90 Техас СССР/165 Гонконг

РВ1+ЕВ2 61/77(34) 69/77 (16) 70/77(20)

РА 51/58 35/58

НА 32/33 14/38

ДА 35/41 12/41

ИР 38/39 16/39.

ы 17/23(16) 16/23 (6) * 20/23 (6)

№ 28/30 15/30

В числителе указано число совпадающих олигонуклеотидов при сравнении фингерпринтов генов вируса СССР/61 и указанных вирусов. В знаменателе - общее число анализируемых олигонуклеотидов для

данного гена вируса СССР/61. В скобках - число несовпадающих олигонуклеотидов, выявленных при сравнении фингерпринтов генов вируса СССР/61 с фингерпринтами соответственных генов указанных вирусов (представлено для генов вируса СССР/61, обнаруживающих выраженное структурное сходство с соответственными генами вирусов КЗК2 ).

СССР/61 существенно ближе по структуре М-гену раннего изолята. вирусов НЗН2 Гонконг. С другой стороны такой перекрестный анализ показал, что ьсе гены промежуточного по времени изоляции вируса Н1К1 •Бразилия проявляют явное структурное сходство с соответствующими генами исходного вируса СССР/90. Это указьгает на то, что штамм Бразилия является истинным дрейф-Бариантом вируса СССР/90.

Ранее было показано, что вирус гриппа, -ним, превалировавший в СПА как штамп А/КалхфорнкяЛС/ТВ, представлял собой природный ре-асссртант, несуций 4 гена от вирусов (РВ1,РВ2,РА и ;1р), пред-

положительно от втамма Техас, и 4 оставшихся гена от вирусов К1Н1 (сравнивали 80 штаммом CCCP/f-O) (Toung & Paleee, 1979). Позднее бщ описан природный реассортант сероподтипа HW1 A/4bepJeen/3itO/7S » несупдей пять генов от вирусов НЗК2 , а гены ЦА, NA и US от.вируса H1N1 , сходного с вирусом А/СССР/90/77 (?alese Ь Тоипз, Л332). В еще более позднее время путем прямого секвенировакия было показано, что эпидемический штата сероподтипа В1Н1 А/Киев/59/79 представляет собой природшй г.?^есортант, несущий гены FBI, Ш, РА и КР от вирусов НЗН2. (Петров, 1989) , Каи показали последние исследования (Сох et el., 1989), подобные вирусы выделялись в период 1977-1979 гг. совместной циркуляции вирусов H1N1 и Н3Й2 , однако подобные реассортанты не обнаруживались после 1980 г. Таким' образом в первый период социркуляции в популяции людей вирусов гриппа Н1И1 и НЗН2 в 1978-79 гг. выделялись природные реассортанты, сохранпщиз серологический подтип НИИ , но несущие часть генов внутренних белков ог вирусов Н3Я2 (от трех до пяти генов: FBI, FBZ, U или FBI, FB2, РА, ПР.и П.).

В описанном наш случае изолят вируса Н1К1 А/СССР/61/79 следует рассматривать как природный реассортант сероподтипа Н1Н1 , несущий гена FBI, F82 и Ш от вирусов Н3И2 . Для разных реассортант-ных вирусов наблюдается различная перегруппировка генов внутренних белков с сохранением антигенной специфичности H11J1 . Необходимо отметить, что в 1978-79 гг. из популяции были выделены истинные дрейф-варианты вируса А/СССР/90/77 (см. ваше приведенные данные о генетическом родстве вирусов А/СССР/90/77 и А/Бразилия/П/78, а таку.э данные Hinshew s> debater (1982) . В результате описанного "перекрестного" анализа структуры генов вирусов двух сероподтипов нами не было обнаружено антигешшх реассортангов (H1N2 или Н3К1), что подтверждается лигературнш® данными (Сох et аЛ.,1989) ,у которых были бы перераспределены гены, кодируйте белки поверхностных гли-копротеинов.

Исходя из представленных данных можно сделать вывод о том, что при совместной циркуляции вирусов двух антигенно различных сероподтипов (на примере социркуляции вирусов сероподтипов him и H3S2 ) антигенный дрейф вирусов обоих сероподтипов и пересортировка генов мезду вирусами разньх сероподтипов могут происходить одновременно и независимо друг от друга.

1.3. К вопросу о проислогкдеши эпидемического штамма вируса гриппа А кип А/СССР/90/77.

Исходная задача в данной серии исследований состояла в установлении степени генетического родства вновь выделенного вируса ниц А/СССР/90/77 и ранее циркулировавших вирусов того же серолодтипа. Появление вновь вирусов ¡111:1 с 1977 г. могло означать возврат к вирусам, циркулировавшим 20-30 лег назад, к которым у большей части популяции людей в возрасте свыше 20 лет имелись антитела. С другой стороны, как было отмечено выше, наблвдалась одновременная циркуляция вирусоп гриппа я>'2 , что несколько противоречило общепринятым представлениям о сменяемости сероподтипов. Бо всяком случае появление этого вируса вызвало ряд разноречивых предположений, в тем числе о его иску-ственном происходцении и внесении в популяцию людей (Пакета еЬ «I., 1978) . При исследовании изолированных штаммов вирусов гриппа ни и 1977 г. (в частности штамма А/СССР/90/77 ) оказалось, что они обнаруживают гораздо большее сходство с вирусами НИЦ , выделенными в 1950-1951 гг. ("скандинавский" вирус) , в частности со штаммом а/тя/ 1/50 . чем с более ранними (¿5/Р1У1/47) , или более поздними (А/Остгег/1/57) изолятами вирусов Н1К1 . И наоборот, штагам вирусов 1950 г. имели большее сходство с новыми изолятами вируса, чем со итаммами, циркулировавшими до и после 1950 г.

Для выяснения степени генетического родства новых и старых вирусов НИИ ш провели сравнение структуры индивидуальных генов нового изолята А/СССР/ 90/77 и двух старых - наиболее близкого серологически штамма А/?т//1/50 и более раннего по времени изоляции штамма ¿/145/1/50 - методом олигонуклеотидного картирования. Были проаналиЕированы фингерпринты всех генов сравниваемых итаммов. йа рис.2 представлены фингерпринты 5-го

I . <;г о -13 „ «ч д'* • <1 ®<,<з>.% Л * • » (/¿Г*** • 'Л» . • ^• 'Л/-

«

имк/кт

• ®Д-а. ? /» ■ О У - * •V.. * . « » * . Л « ©

гч/п/ю

7 7Ш" о ' »

» * " РМ/1/41 * РМ/1/47 |

рис. 2. Олигонуклеотэдныд карты генов М (а) и (б) эпидеми-» чвскик штаммов вдрусов гриппа А/СССР/ЗО/77, и А/Г.1/1/47. Стрелками указаны олигокуклеотидц, специфичные для гзнз данного штамма.

я 7-го сегментов РНК исследуемых вирусов, кодирующих соотватствзн-но, ЫР и м-бэлки. Результата количественного анализа олягонукле-отядкнх корт представлены в Табл. 4. Для удобства ваалияв фкнгер-лринтн штамма А/СССР/90/77 (СССР) попарно-сравнивали с фингарприч-твми штаммов А/ВЯ/1/47 (50 и А/РМ/1/50 (51/). Оценку мпкимялъно-го числа замен оснований в анализируемой адсгя сегмента РНК сравниваемых вирусов проводили как описано у ^((¿/¿та вЬ а!,, (1978). Такой расчет основан на статистически оправданно5 допущении, чтс одна мутация в случаев мокет приводить к исчезновении одного и пслвлэш'ю другого олвюнуклвотида (парное изменение) и в 5С'.>

Таблица 4

Анализ олнгонуклеотидных карт индивидуальных сегментов РНК эпидемических итакмов вирусов гриппа А/СССР/,90/77, А/1".</1/50 и А/л11/Л/47

Гек Сравниваемые сегмент пары РНК вирусов

Доле гена, представленная анализируемыми олк-гонуклеотп-дами з» 1

Минимальное число замри оснований^

1,2,3

Пояснения см. в подписи к Табл. I

Процентная ■

доля замещенных оснований»'

СССР - тп 15 1,05

ЕВ1+РВ2 СССР - гм 27,5 40 2,8

СССР - РЯ з 0,35

РЛ СССР - Г4 34,5 21 2,5

СССР - тя 13 2,3

НА СССР - ВЦ 29,5 ' 23 : 4,0

СССР - га 9 1.5

НА СССР - 42,5 16 • 2,6

10? СССР - Г,7 О ^ 0,33

СССР - К! 38,0 29 4,8

СССР - 2?И 19 4,8

И СССР - иг 48,0 6 1.5

СССР - ш 6 1.4

СССР - }?и 66,0 13 3,0

случаев это происходит ь результате двух независимых мутаций. Как видно из дыжх Тайл. 4, все гены вируса СССР ил'згот явно выраженное структурное сходство с соответствующими генами штамма , кроме РШ-сегмента 7, кодирующего М-белки. Структура отого сегмента, как следует из данных рис. 2 к Табл. 4( колонки 4 и 5) , имеет значительно большее сходство со структурой РНК-сегмента 7 штамма IЛ . Из данных Хгас-^па ег а1., (1976) , полученных методом олигонукле-

отидоого каотиропа, ¡ад, следуе?, что вое восемь 1'енов вируса 127? г. практически идентичга генам, вируса 19ь0 г., из чего автора сделали вывод о том, что вирусы 1950 г. являются прямыми предшествеышками вирусов 1977 г. Более гого, и,™ было высказано предположеш'.е о их искусственном "заносе" в популяцию додей в 1977 г. По нашим данным вирус СССР/9С/77 по крайней мере по одному из генов (НК-сегменг 7, кодирующий М-белкп) обнаруживает существенное отличие от вируса 1Тг/50 и в то те время значительно большой сходство с вирусом I'-', 1/4-7 • Недавно с помощью секвенированкн было показано, что РНК-сегкенты 7 вирусов СССР/90/77 и ¿У/50 в действительности обнаруживают значительные структурные различия: было выявлено 17 нуклео-тидных замен1, часть из которых приводит к замене амякоквслот в сгруктуре белков М1 и У2. (ЗеЬеаев & ЬапЪ, 1969) . Болев того, о помощью набора моноклональшх антител к катриксноыу белку МГ было показано, что по антигенной структура бол с к 1!1 вируса Г7./5о существенно отличается от белка М1 вируса СССР/90, котя з целом он является крайне консервативным зреда клгя иесдодовпильс. групп вирусов (ува \like et п1,, 1984-) . Исхода но икеюцкхея данных модно высказать следующие предположения о происхождении я-'руса А/СССР/90/77. На основании данных Табл. 4 и основываясь на большом серологическом и структурном сходство вирусов 1977 и 1350 гг. можно считать, что новь'й эпидемический влрус А/СССг/90/77, сохранив семи гонов от одного родительского вируса, близкого к вирусу Г77/50 , получил один ношй ген, кодирующий М-белкя, от другого родительского вируса, более сходного с вирусом из/47 . В таком случае его модно рассматривать не как чарианг. вируса Р',7/50 или сходного с ним,' каким-то. образом сохранивши-}? е популяции людей или животах или. другим способом (включая возможную консервацию в холодильнике) , а как ре-ассоотачтный вирус, гены которого произошли от двух родительских ьарусоь. С другой сторона альтернативным объяснением различий в структуре М-геноэ и антигенных различий III- белков вирусов СССР/90 и 3' ,7/50 может бить генетический дт'морф::зм з популяции штаммов вирусов гриппа КИМ , пиркули;-отзав131Х в 19£0 или 1977 гг.

1.4. Особенности структурной организации белков'. МГ и М2 природных изолятов вирусов гриппа птиц и. млекопитающих.

Душные, полкченные в последние годы, указывают на непосредственное участие продуктов гена 7( белки Ml и Е.Е2) в формировании таких вакных свойств вируса гриппа как ограничение круга хозяев (Euckler-TOiite et al., 1986) , уровень репродукции ( урожайность ) в. куриных эмбрионах (Klinov et al., 1983) , чувствительность К аманг тадину и.ремантадину (Hay et al., 19855 Belche et al., 19S8), а также в сборке целых вирионов.

