Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЛИПИДНЫИ БИСЛОЙ И НЕБИСЛОЙНЫЕ СТРУКТУРЫ В ОРГАНИЗАЦИИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "ЛИПИДНЫИ БИСЛОЙ И НЕБИСЛОЙНЫЕ СТРУКТУРЫ В ОРГАНИЗАЦИИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН"

На правах рукописи

1

ТАРАХОВСКИЙ Юрий Семенович

ЛИПИДНЫЙ ВИСЛОЙ И НЕБИСЛОЙНЫЕ СТРУКТУРЫ В ОРГАНИЗАЦИИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

03.00.02 - биофизика

Автореферат диосертации на соискание ученой степени доктора биологических неук

Пущкно 2003

Работа выполнена:

в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук. проф. Л.С. Ягужинский Доктор физико-математических наук Д.П. Харакоэ Доктор физико-математических наук Ю.А. Ермаков Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится » С<ТЬТра 2003 г. в. час

на заседании Диссертационного совета Д 002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по "чресу: 142260, Московская область, ч

г. Пущине, ИТЭБ РАН \ /

С диссертацией можно ознакомиться в б' - Институт теоретической и экспериментальной ' РАН

Автореферат разослан о » Г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. . .. Актуальность проблемы. Природные литии способны образовывать разнообразные структуры в зависимости от рН, ионноП силы, температуры и других ^ факторов. При этом л и и иди ый Си ело il, наиболее хорошо 'щученная составляющая биологических мембран, является лишь одноП из известных фаз — а именно, ламс.-иярпоП фазой, наиболее полно отражающей паши представления о барьерных .свойствах мембран. Однако все разнообразие функций биологических мембран связано с процессами временного и локального разрушения-восстановления бнелоя в таких явлениях, как: трансмембранный перенос метаболитов,'секреция белков, обмен генетической информацией между клетками, внутриклеточная доставка различных кочпоне1пов, эвдоцитоз и экзотпоз, клеточное деление,^ слияние( клеток, бактериальная ннвазия, вирусная инфекция и многие, другие. Все эти процессы сопровождаются разнообразными видами межмембранного взаимодействия и слияния мембран при которых происходят изменения фазового состояния липидов. Такие кооперативные струюурные перестройки в мембранах называются разовыми переходами. '

Два обширных и сильно отличающихся по физической природе типа фазовых переходов липидов привлекают особое внимание исследователей. Во-первых, это процессы плавления липидов, способные вызывать разделение твёрдых н шших фаз, приводящее к латеральной сегрегации компонентов в плоскости мембраны. Во-вторых, эго полиморфные фазовые переходы липидов, в результате которых,могут образовываться такие небислойные структуры, как кубические или гексагональные фазы.

Биологическое значение обоих явлений чрезвычайно велико, В живых клетках гомсостатнчески поддерживается такой состав липидов, при котором, в интервале температур, характерных для жтнсдеятельности данного организма.^ лтшаы находятся в расплавленном состоянии, • при этом существует . возможность , возникновения полиморфных фазовых переходов

Принятые со крашенин: * >■

Пригюлные липили и их синтетические аналоги DGDG—дигалакгозндлиглицерин MGDG — моногалактозилдиглииернн PG - фосфаткаилглииерин DOPE—д иолеилфосфэтняилэтанолзм ни DOPC - диолеилфосфатидилхолин ' ОМРС-димирисгоилфосфапиилхолин ■ DPPC — дипальмтхнифосфатндидхолнн ' " Синтетические катионiте липилы E-DOPC —этил-диолсоилфосфатидилхолин „

DOTAP -диолеилтрнметнл аммоний пропан ' .' ТТМЛ-татрадсцилтри.метилачмоиийбромид 1>С-СЬо1-диметиламиног)га11кзрбамоил-холесгерин Мстозм исследования ' . ДСК-дифференциальная сканирующая калориметрия..

- КД-круговой дихроизм ----

-ЯМР-ядерный магнитный резонанс

В последние годы интерес к исследованию свойств липидов особенно возрос в связи с широким использованием лип'осомальных препаратов в медицине и, прежде всего, в генной терапии, Возникла практическая необходимость создания липосом, содержащих генетический материи или лекарственные вещества и способных активно и избирательно взанмодей с гво вать с поверхностью определенных клеток-мишеней, проникать » цитоплазму н том освобождать биологически активный агент. Создание молекулярных ' машин, способных выполняв столь сложные , и многостадийные операции, моледир\юшне явления живой 1ф1фоды, невозможно без глубокого и всестороннего изучения всего разнообразия .физико-химических свойств липидов, которые; наряду с белками, полинуклеотидам и к полисахаридами являются венном биологической эволюции молекул. ,

Цели к задачи исследования. Целью представленной работы.было изучение сгруетурной оргашшшш различных фаз лнпидов, как в модельных системах, ток и в живой*клетке. Мы ставили следующие задачи исследования, фазового поведения модельных систем: ,,

* ' 'Роль электростатических взаимодействий в регуляции полиморфного поведения

липидов,

■ ' Влияние больших амфинатических молекул, например молекулы хлорофилла, на

полиморфное поведение различи ыхлинидов. \ ' '

* ' • Роль процессов исрекисного окисления липидов в регуляции фазового повеления

мембран. Структурны с изменения в комплексах цнтохроч с—карлнолипин. ,

■ Физико-химические свойства' комплексов белков или ДНК с различными - лнпкдамн.

Закономерности, обнаруженные в модельных системах, были рассмотрены также на примере клеточных мембран. При атом ставились задачи исследовать: " Структуру it динамику изменений межмембранных контактов в зонах адгезии внешней н внутренней мембран грамотриизтельных бактерий.

■ Влияние двухвалентных катионов на полиморфизм мембран грамотриизтельных бактерий и проникновение ДНК в цитоплазму.

* Роль мембранных |фОиессов в ннфецированин клеток Escherichia coli фагом Т4,

■ Изменения структурной организации клеточных мембран при взаимодействии с кат ионными линосомами.

Научная новизна.

■ Впервые обнаружена возможность контроля полиморфного повеления липидов, основанная на регуляции электростатических взаимодействий между противоположно заряженными полярными головами молекул. Ныло показано, что, изменяя соотношение зарядов ли пила, мы можем получать определённые полиморфные кубические или гексагональные фазы.

■ Впервые показано, что амфипашчсские молекулы, имеющие большой объем в полярной области, например молекулы хлорофилла, способны инициировать полиморфные переходы липидов благодаря изменению соотношения размеров полярной ti гидрофобной поверхностей мембраны.

■ Провезен анализ влияния нерекисного окисления лнпидов на фазовое состояние •и структурную организацию мембран,, образованных кардиолипином и щлохромом с. Показано, что наблюдаемые структурные изменения мембран связаны с образованием олигомеров белка н продуктов перскисного окисления липидов. ,

■ Впервые обнаружено стабилизирующее' воздействие катонных липидои, используемых о генной терапии, tu молекулу ДНК. Благодаря формированию специфической мультиламеллярной фазы ДНК-липидпого комплексов которой молекула ДНК оказывается «зажатой» между мембранами, температура плавления ДНК повышается до 105-115*С.

• Проседиt детальный анализ структурных изменений мембран в условиях трансформашш клеток грамот р шит ельиых бактерий экзогенной ДНК. Показано сходство механизмов полиморфных изменений мембран бактерий, ответственных за трансмембранныП перенос ДНК, и полиморфизма липидов, наблюдаемого в модельных системах.

■ Исследованы ' структурные изменения мембран Escherichia coli' при инфицировании бактериофагом Т4. Впервые .ттоказана роль межмембранных взаимодействий и процессов слияния мембран в инфицировании бактериальных клеток. Обнаружена специфическая структура, названная «тоннелем»,

ответствен пая за перенос молекулы ДИК через мембраны бактериальной клетки.'

, ' ■ ■ 1 *

Практическая ценность работы. ¡.Обнаружены н проанализированы условия, при которых образуются кристаллические 'и нарзкрнсталлическне структуры па основе смесей анионных и катонных лниидов, ДНК-липидных u бслок-липндных комплексов. Такие структуры могут использоваться в качестве матрицы при создании электронных устройств и мнкрочипов для потребностей нзнотехнолотй. 2. Исследованы процессы взаимодействия с клеткой липосом и бактериофагов, -по может найти применение в генной терапии и других областях медицины при создании средств доставки лекарственных препаратов в цитоплазму.

Основные положения, вы косимые на защиту. Природные ли пилы, благодаря способности к сложному фазовому поведению, способны - выполнять функцию активно!! матрицы, на которой происходят - разнообразные процессы жизнедеятельности. Исследования фазового поведения липндов имеет большое практическое значение и потенциально может использоваться в медицине н технике. • Апробация работы. Работа пошла апробацию на Съездах биофизического общества в Канзасе (1998г.), в Новом Орлеане (2000г,), в Постоне (2001г.), в Сан. Фрашшско (2002г.). На КейстоискоП конференции по v не вирусным средствам доставки генов, Ксйетон, Колорадо, 1998г.' ' ''"'■' '

Публикации.'По теме диссертации опубликовано 33 статьи в центральных отечественных и международных риалах.

Структура и объем работы. Работа изложена на 260 страницах машинописного текста. Она состоит разделов; Обзор литературы. Материалы, и методы, Экспериментальная часть, Заключение и Выводы. Имеется тахжс Список шпирусмой Л1ггературы, содержащий более 500 источников.

МАТЕРИАЛЫ и методы.

Материалы, В работе использовались л иг гады, под ученные ог компаний Avanti Polar Lipids или Sigma. В некоторых случаях днпиды выделяли из соответствующих природных источников. Их чистота определялась с использованием тонкослойной хроматографии, Cutncj Н анализ тпон-дипальчктоил-фосфат идилхолина ироводмея в лаборатории H.A. Василенко (Институт Тонкой Химической Технологи и, Москва). Синтез эшл-фосфагидилхолинов про водился я North weitem University, USA. Экстракцию липилов из пурпурных мембран проводили в лаборатории Л.И. Барсукова (Институт Биооргаиич еской Химии, Москва).

Дифференциальная сканирующая микрокалпраметрия. Намерения тсплопоглощсния проводились на приборе a VP-DSC Micro Calorimeter (MicroCal Ine, СШЛ) или ДЛСМ-4 (Биоприбор, Россия),

1гР~ЯМР спектрпекппия, Altai it J препаратов проводился гг. лаборатории И.Л. Вас клеи ко и использованием спектрометра Bniker WM-250 (Германия). Рабочая частота 101,4 мГц. , м!

Электронная микроскопия.

Метол замораживания-скалывания. Суспензии замораживали в жидком пропане и скалывали на модифицированной нами вакуумной установке JЕЕ-4В фирмы JEOL (Япония) при вакууме 10'7Торр и температуре -150'С. .

..■ Метол ультрятпнких срезов. Препараты фиксировали 12ч Hi раствором четырехохиси осмия, затем1% растворе таннипа и после стандартной процедуры обезвоживания, заливали в эпоксидные смоли.'Срезы окрашивали но стандартной методике уран плац етатом и югтраточ cot ища и просматривали па микроскопе JEM-100В. . . • ■ .

Jifir-Te методы кратко описаны п подписях к рисункам и в основном тексте

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ

> Изменения фазового состояния линндов живых клеток .обычно протекают локально в специфических участках поверхности мембран н часто бывают весьма кратковремеины. Это в значительной мере затрудняет их исследование in \i\-o. Существенный- прогресс в этой области был достигнут,, прежде всего, благодаря уникальной способности лнпидов спонтанно образовывать разнообразные структуры in vitro, что открывает, широкие возможности для моделирования биологических процессов. " .*•... •

' Электростатические силы в регуляции полиморфного поведения липидов.

Мы предположили, что в липосомах, образованных смесью ■ положительно заряженных (катионных) н отрицательно заряженных (анионных) липидов, электростатические взаимодействия между полярными головами молекул moot зависеть от соогиошсния зарядов, определяемого лишимым составом. Например, если количество отрицательных и положительных зарядов одинаково, доминируют силы электростатического притяжения между полярными головачи и средняя площадь полярной области будет меньше, чем в случае, когда имеется избыток анионного юн кат ионного ли пила, и присутствуют силы электростатического отталкивания между одноименными зарядами. Эти пороиессы могут влиять на фазовые переходы липидов. ■ .