Белок Ж обнаруживается как электронно-плотный белковый слой, выстилающий изнутри, вирусную оболочку и стабилизирующий структуру зрелого вириона. Белок М2 представляет собой мембранный белок а выступающим нарушу Н -концом, и одним трансмембраяным якорным доменом, когорт обнаруживается в составе зрелых вирусных частиц (Hay efc al., 1937).

С целью выяснения особенностей структурной организации Ы-гена и. его продуктов ш определили нуклеотидные последовательности, данного гена одного птичьего вируса (itv/Weybriage-ilTN?) и одного вируса человека (.Д/ЙГНИ/ЗЗ-ШЩ) и сравнили их и выведенные'ис них аминокислотные последовательности, оо структурами М-генов и их продуктов других изолятов вирусов, гриппа А человека и птиц. Нуклеотиднуи последовательность РНК-сегмеята 7 вируса irv/Weybridge определяли, прямым секвенированием. вурионной РНК с помощью синтетических ДНК— праймеров (Air ,1980). Последовательность нуклеотидов РШ-сегмзнта. 7 вируса туз! определяли методом. Ыаксеыа-Гилберта, используя, клош-jjostxxmya к^-кояио. * . . ;

При сравнении, последовательностей М-генов двух указанных вирусов было обнаружено 85 различий в кодирующих областях. Это означает прш. ерно 9054' гомологии М-генов вирусов гриппа человека и. птиц. При сравнения И-генов вируса PPY/ffeybridse и FPT/Eostok была выявлено 28 нуклеотидных замен. Сходны»/, образом при сравнении- вирусов \VSN и. PR/8 была выявлена 31 нуклеотидиая замена. Это указывает на достаточно высокий консерватизм в структуре РЖ-сегыента 7 среди вирусов гриппа человеками, птщ.

Аминокислотные последовательности, белков Ш и 1а2 вирусов кп к PPV/Weyiwidse представлены на рис.. 3 и 4. Для белка Щ мезду вирусами ITV-W и wstl было выявлено It аминокислотных замен. Волышш-

,'яс. з. ¿¿гинскислстныэ последовательности белка М1 Еирусев грипда гРУ/ШфП^е 1РРУМ1 и УБМ

в сравнении с аминокислотном последовательностями бэлка М1 ЕИрусов гриппа птиц: ЕР\{/Яойсск. 1РР\и)1.ПШЫгЛМ/78 (Мл117?1 : челевэка:РИ8, А№$кЦ017?(и^Я77}, А/Мт/Г? (Мот 71), А/йлпзкск///79 (Зяпд 79) а вируса гриппа сейнйй А/£ыспе/1°иа-/{5/ЗС (5*30).

*£ц.теустт ка£1а&&ш> токвимтоьс ммтиств^

наилсчегт уиикви. какио*ш> угафчспйх чтсиисти

(ькркткго. сгугптум еасссвявгу смаьксаюо; виносаую.* идолкси. сгчтол*»* фмьидосог иияокаукм

{

&««30 НЛ1.ПС

У&Ы рве

В* ГЦ 79

и т

о

ЯЮКЙЫТГУ СЛКГУА1_5Т5 ТСАЬАЗСТ.-.1ТЧ*1»СГУТТ СУ МГ«. УСАТ

ЯЛ1Л*Е1ГП< СА*Г1АСЛГ8 АСАи5СКШ. 1ГМ**САУГТ Г»АГИ.^САТ 4

А I

I

А и

свдидодов эдасштти гивктяу Ь^ТТАКАКБ

СЕОидеСМЯ ьнациуугт РЫКмш^^у Ц^ТДОДЬС

гр»сн1

то

и5£Й7?

и00СМ-?2

&ДПС79

; I : со *

I И

1 И

кмсуиом ои*е***тус тияшаськ сюихшфАГ бкемеуод* £Ано|даом СНУОАЮТГС ТНР1&£АС1Ж ^ОШСЖЬОА* оююсуо^ОА

о И

аг а ы

СУ А О

ГУ А ОТ

»«>0

п>у<в> тс«»

и00ЯМ73

ьо

А

А

i.

Прзмэчяяия. Для друпх вирусов приведены ляль отличащр°ая алаз накис лоты.

* Стрелками сверху обозначены аминокислотные остатки, характерные для вирусов птиц и человека,

* Обозначены различая между вируса® РРУ(У*/) % . йспсльзсван однобухьешшй аминокислотный код-

го и*

v * ! LS

HÎlLïtlfTP TRKOWECSCt DSSDPLVm SIIGlL.wJL HLDRUTXC

П-ЧД-ТЕУМ* IHKSVCCRCW O.;S0PL>V|M MliOJUH.IL HILOBUfC с к

V

v s

ГТЧЯЬ-КУСи» RCPSTt^VP* IMBEETRÇE5 çmavd^ooch rvwicLC

•уивгхтаь* PcpjTEGVpr iMcezrs*c5 oui.'/злизсм- rvvrcLf

CK SA 5

* p

r EH Г H

S1/30 HAU 78

FPVfJ»)

rpvtm

vsw

PR ft

U5St77

узогп72

Гкс. аминок': с потные поодедоввтвяьассти белка М2 рируоов ÇPV(WJ и WSW в сравнении с енялогич-кнш; вис двдсвп те дьаос тяма вирус on гриппа птиц: FPVfR) ,M&tl78 ; челоЕЗКэ: РК8, USSR 11, и: 13чтид ан-устоичиaorо варианта вируса A/SEb/i/2, (В£Ь02), fi/2lnçâfinre/{,'S7 (Stng $7), Udorn 72 ß.wg 79 и вируса Sw 30 '

(¡¿(/значения си. в подписи к рг.с. 3

*о lb-

сгво из них оказалось консервативными: 5 замел Вал Илей (Ь положениях 15, 59, 115, 205 и 219 ) , 2 замены Трв -«''Ала (в положениях 121 и 137), Глу Асл. (204) и. Лей Мет (248) ■ Вшшленх только две зарядовые замены: Тир0 (FPT-ftW IVc"1" (ЯЗ.) (IIO) и. Acn". (rf'j-w) Cepü (т'зн) (231) . Лри срапнеьии этих поелоцова-тедьнося^й а лоалздйК'.тадьностями гена М других вирусов человека, (рис. 3, н"ле 'XSií ) ,пгиц и вируса свлявА .{pao. Z, вышеKPV—w ) выявлено только три. положения, замени в Kcvopiix могут быть связали о. ограничен ем крута хозяев (Bucfcior-íhita ot al., 1986) . Б положениях 115, 121 и 137 (указаны строками) т>се. вирусы, тгаиц'имакге Вал, Трэ и. Тре, а вирусы человека с.ротвстсгвенло Илей, Ала и. Дла. Зги позиции, аминокислот- локализованы в области Щ, которая взаимодействует с липкдным бкелоеи. ыеио'раш (вгеводЛаиеа & rvangiono, IV8L) . Надо отметить, что в данной обласхи HI вирусы человека задержат больш^гидрофобных остатков, чем вирусы птиц. Так, в указанных трех позициях белка Щ у вирусов человека находятся три гидрофобных остатка, а у вирусов птиц только один - Вал^. Как следует . из литературных дальых структур«. MI белков вирусов гриппа А являются весьма хонсерьат;ц?щми. В чаотноати кластеры гидрофобных амино кислот, размсиенныз в лулидном кембрашгам бислое (Groáoriados ft Vreigioue , L0S1) локализованы a одинаковых положениях. Сходны?,! образом кластеры ззр.ттешых аминокислот , которые мсгут играть роль во взйииодеЛс.'аки с РНК б составе РНП, также локализованы в • . идентичных .местах у разных вирусов,

Ашшоклолоткяе последовательности белка М2 представлены на' рис. 4. У ИЙ в 'руаоь F?V-i? л да? обнаруживается 10 аминокислотных различий. 5 из -ми: локализовали и коротком выступающем II- концевом дсыенэ 12 (Ьяв-Ь et .-a., I9í\5).В положениях II, 14, 16, 13 к 20 у вируса yyv-TP гжодятол Тре/ Пил, Глу", Сер и Сер, у ЕИруса *3N - Млей, Глу", Гл.;, Apr4" ¿ коя, соответственно. Две замены.располагается ик./гри грлчгсмембраччогэ доме;на в гслат.ениях 31 и SB, и котор:« у находятся Сер и Сел, а у WSH - Асн и Лей.. На ци-

топгаялатичвекем "xr.crje" б.)лка í!"2 (рис. 4, правая часть) распо-лакаксл ccr,ib"íiece. ;; згл-енм: консерватшзн&я Лей -»-Фен (55) и две &чрядо:ыэ: Льэ+ (ярт-я-) -+■ Глу~{ЪУ'О (70)и Глн° (?F7-W)Дкз'1' (та;) С<8)Пр^ оравнэнка о тих последовательности со структурой бьлкоз ti? друтнх ph. уели челоьека и птиц (рис- 4) было отмечено

четыре положения аминокислот, которые могут, быть связаны с ограничением круга.хозяев. Одна из них является консервативной: Лей (птичий) -*■ 8ен (человеческий) в положении 55, которая располагат ется во внутреннем цитоплазматическон. домене. Другие три замены сконцентрированы, в вьступающем /i-концевом домене М2 в положениях II, 14 и. 16, в которых у птичьих вирусов находятся Тре,. Гли н. Глу~, а у вирусов человека, соответственно, Илей, Ппу" и. Гли (указаны стрелками на рио. 4-).

Способность к репродукции с высоким выходом ("урожайность") в куриных эмбрионах также ассоциирована, с функцией РНК-сегмента 7 (Dowale, 198Ч-; KLtmov ^t 1983).Известно, что. вирусы гриппа птиц, а. также вирусы РР/8, ВвМ2 и. Swine хорояо размножаются в куриных эмбрионах. Вирус, иан , наоборот, размножается довольно, плохо. Тем не менее нам. не удалось выявить каких-либо специфических положений аминокислот ки в MI, ьи в, М2, а которыми можно было, бы ассоциировать свойство высокой непродуктивности в куриных эмбрионах. Необходимо отметить, что по -своим структурным характеристикам, белки. Ш и iß вируса гриппа свиней занимают, промежуточное полсскение между соогветсгвуицйми белками вирусов гриппа человека»'а птиц.

Таким образом были, выявлены определенные закономерности структурной организации белков.. ¡Д и Ы2 вирусов гриппа человека i. птиц. Обнаружены три характерные позиции аминокислот в составе белка Ш и четыре в. составе белка М2, в которых находятся строго определенные аминокислоты, специфичные для вирусов кавдого вида, и а которыми, можно, в частности, ассоциировать такое важное свойство вирусов, гриппа как ограничение круга, хозяев'. Возможно, что выявленные особенности структурной организации Ы-белнов вирусов гриппа человека и. птиц определяет некие селективные преимущества при репродукции вирусов в соответствующих клеточных системах. Обнаруженная закономерность, по-видимому, может быть использована в качестве тест-критерия для установления видового источника происхождения 7-го сегмента вирионной РНК при. анализе генного состава вноеь выделенных природных изоля-тов. вирусов гриппа человека и.жлзотных.

II. Структурные изменения в геноме вируса.гриппа в процессе адаптации к новому хозяину.

Важным свойством! вирусов гриппа является их способность менять круг хозяев, приобретать способность к репродукции в клеточной системе нового хозяина и становиться вирулентным для него (Klenk, Hott, 1 ;lQ) . Вирулентность представляет собой, повидимо-ыу, результат сложного взаимодействия многочисленных факторов, которые определяются как биологическими и генетическими параметрами вируса, так и чувствительностью клетки-хозяина. Одним из подходов в исследовании ыолекулярно-биологичеоких основ вирулентности является изучение процесса адаптации вируса гриппа к различным организмам и клеточным культурам, приводящего к формированию вирулентных или аттенуированных вариантов вируса. В теоретическом плане подобные исследования представляют интерес. в авязи с изучением вопроса о путях возникновения новых эпидемических штаммов, поскольку сходные процессы MOrtfT происходить и в природе, в частности антигенный дрейф вирусов гриппа (Hinaham & v/:bster, 1982). С практической точки зрения важность их определяется тем, что такой подход является одним из возможных путей создания живой гриппозной вакцины на основе, например, холодоадаптировшшых (Ghendou et al., 1 ;B11 Kendal et al., -1981) и аттенуированных вариантов вируса гриппа ( Еилин-ская и др., 1982) .

II.I. Генетическая изменчивость вируса гриппа человека

_в процессе адаптации к мышам._ „

В работе была использована модель адаптации вируса гриппа к легким №шей при интраназальном. заражении. В качестве модельного вируса выбран эпидемический штамм вируса гриппа А/СССР/90/77. Исходным, материалом служил вирус, прошедший три пассажа в куриных эмбрионах на предельных разведениях. Он был непатогенным для мышей и обозначен как 0-вирус (О.В.) . Вирус пассировали в легких мышей (использовались белые нелинейные мыши весом 6-8 гр.) путем, интранаэального заражения. Каждому животному вводили по 2-5x10° ЗДЦ^О вируса (ЗЩ50 г 50Й-ная эмбриональная инфекционная'доза) . Через 48 «асов часть мышей забивали, остальных оставляли in 14 дней на выживание. У забитых мыкей брали легкие и готовили 10%-ную суспензию (масса/обгом) , которую использовали для последу!;)-

щего заражения. Наличие вируса., в. легких устанавливали: путем заражения куриных эмбрионов легочной суспензией, с последующей проверкой аллантоисной жидкости в реакции РГА. Полученный вирусный материал накапливали а аллантоисной полости П-даевшх куриных эмбрионов.

В результате пассирования через 12 пассажей был получен вирус, патогенный для мышей, который вызывал гибель животных на 4-7 день после заражения при летальной дозе, вызывающей ЬОК-ную гибель (ЛД^д) , равной 1-5x10* ЕИД^. Полученный вирулентный вариант, вируса обозначали как Ы-вирус.

Исходный (0) и адаптированный (М) варианты вируса заметна различались по ряду биологических свойств. Так М-вирус оказался более термостабильшш, обладал гсЬ-49+-признаком, тогда как 0-вирус -40~-признаком ( гсЬ - способность к репродукции при заданной температуре) . М-вирус обладал существенно большей чувствительностью к мышиным эритроцитам; чем 0-вируо ,в реакции, гемаггла-тинации. .

Генетико-струкгурный сравнительный анализ 0- и. М-вариант.ов вируса А/СССР/90/77 'проводили с помощью оллгонуклеотидногл картирования сегментов внрионной РНК. Было показано, что в результат« адаптации, данного вируса к легким мышей, приводящей к образованию вирулентного вируса, обнаруживаются изменения в структуре по крайней мере пяти из восьми, вирусных генов: в одном из генов РВ1 или РВ2 {в силу невозможности разделить эти два сегмента с помощью электрофореза в геле ош анализировались вместе) ; генах РА, НА, ЫА и ЮР .В структуре генов, кодирующих матриксше и неструктурные белки (сегменты 7 и 8 вирйонной ГШ) изменений обнаружено не было. Для количественной оценки структурных различий между генами сравниваемых вариантов вируса А/СССР/90/77 были сделаны расчеты минимального числа замен оснований н процентной доли замещенных оснований, как описано выше (данные представлены в Табл. 5) . Из результатов видно, что наиболее изменчивыми в процессе адаптации вируса А/СССР/ 90/77 к условиям репродукции в легких мкией оказываются гены гемагглвтинина и нейраминвдазы, то есть гены, кодирующие белковые части поверхностных гликопрстеинов вируса. В меньшей степени, изменяется структура генов белка 1.? и белков полиме-разного колшлекса.

Таблица 5

Анализ олмгонуклеотидшх карт генов вирулентного (И) и невирулентного (0) для мышей вариантов вируса гриппа А/СССР/90/77.

т-

-г

Ген

оиегмент f

рнк

! Распределение анализи- (Доля гена, руемкх олигонуклеотидсв!представ-

т-! ленная

!анализиру-

Т

число

!олигону-!клеоги-

I Дов

, т | j_p i cuiajunonpjf- I

0+ i W^ !ешми оли- !

I Минимальное число ! замен оснований в ! анализируемых . ! олмгонуклеотидах

!гонуклео-| тидаммЗ .

число i ггроцент-i пая доля

;+рв2 87 I - 26,5 I 0,09

РА 44 - I 29,0 I 0,17

НА 46 4 I 32,5 5 0,86

NA 39 Z I 36,5 3 0,53

NP 43 2 - 33,0 2 0,44

н 39 - - 48,0 - -

NS 25 - - 46,5 - -

* О4" - олигянукл е отиди, уникальные для соответствующего гена 0-вируса.

^ М4- - олигонуклеотиды, уникальные для соответствующего гена М-вируса.

Пояснения aii. в подписи к Таблице I.

m

Следует отметить, что охсдная картина структурной изменчивости генов вируса Гриппа была обнаружена при сравнении вируса А/Ленинград/ 134/57 (к2к2) и полученного из него холодо-адаптированно-го варианта А/Ленинград/134/57/47 путем 47-кратного пассирования в куриных эмбрионах при пониженной (25°С) температуре (Александрова и др., 1979; Ghendon efc ьЛ., ; Ccx et ¡J.., 'i9S5) • С помощью олигонуклеотидного картирования и анализа РШ-РКК-гетеродупле-ксов в полиакриламидном геле было показано, что имеют место структурные изменения в одном из генов FBI или FB2 (анализировались вместе) , а также генах НА, :.'А, HP и, М.

II.2. Роль гемагглюгинина в процессе адаптации вируса гриппа к новому хозяину и приобретении им вирулентных

свойств._

Большой интерес вызывает вопрос о структурной изменчивости гемагглютинина вируса гриппа в процессе его адаптации к новому хозяину. Являясь поверхностным гликопротеином, НА, повидимому, должен быть наиболее чувствительным к смене клеточной системы, что подтверждается, в частности, значительным повышением чувствительности адаптированного к мышам М-вируса к мышиным эритроцитам. Показано, что при адаптации вируса гриппа А/СССР/90/77 к легким мышей, он изменяет свои антигенные характеристики С Sitein -л et а1.,19Ь4) . Известно также, что точечные мутации в структуре НА могут приводить к резкому изменению вирулентных свойств вируса (Kotfc et ей., 19835 Kaisayoka St Viebster,19&3). Будучи главным, поверхностным гликопротеином, НА является ответственным, за первичные этапы взаимодействия вируса с клеткой: адсорбции и слияние мембран (Kleiik & Hott, 1988) . Возникает вопрос о функциональной связи, антигенной изменчивости НА при адаптации вируса гриппа к новому хозяину и приобретением им вирулентных свойств.

Ранее было показано (GiteLnaa et al., 1964) , что процесс адаптации вируса А/СССР/90/77 к мышам происходит в два этапа: на первом (1-3 пассаж) изменяются антигенные характеристики вируса, на втором (9-12 пассах) развивается способность вызывать гибель животных. При анализе структуры НА на 1-ом этапе (3-ий пассаж) обнаружена аминокислотная замена Асн° —»-Асп~ в положении 127 большой субъеданицы НА (HAI, AcHjgy —*■ Асп) , на втором этапе была выявлена вторая замена в HAI Tpegg -*■ Ала (Жданов и др., 1986; Гринев и др., 1988) . Вызывает несомненный интерес вопрос о возможной роли, каждой из этих мутаций в приобретении вирусом вирулентных свойств, а также о сом, в какой мере адаптированный и вирулентный для мышей вариант вируса А/СССР/90/77 представляет собой гомогенную популяцию как по вирулентным свойствам, так и по структуре Ш.

Для этой цели адаптированный к мышам вирус А/СССР/90/77 (12-ый пассаж) был дополнительно пассирован 6 раз в легких мышей для получения стабильного вирулентного вируса ( 18-ый naccaat, обо-

значен как вирус 18п.) . Далее вирусI8i. был клонирован в культуре клето фибробластдв эмбрионов кур (530 методом бляшек. Было отобрано 38 клонов, которые были исследованы на антигенную специфичность и способность вызывать гибель мышей при интраназальном заражении. Подавляющее число клонов оказалось патогенными для мышей, вызывая гибель животных на 4-7 день после заражения при летальной дозе, вызывающей 509á - ную гибель, достигающей величины, равной 2-5хЮ4 ЖД^- При этом было выявлено два непатогенных клона, которые не вызывали гибели животных даже при внесении дозы более I07 ЗИД^-). Был отобран один патогенный ( кл. 7п ) и один непатогенный ( кл. 31 нп) клоны. В дальнейшем изучали четыре варианта вируса AlСССР/90/77: исходный неадаптированный вирус. (О.В.) , адаптированный к легким мышей путем. 18-тигкратного пассирования (18п) и полученные из него вирулентный (кл. 7п) и авирулентный (кл. 31нп) варианты.

Антигенный анализ этих вирусов о1использованием набора моно-клональных антител к НА вирусов ШН1 (А/СССР/90/77 - 4 моноклона, А/Бразшшя/11/78 - 7 моноклонов) показал идентичность НА всех адаптированных вирусов и их отличие от исходного вируса: у всех адаптированных вирусов наблюдалось практически полное подавление реакции торможения"гемагглютинации. (РГГА) с тремя моноклояами НС 22, НС 124 и НС 70/1 (Таблица б) . Заслуживает, внимания факт антигенной идентичности НА патогенного (кл. 7й) и непатогенного (кл. 31нп) вариантов адаптированного к легким мышей вируса (18п).

Нуклеотидные последовательности гена НА сравниваемых вирусов определяли прямым секвенированием вирионной РНК в обратно-транск-риптазной реакции с использованием, синтетических ДНК-праймеров длиной 10-18 нуклеотидов, комплементарных различным: участкам, гена НА, методами. Сэнгера и Мак с ама-Гилб е рг а. Во. втором случае реакцию осуществляли с. помощью Б'- меченного по фосфору праймера с последующим секвенированием Р^-ДЙЙ-продукта химическим методом, В результате у всех адаптированных вариантов были выявлены две нуклеотидные замены: Лд^д -**Г и —»-Г (указано положение нуклеотида от 3' -конца, сегмента вирионной РНК)' , приводящие к описанным выше аминокислотным, заменам Tpegg -*■ Ала и. Ася^у —г-Асп, соответственно (рис. 5) . Других замен обнаружено не было.

Тг&шца ¡¿б

ИЗМЕНЕНИЯ АНТИГЕННОЙ СПЗЦШЧЗОСГИ АДАПТИРОВАННЫХ К ЛЕГКИМ ШЕЕЙ И КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ВДСК

ВАРИАНТОВ ВИРУСА ГРИШ А/СССР/90/77

ВАРИАНТЫ ВИРУСА А/СССР/90/77 ГОНОКЛСШШШ АНТИТЕЛА К ВИРУСАМ ГРИППА Н1Л1

А/БРАЗШКЙ/П/7в А/СССР/30/77

ЕС 2 НС 3 НС 24+ НС 29 НС 124+ НС 125 НС 142, НС22/1 НС70/1+ НСП0/1 НС264/7

о.в. 18 п. 6400 12800 3200 3200 12800 100 12000 12800 12000 200 6400 3200 12800 12600 12800 6400 12800 <100++ 12800 12800 12800 12800

«сл. 7п. кл. 31ид. 12600 6400 6400 3200 100 100 12600 6400 200 200 3200 6400 12800 12800 6400 6400 <100 <100 12800 12800 12800 6400

15 с. 32 ВДОСц. 12900 6400 6400 3200 <100 100 12800 6400 200' 100 .6400 6400 12800 12030 6400 6400 <00 <100 12800 12800 12800 12800

ПРЕЩСТАВШШ ОБРАТНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ ТИТРОВ В РЕАКЦИИ ТОРШЕНШ 1ШШИГШЩИ СР2ГА) ♦ - ОТШЧЙЫ 5ЮН0ГСЮНЫ, С КОТОРЫМ ЫАВЩЦЕТСа ВДАВШИБ РЕАКЩШ РЗГА У АДАПТИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ ВИРУСА Д/СССР/90/77• ++ - < 100 - ОТСЗПСТВИВ РЕАКЦИИ.