Для проверки данной концепции мы использовали смесь кат и о иного аналога фосфатидилхолииа (E-DOPC), несущего один положительный заряд, и-анионного фосфолипнла кардиолипина, с двумя отрицательными зарядами на молекулу;

* . р г "

Рл^ 1. Рсглиад с поверхности евдоз глисоц полученных гри сите^^лзнл! скитопнеессго «званного ги-^ Е-ООРС и анионного млцдз кгрйисллткна (и сер^э бы«. (А) - мембрзнкые вез*<ули. образованные Е-СОРС; (В) - тр)-6см«л гекагонатьисД Н< фазы в смеси Е-ООРС и юратам-^на. соспноц,е«еезггядса (*/•) = 1Л;{С)-грйгтагллг>5^ес*сД № (тхэгммгы. мосоошошсн««р««оа (■Ч-) ■ 2/1)-В углу гредстзален Сурь^-а<имз изображения, о&урргхазочлй тетрагональную рсижтку.

Электрон мал микроскопия" показала (Рис.1), что каждый лиши в отдельности образует ламеллярную фазу, т.е. бислойньге мембранные структуры, представленные большими везикулами. Однако при смешивании липидов,' образуются иные фазы в слсдуютсм порядке: везикулы (чнстыП кзрдиолншш) о губчатая фаза (+/»)=!/4 куСнческая фаза (+/-)=■ 1/2 с» гексагональная Нц фаза (+/-)=)/! о кубическая'фаза (+/-)=2/1 о губчатая фаза (+/-)=4/Г«> везикулы (чистый Е-БОРС).

Гексагональная Нц фаза, структура с максимально(I отрицательной кривизно(1 монослоя, образуется в такой смеси липидов, в которой нейтрализация зарядов максимальна (+/-)" 1/1. Отклонение от этого соотношения в сторону преобладания, положительного или отрицательного ззрязов одинаковым образом приводит к появлению структур с последовательно уменьшающейся внутренней кривнзноК, поскольку известно, что соотношение площади, занимаемой жирными хвостами молекул к площади полярных голо о изменяется в ряду, фаз: ламелляриая жубическая > гексагональная. Наличке такой закономерности подтверждается также данными малоуглового реттеновского рассеяния (Рие.2). Анализ рефлексов обнаруживает присутствие гексагональной Нц фазы в нейтральной смеси лнлндоа (+/->"1/1. Более того, смеси <+/->=2/1 и (4/-)^ 1/2 дают идентичные рефлексы, соответствующих из вестиоА кубической фазе С)"4 с пространстве!шоП группой РпЗгп. Сходство кубических фаз обращает особое внимание, поскольку представленные ли носом и нчеюг противоположны с по знаку, но одинаковые по абсолютному значению заряды, и существенно отличаются по химическому составу. Полученные нами результаты свидетельствуют о доминирующей роли абсолютной величины сил межзарялооых взаимодействий о определении структуры образующихся фаз.

Обнаруженное нами явление может найти непосредственное применение в биотехнологии поскольку кагиошше лишиы, в том числе Е-ООРС, являются перспективными агешами траисфекиии и применяются в генной терапии.

О V 2 0 1 2 3 4.5 0 1 *2

Bieifwcil Sftàrg х too (1/А). Rt-roal Esidnj* i» (t Aj ' Rtorractl Sfî£TS * (ОС {«*)

Pec. 2. Графическое гредстзагсиио результатов мз.хуя»есго рентгенсесюго pi сияния тгессч E-DOPC и »ардксг^ма. ГЪгоризснтагл стпе*ень< величины обратного рзхтеяиия со рефле«ссв, а го вертшали -индексы ГЛцдора (1.U). Нашей ipfstix дзет бегуну d - пэдхыЯ илг решвтю. (А) - и>£|<ческзя фаза смеси 1/2, d = 12,4 hv; (В) - гёсагскз.чкзя tit Фаза сием 1/1, d= 5,82 км; (С) - кубичоекм фззз. {*!•) = 2/1, d = 12,6 нм. Томи ап^роча-адрезаны гррмьми по мэгзд мз/^ены^« »з-адзгез, грн атсм R >>0.999 для все* сг^эеа. Дзмкыа получены соеместно cTJ. IHctaash.

Полиморфизм галактолипидов, инициируемый хлорофиллом.

Известно, что основная масса хлорофилла в мембранах под ко плов в.\0Д1ГТ q состав хлорофилл-белкового комплекса >t лишь небольшая его часть ассоциирована с лшщдами. Влияние этой части хлорофилла на структурную организацию мембран изучено мало. Но имеющимся представлениям, хлорофилл способен внедряться в линилнып бис.-oii, при этом иорфиринооос кольно находится в облает» полярных трупп ли пцло d, в ю время как гидрофобная Соковая цепь; представлен над остатком фнтола, погружается вглубь шлрофобноП области бислоя.

Линидная .часть тилзкондной мембраны содержит 50% мол огалактошлд «глицерина (MGDG), 25-30*! ô дигалактознлд игл и перина (DGDG), 9% фосфатидплг.ишернла (ГС) н небольшое количество сульфолипидоо н фосфатизилхолнна..Фазовое повеление галакто.ишндоп хорошо изучено, построены фазовые диаграммы, в соответствие с которыми, » условиях дегидратации н при определенных соотношениях MG1)G и DGDG могут формироваться различные кубические к гексагональная Иц фазы. При полной п ¡л ратании суепешня природного MGDG образует гексагонзльную Нц фату в широком диапазоне температур, тогда как зналог MGDG с насыщенными алкнльными цепочками полярных хвостов, а так же природный DGDG образуют стабильный Спелой ,

П настоящее время полиморфные фазовые переходы лннидов хлоропластов привлекают большое внимание, поскольку они играют существенную роль в жизнедеятельности растений и, в ч зет пост ii, и адаптации к экстремальным условиям. Представленная часть работы посвящена изучению влияния хлорофилла на полиморфизм лшшд'ов хлоропласт о в, что особенно актуально в свете этих исследований.

II соответствии с данными "Р-ЯМР хлорофилл, добавленный к различным смесям липндов хлороп ластов, неизменно разрушал Си слой и инициировал появление изотропных и трубчатых фаз. Так, смесь MGDG/PG (2/1) образовывала бнслоПную структуру даже при повышенных температурах (50'С), в то время, как в присутствии хлорофилла Спелой был стабилен только при 5'С, а при более высоких температурах появлялся н рос изотропный сигнал. При 50*С значительный вклад давала также

гексагонзлыод Нп фаза . При большем содержании MGDG прослеживалась такая же последовательность событий, но с cute более выраженной тенденцией к образованию гексагональной 11ц фазы. Аналогичная картина наблюдалась и в более сложных, тройных смесях лииидов (Рнс.З). Тенленния была ещй Солее выражена в суммарной фракции лнпндоа тнлакойдов.

Рис. 1 Спелр rP-RV? (А) - есдиой сугпеюм TODG/DGD&PG (32.1) при WC (а); те *а +

лгерофилд (т^дЧгсро<:*.%1 5:1) грх ЗО'С (Ь). (В) - волной еусгекзеи суиизрной франки г^гпцоа хлоропластов гри ЗО'С (а)с та же глч^да + ¡шсрофкгд (мплДлсрофкгл 5:1) г;* ЗО'С (i). Галзггеяигииы. а также хлорофл-тлы фер«ы "а* и "С" Ъыгм хстрзгуревзны из юммеркесю« грепаратсв Игната. Вое сиеси rcroawwa в хпероферме, за:си хясройярм уда^лся вису-^&эдси в потопа врсоиз н год Biiyyuou. Суспеиз** готомг/сь встрял у аам/еи глёяш галдев в DrO. Эм и noc^esycsi/e ♦Юррт -го о *2Cpp« ß3Hl4je '"Р-Я'Л3 по.*ту^ены ccevcctk» с НА Скилеяно.

Нами также было проведено исследование изменения ультраструктурной организации всех неречи елейных выше смесей лииидов. Было обнаружено, что процесс нарушения СислоПной структуры иачннапся ' с формирования многочисленных контактов между мембранами. При исследовании методом заморажнпания-скалывания эти контакты выглядят как специфические структуры, изпсстныс пол названием «лнпкдные частицы». Их присутствие в препарате коррелирует с появлением изотропного сигнала ЯМ1\ Данные ЯМР о появлении гексагональной Н^-фазы были также подтверждены электронной микроскопией. Полиморфные превращения в мембранах представляю г типичные примеры многостадийного процесса слияния мембран (Рнс.4), и широко распространены в различных биологических процессах, связанных как непосредственно функционированием хлоропласте», так и с многообразными иными процессами структурных преобразований в мембранах различных клеток.

Spongo

Рие.4 Схематг«>сгое

гредстз8ле»мв . гэстедаазтелъкч« стада пел^черфиы* грегрзадииа rw/£ca хкрос-г-зетов в грисутствл» xnopoC»wj. ' мам

злеетронмо-икфооопяческие . усслелзезикя. . Представлены лаьюлл^рнгя (L), i^araa (Spenge), »yfit^ecnafl (Cubí), и гексагональная ' (Hexagonal Н.) Саза ПсаззнО, что гроцссс . фазгвых грсера^енкЛ является результатом образом*« различных тилэе мемгембрзмнь« интатез.

Взаимодействие липидов с белками и структурные переходы в мембранах при перекисном окислении.

Взаимодействие мембранных белков с липндным биелосм является предметом многочис ленных исследований. Одним из наиболее интересных примеров, демонстрирующих возможность существования многообразных форм белок-лнпидных взаимодействий, может быть продемонстрирован на примере шггохрома г. Будучи водорастворимым белком, ни i ох ром с может проявлять также свойства типичного гидрофобного белка и инициировать структурные преобразования фосфолипианого бислоя. Взаимодействие цитохрома с с бислосм определяется конформационными изменениями белковой молекулы, сопровождающими процесс присоединения гемовой группы, tum цикл окисления-восстановления гемового железа.

Необычное повеление цитохрома с, обнаруженное в исследованиях модельных систем, породило ряд спорных гипотез о возможном биологическом значении полиморфных фазовых переходов, инициируемых этим белком в мембранах митохондрий. Известно, что цитохром с присутствует внутри крист, на-внутренней поверхности внутренний мембраны мтохонлрий, ко, как некоторые другие мшохошриальные белки, синтезируется в цитоплазме, и в дальнейшем, должен преодолеть барьеры обеих мембран для того, чтобы попасть во внутрикристное Пространство, к месту своего функционирования. Существует предположение о том, что данный белок, в результате специфического взаимодействия с митохоклрналы!ым липидом кардиолипином, способен индуцировать появление инвертированных мнпелл в участках полу слияния между внешней и внутренней мембранами митохондрий, в так называемых зонах адгезии, благодаря чему и осуществляется транспорт шпохромас во внутрикристное пространство.

*. В представленной работе мы задались целью проверить, во-первых, способен ли цитохром с специфически взаимодействовать с кард иол шиш оч, и во-вюрых, способен ли шпохром с индуцировать возникновение инвертированных мицелл. Нами было показано, что цитохром с не вызывает фазовых переходов в бислое, но в процессе окисления хардиолипина, возникают минеллярные олнюмеры. белка и продуктов окисления липкла, что существенно меняет морфологию мембран.

В целях проверки предположения о возможности избирательного взаимодействия шггохрома с с кзрдиолипииом^ мы исследовали протсолипосомы, содержащие смесь кардиолипина с аналогом фосфатидилхолипа: дипальмктоил-тнон-фосфатцаилхолином (thoh-DPPC).

Эта смесь использовалась потому, что химический сдвиг в ЗП'-ЯМР спектре тион-DPPC -находится на 56 ррш плево ог сигнала,85% НЗР04, что позволяет независимо регистрировать спектры двух липидов," как 'это показано на- Рис.5. Представленный спектр свидетельствует о том, что «сходная смесь кзрднолишша и тион-DPPC образует бислойную структуру, причем спектры обоих липидов весьма схожи. Однако; как и предполагалось, в присутствии цитохрома с только кардиолипин претерпевает структурные

Рис. 5. Спектр 3Р-ЯМР при 24,3 МГц гюяученныД гри <0'С на бедной сусге«ии смеси юрдиопюкна сердца быка и тион-ОРРС («спярнм соотношение г/гидса 1:4). Спектр гопучем грм 4й"С потоку, что ниже: этой температуры тиом-СРРС наносится в еостсям»и.геля,^ (А) суетен:*« сосфсл^ла в отсутствие! цитэдрсмз с и (В) - суспенэм ОосСол^гцу е г^еутсгеии фсрроцигохрома с (аоссгзнсапенкоа течовэе железо) после ЗСмин инкубации. Восетз»йапенмая фориа цитырсиз с ,- <£срроц«:счлм с был .гол/чек ' оброботюй а' феррицитсхрома с дятионэтем натрия, с поспздюцхм-удалением■ *п- о1'"» ' 'сетей на сефздексе 0-25. ~ ■ ' •• . - ';'•*

изменения, сопровождающиеся увеличением изотропного сигнала. Спектр тнон-ИРРС остается неизменным и соответствует форме спеетра фосфолипидиого бнелоя (Рис.5). Появление изотропного сигнала карлиолипина свидетельствует о появлении мицеллярпых форм, в которых вращение фосфата а, значит, п всей молекулы карлиолипина не ограничено. Наложение «изотропного» и «бпелойпогоо сигналов свидетельствует о том, что. в условиях, нашего' эксперимента, '■ лишь часть карлиолипина претерпела структу рный переход из бислоя в мицеллы.