Eue. 5. Нуклеотидкые и аминокислотные замена в структуре гемагглю-тивине вариантов вируса гршша А/СССР/90/77, адаптированных к легки,1 мшей и культуре клеток МДСК

нуклеотвд1 348 462

О.В. ■ 5'.... ААТ ITA АЦА .... ААЦ ПА АЩ .... 3-

Асн-Глл-Гео Асн-Вал-Тре

18 п Г Г

ш.7п Г Г

кл. 31нп Г Г

15 п Г

22 ВДСКп Г

Ала Асд

2

аминокислота 89'. I2V

Последовательности приведены в терминах ДНК, комплементарной сегменту Еиряонной РЖ, кодирующей гемагглвтинин.

1 - положение замещённого нуклеотида указано от 5' - конца к ДНК.

2 - положение замещенной аминокислота указано от ff- конца тяжелой

субъединицы гемапотютннина HAI.

Как можно видеть, все адаптированные варианты имеют идентичную структуру НА. Ваяно отметить, что это касается как патогенного, так и непатогенного вариантов С кл. "Яг я кл. 31нп) , прошедших идентичную "пассажную историю" в легких швей. По этой причине, по-видимому, трудно объяснить возникающие в процессе адаптации в структуре НА мутации в терминах приобретения вирусом.летальности для кыней, По всей видимости, в отношении НА речь в данном случав может: идти лишь о селекции в процессе адаптации мутантов, способных к репродукции в клеточной системе нового хозяина.

Была изучена эффективность репродукции.полученных адаптированных вариантов в легких мызеК. Для этого шл заражались интраназа-льно с последутацкм титрованием легочной суспензии на куриных э.чбри-" онах через каяцне 24 часа. На рис- 6 представлены кинетики репроцу-

Рис. 6. РЕПРОДУКЦИЯ АДАПТИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ ВИРУСА ГРИППА А/СССР/90/77 Б ЛЕГКИ! МЫШЕЙ

БРЕМЯ, ЧАСЫ

Мыши заражались интраназально аллантоисной жидкостью, содержащей вирус. На калдое животное вводили по 10^ ЗИД^ вируса. Через каждое 24 часа часть животных забивали и 101^-ную суспензию легких далее титров<ли на 10-дневных куриных эмбрионах. Результаты оценивали как инфекционные титры для куриных эмбрионов в ЗВД^о 1-к/.нети.ка репродукции адаптированного патогенного вируса кл. 7п. ;>кикетика репродукции адаптированного непатогенного вируса кл. 31нп Приедены усредненные результаты нескольких независимых огштов.

кции клопов 7п и 31нп в виде log^ ЭДДвд (G.B. прг.ктичэски. не. размножался: к 72 чесу инфекции его титр составлял менее 2 lcs10

вирус 18п репродуцировался на уровне кл. 7п ). Видно, что патогенный вирус, размножается гораздо более аффективно: разница в тиграх по сравнению с непатогенным вариантом составляет, примерно 2 log10 ^ уч9т0м идентичности, структуры НД адаптированных вирусов (см. Табл.- б и рис. 5 ) можно предположить, что приг обретение вирулентности связано с, селекцией мутантов, обладающих повышенной способностью к репродукции. Такая, способность монет: определяться, например, более шсокой транскрипционной и реплика-тивной активностью полимеразного комплекса, включающего белки FBI, FB2, РА. и К?(К1еп11 & Son, 1988). . это может быть связано с мутациями в структуре одного или нескольких балков данного комплекса .с. последующей селекцией таких внсокорепродуктнвных вариантов. Выше было показано (см. Табл. 5) в помощью олигонуклеотиднопо картирования, что в процессе адаптации вируса А/СССй/90/77 к легкий мышей обнаруживаются изменения а структуре ряда вирусных генов» включая гены белков полимёразного комплекса (один из генов PBI или FB2, гены РА и ИР ). Позже путем анализа реассортантов патогенного и. исходного вирусов показано, что для приобретения вирулентности необходимы структурные изменения по крайней мере в одном из генов Р (предположительно FBI) (Zaveria efc al., 1989).

В другом независимом опыте вирус. //СССР/90/77 клонировали 4 раза в куриных эмбрионах на предельных разведениях и пассировали в легких мышей, как описано выше, 15 раз до получения стабильного патогенного вируса (обозначен как вирус 15п) . Картина протекания процесса адаптации (изменение антигенных характеристик и приобретение вирулентных свойств) практически не отличалась от описанной вншо. По антигенным характеристикам вирус 15п не отличался от описанных выше адаптированных вирвдоз 18п, кл. 7h и.кл. 31нп (см. Табл. 6) , однако в структуре его НА выявлена всего одна мутация в HAI AcHjgy -»-Ас л (рио. 5) . Второй замены Tpegq -»»Ала обнаружено на было. Повидимому, для адаптации данного вируса к репродукции в легких мышей .(независимо от того, образуется вирулентный или. авирулентшй вирус). необходима. как минимум одна..мутация в структуре его НА: замена AcHjgy ->-Acii в тяжелой субъединице HAI.

Ьсзльиочыо вирус А/СССР/90/7?, рротедга1Е 4 пас сала на. куриных эм5риоках при. предельных разведениях, пассировали 22 раза в культуре клеток кДОС ( перевиваемые клетки почек собаки.Мадин-Дарбик ) . Получений вирус {обозначен, как вирус 22 МДСКп ) имел измененную антигенную структуру, которая, однако, оказалась идентичной структуре веек вариантов вируса А/СССР/90/77, адаптированных к легким шльай (с«. Табл. 6 ). В структуре его НА. выявлена лишь одна мутадка:. аамона Aciijgr, Асп, характерная для адаптации данного .вируса к. кышам.

Поскольку КА осуществляет первичную функция взаимодействия, ыируса.с. клеткой, то, повкдтому, длл эффективного взаимодействия его структура должна соответствовать структуре поверхностных рецепторов ялегви-мшеии (Elenk. & Reit, -1983). Можно предположить, что такдк адекватная, структура КА селектируется на первых этапах'адаптации, поскольку пересечение вирусом межвидового барьера может быть связано с переходе^ к новому типу клеточных рэцептррсв. Как видно из представленных данных (см. рис. 5) такой характерной мутацией в структура НА при адаптации вируса А/СССР/90/77 к легким мщвей ц клеткам ВДСК является зарядовая замена AcHjgy Асп" в яяжьлой цзпи НА1, которая селектируется на- ранних, этапах адаптация. В этом учаоисе ЕА исходного (О.В.) вируса расположен сайт глкьоьилироьаниа с. характерной структурой Асн - Вал Тро (рис. 5) л указанная замена приводит к е?о утрате.

Этот сайт располагается в области антигенной де гершнактц A (lSlley >л sicebel, ЛЭЬУ) и селекция варианта с таким, образом измененным НА, вероятно, дает лучшее стерическое соответствие рецептор-свягивающей области НА (при. элиминации олигссахарид-:юй ц&пи ) и клеточного рецептора нового хозяина. Локализации данной позиция аминокиол&тн на модели трехмерной структуры НА Лскдзока на рис. 7. Согласно трехмерной модели iü (4lisoa et , «1., 1931) даный учаоюк расположен в области змккггколоткой последовательности, фор&ируюшей внешние края рецептор-связьзая-цего кармш а., Помимо утраты сайта пккоз.и.крования в указанной соластл данная мутация дает отрицательно оаргхенчий ксп^оу ь не -пооредсгвеккой блаэсст ст п&ьожмально чарпкеншх Гла^с, ^с126 и -Ápr-j-rjQ. Богыоша г.заниадейотвие может приводить к изыенепв» коя^ормацжи всей да^сй доягенгоЬ облелти.

тяжелой субъедишцн НА мруса гриппа антигенного иод-типа НЗ (Й'Псоп еЬ а!., 1981). ' Отхаиено положение аминокислотного остатка 127 НА вируса пни

А/СССР/9СУ7? ( полож&низ аминокяалотногэ остатка 127 антигенного гсдшп». ПГ соатаэгст вуьт лол амида 13Г НА аята-]-е1Еого лодп'па ИЗ) . :

за

Вызываем вопрос, происхождение второй мутации Тре^ Ада (Бис. 5) . Как-видно- иб данных, она № является оСязатедьнйй. ни. дне. начальных отелов -адаптации, ни дая селекции вирулентного вируса. Так', адаптированный к мысам..и патогенный, вирус 15п и адап-- жированный, к клеткам ВДСК вирус 22 ВДКп в структуре своего НА стой замены не имеют. Более того* как. видно из данных Табл. 6, адаптированные варианты вируса А/СССР/90/77, несущие одну или две указанные мутации в НА, оказываются антигенцо неразличимыми. Можно предположить, что лу.бо эта мутация является случайной, лиг бо ее появление, связано, с различиями в условиях предварительного, клонирования исходного вируса и. его последующего пассирования в новой клеточной системе. Во всяком случае нами на обнаружено различий ыеаду вирул^щшыци вирусами 18а и кд. Ъг (две мутации в НА)> и 15п (одм,'/цутация) как ш. сачагенноот для мышей, так и. ■ по уровню их'репродукции в легких шшй.

Заслуживает Интереса обнаруженная- идентичность замена-^си127 в НА вариантов вируса, адаптированных к различным

клеточным; системам; млекопитающих; легкие мышей и. клетки ВДСК. Это может указывать на общность процесса адаптации вирусов гриппа к клеткам, млекопитакяцих и, поеиидкому,, на сходство структуры их клеточных рецепторов,

Как можно видеть из данных рис. 5 и. 6 два адаптированных к легким мышей варианта вируса А/СССР/90/77 (вирулентный кл. ?п и авирулентный о. 31нп) , имея идентичную структуру НА, различаются по уровню реяродукции в легких мышей: разница в инфекционных титрах составляет, около 2 1об10 Можно заключить, что структурная изменчивость гемагглютикина можс.: быть необходимой для.адаптации вируса.гриппа к условиям репродукции в клет.одоой системе нового хозяина но, повкдиюму, недостаточной для. рования. вирулентных свойств адаптированного вируса., ^озмрзмо, что определявши, фактором в формировании вирулентности, является селекция мутантов по генам.внутренних белков (в особенности белков, лолимеразнохо комплекса) , набор которых может обеспечить более высокий уровень репродукции вируса.

III. .Различия! г структуре гечмгглйтишша паркантол Еируоа гриппа ,1, _^аящакк$аса по иммукогсгакм активности.

Известно, что нирус гриппа.претерпевает два типа антигенной изкенчивости в процессе циркуляции в природе: антигенный дрейф и антигенный сдвиг. Давпение антител в частично иммунной популяции, хозяев, повидимому, является тзм механизмом, который определяет направление селекции изменившегося в процессе дрзйфа вируса. В процессе иымунооилездии ( направленность которой определяется очевидно, уровнем к спецификой набора присутствующих антител) как в природе, так и при лабораторной селекции можно обнаружить ц. получить варианты исходной вирусной популяции, (С^нотипически разлииааар'.еся по антигенной специфичности, уровюа репродукции, кымуногенной активности и другим признакам (ЕИЪоигде et s.l., 1988; Schild et al., 1983) Eata e>t al., 1987).

Представляет теоретический и практический шторзс. изучение вопроса о существования и возможности получения вариантов вируса гриппа одного серотипа, отлк'шицихся по имиунсгенной активности. (Aadrawea, 1969$ Hacrnun et ¡а., 1973)« Решение, данной задачи непосредств'ешю связано о, проблемой соххйнешя вируса ъ мезэпи-демические периодам! критерием, отбора вакцинных штаммов. По мнению некоторых авторов вирусы, обладающие пониженной иммуногенной активностью, способны длительно находиться в организме носителя и сохраняться в мехопидемический период, а понижение уровня специфического иммунитета в популяции модег способствовать преобразовании их в эпидемические варианты.(АШгеиез, 1969 ) . Вместе с тем.вопрос; о структурных и.функциональных особенностях вирусных-компонентов, непосредственно „влиящих на дошуяогенную активность вируса или. коррелирующих с ней до настоящего времени продолжает оставаться в значительной степени^тиштым. - Одним из возможных путей решения указанной проблемы Т^ляетея цзучениа генатико-сгруктурннх различий кел»ду вариантами, подученными, от одного, родительского вируса и. отлииающимисл^цруг от .друга по иммуногошой активности. С целью выявления возмогших маркеров.повышенной и. пониженной ишуногеннооти. было проведено сравнительное изучение, структур! гемаггшотияина двух таких вариантов вируса гриппа, поскольку НА является основным протективным антигеном: данного возбудителя.

В работ« использовали, ьттенуирсваший вакцинный штамм, вируса гриппа А/Бикторхя/£5/?2/50 (НЗН2) . Высокой,муногенный( В.й.) и. низкоиюаунэгеншй (H.H.) Еариаиш исходного вируса были получены Г.С.Скрилненхо с сотр. (ЩИ вирусологии, и. эпидемиологии, им. • к.И.Мечникова, г. Одесса) о помощью иммуноселекцил в пассивно иимугазированных изологинеохиш. сыворотками куриных эмбрионах. В качестве изологииесних применяли сыворотки, петухов, которых иммунизировали раздельно исходным вирусом и. его антигенными предоестЕИШияами. (исгкмцзоЕалнаь вируса серолодтилоз Яеу/ЛИ, НОЯ); E1I11, H23J2) ' . Куриные эмбрионы иммунизировала, смесью полученных сывороток, дрш получения вариантов исходного вируса с разной: ишуногснной активностью дозу вносимой смеси, сиворонок подбирали экспериментально, ймкуног.енность полученных вариантов определили по уровню образования антител у экспериментальных мыией после интраяазального заражения. Е результате такой селекции были отобраны' два варианта: шсокошмуногеншй (В.й) , шму-ногеииость' ксторога. превышала ккмукогшшость исходного вируса. I. 4 раза, и низкоишукогенный (Н.Й.), шыушгенность которого, оказывалась в 2,5 раза ниже, чем у исходного вируса.

Исходный вирус и его два варианта накапливали £ адлантоис--ной- полости Ю-дневных куриных эмбрионов. Определение первичной последовательности генов НА а савкиааемых вариантов осуществляли термаяаторным методом Сенгера (Sanger et al., 1977) с модификациями (Air, 1979; Uarkuahin et al., 19P8) с использованием набора синтетических ДКК-праймеров, комплементарных различным участкам сегмента РНК, кодирующего НА вируса А/Виктория/3/75

(H3IK!) .

Б результате в составе гена IIA высокой,абиогенного варианта выявлена 3 значащий нуклеотидше замены в положениях 487, 550 и. 655 тяжелой цепи HAI, приводящие к замене аминокислот в положениях Г37, 158 и 193, соответственно: Асн^г, -♦'Сер0,

и Нумерация соответствует поло-

жению нуклеогкдов. и аминокислот, в HAI вируса А/Вкктория/3/% (i£in Той W. et al., 1950) . По. сравнению о исходам вирусом в гене НА низкоишуиогенного варианта выявлена одна значащая оаыена в положении. 511 НА!, приводящая к аминокислотной замене

в положении. 145: Cep^g -+-Илей°. На рио, а представлена пространственная локализация, обнаруженных мутаций на трехмерной модели гена НА. антигенного иарманта НЗ (Wilson et »'j.,, -1931) . При сопоставлении полученных результатов а л опали s аци ей антигишо активных областей на молекуле M (»Hey ft al., 1981) видно, что, замены в положенигх 137 u> 145 приходятся на область антигенной детерминанты. А, а замены в положениях 158 и 193 - на область детерминанты В.

Измененные у HAI В.И. - варианта аминокислоты в положениях 137 и 193 находятся в участках молекулы. НА, стимулкруяцих пролиферацию Т-хзллеров и. Т-цитотскси^аских клеток, соответственно (ЬашЪ & Green, 1983; ündwiood et al,, 1983), И, кал покачано, обнаруженные мутации в структуре НА могут активизировать этот: процесс; (Wiley & Skehel, 15^7) . Кроме, того, анализ положения обнаруженных замен на трехмерной модели. НА показан, что почет, все замены расположены в области рецепторного кармана молекулы НА, контактирующего □ клеточным рецептором. ( замены, в положениях 137, 153 и 193, характерные для В.2. - варианта) ( см. рио. 9) . Так, 137-я аминокислота (в oTOit. положении, у В.И. - варианта. обнаруживается .замена Асн ~*Сер) в соответствии. с пространственной моделью НА (ïiley 8» SkshfJL., 1987) участвует г фор^-мировании. переднего края рецепторного; кармана и при контакте с клеточным рецептором располагается напротив, карбоксйлата скало-вой кислоты рецептора. Возможно, что замела. Асн на меньший па; размерам. Сер облегчает взаимодействие с рецептором в данной области. Отмет!гм, что аналогичная замена Асн-j-gr, Сер может происходить в естественных условиях циркуляции, вируса гриппа (Both & Slei&h, 1981? Lîin Joîi V/, st al., 1980).

Остаток 158-ой аминокислоты токже располагается в области, рецепторного кармана, но на его противоположной сторсне (рис.9), ¿•этом положении у В.И. - варианта произошла ззлена Гля^д с полярной R-группой на Вал0 с н^пдгаярной н-группой. Такое па.~ мещение, вероятно, должно приводить к повышению локальной гидрофобное™ соответствующей области рецепторного кармана и, поводимому, влиять на кмыуногениые свойства вируса. Кроме того, замена аминокислоты в положении 153 может оказквась влияние на урожайность вируса и его инфекционную активность (Both et al., 198^ Kilbouwie et .il., 19S8).

Bis. 8 Bio. 9

Bsc. 8. Схематическое изображение трехмерной структура Щ вируса гриппа шглтопнога подтипа НЗ (Wilson et ai.,1981). А,В,С,Д - прздполоштольлое расположение антигенных областей (i/tle7 et al., 1931) темшш кружками. с цифрами отмечены расположение и номер замещошшх аминокислот у высоксиммуно генного. ( стрелка в скобках, направленная.вверх) и низкоиммуногешого '(стрелка, направленная вниз) вариантов вируса гриппа

Л/Виктлрия/33/72.

Рис- 9 . Расположение некоторых аминокислот молекулы IJA вируса гриппа Х-31 (H3N2) в области рецептор-связываю-щего кармана для сиаловой кислоты клеточного рецептора (Wilsy ¡S ßkehel, 193?). Яаетрпховаш аминокислоты, замещенные у высококммуногенного варианта Еируса гриппа А/Викторкя/35/72.

193-я аминокислота располагается в задней стенке рецептор-ного кармана (Wiley et а\.,' 198-1) . Замена.Cep°g3 -»• Арв" у В.И. - варианта, приводящая к появлению существенно большего по размерам и положительно заряженного остатка, по данным vfilsy 8» Skehel (19s?) помещает длинную гибкуга боковую цепь Apr в положение, где она может стерически выступать внутрь рецелтор-свя-зываюгцего кармана и участвовать в полярных взаимодействиях с . . рецептором. Кроме того, есть данные (Keadal & Сох, 1?85) '. что замены на участке 188-193-Й аминокислот тяжелой цепи HAI могут существенно влиять на эпидемические потенции вируса.

Следует отметить, что в литературе описаны мутанты вируса гриппа A H3U2 , отличающиеся от исходного вируса только одной аминокислотной заменой в области рецептор-связывавшего кармана молекулы НА (Underwcd et al., 1937) .' Среди описанных мутантов есть и вирусы с заменой в положениях 145, 158 и 193-й аминокислот, то есть в тех же-положениях, которые были выявлены у вирусов с различной иммуногенной активностью. Эти вирусы имели-измененные рецептор-связывающие характеристики по сравнению с исходным вирусом. Так, описанная замена СеРх93 повышала

сродство вируса к клеточному рецептору. Авторы, также указывают • на значимость наличия заряженных остатков в основной) облаати. ре-цепторного кармана ( в нашем случае замена Сер0 —»■ Арг+) , которые могут существенным.образом влиять на сродство к рецептору. Остаток 145 HAI локализован на петле, которая выступает из молекулы НА поблизости от рецепторного кармана и природа и ориентация его боковой цепи, мояет влиять на связывание рецептора. В данном. случае замена Сер —* Илей понижает сродство к рецептору.

Полученные результаты показывают, что высококммуногенный и нязкоишуногенный варианты вируса^триппа, полученные от одного родительского вируса си помощью икмуноселекции могут отличаться друг от друга и исходного вируса п^. наличию аминокислотных замен в определенных локусах их гемагглютининов, как правило в области рецепторного кардана, и. прилегающих областей. • Структурно "функциональный анализ выявленных замен на трехмерной модели НА позволяет предположить, что имеет место корреляция иммуногенной активности вируса гриппа с рецептор-связывавщей активность» его гемагглю-тинина и стимуляцией пролиферации Т-клэток.

' *

1У. Молекулярно-генетичоские основы устойчивости вируса. гриппа А к антивирусному действию новакина.

Однии из основных подходов, в профилактике и лечении гриппа является использование химиотерапевтических препаратов, оказы,-ввва^их антивируслое дейшвие. Среди, первых стали использоваться производные адамангана: амантадин (1-аминоадамантан>НС1) и ремантадин ((¿-^етил-1-ада1/антан-ыетиламкн.КС1 ) . Однако последствием широкого, использования аналогов адамантана стало появлений устойчивых к ним вариантов вирусов гриппа. Такие варианты бнла выделены от пациентов, а также селектированы у животных и в культуре, меток при. культивировании, вируса в присутствии препарата. Это. поставило вопрос, о необходимости изучения молекулярных основ такой устойчивости с. целью направленного синтеза более "неудобных" для. вируса аналогов уже используемых соединений, а также поиска ноны/ антивирусных препаратов, что могло бы привести к разработке методов комплексной тераша гриппозной нв|екцка.

Вскоре после открытия противогриппозного действия амантади-на. (ОатПвв сь »1,, 1964) была обнаружена его активность как препарата против болезни. Пархшжояа. (всЬяаЪ еЪ а1», 1972) . Ремантадин обладает более силькьщ.антивирусным действием, чем амантадин, но, повидиыоыу, не влмяетгна симптомы болезни Паркинсона. Наличие у амантадина, как антивирусного агента, терапевтического действия против болезни. Паркинсона.побудило исследовать другие препараты против данного заболевания в отношении их противовирусного, в частности противогриппозного, действия (РгесЬег, -1983)« К таким препаратам относятся в частности норакин (трипериден ) , паркопан (тригексифенидил) , ахинетон (биперидея) , которые являются преимущественно антихолинергическими препаратам, а ан-типаркин (диэтилбензтриамин) , который классифицируется как ан-тигистамин с некоторым антихоякнершческим действием (ТемАег, 1581) . Наиболее сильным антигриппозныы действием обладал норакин. Ниаё приведена его структурная формула:

Наранин икгибирует репродукцию различных орто- и парамиксс-рирусов: вирусов гриппа А и В, кори. (ГгазЪег et el., 1984} Schroder <sfc al., 19S5) и. респираторно-синцитиального вируса (lientel at al., 1988) in vitro li оказывает протектнвиое действие у экспериментальных животных, инфицированных вирусам грипг па:A (Keider, 1486) . . Он также ингибироЕад размножение вирусов гриппа А в фибробластах куриных эмбрионов, клетках ЗДСК и клетках асцитной карциномы Эрлиха СРгезЪег et гл.,, 1984). Норакик обладает несколько более слабым антивирусным действием.'по сравнению с ашнтаданом и. ремантадином, но более широким спектром действия. Гак в отличие от ремантадина.он ингибирует репродукцию вирусов гриппа В и ларамиксовирусов. Механизм действия нора-кина, повидикоиу, отличается от. действия ааантадина и ре.мадтади-на, так как мутанты, резистентные к норакину и. ремантадину, обнаруживают слабу» перекрестную устойчивость (Нeider et al., 1985).