Рис. 6. *'Р-ЯУР спектр (24,3 МГц) псгучемныД на водиод суспензии юроюлипина сердца в грису:стй"й цйтехречэ, с при 20*С; мсгярнсе состнааеняе фосфогигаддВели 44:1,- (А) -сустенз/я чистого кэрдиолиггииа^Р)'- суспензия юрдислиг«и - цятохрсм'с, 1чэс и'нкубации. г идея; окисг^нкя »зрдийлйгуиа 0,6; (С) - то ке, что и (В), но после 6 часов ><*«у5зцих; (0) - после 24 чзеез

Степень оюеденносги >

определялась . го соотно^-силю • мзю>цуисз ' погпадемця гри 215/233 ни.

Избирательное взаимодействие шпохрома с и кардиолишша обусловлено наличием негативного заряда на кардиолнпине н позитивного заряда на шгсохроме с. Однако дальнейшие исследования показали, что, хотя заряды необходимы для осуществления взаимодействия между белком и лииидом,- появление мицелл обусловлено другими факторами. Было обнаружено, что величина то тронного сигнала карлиолипина может существенно возрастать при увеличении времени и повышении температуры инкубации протсолниидного комплекса (Рис.6). Напротив, изотропный сигнал не появлялся в случае, если использовался карднолшшн, двойные связи которого были порогенизировапы, что предотвращало возможность окисления (не показано).

Электронная микроскопия (Рис.7) обнаруживает в суспензии липосоч нз карлиолипина и тион-ОРРС, а также комплексов щлохрома с и лишиа присутствие типичных мембранных везикул с гладкой поверхностью скола. Инкубашя протсолшщдных комплексов при повышенно¡1 температуре приводила сначала к появлению внутримембранныч частиц, а затем к разрушению Спелой ной организации и возникновению мицелл. В присутствии антноксиданга а-токоферола этот процесс был менее выражен при кратковременной ннк)баиии (не показано), однако, через несколько часов морфология поверхностей скола мембран сильно изменялась. Гидрогенизация двойных связей кардиолшшна предотвращала возможность

окисления лил та и изменения морфолопш мембран не наблюдалось, что свидетельствует о существенной роли окисления в этих процессах.

Рис. 7. РсЛГ-ГЫ с лоссрхиссти схстсзгмэсси из кэрдлагил^а и тюн-ОРРС в гр/сутствуи цктсхрсма с. А - кн<>6зц*я 30 амн, гри 20'С сгуспеинссы 0,6. Поверхности екзла гялооом глад««: В -и-куфа^/я 2 чзоа, гря 20'С, есслолости 1,0. Е<«ны енутр^ум^ранние частица (ясгаззмо стрсжзмя); С -ин<у5з^л 120 ил» грп БО'С, Мелйранниб структур«

полностью разрушены,

присутствуют к/челлы; й -ии^-бащ-я при КГС, 2 чзса в присутствие антиоощэнта а-тооферелз. В/дно

существенное кзру^е-те »юрфопегул позсрдности осла «¡»Ер;*; Гтоогсндмция кард/ст-клина лроздхлась ка юталчзторе Р&лкз в метзхле, Очутств/е дю^ых связей контрсл/рСЕаяось ЯУР. ГЛзалзб: 200им.

Электрофорез бело к-лнн иди ых комплексов п полиакриламидном геле (Рнс.8) свидетельствует о том, что при увеличении времени инкубации препаратов полоса, соответствующая мономериоП форме шгтохрома с, постепенно исчезает, но взамен появляется и раетСт полоса высокомолекулярных комплексов в области старта, Олигомср)пация белка может быть обусловлена появлением оснований Шиффа в результате сшивок между белком и продуктом окисления карднолннкпа - малоновым днальдептдом, -■ Присутствие Шиффовых оснований можно наблюдать по их спектральным характеристикам (Рис.9). Представленные данные свидетельствуют о росте содержали* ' Шиффовых основан и П в условиях, благоприятствующих окислению лип идо в.

Известно, что шпохром с катализирует перекиеное окисление карднолинина, в результате чего появляются диальдепиы, способные сшивать белки и образовывать белок-липндные олигомеры, которые'сначала образуют минеллярные структуры в гидрофобной области мембран и выглядят, как вторим ем бранные частицы па поверхности скола, а при большей степени окисления и разрушении бислоя образуют суспензию мниелл (1'ис. 10)

. л

Лв ■ с

/ 1 ■ л

Sem 0 Sun О 4 cm О Sem Г Рис. 8. Эглпрофороз в 15% псллзтр/лги/гксм геле (фссфатнлЛ буфер. + SOS). А -цитехреи с; О -суспе*з/я кзк^лт/иа и цитсхрсма с, ск^б^им^юя 24 часа гри 2СГС; С - «шуба^а 3 чзса грй ЭГС; D -то >очго и «С* ю госте 24 чзеоа ич^Заци*; Е - сусгсч^я tviportn/vpc sau полз «зрдизгмпииа и ipiTC*pcua С. умиубацля 24 часа г,р4 Ю'С. Старт кахсглтся в обмл« Оем. Полоса 1 соогезтствуег мзмочсрнзЛ Сорие цлтехремл с. 3 пстоси 2-4 ссотвегстауют сл/.х«ср«ии форизи этого бела. Дз>*<ые поручен в сотруйинчостве сглбсрзтс^лй ИА Bacwiex«).

ifi

£

с

>0.6

о ОС

400 450 500 пш

Рис. 9.

Спектр препаратов «А- чистота ырдлэгжума; В - гретеог/хоси *ард/елта*.цптсхрдч с (44:1), ун^Ъг-^я гри 20"С в течете 24' часов; С - то же, что и «В», но нзфеэ цо 37'С в течеи/в со им. Данные пс£учег<ы в еатрудн|*<естве с паЕэрзтор 1«сй НА. Василенко

Рие.10. Схеиат^есюе гредгтззлем/s rpoyecea обраказн^я оглъисрся цетолроиа с м нарглзппг/ка в результате cay-so* RpcsynrasM nepcw>oroow"cneniui, 1- внэ+а.*» беям аггсрб/рустея на поверхности биегая бг-згегзря ' зямтростапместк« взз/макейгге«»«; 2 - 3 - га »дере увет-ления степени герсьчиого опустения грсисхсдит гроцеес спггсмер/учл», что гриваут к псяЕлеи/ю внутрииеиЕрзииы* vjctvh на поверхности сюта; 4 -яагьхеЛлее скисяскио rpvscsnr* росту о,"л*с«ерое. гри этом weu$p3«ij рог?)г^>стся и грегарат содержит еуепеиз/в ии^елл.

Роль латеральной сегрегации белка в мембране при формировании различных типов двумерных кристаллов бактериородопсина.

Встраивание белковых молекул в лип иди ые мембраны представляет интерес не только в фундаментальных исследованиях, но также предполагается их использование в технике при создании бносснсороо и в медицине при создании средств доставки лекарственных веществ. Одним из наиболее интересных и активно

исследуемых объектов в этой области является бактериородоиснн го пурпурных мембран На1оЬас(епит ка!оЫит. Особенностью этих мембран является наличие гексагональной двумерной кристаллической решетки, образованной бактериородопенноч. В представленной работе мы обнаружили важную роль процессов латеральной сареюшш белка при формировании различных: типов 2-х мерных кристаллов.

Спектры КД реконструированных мембран (Рис.1 1) характеризуются наличием положительного пика при 530 нм и отрицательного пика при 600 им. Характерно, что по мере уменьшения содержания лишиоа в реконструированной мембране спектры КД все более' приближаются к спектру нативной пурпурной мембраны. Так, при реконструкции бактериородопсииа в лип иды из пурпурных мембран наблюдается потгн полное восстановление исходных параметров КД при соотношении липкя/белок 0,33:1(Рис.11Л). При реконструкции в фосфатйдилхолин соотношение ли пил/белок 0,33:1 тахже дает лучшие результаты, хотя спектры сильно отличаются от нзтивных (Рис.11 В). В присутствии 3,6М N30 спектральные характеристики реконструированных мембран еще ближе к нативным (Рис.11С).

Анализ процессов 'плавления реконструированного бахтериоролопсина, проведенный ,с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (Рис,12), также свидетельствует о том, что ЫаС1 влияет на термосгабилыгость белка.. Так, в присутствии 3,бМ КаС! плавление реконструированных мембран наблюдается при более высокой температуре, приближающейся к таковой нативной мембран ы,^ что свидетельствует о более полном восстановлении исходных параметров белковой молекулы при реконструкции. ,

600 600 пт $00 600 пт S00 ■ 600 лт

Рис.11. Спектра КД багтериорсаототна рексмет рукроваиного в мембраны с различным составом лилидсв. А - юипгекС аериородоосииа с лигмдзми гуроурных мембран; В - с nmnttu фоаратидллхолииом. Соотношение пип/д,'5ело)с 1/1 (1); 0,6/1 (2); 0,33/1 (3); дативный пурпурные мембраны (4); С - в присутствии.3,6.4 NaCI комплекс с фосфагодюхоланом 0,33/1 (5); комплекс с;пияидзми пурпурных мембран 0,33/1 (6); натиаиые пурпурные мембраны (7). Данные получены, е сотрудничестве с лабораториями ИА. Василенко и Л И. Барсу«ееа. •:. ■ - "

Рис.12. - Кривые . ДСК плавления ' • балериородапсина в комплексе с различными лендами: А- нэткеные пурпурные мембраны; В -ГМБР (0,33/1) в буфере, содержащем 0.15 М NaCJ; С- то же самое, но 3,6 М NaCt D - БР/ФХ (0,33/1) в буфере содержащем 0,15 м NaCt Е - та . ке самое, но 3.6.М NaCI., Данные получе>ш в сотрудничестве с лабораториями И А. Василенко и Л Н, Барсукова.;. « • -* *'ч

Обозначения: '*"

ФХ-£ичныДфоофагкаидхол«<н ПЛ * пиг.хды пурпурных мембран БР - Сакгериородогкмн ПМ-пурпурные иеибраиь! ■•'-

10(ГС

По данным электронной * микроскопии (Рис. 13) гексагональная кристаллическая упаковка белковых молекул, характерная для нативных мембран, наблюдается при реконструкции Сакт ер нородопсина в лиши и ш пурпурных мембран с соотношением ли и ид/белок 0,33/1: При более высоком содержании линидов на поверхности сколов присутствуют хаотически расположенные внутримембранные частицы, типичные для большинства мембранных белков. Как показано наРисЛЗЛ, реконструированные мембраны имеют островки шероховатых и гладких поверхностен скола. Оба типа поверхностей характеризуются присутствием гексагональной решетки и морфологически аналогии и ыти гго плазматической и экстра*легочной поверхностям скола пурпурных мембран. Напротив, при реконструкции в мембраны'т яичного фосфат ид илхолина (Рис. 13 В,С) можно наблюдать возникновение совершенно иной ортогональной кристаллической решетки. Эта решетка образуется в присутствии 3,-Ш КаС1 и при соотношении лиинл/бслок 0,33/1/ При снижении содержания соли кристаллическая структура разрушается.

|»М

.............

ИИаИН»

Рис. 13. Элесгронмые у/ирофстгграфуч ре---« с псвертмосги екглоа рсснстру^рогзнных иеибрзч (А) -ссгср*з:у« бзггерйзрйяпси« и (»г^ы п)рпурных мембран, юм.-ле« с соотношение»! белои'лсьи 0,33/1. Представлены отдельные фрзтенты с п-лажЯ (соси) и 1аерс*оьэгоЛ (сгравз) поверхностями осела, в так же данкуе 20-Судо анализа, геказымес^е генозгокальйоД кристзя'м^есксЛ

рсаетги на обеих поверхностях. (В) - поеершости сгсгса мембрзи, обра»езккьи бггтсрлрйнпссиси и яим«ь:м Сссфат^слчгуксм. Ксмкпеге с состкоиекием гуп/д'бе.х* 0,33/1 в гр,<сутстг.м 3.6М МэС1 и 20-Сурьо емагиз пкерхюсм. Рефпекы, се^мепъетерх^ о изличм ер торс «б и^еоэй решетки, еыдслеигд ируаанл, (С) - обрзтмэв Сурю греобракаахлв поверхности (В). В/дна срторси5.мес*ая упзкеяа мглегул бзтриереаопеуиа. Магнтзбная ^та: ТОнм, Сурьв анализ ихбра«еи/1'выполнен ААДеегыу.