Действие норакика проявляется ка ранних стадиях инфекционного цикла. Он ингибирует адсорбцию и.проникновение вируса, в клетку (Schroder et, al., 1985). , эирус-индуцированный гемолиз, а также конформационные изменения в молекуле НА при. кислых рН, которые .являются необходимой предпосылкой для слияния, вирусной и. клеточной мембран (Skehel ofc al,, 1982j Ghendon efc al., 19SG) . Мишенью антивирусного действия Ножкина является НА. Анализ реас-сортантов неэду норашн-устойчивым мутантом вируса. IFW/Weybrideo и норакин-чувствителышм.вирусом WST/Hostok показал, что НА является ответственным за норакин-устойчивость ('Glieudoa et il,, 19S5). ".

Для изучения, молекулярных основ ингибирушего действия нора-кина был получен ряд яоракин-устойчивых мутантов вирусе гриппа.

»

FPV/Veybrictge (H7Я?) (Seider et al., 1S35; Pröscb et al., 1968) и проанализирована-структура^ генов их НА в сравнении с исходным норакшчувствительным вирусом. Шбор данного штамма, определялся тем, что он оказался наиболее норакин-чувствительным из исследованных вирусов гриппа. б(К-ная ингибирушцая доза. (ИД^д) в тесте снижения образования бляшек для него составляла I мкг/мл. Норакин -устойчивые мутанты родительского вируса FPV/Weybridse (ppv-W) получали, путем, трехкратного пассирования на первичной культура клеток эмбрионов кур (CEC)в присутствии 20 мкг/мл препарата в культуральной среде (Heider et &1.,1985) . Титры вирусов и чувствительность к норакину определяли, методом блязек' на CEC. В этих условиях в присутствии препарата ин$екционность исходного чувствительного, вируса падает с. 1,0x10'' до I.öxIO3 БОЕ/мл (БОЕ-бляижо-образующая единица) , а инфекционность резистентных мутантов практически же меняется.

Вирусы накапливали, очищали, к. РНК Еыделяли как описано ранее. Первичные последовательности НА-генс® определяли прямым оеквеки-рованием вирионной РНК по методу Сзнгера и Эйр (Air ,197-5) о небольшими модификациями. (itolcucbln et al., 198S) у.спользова-нием, синтетических ДК-прайыеров. • •

Была определена последовательность гена НА одиннадцати нора-кин-устойчивых мутантов и чувствительного родительского вируса. • Показано, что устойчивость к препарату не определяется какой-либо отдельной мутацией и аминокислотные замены могут выявляться в различных позициях вдоль всего, полипептида. Как видно из Таблицы 7 устойчивые мутанты содержат одну ( 5 мутантов , две ( 5 мутантов ) или. три ( один мутант.) мутаций в НА ( колонки 2 и 3) . Они являются точечными и. распределены. по полипептидным цепям обеих субъединиц HAI и НА2, будучи.разбросанными в пространстве по структуре олигомера. Используя трехмерную модель молекулы НА вируса X 31 (Wilson et ai., 1^81) и основываясь на допущении, что гемаггл®-тинины вирусов гриппа А обладают сбг^ностью в структурной органиг гации, бьщ; проанализированы участки локализации и возможные структурно-функциональные последствия выявленных мутаций.

Аминокислотные последовательности НА обоих вирусов "внравниг ьали" по принципу максимальной гомологии согласно Lipman & Гсаг^рп ^1935) . Общая гомология между НА вируса X 31

Таблица 7

Характеристика аминокислотных замен в структуре гемагглвтинина Норакип-устоНчивызс мутантов вируса гриппа л/РРУ/ТСеуЬгМбз

1'.!утант ^адохения мутаций НА1 1Ш2

,-Л

йзмоненае Тип Достун-ВТОрИЧНОЙ ность

структуры2

заряда

Изменение молярного объема остатка,

- (X3)4

1 • 2 13 4 .5 6 . 7

2 -112 _ 0 ОС 3 74 — '44

15 112 - 0 и 3 74 -«■124

10 131 Е—-К - -v +• а 1 90 —1о6

12 13-'!- 0—0 0 — - 25 '+4 — 74

7 с—а 0 — ■ 3 2 44 -«■112

4 205 0—Л 0 — + в. 2 44 —112

114- Э - —■ о£. 0 90 — 74

ц .. 122 I—? ' 0 —л- о' В 74 77 — 81

41 А 0 0 ' 0 77 — 61

1 91 я—"/ + _ 61 112 —124

210 Н-^К + — - а 7 99 — 78

6 35" А—3 0 0 сС 3 61 — 61

,50 0 —г. 0 ОС 25 44

16 10? Т-*А 0 _ 0 сС 0 77 — 61

19 0-»Н - * 0 60 74 — 7«

3 260 _ .. 52 90 -о 74

33 • 0 —* 0 . ос 5 144 — 72

123 Н—3 0 оС за 112 — 61

т

А Указаны позиции аминокислот а соответствии с их нумерацией для НА вируса 1-31. Использован однобуквенкнй код.

'' Праведен в соответствии со словарем вторичной структуры белков

> "»я

согласие КаЪпсЬ, Зо.П'1ег (1983).

Средняя доступность всего белка НА составляет 24% от максимальной до-стэпнооти (Вачиапп, Ргопав1, 1989)^ 1е£еренс-состокние для макскмашюй доступности (в %) для аьшнокколоты I взято исходя из лкнейиои котцорма-цни олпгопептвда Гди-али-Х-Гли-Гли. * 1,'олярчые объеш! зминогаслоткнх остатков взяты, у 2вяуа<;г1п (1972).

(Yeriiooyan et al., П9БО) и ÍPV-Vf составляла 4BS ДЛЯ HAI И 66$ для HA2. Вследствие высокой степени гомологии правомерно допустить сходство трехмерных структур обоих НА. Ионные заряд-зарядовыа взаимодействия учитывались по принципу "все или ничего" в зависимости от того, находятся ли взаимодейдтвующйб группы атомяв в пределах выключавшего расстояния в 4 А Или нет. Взаимодействия, обусловленные водородными (Н-) связями, оценивали, сходным образом. Выключающее расстояние между Н-связшшыми донором и-.акцептором составляло 2,8 А. Доступность каждого атома для взаимодействия определялась по Richards (197?) . Программа для оценки доступной поверхностной области описана у b.-.uí:.„.u. et al,., (1^69).референс-состодние для максимальной доступности (в % ) для. аминокислоты X взята исходя из протяженной конформации олигопелтида Гли-Г^-Х-Гли-Гди.

Большинство аминокислотных замен (12 из 18 ) было выявлено в легкой цери гемагглютинина НА2 (колонка 3 в Табл. 7) , прием 9 из них находятся в составе «¿-спиральных структур. У'9 из II мутантов обнаружена по крайней мере одна зарядовая замена (колонка 4) . Не было обнаружено мутантов, содеркащих зарядовые оааеш в .обеих цепях HAI и НА2 одновременно. Большинство мутаций приводит к изменению полярности или гидрофоб ноем;, а также молярного объема.аминокислотного остатка- (колонка 7). Ряд мутаций (см. следующий параграф) имеют тенденцию нарушать сильные внутри- н межмо.Чекулярные взаимодействия, такие как солевые мостики к Н-связи. По сравнению со средней доступностью (2436) для аминокислотных остатков гемагглютинина (Вашааип et al., 19с9) по крайней мере один замещенный остаток каждого мутанта ( за исключением мутанта 12 ) обнаруживает низкую доступность (0 - Sí) ( колонка б) . Это заслуживает внимания с учетом, как правило, более высокой частоты появления мутаций на поверхности белка. Следует отметить, что все недоступные (или слабодоступные) боковые цепи представляют собой части элементов вторичной структуры (oí -спирали или j3 -структуры - колонки 5 и 6 ) , образующих пространство между структурными элементами НА . Таким образом тип вторичной структуры сохраняется, но в результате мутаций стабильность элементов вторичной структуры может изменяться.

1У.1. Возможные структурные последствия ашнокиопотных замен в EJA. ?лутаыгов вируса srv-w , устойчивых к действию норакина.__

Была, предпринята, попытка, проанализировать возможные структурные последствия выявленных мутаций в НА на основе трехмерной шздат ли НА вируса X ЗГ, в целью прояснения возможных молекулярных мехаг низмов действия норакина, как. антивирусного агента. Для большинства мутаций оказалась возможной интерпретация обнаруженных замен в. терминах нарушения конформации НА при. рН 7,0 и дестабилизации положения фьюжн-пептида у устойчивых вариантов, Попидикому, эти. мутации могут давать возможность осуществляться кислото-зависиша кок^ормационньш изменениям в НА, что является необходимой предпа-сшшсй .сли&мя вирусной и эндосамальной избран (skelael et ai,, 1902j Iielenius et al., 199o) » в присутствии ингибитора. На рис- 10 показано положение некоторых из обсуждаемых замен на трехмерной структуре гематготишша. Ниже приведены, результаты такого структурно-функционального'- анализа:

Замена Acnjjo -*■ Лли° (Тир0) (ыутаиты 2 и-15) (см. рис. Юа и 106) . ¿слу-2 является высоко койсервагивкаы во всех описанных последовательностях IfA. Он локализован на длинной <*-спирапи НА2 в. том. месте, где она соприкасается а. Х^-концевым. (фьюдн) пептидом посредством.Н-связей. Он образует 4 И-связи а остатками I а. 4-6 хТ -концевого пептида НА2. Указанная замена нарушает это взаимодействие и таким. образом, увеличивает подвижность //-конца и дестабилизирует полазеншз фьюлш-пептида в кенфорлации НА при рН 7,0.

Замена ~> Оптант 10) (рла. Юа и 106) . Глу^-щ

з Н&2 погружен в HA2-HA2 келш'ростралстао, образуя солевой мостик и Н-сеязи a. Apr^gg и Apr^g? своей цепи НА2. Зелена нарушает эти взаимодействия н ослабляет стабильность всего, трнмера.

Замена Гли^ -*■ Асп~ (мутант 12) (рис. Юа и 1бб) . Глк^д в НА2 локализован вблизи, длинной с5-спирёли НАЯ. Замена может увеличивать кислотность вблизи фыэзк-Тзептида. •

Замена Гли^д -». Apr"8, (мутанта 7 и 4) (рис. Юа и 10в) . Замена небольшого незаряженного Пли в KAI па. большой заряженный Apr должна, уменьшать высокую подви>хность полипептидной цепи в этой области и, возмогло, приводить к существенному ко!&$ормационному изменению.

рис. 10а. Модель трехмерной структуры гемагглютинина вируса

гриппа антигенного подтипа НЗ (miey et al., 1931). Указаны положения некоторых аминокислотных замен у норакин-устой-чивых мутантов вируса гриппа. A/FPV/ffejbrldga; откечены положения К- и С-кощов тяжелой (HAI) и легкой (НА2) цепей. Стрелкой показана длинная о£*спираль оубъединицы НА2, двойной стрелкой -глобулярная часть субъединицы HAI, 4'ьшкн-пептид представляет собой область -конца субъединицы НА2.

С-НА1

М- ь

и-г_. v v , л

' I Л , '

ОХ

Ы-НА2*

Л

50

< Ы

< щ. >- у ■ (< / У

V;

36

'V

'Л I

1 гА ■

1РЛС1 Область фыоан-пептида гемагглютияина вируса гриппа

в увеличенном масштабе (см. рис. 1Са) . /.•■азаны айи нота ело ты исходного норакми-чузствительного вируса.

/■¿TL i-*'

г\ хл ^

£ 2B0 ^

Рис. 10в. Область глобулярной части субъединицы KAI вируса.

гриппа в увеличенном масштабе (см. рис. Юа) . Указаны аминокислоты исходного норакин-чуьствительного вируса.

3-шг;на r.iyjjx. АаГ (кугшпн 7 и 4) (рис. Юа л 106) . Глуд^ в ид2 образует солороЗ соси с Лизд^ в той части длинной tó-слирали того же полипептадп Ш2, которая стабилизирует полоке.чис ^лгкп-пептида второй ИД2-цепи черэз Н-сеязь. При за-ненэ на Асп (который меньше на один С-атом) Н-связь может но образовываться, что ыедет иршодтчь к дестабилизации положении $ьши-л?лтида з хоиформадии при pH 7,0.

Зл'-гона Tpejoo ""ЛЕЗ0 (мутант 5) (рис. Юа и Юв) . рта . замена з Н\1 мохпт ограничивать высокую гибкость отой области с полипептидной цепи (возможно за счет значительного'увеличения r:?;¡¡ г.!'05нссти ).

Тра"т -"-Ала0 (мутант 5) (рис. Юа и 106) . Тре41 з НА2 деяа» в НА2-ИЛ2 мелпросгранотве» и образует Н-связь с Tpogj ■л Лсп^ другоЛ молекулы НА2, которая может нарушаться при данной 32,"С'Н0.

Замена Apr+j -т- Тир0 (мутант. J) (рис. Юа и Юв) . В Ш вируса X Я а положении SI'-находится Сер0, который образует Н-связь с Асп^г,^ той полипептидной цепи. Aprgj 'у вируса может участвовать в образовании солового мостика с Acng^j, который данная замена может нарушать.

S&raHaJ^iCgjq ->► ¿он0 (мутант I) . Гис;>10 в HAI располагается в пространстве между двумя НЛ1-лслипептидаш. Он образует солевой мостик с Лсл^ и Н-связь с Aprv^O ДРУГ0Й молокулы HAI. Оба взаимодействия могут нарушаться иДи по крайней моро ослабляться при такой замене.

Замена Ала%^ -*-Cs2° (мутант 6) (рис. Юа и 106) , Ала ^ в НА2 образует внутримолекулярную Н-сбязь с Aanjg той so поли-поптидной цепи НА2. Замена на Сер должна наруиать эту связь, возможно дестабилизируя конформацию НА при pH 7,0.

Замена_АсП|д —Асн° (мутантов) . Aciijg в Ш2 локализован на поверхности белка. Замена его на Асн будет увеличивать общий заряд на поверхности. Н-связ^- о Ала^ (см. вше) будет при этом сохраняться.

Замена ТридЭ -*• Цис0 (мутант 3) . Tp:í0g (как и Тирр3 у вируса X 31) может быть помещен в межпространство между двумя молекула».« HAZ и располагаться рядом с АрГдд другой суОъе-динипы НА2 и располагаться рядом с Арг^ другой субъвдиницн

t

HA2. Замена. Три на.меньший по. размерам. Цис будет нарушать любое возможное взаимодействие в этой области соприкосновения.

Замена, Apr jog —*• Сер0 (мутант 3) . Арг^д в НЛ2 взаимодействует с. той же полипептидной цепи через Н-связь и солевой мостик. Эти. связи могут быть нарушены заменой на Сер и уменьшение электростатинеского заряда в этом месте может еще болаа дестабилизировать внутримолекулярные связи.

Таким образом, результаты анализа структуры НА 11-ти мутантов вируса гриппа. EFV/'.Veybricee , устойчивых к действии нора-кина, позволяют сделать следувцие выводы. Устойчивость может бить связана с наличием.1-3 аминокислотных замен в структуре НА.

Большинство мутаций находится в субъедпщце ЦА2, причем-, осцовнад

1

i¡x часть локализована в- составе ©¡-спиральных структур., Bi оснрц--вдм мутации связана., Ъ. изменениями заряда и/или полярности ашно~ кислот., Структурно-фуняцирнаедный- анализ мутаций на основе 3-х мерной структура Н4 вдруед. Х 3I¡ цоказал, что большинство мутаций могут дестабилизировав, сп;рук;г,уру Ш. при рН 7,0, наруиая Н-свя-зи а также солевые которые яьляатся стЕогствелнъади за

внутри- и межколекуллраде взаимодействия. ,Цругие мутации могут дестабилизировать положение фыян-пеитида. Обнаруженные измен*-ния в структуре. НА могут способствовать кон^ормационным иамна-ниям НА,, необходимым для слияния вирусной и клеточной мембран в присутствии ингибитора, то есть тем конформационкым иомэненинм, которые происходят в НА при кислых рН в нормальных условиях инфекции. *

1У.2. Сравнительный анализ аминокислотных загнан в НА У .мутантов вируса гриппа A/H'T/iV«;,bridge, устойчивых к действию иораккна и фмантадина._

Ранее были описаны мутанты вирусов гриппа А, устойчивые к действию высоких концентраций амантадина, которые содержат структурные изменения в НА (ü&ivlíla ct £.l.il; 19SJ) . Назд Был проведен сравнительный анализ мутаций в НА у мутантов вируса гриппа A/íPV/Víeybridt;«, устойчивых к действию амантадина и норакина. На piso. II схематически представлено расположение аминокислотных замен в НА емантадин-( А-) -устойчивых inicia et .-i., 15 с 5) и нораккн-(к -) -устойчивых (данная работа) мутантов по

НД1

НА 2

Х31

А N

дл

11

ли

205

ЙО

200

300

■ согкальшй пепгед

П.

»2 м

I_

100

И i 3 -1

*

200

I- связующий пептид I 1 - дасульфвдная сеязьЬ£>^6- спираль ЕЗ-_уЭ -сгруяяура |- мутации |- совпадающие аоложешш мугаций

Рис.II..Сравнение аюнокислоша замен в структуре НА.акангадан-устойчивых- (А) и наракан-усюйч&вых (ы) мутантов вируса гриппа ЕРТ-игеуЪгАаее. На верхней схеме представлены некоторые

структурные особенности НА вируса I 31

ел сл

. ' - - ■ « длине молекулы.,НА, <У)Ч последовательности приведены в. соответс- " тлие са структурой НА вируса X 31. Сверху на схеме приведены, не-' которые структурный особенности RV вируса X 31 (Wilson et ai., .

Б сарии А-устойчивдх мутантов, в НА выявлено 24 положения, •в. которых- обнаруживается аминокислотные замены (10 - в HAI и 16 ■' в НА2) . Для И -устойчивых мутантов выявлена 16" положений,' в кс^ торьа..обнаруживаются замены. (5 - в.НАГи 12 - в НА2) . Как. мок-'.' но.видеть, расположение мутаций в обоих случаях в основном не совпадал»., Однако в ебоих едучаях большинство, аминокислотных замен' .; (17 из 26 для А-ус-тойчивых и 12 из I? для .13 -устойчивых мутантов) находится зз аубъедшъще НА2. Причем, подавляюще их число локаяиг зовано. в двух стиральных структурах. Выявлена четыре аовпа-даюцих положения мутаций: Apr^j и Гли^^^ в liAI и Acn^jg и Глу^ . в НА2 (на рисунке отмечены стрелками) . Причем только в одном случае выявлена идентичная замена; Acnjjg —»- Глк°у А-устойчквого. мутанта и. N »-устойчивого мутанта 2 (Табл. г!) . У Е -устойчивого, мутанта 15 в~ этом, положении происходи закена Асп~—»-Тир0. а. у другого А-усяойчявого мутанта - Acn~-V Асн°. Как иидно, вое три мутации приводят к замене отрицательно, заряженного Асп на аминокислоты с незаряженными боковыми цепями.

Как отмечено вше, положение. Acnj'jg является высококонсерва-: тивньш среди различных НА. Он локализован на длинной а-слирали НА2 ь том маете, где она_ соприкасается а Е-концовым (фьюжн) пептидом посредством водородных связей. Замена Асп" на. Г.ш°, Тир0 или Асн° нарушает ого взаимодействие, увеличивая подвижность конца и дестабилизируя положение фьюжн-пептида в конформации, НА при pH 7,0.

Замена. ГлУ}^ в НА2 на Асп" у Н-устойчявого. мутанта 4 (Табл. 7 ) также может приводить к дестабилизации положения йыат.н-пептида в конформации при pH 7,0. У А-устолгиивого. мутанта е этом положении происходит замена другого характера - Плу"^ Лиз . В структуре НА исходного, чувствительного вируса Глу^, находящийся на длинней <*-спирали НА2, образует, солевой костяк с Лиз^г, той же цопи, который находится в Бал-дер-Заальгхвском контакте с концевой й-группой другой субъедию;цы IIA2. З-тенн

Глу-—»-Лиз+приведет к замене нейтрализованного мостина Г'луда -•"иа117 на- ДЕа положительно- заращенных лизина (114,117) , один из которых (117) , находится в контакте с;, д-концом. НА2 другой цепи НА2. Ото будет электростатически,дестабилизировать положение Н -конца в конформации при pH 7,0/. - .

■ Aprgj в HAI замещается у N-устойчивого' мутанта I на Тир0, а у двух А-уагойчивых мутантов соответственно на. Глн° и. Лей0. . Во всех случаях происходит замена на.незаряженный аминокислоты. При зтом нарушается солевой мостик с Acn^j той же полипзптид-ной. цепи, что также дестабилизирует структуру при pH 7,0.

В положении 205 HAI происходит, замена небольшого, нвзаряжен-- ного Гли° на Арг+ у н-устойчивых мутантов ( 7 и ,4) и Лиз+ у А-устойчивого. мутанта. В обоих случаях происходит'замена наг больше. положительно заряженный остатки, что молет уменьшать высокую подвияность полипепткдной цепи.в этой области.и,.возможно, приводить к существенному кэнформационному изменению.

Таким образом в.составе.мутантов вируса гриппа ЯРТ-W , , устойчивых к действии норакина н: высоких концедтваций шлонтадя-на, выявлены сходные аминокислотные Замены.в НА в отношении, сайта и направления замен, которые могут увеличивать подвижность А/-конца' субъединицы RA2 и дестабилизировать положение , фыажн-пептида в конфигурации НА при pH 7,0 и всей структур! в целом. . ;/.<-V.

Известно, что амантадгег в высших кощентрациях' (0,2-0,5 мМ) ингибирует киолото-индуцированше конформадиокяые измене^ ния в НА. Амантадин-устойчивые кутанты способны претерпевать ," эти. изменения при повышенном рН( так как конфигурация мутант-;' ных НА. при. pH 7,0 сказывается дестабилизированной (Daniels ей; al., 1985) . Соответственно влияние аминокислотных'замен в .' структуре. НА у нораяин-устойчивых^утаытсв может:быть аналогичным, что дает возможность осуществляться слиянии мембран в усг ловиях повышенного pH. . :. •

Показано, что при. низких Кхлщеятрациях .( 1,0-10 .цМ) первичной кипенью антигриппозного действия амаятадина и. ремантадина является белок Н2 (Нцу efc al¿, 1935;: Karginov et Д., 1987 í Bolshe et al., 1986) - Все мутанты, устойчивые. к. относительно низким концентрациям амантадина и ремантадина- несут мутации, s.

белке М2. Однако анализ структуры белков М2 норакин-устойчивых мутантов не обнаружил закен в МЕ, что подтверждает результаты анализа реассортантов (Ghendon ab ol., 1986) о том, что мишенью антивирусного действия норакина является гемагглютинин. Это может отражать некое отличие в механизмах антивирусного действия амантадина и.норакина, а также объясняться тем, что нижний концентрационный порог ингибирующего действия норакина существенно выше, чем для амантадина и. ремантадина. В то же время кривая "доза-аффект" для нораг.ина имеет гораздо более крутой характер. Б силу этого переход от. низких концентраций к высоким, характерный для ингибирующего действия амантадина и ремантадина, для норакина может быть слабо выраженным.