Таким образом, на основании провезенного исследования можно представить, чю по мере удаления детергента из лишино-белкового солюбилизата образуются мембранные структуры в которых мономерный белок ассоциирует в олнгомеры. Структура олнгомеров определяется природой используемых липилов. При этом о л игом еры ис находятся в состоянии максимально плотной упаковки, н их распределение и взаимная орнс1гтацня в плоскости мембраны являются хаотическими, что проявляется в неупорядоченной упаковке внутри мембранных частиц. Лишь в случае использования для реконструкции линидов пурпурных мембран, при нативном соотношешш лиши/белок 0,33/1, по-видимому, создаются благоприятные условия для формирования регулярной гексагональной решетки. И случае использования фосфатиднлхолина требуется внешний фактор для1' перехода мембраны из «аморфного» в кристаллическое состояние. Роль такого фактора играет КаС).

Отличительной особенностью нативных клеточных мембран является наличие определенной ориентации белковых молекул поперек бнелоя, благодаря чему.

например, бактсрнородопсин и друте транспортные белки способны создавать трансмембранный электрохимический потенциал. При реконструкции пурпурных мембран молекулы белка ориентпропаны поперек плоскости мембраны в двух противоположных направлениях. Поэтому, при формировании кристаллической решетки, присущей нативпым пурпурным мембранам, должно происходит!, разделение молекул с различной ориентацией (Рис. 14). Образование двух типов кристаллической решетки связано с различиями процессов енрегации белковых молекул в плоскости мембраны. При использовании дшшдов пурпурных мембран (Рис. 14В.С) сегрегация приводит к восстановлению i шпоной гексагональной решетки. При реконструкции в фосфапиидчолин (Рис.14В\С') происходит формирование ортогональной решетки в которой наблюдается чередование молеку л с противоположной ориешацией. Преобладание того илн иного процесса сегрегации белков зависит ог лнпидного состава, температуры, концентрации солей и других факторов.

- • :!&*) —►Êssâ.:

Рме.14..Схсматимсекоо.гри^глёние сроцегеов латеральной сегрегации бзпер^срсдогсима при фср«»-рсазн/и гекаго-мсысй й ортегонагьноД крхстзлч^есох рентах. А - реюмстру^розанныа гёп^д-белевьн) *очлле«сы грсдстзгляст ссбоЛ ме»йрз>-«ые вези«улы. в которых ис»е*упи Бело расположены случз;иьч образен и выглядят к» поверхности иола в вкйо Еиутримеибрзкних чзсткц еферичеаол ферма В отлм/ô от изтквнух неточных »«vîраи. ориентзц'я н*ок«уп потере« 6/олоя тзооз случена и на гредставлечнсй cxevd uenciyru, срисктирсм-кие' в грстхьэл сложных ьалрзгген/ях, обоз><з^ни бегу« и верным цаетзыи. В - в услсакях, способавус^х фери/реззнио ср^сталги^есюй реиотии, WpCiwiH геисагеизльних крилаллоз сегрегирует, в ззвидаиост* от сс^ктз^м бел«, и образуют отдепма острее™ с (е«!агоиаль»ой реыаткей. С - далее, в результате Срагмснтзци^, учзстм меибрзн с разл^-исД сриента^хсЛ белков ракелястся. В' и С' - всзисжен тастэ и^ой споооб лзтерзяы-оД ссгрсгац^л гри котором грогузопепохнэ ериент^реззАкье медаулы образует чередующиеся р?дм. В этой случзе Tawe обрззуегся гесагонзпьная решетка, которая представляет собой изложение дзух ортогональных решеток с гротезоле.'вжюа сриеигз^Л мгленул бел »а.

Полиморфные фазовые переходы в ДНК-липидных

комплексах.

Взаимодействия ДНК с лип илом привлекают большое внимание о связи с возможностью использован)[я липосом .в качестве переносчиков генетического, материала в генетике, молекулярной биологии н медицине. Многие природные фосфолишиы не могут непосредственно взаимодействовать с ДНК в связи/с наличием сил отталкивания, присутствующими между отрицательно заряженными, фосфатами молекул ДНК и фосфолиннлов. Однако такое взаимодействие может быть опосредовано двухвалентными катионами некоторых металлов. В настоящей работе представлены исследования фазового поведения комплексов ДНК' ■ с фосфатндилхолипами в присутствии катионов кальция.

Комплекс ДНК-Саг*-ОРРС

Процесс комплексообразовапия ИРРС и ДНК можно проследить с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). ПРРС имеет узкий максимум плавления при 41,6*С, как это видно на терм о грамме (Рис. 15). В присутствии ДНК и Са"* термограмма ОРРС обнаруживает появление нового максимума при 43,3'С.

*] пмл1 Рис. 15. ДСК термографы кэмллетаоз ДНК-Са1* -СРРС, Указаны

* мслярнье грсяорц/и ДНХ/я/лид' (п). ДНК тгмуса тел ей« (Э^дта)

*------г-ггТ—-опег.илегуо фонтом и хлороформом (относите

* уч.Д лсгпси;емкя при А25й'А2£0> 1,5} И сбрзбатзалэсь ультразвуком до ---,—-"**-.—фригмснтсз ЗОЭ^ОО Ьр. Срал»е»сы ДНК смсаУЕаялсь с малыми

5 ' А ■ л/лоссизч*, г»луче*иь;*м угьтрзззухоюД обработай везжул

£ 1___' (¡»много РС, ил« ОРРС {Ava.ii) в 0,5 м'Л растворе НЕРЕ5 (рН 7,*).

^Д Далее 10С«М рзствор СаСЬ медленно добавлялся к еусяеизл! гри

л * пхтсянчем теремсииМн/и, немилей гиофклиз/ровали и

" • ■ ■ — п, 0 обрабатывав хлероформемдля рззруш:«/я «мбрзкки*структур и

* I £ля к'к/^/з'^л фори*рсез*/я уиаертгрйаанхой фазы в

* I сракимоском растворителе. Посла удаления хлорюОсрмэ ---'-а» ва«у)шрсвзн*еч грепзрзт репсратсрсыли. Сирость изгрезз 0,25

т*тр*»>н(*1>с И*м»м Ссакы гспуче*и в освмсстмоЯ рабств с Т.И НдслзевсЛ м калориметре ДАСМ 4.

Риг.16. Стругтурнзя организация г>узафо6нсД позерхкостя осла мем5рзн ОРРС, фкесрокмных от различных теюератур. - С) - юктрсльныД греларзт л/лосом из ОРРС: (О-С) - клглексы ДК<-Са2* -ОРРС, полярное соотмо-^екие ДЧК'г.илгд 15. (А) - При теияерзтуре 17*С (илке предперехгда ) и (8) -4?*С (вы^о <лза*ога (Ьазовсго герс&дэ) в ло&се»ости скслэ мсибрзя л/лоссм вытляйят гладями: (С) -лри температуре ЗЗ.В'С, мечду гредлере*едом (35*С) и глазном Сизовым геретсдем (41,6"С) лилида, ы ле&еркиости скола нзбледзотся «рилл-и фаза, лсригд 15»м. ДНК-Са2<-СРРС гемллекат (0) - гри 6'С образуют розеткое^диывструпуры^Е, Р)—гри 17 и ЗЭ 'С образуются БСгми »рилгл» (¿огы с периодом 25 и«, (в) - лри 45*С образуются червеобразные склаг<и. Масштабе 200ни.

Наличие' коррелят!и между площадью новою максимума и молярной пропорцией ДНК в образце свидетельствует о формировании комплекса ДНК- Са1*-ОРРС. Суммарная энтальпия обоих максимумов на представленных скалах была 7,0±0,б ккал/моль. При этом, а условиях нашего эксперимента, значительная часть л шиш вовлекается в формирование комплекса с ДНК.

-¿1

пМЛ

А.

Электронно-микроскопический анализ реши к с поверхности сколол 014*0 показывает (14(0.1 б), что при криофнксации от температуры, находящейся о интервале между преднереходом (35'С) и главным фазовым переходом л и пило в (41,6'С), образуется типичная структура, называемая «риппл» фазой с периодом 15 нм (РнсЛбС). При более высоких к при более низких температу рах мембраны выглядят гладкими <Рис.16А,В). При образовании комплекса ДНК-Са5* -ОРРС диапазон температур, при которых можно наблюдать «риппл» фазу, существенно расширяется. Так, при б'С наблюдаются по меньшей мере две фазы: «риппл» фаза с периодом 25км и розетковилные складки (Рис. 16П,Е). При температурах, близких к главному фазовому переходу формируются два тина -«риппл» фазы: с периодом 15нм, характерным для исходного -ОРРС, и с периодом 25 нм (Рис.16Р), который наблюдается для комплекса ДНК-Саг*-РРРС и при Солее низких температурах.

При температуре выше фазового перехата мембраны также не выглядят гладкими, как это характерно для исходного ли гида.' На поверхности скола наблюдаются многочисленные твил истые червеобразные складки (РисЛЮ). Анализ длины этих складок свидетельствует о корреляции их длины с длиной используемых & эксперименте фрагментов ДИК (не показано).

Итак, данные дифференциальной сканирующей калориметрии и электронной микроскопии свидетельствуют о том, что образование комплекса ДНК-Са3*-ОРРС приводит к существенному изменению фазового поведения лнпндов. В препарате сосуществуют две фазы, одна нз которых по своим свойствам близка к исходному липнду, а свойства другой сильно изменены. Часть липнда'образует «риппл» фазу в характерном дляисходного липила температурном диапазоне. Наблюдаемый период волн также харастерен для исходного линида (15 им). Другая фаза, существе и но отличается от исходного линида не только периодом волн 25 нм, но также и тем, что периодические структуры сохраняются во всем диапазоне исследуемых температур.

При этом молекулы ДНК могут ориентироваться вдоль' гребней мембраны н образовывать на'поверхности мембраны каркас, который.может служить фактором стабилизации «риппл» 'структуры, что позволяет объяснить ее существование в широком диапазоне температур. '" .

Комплекс ДНК- Са^-лецитин ' ;

Способность ДНК инициировать полиморфные фазовые переходы мембран н, в частности, способствовать образованию инвертированных трубчатых структур была показана на синтетических хатионных лигошах. Предполагаемая нами возможность влияния ДНК на полиморфизм природ пых фосфо.ишидов может иметь большое значение для понимания процессов жизнедеятельности. . В данной 'работе мы использовали - катионы Са1* для ижшкзнии взаимодействия между молекулами тимусной ДНК и липосомами из яичного лецитина. При этом образуется.комитекс ДНК-Са1*-лецитин, в котором двухвалентный катион Саг »грзст рать мостика между фосфатами ДНК и лешгтииа. -

Электронная а микроскопия замораживания-скалывания выявляет изменения структурной организации природного яичного лецитина,, инициируемые взаимодействием с ДИК- Са1*. Так, в отличии от суспензии лецитина, представленной мультнламеллярными липосомами, комплекс ДИК- Са^-лецигин обнаруживал появление новых структур двух типов: (1) - палочковидные' или шгтевидные образования па гнарофобной поверхности скола некоторых линосом; (2) - пучки фибрилл, не связанных с мембранами (Рис. 17).

Рис, 17. NVipoOororpaiiw M*opa«mHKa-c*arbiMKiyi (A-O) и негашеного иситрзсткровзн*я ■ (С) *cv~eca ДНК- С а5*- гецитии. (А) палочкаудныв и нитевидные структуры на поверхности схсяа мембранных (В) - руч« сибригчт, но связано с wwipa-uvit; (С) -гучш (¡у^ркгд аналогичные

грсгстгвлеииьш и »0» бымпястся чзкжо негативный кактрзятревзи^еи в урзнктз^етатв (сурз***еко

IttSrtii . ■■ ■ •

Палочковидные и нитевидные структуры схожи с описанными ранее, так называемыми, структурами «спагетти», найденными в комплексах- ДИК с синтетическим катонным холестерином. Предполагается, что эти структуры представляют собой трубочки лшшда, покрывающие шпи ДНК. Пучки фибрилл не связанные с мембранами представляют иной тип ДНК-линцдных комплексов. Эти образования можно наблюдать как методом замораживалия-скалывання, так и контрастированием с помощью ураннланетата. Структуры, окрашенные уронил ацетатом имеют электронно плотные (темные) полосы, разделенные неокрашенными белыми полосами лнлила. Наличие темных полос может объясняться способностью >раннланетата окрашивать ДНК.