Приведенные результаты дают основание заключить, что нора-кин, повидиыому, мойег представлять по крайней мере один из аспектов бифункциональной ингабируюдей активности амантадина как в выборе бслкагнишени воздействия, так и в том, что устойчивость к ингибирующёму действию в ряде случаев может определяться сходными мутациями,

В ИВ о д и '

1. Показано, что при совместной циркуляции с 1977 г. вирусов гриппа А сероподтипов Н1Н1 и. H3II2 в популяции людей могут циркулировать природные реассортантн между ними по генам внутренних белков. Это дает основание рассматривать процесс перегруппировки генов как один из механизмов возникновения новых эпидемических штаммов вирусов гриппа. .

2. Показано, что минимальная скорость накопления мутаций в геноме вирусов гриппа А в процессе естественной циркуляции

на основе анализа изменчивости генов внутренних белков вврио-на составляет 10"^ замен оснований на один нуклеотид в год.

3. Показано, что апидемический штамм вируса гриппа

А/СССР/90/77 мозгно рассматривать как реассортант по РНК-ссгксн-ту 7, кодирующему белки MI и М2. Альтернативным объяснением разлития в. структуре М-генов й антигенные различия MI-белков ьиру-сов НИИ А/СССР/90/77 и ¿/¡?Ч1/Л/30 может быть генетический диморфизм ь популяциях штаммов, циркулировавших в 1950 или 1977 гг.

4. При анализе структуры сегмента 7 вирионной РНК вирусов ; 1 гриппа А человека и птиц показано, что в структуре белков Ml и

М2 существуют позиции аминокислот (3 - для белка И и 4 - для белка М2) , в которых находятся характерные аминокислоты, позво-.; ляющие по этому критерию дифференцировать хозяйскую принадлежность исследуемого изоллта вируса.

5. При изучении процесса адаптации вируса гриппа А к нозо-му хозяину (на примере адаптации вируса гриппа А/СССР/90/77 к условиям репродукции в легких мышей и культуре клеток ВДСК) показано:

а) при адаптации.вируса к легким мыаей, приводящей к селекции вирулентного Еируса, обнаруживаются изменения в структуре по,, крайней мере 5 из 8 вирусных гонов'(в одном из генов FBI или FB2, генах РА, НА, НА и ИР);

б) мутации в структуре гемагглютинина, необходимые для адаптации вируса к условиям репродукции в клеточной системе нового хозяина, сказываются недостаточными для формирования вирулентно,-го вируса, так как вирулентный и авирулентннй варианты вируса, полученные из адаптированного к мымам вируса, имеют идентичные аминокислотные замены в структуре своих гемагглютининов;

в) вирулентной и авирулентный варианты вируса, прошедшие одинаковую пассаяную историю в легких мышей и имеющие идентичную структуру гемагглютннина, существенно различаются по уровню репродукции в органе-мишени: разница в тиграх составляет величину порядка 2 l0S ЗЩвд!

г)- варианты вируса гриппа А/СССР/90/77, адаптированные к различным клеточным системам млекопитающих (легкие мышей и культура клеток МДСЮ , несут идентичные мутации в структуре своих гэмагглютининов.

6. Показано, что различия в уровне ишуногенной активности вариантов вируса гриппа А> получеккых от одного родительского вируса путем иммуноселекции, могут определяться различиями в ре-цептор-связнвашщей активности их r/магглытишноя и активации пролиферации Т-клеток вследствие произошедших кутаций в рецептор-связывака.ей области гекагглютинина.

7. Впервые проанализирована структура гена гемагглютинина

целой серии мутантов вируса гриппа А> устойчивых к действию антивирусного препарата норакин. Показано, что:

а) мутации в гемагглютинине могут дестабилизировать его структуру прй pH 7,0, нарушая водородные связи и солевые мостики, ответственные за внутри- и межмолекулярные взаимодействия,

а также дестабилизировать положение фыожн-пептида, приводя к кон-формационвдм изменениям в структуре гем&гглютинина, необходимым для слияния вирусной и клеточной мембран;

б) норакин может осуществлять по крайней мере один из аспектов бифункционального ингибирувщего действия амантадина как в выборе белка-мишени, так и в том, что устойчивость к ингибитору может определяться одинаковы»« мутациями.

К'

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Шилое A.A., Козлов J0.B., Курманова А.Г., Горбулев Б.Г., Селиванов Я.М.;, Дцанов В.М., Баев A.A. Анализ структурной изменчивости индивидуальных генов эпидемических штаммов вирусов гриппа H1N1 . Молекулярная биология, 1981, 15, I37I-I384.

2. Kozlov Tu., Gorbulev V.G., Eurmanovn A.G., Baev A.A., Sbdlov A.A.-, Zhdanov V.M. On the origin of the H1K1 (A/USSR/90/ 77) irifluensa Yirus. J. Gen. Virology, 1961, £5, 437-ЗД-0.

3. Козлов Ю.В., Шилов A.A., Курманова А.Г., Горбулев В.Г., Селиванов Я.М., Дцанов В.М., Баев A.A. Рекомбинационное происхождение эпидемического штамма А/СССР/90/77 вируса гриппа. Доклады АН СССР, 1981, 257, 721-724.

4. Махов A.M., Шилов A.A., Жданов В.М., Клименко С.М. Элек-тронномикроскопический анализ индивидуальных генов вируса гриппа. Вопросы вирусологии, 1982, 6, 677-681.

5. ¡Лилов A.A., Селиванов Я.М., Мельниченко Е.И., &цанов В.М., Козлов К.В., Курманова А.Г., Горбулев В.Г., Баев A.A. Изучение генетического родстве старых и новых вирусов гриппа человека

методом олигонуклеотидного картирования. Сборник "Молекулярная биология вирусов гриппа и гепатита", Москва, 1982, 46-50.

6. Ю$еров В.П., Самохвалов Е.И., Янкина З.К., Шилов A.A., Ур^га^ь X.B. Получение индивидуальных двутякевых ДНК-копий гено-'

ма вируса гриппа. Сборник "Молекулярная биология вирусов гриппа и гепатита", Москва, 1982, II2-II6.

7. Шилов A.A., Руднева И.А., Обросова-Серова Н.П., Дданов ,-, В.М. Генетическая ¡изменчивость вируса грмзла в процессе адапга- V: ции к новому хозяину. Доклады АН СССР, 1904, 274, I2I7-I220.

8. Шилов A.A., РуднеЕа И.А., Обросова-Сероьа Н.П.,. Чайка О.В., Синицын Б.В., Жданов В.М. Адаптация'вируса гриппа к новому хозяину: генетическая изменчивость вируса гриппа человека в пррцессе адаптации к мыиам. Вопроси вирусологии, IS84, 4, 410-417.

9. Шилов A.A. Олигонуклеотидное картирование вирусных нуклеиновых кислот. Сборник "Методические.рекомендации по применении современных методов исследований в вирусологии", Москва, 1984, 16-22.

10. Со;: Ii.ОТ. , ICendal А.Р., Shilov A.A., Alexandrova G.I., Ghéndon Yu. Z., Klimov A.Z. Comparative studies of А/Leiiingrad/ 13V57 wild-tipe and ¿t-7-timec passed cold-tdapted autant influenza viruses. J. General Virology.- 1985, 66, 1697-1704-,

11. Шилов A.A., Мойсиади O.A. Различия в структуре генов матри-ксного белка устойчивого и чувствительного к римантадину вариантов вируса гриппа. Сборник "Молекулярная биология вирусов", .Москва, 1985, 42-46.

12. Климов А.И., Шилов A.A., КоксН.Дк., Кендал А.П., Гендон Ю.З. Сравнительное изучение вируса гриппа А/Ленинград/134/57 (H2N2) и полученных на его основе холодоадалтированных доноров аттенуации Сборник "Молекулярная биология вирусов", Москва, 1985, 78-83.

13. Шилов A.A., Чайка О.В., Мойсиади С.А., Букринская А.Г., Жданов В.М. Ремантадин-устойчивый и ремантадин-чувствительный варианты вируса гриппа отличаются по структуре генов гемагглютинпна и матриксного белка. Доклады АН СССР, 1986, 289, 1255-1257.

14. №лоз A.A., Чайка О.В., Стеров А.И., Мойсиади С. А., Букринская А.Г. Различия в структуре генов матриксного белка и гемагглютинпна чувствительного и устойчивого к ремантадину вариантов вируса гриппа ВЧЛ ( штамм Вейбрида) Вопросы 'вирусологии, 1987,

Р 3, 289-293. - '

15. Шилов A.A., Козлов Ю.В., Чайка О.В., Курманова А.Г., Жданов B.W., Баев A.A. Генетическая изменчивость эпидемических штаммов вирусов группа серотипов К-Ш1 и НЗК2 в процессе антигенного

(

дрей&а. Вопроси вирусологии, IS87, № 4, 419-429.

16. Козлов Ю.В., Шилов A.A., Чайка О.В., Курманова А.Г., Жданов В.М., Баев A.A. Генетическая рекомбинация между природными изояятами вирусов гриппа серотипов H1N1 и НЗИ2 . Вопросы вирусологии,.1987, № 6, 660-666.

17. Шилов A.A., Синицын Б.В. Определение первичной последовательности вирусных РШ о поморю комплементарных синтетических ДНК-праймеров. Сборник "Методы исследований в молекулярной, обцей и медицинской вирусологии", Москва, 1987, 5-13.

1В. MirkuEliin S., Ghiasi H., Sokolov H., Shilov A., Eini-tzyn В., Brown D., Klimov A., Kayak D. Nucleotide eeqence of E1U serment 7 Weyfcridge (H7.I?) and WSH (H1N1) imluenza vi-

tuses. Virus Reseajc^e, 1988, 10, 263-272.

%

"¡i

19. Демьяненко й.В., Шилов A.A., Чуьакова З.К., Чайка О.В., Исаева E.H., Ровнова'З.И., Исаева Е.С., Косяков П.Н. Сравнительная характеристика гемагглюткнинов вирусов гриппа А с антигенной структурой HswlHI , выделенных от человека и тавотных. Вопросы вирусологии, I9S8, IP 2, 157-162.

20. Чувакова-З.К., Демьяненко И.В.', Ча:!ка О.В., (Еилов A.A., Ким Э.В., Ровнова З.Й., Исаева E.B.( Исаева Е.С. Антигенный анализ нейраминидазы и структура генов нейрашнидазы Еирусов гриппа

А (Н1Н1) -серовариант. Eswun , выделенных от человека и .тавотных. Вопросы вирусологии, 1989, № 6, 656-651.

21. Яономаренка А.И., Шилов A.A., Чайка О.В., Рыбакова Ï.M., СкрипченкО) Г.С. Различия в структуре гемагглютинина вариантов вируса гриппа А (ЯЗН2) , различающихся по иммуногенной активности. Молекулярная генетика,микробиология и вирусология, 1990, III, 7-9.

22. Shilov A.A., Chuvakov« Z.E., Eeir/cnerùco I.V., Cbayka 0.7., Iseeva E.I., fiovnova Z.I. Badioiangnoess«5 and oliL;onucl^otj napping oí A/Hsw1H1 influenza viruses, isolated fron hun.ins a:vl animais. Acta Virolosica, 1990, ¿4, 493.

23. Pxöeüh S,, Haider H., Sehred er'. С., Shilov A., Sinitzva В.,

BliMV Y., Krü¿sr D., FrikiHúl C. Uappiry Kutd;i0tui in iiiiluenja A virui!; »osisitant. to ttorafcin. ÎSBS betters . 267,' 19--01.

24. Шилов A.A.., С1ницин Б.В., РуднеЕа У: Л. Роль гемагглютяни-

' на в процессе адаптации вируса гриппа к hcfcmv хозяину и приобретении км вирулентных свойств. Доклада АН СССР, 1991, 318, 9S5-599.

Зик t?9Pcfit тар. юо St/SSL/ -.У <'<}.