Ми предполагаем, что пучки фибрилл представляют собой гексагонально упорядоченные трубочки лнпида, заполненные ДИК (Рис.18) Величина периода близкая к 60А довольно типична для трубочек - гексагональной Ни фазы фосфолипидов. Следует 'отметить, что длина фрагментов ДНК, используемых в нашем эксперименте была около 500 пар оснований, что соответствует около 150 им. Однако, длина трубочек была намного больше, что свидетельствует о том, что внутри лииидных трубочек молекулы ДНК могут располагаться последовательно друг за другом. ,

Известно, что лецитин обычно образует стабильный бислой и не'проявляет выражение!) склонности к полиморфному поведению за исключением немногих случаев действия биолошческн-актиаиых модуляторов среди которых могут быть лишиы, нолиненпиы и белки. Молекулы ДНК в комплексе с ■ некоторыми поливалентными катионами могут служить в качестве таких биологически-активных модуляторов полиморфного повеления. Возможно, что способность лнпилов продуцировать упорядоченные структуры с ДНК может быть использована клетками для упаковки хромосом в ядре, или в процессах транслокапии ДНК через мембраны при трапсфекции, в процессах вирусной инфекции или в различных формах обмена генетического материала между клетками. ■ ч ^ - -

Рис.18. Гипашпьвсая модель структурной срганкззчии фибрялгуриых комплексов ДНК-лециткч. Мадепь оснсеака на Эналюз изображений замера** миия-скалыаания (А) и контрастирования урамияа^етагтсм (В1 Профили эпелроииой плотноста этих изсбраке^й «а» и <Ь* обнаруживают периодичность о .ало БОА. Гред.тслэгэвтся, что сеетгые полосы офз^еьных уранл-ацетатом фибрилл соответствует гидрофобным сластям трубочек лиг^оного б>>слся, а темные полосы - окрзижнным молекулам ДНгС, заключенный внутри трубочек.

Высокотемпературная стабилизация ДНК в комплексах с катионными липидами.

В ладной работе представлено исследование влияние мембранных катионкых липидов на плавление }ЩК, которое, как было обнаружено нами, существенно отличаются по своему действию на плавление ДНК от водорастворимых катионных агентов, таких как катионы двухвалентных ' металлов. Посредством спектрофотометр и и в области 260 им нами был проведен анализ присутствия нативпой ДНК после нагрева ДНК-лнпидных комплексов до ЮО'С и последующего охлаждения препарата до комнатной температуры (Рис.19). Было обнаружено протектирующее влияние катионмых липидов на молекулу ДНК.' Максимальная протекши ДНК наблюдалась при соотношении зарядов 1,5-2,0.

Рие. 19. Процент нзтиекзД ДНК после 10 мхи кипячения ДНК-липдаых комг^юсвс раш^мными значениями R^. Данные спепрофотометрии при 260 ни после охлаждения грелзрата до 25*С и обработки в 25мМ SDS. Даны средние. значения J-5 измерений, Использовал* ультрззеуюеыо. фрагменты тимуеной 'ДНК' телёнка дгичой около 6000 bp. Препараты в 5vM июдилатнои буфере, pH 7.0. E-DOPC (Ш). DOTAP(*), DC-Chol * DOPC (1:1) (•). DC-Chol + DOPE (1:1) (•), TIMA (♦), TTMA * DOPE (1:1) H'TTOA »DOPC (1:1) (X), DOPC (*)■

oo ía To Ts го

Необходимо отметить, что протектирующая способность липидов не коррелировала с их известной активностью в трансфскции. Высокая протектируюшая способность была обнаружена как у очень активных транспортеров ДНК, таких как Е-DOPC, DOTAP, DC-Chol + DOPI-, так и у липидов с низкой активностью .в трансфскции, как например: DC-Chol+DOPC, TTMA+DOPE. или ТТМЛ+DOPC. Возможно, что способность образовывать бислоИныс мембранные структуры являлась важным фактором, определяющим протекторуюнше свойства липидов,

поскольку мицелообразуюшиП катион пи й детергент ТТМЛ оказывал существенно меньшее протектнруюшсс действие

Рис. 20. ДСК Сланы комплекса Е-ОСРС с глэзмгсэЛ р-гал ДНК (7651Ьр) ьа стандартней фосфатном буфере Дулбеюю, (А) - -«энтрсяъ (йал ДНК; (Э) - исиглес^, псру^еььыД добав^ниеи Сслыам ты.тосеи Е-ООРС х р-гал ДНА, 1; (С) - Ю1Г7К«с, ю.ту^книД дзбавяексе« малых (обработанных ультраз»уюм) гипосеы Е-ООРС к р-тал ДНК, (V;' 1. Сюростъ скз«/рс&знля 10 градус. Калориметр УР-ИЗС (№сгоСа1, США)

Анализ профиля плавления ДНК-лнтипих комплексов показал наличие двух областей плавления ДИК (Рис.20), Одна область совпадала с кривой плавления свободной ДНК в соответствующем бу"5>ере. Эту часть ДНК мы назвали терчолабнлыюП. Другая область тенлопоглошеиия располага.1ась в 1емнературном диапазоне 105-115'С, независимо ог нснользусмого буфера. Эту ДНК мы назвали тсрмостабильной. Температура плавления термостабилыюй ДНК мало зависела от концентрации кашонного лип ид а или от параметра Я,»/.). Напротив, количество термостабилыюй ДНК было чувствительно не только к параметру ГЦ»/.), но и к условиям приготовления комплекса Например, оно зависело от размера используемых л и носом. Большие липосомы были неизменно менее эффективны в формировании термостабильной ДНК, чем малые ли нос омы (Рнс,20),

В процессе взаимодействия ДНК с катиоипыми липизамн формировались большие хлопья препарата, которые можно было легко отделить центрифугированием. Было обнаружено, что седимснт содержат практически все количество терчостабильноИ ДНК, тогда как прозрачный супернатант содержат термодабильную ДНК (Рис.21). При этом около 95% лшшда содержалось - в седнменте, тогда как супернатант содержат в основном свободную ог лнпида ДНК (Рис.22). Анализ трансфскцин свидетельствовал о том, что вся активность препарата принадлежала седименту, т.е. термостабилыюй фракции ДПК, тогда как термолзбильная фракция была практически неактивна в трансакции.

По данным электронной микроскопии, о препаратах, содержащих термостабнльную ДНК, доминирующей структурой были мультнламеллярные комплексы с периодичностью около 6,0-6.5 им (Рис.23А), что характерно для подобных комплексов, образованных различными катнонными лншиами. Было обнаружено, что периодическая мудьтилачеллярная структура очень стабильна и сохраняется даже после нагрева препарата до 130'С (Рис.23В). При этом, периодичность структур существенно не изменялась. Высокая температурная стабильность мультиламеллярных комплексов, по всей видимости, может служшь структурной основой для возникновения термостабильной ДНК.

ТО «О 90 100 110 130

■Р

I

«с

Рис. 21. Сены ДСК тсриэстабильноЛ и тер«каб*лы<Л ipatu/Л ДНК рэделсикых центрифугероезн/еи (15 ОООд, 33 м/и). (А) - грспзрзг перед центрифугированием; (3) -суперлзтачт преязрага «А»; (С) - сегмент греязрзга «А». Комт-пеге лояучен добавлением бопьсих лияоссч E-DQPC к ft-гапДНД, FV<r 1- '

>g не *о -то но

I*

F1

и ■Ч

£ ц,

i:

i « Ч '

ii

■v t:

Pus. 22. Состав и вw з^ссть в трзн;4е«;/и сугерчагактэ и ссдимента юигдеисо, полученного как укшнэ ранее (Рио21). Трф-с^сш^^я оцек|тгалзсь на кугыураяьиух юегкзх ВН< в буфере Дупбеол, в отсутствие серы и ахткблотиса, Э«грееекя р-таяэюсзкСЗзы сценлззязсь по флуорссце^^н субстрата. Коя»т*ество ДН< сценизаЬось го гапо^еь^с при ISO им. Для сцен»» ссяерон/я гмя/да к глюсоиа« 6t«i дэбгкек 1S фоофатудлглтанопз«"«, меченныЛ рсдсм/нсм (Rii-DOPE), с маоиумеч погооцения при 5£0ич *

Рие.23. Ультра тонкие _ срезы ДКК-лилидндго хоугяекоэ,' полученного'добзиой обработанных ультразвуки г/хсем ET-DOPC к тииусмсй ДНК теткина в груюутств/и 5 мМ киедилатэ, R^p 1,7. Образцы ф*«сирога.-жь в 1% OsQi при ютнзтной температуре (А); ил* п рл 130*С-,(0). Сурьо в нал« е5лэстей, одкпсн*их звёздо«зии, гредетзьтсн в верхних углах рисунке.. В обеих препаратах Волгина герисдсвбякз« кб 0-6,5 ьм.

кат ионным и липидамн стабилизации ДНК в теорией диссоциации

. Температурная стабилизация ДНК в комплексах с существенно отличается .от известной из литературы присутствии катионов металлов. D . соответствии' с

электролитов, взаимодействие-катионов металлов с фосфатами ДНК возрастает с' увеличением их конце irrpaitmi, что, в конечном счете, определяет рост температуры ■ плавления ДНК от концентрации катионов..

В случае мембрапообразуюших катонных липидов, температура плавления ДНК является величиной постоянной и не зависит ог концентрации катонных липидов, или, вернее, от соотношения зарядов. При этом, параметр R^/.j влияет лишь на количественное соотношение между энтальпиями тсрмостабильной и термолабильной фракш!Й. Т.е. в результате взаимодействия с катиок1<шш линидами, часть ДПК резко изменяет свойства, как бы «переключается» в новое тсрмостабилыюе состояние, тогда как свойства оставшейся части ДИК не изменяются. Мы полагаем, что такое поведение связано с тем, что образующийся

ЛНК-липидиыЙ комплекс имеет строго определенную стехиометрию зарядов 1,5-2,0 , определенную структуру и, следовательно, фиксированные физические свойства: В случае, если мы используем соотношения ДНК и'липида, отличающиеся от стехиометрических, фаза комплекса отделяется ог компонента, добавленного в избытке. Последний не принимает участия в образовании комплекса и присутствует в свободном виде (Р«с,24).

Рис.24. Схема, пстезывавцзя структуру «с«ляв«са в ко терем щмбрзны кагие*иэа>ялчзд

разделе«« слоями ориентированны* нитеЛ ДНХ Как масстьо из литературных данных, рзостс«*ие иекду молекулами £№С валяется фиксированной вел«чиноЛ, от гипидного состава и условий среди,

ПО маиим данный.'структуры, в которых стетоиегрлч гигад'ДН< близка * 1,5-20, грисутпвуйт > препарате независимо от тего в какой пропорции были сметаны гемлонеиты, т.е. в избытке ДНК (А), кг* » избытке пилила'(В,С).'Мы полагаем, * что именно зга многослойная структура с ф«»с/рсикноЛ стехиометрией содержит териосгабильнум ДНК, те^лерзтура глззлеьия готорЫ таске »-о изменяется а

различных смесях ДН< и мгиоиююг^да, ,

/ 1

, ПОЛИМОРФИЗМ ЛИПИДОВ ВКЛЕТКЕ

Фазовые переходы в мембранах грамотр и нательных бактерий в-процессах транспорта в ы со ко мод е кул ирных веществ. Гипотеза об участии мембранных контактов в транспорте высокомолекулярных веществ впервые была высказана Байером, изучавшим структуру мембран оболочки грач отри нательных бактерий. Такие контакты, названные автором зонами адгезии, были обнаружены- только в плазмолизованиых клетках,' помещенных • а гипертонические среды. В дальнейшем, зоны адгезии были обнаружены также в митохондриях и хлоропластах. Несмотря па всесторонние исследования, мы мало знаем о тонкой структуре и механизмах функционирования зон адгезии. Различные авторы по-разному представляют характер взаимодействия мембран в этих участках. Так, в соответствии с гипотезой Байера, в зонах адгезии внешняя и внутренняя мембраны бактериальной клетки вступают в непосредственный контакт, благодаря чему высокомолекулярные вещества, в процессе транспорта, последовательно пересекают гидрофобную область обеих мембран, не попадая в периплазм этическое (фостранство. Такие представления согласуются с гипотезой о возможном участии в транспортных процессах инвертированных мннеллярных структур, возникающих в местах контакта двух мембран. Предполагается, что возникновение таких структур связано с полиморфным фазовым переходом липндов типа бисдой-гексагональная На фаза При этом остается неясным, каким образом поддерживается целостность гидрофобного барьера плазматической мембраны. Раше работа направлена на исследование структуры ■ зон алгнедин и характера взаимодействия мембран в этих участках.' " ■ **

Динамика структурных преобразований мембран : Escherichia coli в средах с высоким осмотическим

давлением. .

Бактериальные клетки способны приспосабливаться к существенным изменениям осмотического давления окружающих растворов благодаря наличию сложных и пока еще мало изученных механизмов адаптации. Настоящая работа посвящена изучению динамики морфологических изменений клеток Escherichia coli в условиях плазмолиза, вызванного действием концентрированных растворов сахарозы.

ш j > i | * 1 i i_i j * j l" * ■ ■ .. ■ * * . . — ^ < ~ v?* v

mm.

Рис. 25. Стрггтурныо изменения в ергаииззц^и мембрзн Е$смШл coli в лерзь;е секунды плазмолиза. (А) .-ми кз ллззмолиза. ультрагсн«,) срсз, мембраны располагается параллельно; (0)- 3 се* плазмолиза. 1 ультра тэио-Д срсз. певалявта» складки, внешняя уеибрзмз rpcsyiypyer пузырим; (С) - 3 се* плазмолиза, ,зг^раяивЗ"<*е.траэление поверхности снопа, псказана складчатая поверхность клетки с пузырькам, аналогичными тем, которые £*дки на "В'; (D и Е) - неверность сюла и ультратснтй срез клегм через 1,5 ,-.2,5 ши ллззадслиза. Влдкы ичаашчз^и глззмзтическоЯ мембраны и сбразс&зя^о везикул в пер^ллазмат^ссксм пространстве; (F и G) - поверхность сюлл и ультрзтоиуД срез клато« через 10 • ГО vx-i глззмслиза. Показан грсцссс фрзгментзц*и ллазматеческэй Mcv6pa>u и поязлеим еез^ул с ' кемлонектзми цитоплазмы в периллззизнмескоч пространстве. Масштаб: 200 )<и.

Наблюдения структурных изменений ободочки клеток £ coli в широком временном интервале or, 3 сек до 30 мни-после добавления данного раствора сахарозы показали, что плазмолиз является сложным и многостадийным процессом, в течение которого происходят, существенные - изменения, организации клеточных мембран (Рис.25). При.этом выживаемость .клеток после 30 мин плазмолиза была близкак1(№«. _ ' _

. В течение первых 3 сек наиболее существенные изменения наблюдаются на наружной мембране,,- в то. время как. внутренняя мембрана и обьйм пернплазматического пространства изменяются незначительно. В интервале времени от . 20 сек до 10*20 мин происходит сжатие ■ цитоплазмы и увеличение пер »плазматического -пространства. D этот момент сахароза уже находится в пер «плазматическом пространстве, и осмотические силы приложены к внутренней мембране. Цитоплазма равномерно уменьшилась в объеме в результате выхода воды, и, при этом, внутренняя мембрана сохраняла связь с не сжимающейся наружной мембраной лишь в некоторых, точечных участках (зонах адгезии). Поэтому

внутренняя мембрана образовывала куполообразные > внячнвания. Через 10 мнн плазмолиза начинается.процесс фрагментации внутренней мембраны о области зон адгезии. Наличие длинных тяжей периплазма!ичеекого материала, соединяющих обе мембраны, позволяет предположить, что этот процесс обусловлен ростом сил натяжения в зонах адгезии вследствие уменьшения обьема шттоплазмы. .

Риг. 2$. ПлазмалмЗО мм*. #Э*зоц*тм» цитопяазиатечеаих вез/пул в периляззиатичесюо грострзня&о. В периялазмапиесхои грострзктее появляется вез/»упы с гпдаой геверхюстыо С«;г4(А). На угьтрзтокюи срезах в^дно, что вез/гули образованы дв) ия меибрзна<м (В и В"). Шаьтз$: 200

Через 20—30 мин после начала плазмолиза (Рис.26) наблюдается процесс, который можно охарактеризовать как эгаошиоз или секрецию нитоплазмагических везикул в пери плаз магическое пространство. Но некоторым морфологическим признакам у этого процесса имеется некоторое сходство с экзопигозом в эукэриотмческнх клетках, однако у бактерий мы не наблюдаем окончательного слияния везикулярной и плазматической мембраны. Везикула «одевается» в оболочку 1П плазматической мембраны к оказывается в першпаз матич еском пространстве. Схематическое изображение динамики плазмолиза представлены на Рис. 37.

Поскольку, как это отмечалось выше, в наших экспериментах практически 100% клеток выживает после 30 мин плазмолиза, можно предполагать, что наблюдаемые процессы являются нормальным ф юно логическим ответом клеток на воздействие гипертонических сред.

Рие.27. Д/кои/я пг-азмолиза ».-его* ЕьсЬеЛЛ'л еоИ в 20% сахарозе. ОМ -шружиая мембракз. РО -пелтигогпвднозыЛ сто), 14 - внутренняя мембрана, 1 - гузырми ха поверхности кгмтги, 2 - инвзгинзц.и внутренней меиСраны, 3 - образовала вез/^л в цктог.-дмч, 4 - ттогл периллазмапиесиого материала, 5 -Срзшемтз^ гпззмгмеибрзны и образование еез**уп в герлхтззие, 6 - эоо^тез цигоппззилтимеойх ве№<уя в периллззизтмческэе пространство.

Полиморфное поведение мембран грамотрицательных бактерий в присутствии двухвалентных катионов.

Известно, что в присутствии двух пале] «них' катионов клетки некоторых трамотрицатсльныхД батрий ^'"приобретают .'-способность • генетически трансформироваться в результат'е захвата экзогенной ДНК. Процедура трансфекцнн сводится к инкубации клеток при. 0'С'и'в "присутствии ЮОмМ двухвалентных катионов (Ca1* или Da1*) в течение нескольких часов. При атом, в среде находится также плазмкдная ДНК. В дальнейшем клетки подвергают .кратковременному тепловому шоку при 42'С.. Электронная микроскопия замораживали «^скалывания показывает (Рнс.28), чтоинкубаиия Escherichia соН или Pseudomonasputida при 0*С с двухвалентными катионами Ca3* *и Ва'* вызывает появление * гладких, лишенных внутримембранных частиц "участков (Рис.28Л), что .свидетельствует о процессах латерального фазового разделения белковых н лншиных компонентов мембран.

ш^-щт ggp;

Рне.23. Электронная «гироскоп»я заморажиази/яскалы аа^я (АЛ) и угырзтехник срезов (C.D). показы азюцзя возил исесн*о полиморфных фззееых перехода® с мембранах ВьсЫгШз соS в условиях, сгасобягулуис проникновению экзогенной ДНК в цитстеэзму. А - хпетм грм О'С в григутсгвл» 100<Д1 Ca1*; B-D - грегарзг «А» госпо тсмоют» шока 15 мин гри 42'С. Стрслкзии пооззна трубчатые структуры гексагональной Н( фаз« лия^ов, Ках'гсказаио на рисуню, трубочм часта образуются в местах кмтзктоз между клеш Víi.

Последующий тепловой шок (3-15 мин при ■12-44'С) способствует появлению на поверхности клеток' трубчатых структур гексагональной Ни фазы (Piic.28lí-D). Появляются многочисленные мембранные'мостики между клетками, что может способствовать слиянию мембран и .даже 'Тобьединелию шттоплазматичсского содержимого соседних клеток, _ ""

Спектры "Р-ЯМР клеток при тепловом шоке обнаруживают появление нового максимума при 20 ррт в сторону низкого поля от сигнала раствора IIjVO« (1*1(0,29). Известно, что подобный сдвиг в спектре фосфолипилов соответствует появлению гексагональной Нц фазы и хорошо коррелирует с данным к электронной микроскопии.

Рис.29. Сгектр *P.RUP метек Escherichia coli (а) - при 42'С. Клетки были гредеарительно инкубированы при О'С в присутствии 150мМ Саг*. (А) -время накопления^ сигнала 2 часа; (В) • гредстэален дифференциальной спектр, полученный вычитанием кз спектра «А» сгеггра, записанного с нэсыи^еииеч сигнала (импульсная последовательность DANTE, несущая частота,отменена стремой). Спектры гояучекы в лаборатории ИАВаскпенга ■

Более того, зкеперимогг с переносом насыщения ЯМР сигнала (Рис.29В) свидетельствует о наличии быстрого обмена молекул между новым максимумом (вновь сформированными структурами) и сигналом от бнелоя, а также между сигналом от бислоя и изотропным сигналом (везикулярные и мниеллирные структуры). Последнее свидетельствует о наличии физического контакта и обмена материалом^ между этими структурами, что, в совокупности с электронно-микроскопическими данными, позволяет рассматривать все наблюдаемые структурные изменения- результатом трансформации линндов бактериальных мембран. Как видно из Рис.30, тепловой шок приводит к существенному снижению выживаемоста, однако количество выживших клеток достаточно для успешной

Рис.301 Влияние гродолжитегьиосго теплового иска при 42'С на выживаемость клеток • (з). Количество трзнесортированных меток • (•), Эффективность захвата ДНК (—)• " Па вертикали отложено относительное количество выживших клеток а начальный момент времени и количество трансформантов (100 соответствует ШклетмЛил), Данные получены совместно сА Г.Сабепьмкоеым;

Результаты данного исследования свидетельствуют об участии полиморфных превращений липидов в присутствии двухвалентных катионов Са3' или Ва2^ в захвате клеткой экзогенной ДНК (Рие.31). Подобные изменения структурной организации мембран, индуцируемые не только двухвалентными катионами металлов, но и другими субстанциями, присутствующими в клетке, как например, специфическими катнонными белками или полиаминами, мо1ут иметь место в течение клеточного цикла, и способствовать таким процессам, как обмен генетической информации между клетками, захвату или секреци и различных экзогенных субстанций, '

-АО ~Й Зо

трансформации.

А

Рис. 31, Cxcmmicaoe изображение пол/мерфиьи Оазогих переходе« а мембранах клею* (рамотрпцзтельных бзитериД, изтионз^Са1* ил/ В а?- ерп _ тестево« uoia. А -

изображены дзо бзпериальлые' клетки, на гсеерхност» и в песта* кснтзш'рсвакил юторых 'формируются пелиморейые Сазы пил/дее; Е- гроцеес начинается с тега, что при О'С прс*эсдит освобс*йениа участке блпоя фосфслл^оэ в результате патерзльной сегрсгз-^л белюз. В грисутст®!'»! катионов Садили Ва^зти участки становятся местом scoop6tvn ДНК, добавленной в среду. Последуххдсе гкеьигение температуры индуцирует псл»исрфхые фазовые перехеды гилида, слияние соседим мембран и образование пор, через которые иожет прс*и*агь ДНК,

Транспорт ДНК через мембраны при инфицировании клеток Escherichia со// фагом Т4

Hi котирование клеток E.coli фагом Т4 является наиболее хорошо изученным примером транслокашщ ДНК через мембраны оболочки неотрицательных бактерий. Было показало, что фаг,Т4 инфицирует клетки в зонах адгезии. При этом вопрос о том, использует ли фаг. унгё существующие в клетке зоны адгезии или нняушфуст появление новых, оставался открытым. В соответствии со «шири не во ft моделью», стержень фага,, выдвигающийся при сокращении фаговой частицы, прокалывает сначала внешнюю; а затем внутреннюю мембраны бактериальной клетки. После этого в цитоплазму впрыскивается ДНК, При этом, предполагается пассивное участие мембран в процессе инфицирования,

* Наши исследования позволяют предложить • иную модель инфицирования клеток, в соответствии с. которой предполагается более сложный процесс взаимодействия фага с мембранами бактериальной клетки. Электронная микроскопия ультратонких срезов и реплик с. поверхности сколов * клеток Escherichia coil, фиксированных '¡срез 5 мин. после начала инфицирования при комнатной температуре, выявляет разнообразные изменения-в организации мембран. Прежде всего, обращает па себя.внимание появление инвагинаций внешней мембраны. В результате инвагинации пол действием фага,-внешняя .мембрана бактериальной клетки прогибается и вступает в непосредственный контакт с внутренней мембраной. Удьтратонкие срезы позволяют обнаружить, также, появление меж мембранных мостиков, индуцированных фагами (Рис.32Л). Измерения показывают (I4tc.32D), что внутренний диаметр мостиков, равный ЗОА, значительно меньше диаметра стрежня фага, который, как известно, равен 90Л. Внешний диаметр мостика при этом составляет приблизительно 120-125А^. Как видно на представленных микрофотографиях, электронно-прозрачные линии, ограничивающие мостик по своей

ширине и платности, не отличаются от клеточных мембран и, по всей видимости, представляют собой срез наиболее гидрофобной части мембран ыюлшиной 30-35 Л,

iJbU С-

Рис. 3Z Щямембрзнные мхтуы в слетах EccJf. г редуцируемые фагом Т4. (а) - мостим между внешней и внутренней мембрзнзии бз сериальной клеим на угьтрагои«« срезах; (5) - расгрсдсяе,<ие плотности в юправлея-ч перг-с^/лулярнои «хтику (лреастзменэ кегатуамов мобраадч/е межмембрзниого моегма. взятого из р*сумэ а, и каложечная ка эта из:£ра*еш>е доситараимз) (в) - гипотетическая осы мездаембраннога «тонмегя», гредпепзгзкхуя проникновение белев стерла сага внутрь гцдро£сбной области мембра* ы, осноезинм м прсьеденных измерениях.1

15

.tt и

•О

Terrprraturo °С 30 ?0 10

ш го зо Temp*rolur* *С

Ж 133 г'ю"3к

Рис. 33. (А) •Температурная зависимость вел^ины ял-перис^а вихада калия из цитоплазмы Eicbirfcfilj ссУ грм инфицировали фзгом Т4. Лаг-геризд определялся как время, гротекзечее от момента добавки фагез и клетсг*<ой еусгекзии до ьзмала ешода юное «алия из цитоплззш. (В) -Температурная зависимость ниальноД скорости выхода калия из цитоплазмы «лете* Есо®, инфициревзмнух фзгем Т4, выраженная в юординзта* Аррениуса. Клетки в стандартной питательной среде Ш в

присутствии (з) и в отсутствии (•) тл'СЮЗь! в среда. Перся гроеедеинеч измерений клеты дважды грсмыеали при 4°С в среда, содержащей S «М матр»»егу« соль f.WS и 0,11.1 Г1аС1 (рН 7/)). Активность ионса кал ля регистрирогали калий<еяективным электродом EM-KQ1, Тотальное осйсрхзкиа цпголлазиапмескссо кзл/я оцеи/вагюсь путем добзвли пел/у/кси-о В (320 един/ц на 1 мл) гри 37*С. Данные пелучены оог место с А А.Хусзимовым, Р. Дзугелавимуетм и ЭЬа«ене

D соответствии с пред став лепными измерениями белки стержня фага должны глубоко проникать в гидрофобную область окружающей его мембраны (1'нс,32С). Данная структура была нами названа «тоннелем». Гидрофобное пзаимодсйствие белков стержня фага с мембранным бислосм может предотвращать утечки ионов, что позволяет . поддерживать мембранный потен пихт, необходимый для жизнедеятельности клетки и продуцирования новых частиц фага.

Известно, что пониженная температура может существенно замедлять процесс инфицирования. Наши наблюдения 'показывают (Рис.33), что при понижении температуры происходит увеличение лаг-периода выхода калия (Рнс.ЗЗЛ) и резкое увеличение начальной скорости выхода калия (Рис.33В).

РиеЛ1. Изменения структурной организации • мембран плети ЕкЛякйй соЗ, индуцируемые фагом Т4 гри различных температурах.- Метод ультратоиш« срезов. Ви/зу представлены в ¿Л,- ''мя- ' • 0<емэт>меа[1,в изображения

—1 —¿й- , ' ^ццн., "' ' ^аблюдаечых межмембранных

-О-С— ^ . . > ■ "МОСТИКОВ.

{Щ? ' ' ..<©. > . . -

Совокупность полученных данных позволяет разделить процесс инфицирования натри независимые стали»: ^ . -

* - 1). При температуре 0-бвС мы1 наблюдали прогиб внешней мембраны и образование непосредственного контаюд между внешней и внутренней мембранами бактериальной клетки (Рис.34Л)." * ' ' ' "

2). При температуре выше 6-7°С начиналось слияние мембран и образование широких межмембранных мостиков^ Этот процесс коррелирует с началом выхода ионов калия т цитоплазмы (Рнс.34В). При этом, начинается инфицирование.

3). При температуре - выше 20°С диаметр межмембранных .мостиков существенно уменьшался (Рис.34С). При этом - наблюдается излом начальной скорости утечек ионов калия от температуры на графике Аррепиуса (Рне.ЗЗВ), что также свидетельствует о существовании структурной перестройки в мембранах при 20'С.

•*■■ 2 [Г : ; t r-IK

----;Г5-„:''• ' % ....

Р«е135. Схема, обьяскяюи^я кэши представления о поеледоезтельных стадиях процесса инфицирования юето* Ecoí фзгем Т4, (1) - инфицирование катхзных хпетос Фаг адсорбируется ьа поверхность клотад (1А). сокращается и предает, стержней впейте» мембрану (1D). Вступаете во взэ/модеиствие мембраны претерпевает процесс спиянед (1C;1D) в результате '•его образуется струшура поры и ДНК фага ивецяруется в цятеллазму (1Е). При этом через пору, может прсисхсаить утечка иоиез. Далее мембрана специфически взаимодействует ео'стержкем, образуя структуру тоннепя (1FJ. Этот момент соответствует закрыт*« отверстия и прекращений утечки. (2А') - у клеток, деэнергазованных цианидом или мерпюлятэм. расстояние между мембрзнаии уеелмено. При этом контакт между мембрзизчи не осуществляется (IB"), и следовательно,'слияния ме иб ран'негре исходит. В результате, ДН< ебортивно впрыскивается в пердплазиатиче«» грострэнстао (2С). Обозначения: ОМ - внешняя и ей бронз; ¡M -внутренняя, плазматическая мембрана. 1 .. • .■ >

*» *. . , . ■ . ' 1 ■" v . " . . ,

Межмембранные мостики никогда не .удавалось наблюдать на клетках, обработанных такими метаболическими, ядами, как СССР, цианид или арсенаг, что находится в хорошем соответствии с представлениям но необходимости мембранного потенциала для инфицирования. Отличительной чертой' деэиергизованных клеток

было значительное увеличение перинлазматического пространства и, следовательно, межмембранного расстояния. Такие изменения, возможно, являются следствием осмотического сжатия цитоплазмы после исчерпания клеточной оперши и потерн цитоплазматического казня. Это указывает на важную роль расстояния между мембранами при инфицировании, как показано на схеме (['»с.35)

Слияние мембран при лизисеклеток Escherichia coli, индуцированном фагом Т4 ~

Известно, что бактериофаг Т4 способен лнзировать клетки Escherichia coli . Нами было обнаружено, что при температуре ниже )4*С лизис практически не наблюдался. При более высоких температурах его скорость возрастала, достигая махеимума при 45-50'С. Кроме того, наблюл пас ь задержка от момента добавки фагов до начата лизиса. Величина задержки также завесила от температуры.

Проведенные структурные исследования показати, что лизис начинается с выпячивания мембран бактериальной клетки и отшнуровывання везикулярных структур (Рис.36). Вследствие этого, как показывают наблюдения, в месте разрыва внешняя и внутренняя мембраны бактериальной клетки могут сливаться, в результате чего, образуется стабильная структура в виде поры диаметром около 100 - 500 им (Рис.3 6В). .

Мы полагаем, что наблюдаемые выпячивания мембран могут возникать вследствие нарушения целостности и сшндогли капового слоя в некоторых локальных участках. Нами было показано, что па ранних стадиях инфицирования бактериальных клеток наиболее явные структурные изменения происходят в нериплазматическом пространстве. Эти изменения связаны с инвагинацией внешней мембраны и образованием кармана Как указывалось выше, такие структуры индуцируются лишь немногими фагами (около 1 - 5% частиц фага).

. ... 1 . А . ■

Рис, ,Зб_Ультрэтонь« срезы клетм EscteneftÁí coi, км$*ц*рсмнных фдом ТА. Продсшлены сгрулурчые изменения в мембранах, ©ктрсэгядзющио процесс гизиса извне, МзоатэЗ 0,1 мим.

В соответствии с нашей гипотезой (Рис.44), в месте формирования инвагинаций происходит нарушение целостности нентидогликанового слоя, поскольку инвагинация занимает значительный объем пери плаз магического пространства и, вероятно, вытесняет нентндогдикан в данном участке. Мы ие исключаем возможности того, что процесс вытеснения может осуществляться с участием периплазм этических ферментов. Именно эти участки могут бьпь «слабым местом» в оболочке бактериазьноП клетки и впоследствии выпячиваться наружу под действием осмотических сил.

.-♦г ....

С О Е

— . ... * .(.•' ■ .* -Т- ■ •* ■

Рис. ЭТ. Схематическое изображение последовательных этапов лизиса извне клети EcoS, киици/роезнмих фзгсм Т4.' (А)- нзруогхие целостиссти пегквдсглианозого' слоя в мосте и/вагичэ^и нзружнсЛ мембраны (НУ) и ее контакткрозанио с внутрею-еЛ мембраной (Bf.t): (В) - выпячиззние наружу обеих мембран, (С) - отс-иурсй/аз«« везикул в о^у^сос^-о среду; (О) — смыкзкее гидрофобных ираеа мембран; (Е) - образе«**«) канала. Стрелки - действие осмотпеом сап на внутреннюю мембрзну и потоки цитоплазмы из клетки. . .

Взаимодействие катион ных липосом с плазматической мембраной эритроцитов

В ранних работах предполагал ось.что кат ионные дппосомы просто сливаются с плазматической мембраной клетки в результате чего их содержимое попадает в цитоплазму. В дальнейшем многие Исследователи пришли к заключению, что наиболее вероятным путем проникновения различных кат ионных згапов в цитоплазму является энаоцнтоз- ' '

В данном исследовании проводится-анализ морфологических характеристик взаимодействия катнонпых' липосом с плазматической мембраной эритроцитов человека Ее исследование особенно актуально в силу того, 'по в мели им некой практике часто используется инъекция катионных липндов в русло крови где часть липосом ^южет взаимодействовать с мембраной эритроцитов наряду с мембранами других клеточных компонентов крови. '*-, * ■ •

Нами было обнаружено, что при взаимодействии с катйоииыми липосомами на Р1:-по верх поел i скола мембран _ эритроцитов наблюдалось резкое снижение количества внутрнмемебранных частиц (ВМЧ) и формирование гладких участков. При этом, па ультратонхнх срезах можно было наблюдать адсорбцию липосом на поверхности клеток. Некоторые, липосом и сливалисьс. плазмам см браной. Анализ показывает, что гладкие участки на. поверхности', сколов плазмамембрапы соответствовали местам адсорбции липосом.'

Через несколько минут после добавления липосом морфология эритроцитов существенно изменялась? Особенно драматическими были изменения эритроцитов, обработанных смесью лецитина н окгадснилямипа. Происходило существенное набухание клеток и трансформация в сферошпы (не показало). При этом в первые 10 мнп наблюдался процесс ипвапншши внешней мембраны и образование эндосом (Рис.28А). Процесс обособления эцдосом морфологически соответствовал процессу эндошпоза. ,

Ри&2& А - ультратэнид срез эритроцита чеяоееса, обработанного г/поссмзми из ОС-хспестерика и СЮРС. Сссса'ч« осмием через 10 мин гюсле добгш^ия ялпссм. Нзбпегастея гречке ;ндо^тсзз и образования эчдоссм а цлгеплазмо. В - рег-л^ки с поверхности ослов тех же эритроцитов, криофксурсвзиц« через 30 мин поста добаелеи/я пиггасом. Нэ&ъсдзется гезец/иез эндоссы.

1} более поздний период времени, приблизительно через 30 мин и позже начинался новый процесс. Мембраны эидосом контактировали с плазматической мембраной со стороны цитоплазмы и отделялись п окружающую среду. При этом, в области контактирования плазматической мембраны с эндосочой, поверхность скола освобождалась от виутримембранпых частиц и выглядела гладкой, что свидетельствует о формировании специфического . взаимодействия между мембранами (Рис.28В), Наблюдаемые изменения суммированы на схеме (1'ис.38).

мв»

«'Ш.

ао иич.

li*TOf№S3«Ji

Рис.38.Схемзгичес*ое изображение процесса взаимсле^ств^я хагионкых липосом с мгибрачоЛ эритроцита. Пмаззмо, что грн адярбцин кз псгсрххость «четки лилоссш глотю юктзоируют с мембраной зритро^ггг(1). В месте адсорбции №поссм образуется еяеикСичееюя зона контаита (2).' Предполагается, что именно в зтлх участках избл еда стоя годдме, л/^ечные в^'утр/мгибраниых чэстич поверхности скалов, что макет грегчествовать сгия-»« мембран (Э). Пасдно, weutpaia эритрссита бгизха ю свс/ч cEcicisau к плоскому биолог (А), образоазнирм/ цдлнч£ричес&уи молекулам/ л/ллда (чля гростоты участи бел«ов не рюемзтр^азегоя). В. результате адсорбум кзтюнных п/ласм из поверхности мембрзкы (0 - пелярнуе головы ютнонюлз г-"я*да ззграаени >чр<ь-и) отрицзгельиы* заряд лил^цов Bhe^jHcra мэиоспгя ллазадтичссвдА мембраны нейтрализуется, что создаст усяоз/ч для более комтотпЫ улаисвп» мзле*ул гмлэ и ахрзчения площади еие-^него моиослоя. В результате грелехадит rpctvS мембрзны (4) и формирование эчдоссч. Дальмсйчсо слияние мембран пр^всйит х нахеллеиио положительного ззрада в э*доссмо, в результате чего она взаимодействует с внутренним момоспоемкшмзтичес1йймембрачи(5).что^з.-ем/кэетгроцеоез*зочитоза. ■ •

Л штосом и с низкой эффективностью в трансфекпин (смесь DC-ход ест ери па и DOPC) оказывали также меньший эффект на структуру плазматической мембраны, хотя они эффективно ал сорбировались на по верх поста клеток. Напротив, существенные структурные изменения производили янпидиие смеси, содержащие DC-холестерин и DOPE, а также лешпнн и окггалсиилачин. Известно, что смесь DC-холестериии и DOPE очень активна п трансфскции, тогда кок смесь ленитина и окталмшламина обладает шпотокснческнм действием. В последнем случае действие катонных ли носом на плазматическую мембрану было наиболее выраженным, и вероятно, разрушительным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе приводятся экспериментальные данные, - свидетельствующие о единстве механизмов и сходстве структурных проявлений фазовых переходов липидов в искусственных системах и в живой клетке. Можно предположить; что,в пронес« эволюции способы использования клеткой способности липидов* к сложным и разнообразным структурным перестройкам совершенствовались,'.что позволяло обеспечивать се разнообразные. физиологические- отправления. Различные фазы 'липидов, такие как бислой, кубические. н, возможно, гексагональные фазы стали неотъемлемыми элементами конструкции * клеток." При 'этом каждой "из фаз, образуемых липндами. отводится определенная роль в процессах жизнедеятельности.

Плоский или незначительно искривленный бнелой выполняет функции барьера, отделяющего клетку ,от окружающей среды, а у: эукариотпчсских клеток, разграничивающий также различные комиартменты шгтоплазмы. Однако все разнообразие транспортных функций, необходимое для обмена внутриклеточного содержимого с окружающей средой,' осуществляется благодаря возникновению специфических и весьма 1(збирательных дефектов'эгого барьера, которые обычно называются каналами, переносчиками, порами н туннелями.' К числу указанных 'явлений, связанных с нарушениями'барьерных свойств'мембран и транспортом веществ, можно отнести также' слияние мембран," происходящее при зкзо- и экдоцитозе, делении клеток, секреции н многих других процессах, которые, в соответствии с представлениями большинства *, исследователей, существуют исключительно благодаря функционированию белков.

Приведенные в данном исследовании факты свидетельствую г о возможности н необходимости участия липидов в структурных перестройках мембраны. Липкды можно рассматривать не только как активную среду, обеспечивающую необходимые условия для функционирования белков, 'но н:как нспосрелстпснного участника разнообразных процессов, направляемых белками н модулируемых другими мембранно*активными молекулярными ком полетами клетки. Эти процессы, Наблюдаемые в искусственных системах как фазовые переходы, могут развиваться в клетке в весьма ограниченных локальных участках, что существенно затрудняет их исследование. Поэтому для нас'особый интерес прелстапляет.отыскание пока что немногочисленных примеров вовлечения фазовых переходов липидов в процессы жизнедеятельности. Наши исследования: показывают, что, как в искусственных мембранах, так и в живой клетае нреобразооашя структуры 61 (слоя осуществляются' благодаря коллективному поведению компонентов бислоя. В зги процессы могут вовлекаться также соседние мембраны благодаря формированию инггактов между ними н слиянию. Исследование этих процессов имеет большое практическое значение и • пах од от все большее применение * при создании лнпосомальных препаратов в медицине, или при со зла! ¡ни биосепсоров, мембранных фильтров, сорбентов и микрочипов в технике.

выводы

1. На модельных мембранных системах и мембранах живых клеток исследованы различные проявления и биологическое значение фазовых переходов и полиморфизма липидов. Показана высокая степень сходства структурных изменений, наблюдаемых как в моделях, так и в клетках, Это свидетельствует о единстве физико-химических процессов, лежащих в основе этих явлений.

2. Закономерное чередование полиморфных фаз в зависимости от соотношения зарядов мембраны обнаружено в смеси анионного фосфолипнда кардиолипина и катионного фосфолипнда этил фосфат ид ил холина Раздельно эти лиииды образуют только ламеллярную фазу, тогда как смесь лишиов образует различные полиморфные структуры: губчатую, кубитческую и гексагональную фазы. Предполагается, что взаимодействие зарядов определяет степень упаковки полярных головок липидов и влияет на их полиморфное повеление;

3. , Обнаружено, что хлорофилл способен индуцировать полиморфные фазовые переходы липидов хлоропласта в. Показано, что в комплексе с линидами хлоронластов хлорофилл. способствует появлению межмембранных контактов, слиянию мембран и образованию кубической н гексагональной Иц фаз, Наблюдаемые структурные изменения, по-видимому, связаны с тем, что объемное парфириновое кольцо хлорофилла, находящееся в периферических областях бислоя, нарушает упаковку полярных головок липидов.

4. Перекксное окисление липидов способно существенно влиять на структурную организацию мембран. Нами было показзпо, что в протеолипосомах из смеси кардиолипина,. лешшша И шп ох рома с при повышенной температуре образуются высокомолекулярные комплексы ол игом еров белка н продуктов перекненого окисления липидов. Такие комплексы способны образовывать ми цел л и внутри бислоя. При дазьнейшем увеличении степени окисления мембраны разрушаются и мицеллярные структуры появляются в растворе.

5. Установлено, что при взаимодействии дел ил копированного бактериородоисина с липилами, выделенными из пурпурных мембран (соотношении лнлид/белок 0,33/1), образуются гексагональная решетка, аналогичная нативным пурпурным мембранам,' тогда как при реконструкции этого белка с фосфат цлилхо ли ном и при наличии высокой концентрации' NaCi, образуется орторомбнческая решетка. Предложенная нами гипотеза дает обьяспенне данного явления на основе процессов фазового разделения белков в мембране.

' б. Обнаружено,' что молекула'ДНК в присутствии катионов кальция способна взаимодействовать с природными и синтетическими фосфат идилхол и нами, существенно влияя на их фазовое поведение. Возрастает температура плавления синтетического фосфолипнда DPPC, исчеззсг. нредлереход, существен но расширяются температурные пределы существования «риннд» фазы. В сходных условиях природный фосфат идилхо ли н приобретает способность к формированию трубчатых структур гексагональной фазы, внутри которых может быть заключена молекула ДНК.

7. Показано, что' в комплексах с кат ионным и липидами образуется термостабильная форма ДИК, денатурирующая при температурах в интервале 105* П5*С. На 'основе литературных и собственных данных предполагается, что обнаруженное нами явление связано с формированием специфической фазы, в которой многочисленные бислойиые структуры липида чередуются со слоями ориентированных нит ей ДНК.

т 33

8. Показано, что двухвалешные катионы Cai+ и Ваг* способны индуцировать формирование в мембранах грамотриизтедьных • бактерий Escherichia coli u Pseudomonas putida полиморфные фазовые переходы в условиях, обычно используемых для траисфекшш этих клеток. Предполагается наличие непосредственной связи между наблюдаемыми нами нарушениями целостности мембран, связанных с полиморфизмом л ил плов и возможностью перекоса экэогенноЛ ДНК в цитоплазму. .. ..

' 9. Обнаружено, что фаг Т4 вызывает слияние внешней и внутренней мембран клеток Escherichia coli, в результате чего образуется специфическая структура «тоннеля»; через который ДНК может попадать "в цитоплазму. Процессы слияния мембран сопровождают также лизис клеток, индуцируемый фагом Т4. Наблюдаемые нами структурные тмененид мембран' бактериальной клетки свидетельствуют о наличии нескольких стадий втанмодёйствия и слияния мембран, типичных для полиморфных фазовых переходов. ...

"" 10. * Сходные изменения 'структуры клеточных мембран, обусловленные единством .механизмов фазовых переходов бислоя, наблюдаются в таких различных процессах, как действие двухвалентных катионов металлов или повышенного осмотического давления на мембрану .бактериальной клетки, или инфицирование бактериальных клеток'фагами, или адсорбция катионных лнпосом па поверхность эритроцита. Во всех перечисленных случаях происходж изменение кривганы бислоя, образование межмембранных' контактов, сегрегация компонентов в плоскости мембраны и, наконец, слияние мембран. * ' ' .

" СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шныроа ВЛ.. Тапдховский Ю.С.. Бооовягин 8.Л.'(1981) Изучение структурных изменений в пурпурных мембранах mHaiobacterium halobium при температурной и щелочной денату рации. Биоорг. Линия. 4,1054-1059."* *'

2. Тапзховекий Ю С., Образцов' В.В. {19S2)_Ульграетру ктурный и биохимический ' анализ фрагме жиро ванных мембран микросом. Биохимия.'47, 842-849.

3.'' 'Мальковекая Г.М., Викторов A.B.,' Василенко H.A., Миронов А.Ф., Швеи В.П., Евстигнеева Р.П., Образцов' В.В' ■ Тарах опеки Я ЮГ,. Боровяпш В.Л. (1982) Влияние иитохрома с на движение и проницаемость' модельных фосфолнпндных мембран. Изучение методом ЯМР. Биоорг. Химия. 8,1563-1568.

4. Василенко H.A., Викторов A.B., Евстигнеева Р.П..Тараховский ЮС . Образцов ' В.В.,* Боровяпш 1JJI. (1982) Влияние лерекнекого окисления фосфолкпндов на

морфологию модельных фосфолипклных мембран. Боорг'Химия. 8,1281-12S4.

5. Borovyagtn V.L., Muronov A.F., Rumyantbcya V.D.*. Tatahovsky Y.S , Vasilenko I.A. ' (1984) Model membrane morphology and crosslinking of oxidized lipids with proteins.

v JMirastr. Res. 89,261-273. " ^ ' .

6. Боровяпш В Л., Василенко H.A.," Миронов Л.Ф.; Румянцева В.Д., Тараховский ЮС. (1984) Влияние о л игом ершацни белков при окислении фосфолинидов на морфологию молельных « биологических мембран, Еиаь Шбрани, 1,926-936.

7..' Сорокоумова Г.М., Василенко ILA.,' Тарахпвский Ю.С.. Боровяпш В.Л., Швец В.И: (1985) Сравнительная оценка методами 'Р-ЯМР и электронной микроскопии роли; моноглюкозшинглииеркда' и; . фосфатцдилэтмюл амина в полиморфном ' повелении молельных мембран. Биол: МсСраны. 2,649-656. 8. Боровяпш В.Л., Ваеиленко'И.Л.,- Сорокоумова Г.М.. Тарахпчекий Ю С. (1986) Влияние хлорофилла на структурную организацию модельных мембран, состоящих

из галактолииидов и фосфат иди лглицерина. Изучение методом электронной микроскопии замороженных, сколов. Еиа.1. Мембраны. 3,592-600. 1

9. Тарах□векий Ю С.. Сабельников И,А„ Ильяшснко Б.Н., Боровягин ВЛ. (1986) Слияние клеток грамотрицатсльных бактерий при действии двухвалешных катионов. ДЛ// СССР, 287,1474-1477.

10.. Borovyagin V.L., Sabelnikov I.A., Tarahov^ky Y.S.. Vasilenko I.A. (1987) Polymorphic behavior of gram-negative bacteria membranes. J. Membrane Biol. 100, 229-242.

11. Боровягин BJI., Василенко И,А., Сабельников А.Г., Тараховский IOC. (19S7) Полиморфные превращения в клеточных мембранах грамотрицатсльных бактерий. Бил1. Мембраны, 4,624-638.

12. Боровягин ВЛ„ Василенко H.A., Сабельников Л.Г., Тараховский ЮС. Полиморфные превращения в клеточных мембранах грамотрииательных бактерий (1987) Биаг. Мембраны. 4,624-638.

13. Borovyagin V.L., Tarahovsky Y.S.. Vasilenko I.A. (I98S) Polymorphism in gaJactoUpid/phosphatidylglyccrol model membranes initiated by chlorophylls: 3,P-NMR and electron microscopy studies. Biochim. Hiophys. Acta. 939,111-123.

14. Тарах о веки й WC.. Манувахова МЛН.. ГонгадзсГ.М. (1989) Динамика изменений мембран оболочки Escherichia coli в условиях плазмолиза Бит. Мембраны. 6, 530540.

15. Чернышов В.И., Смехова T.P., Тарах опеки й ЮС. Боровягин B.JI. (1989) Структурные изменения мембран эритроцитов человека при' взаимодействии с положительно заряженными липосомами. Бит. Мембраны, б, 516-529.

16. Borovyagin V.L., Chcmishov V.. Tarahov^y Y.S.. Smekhova N. (1989/90) Dynamics of interaction of phosphatidyl choline/octadccyalmine liposomes with human erythrocytes: electron microscopy study. J. Liposome Res. 1,269-286,

17. Тараховский Ю С.. Хусаинов A.A. (1990) Изменения структурной организации мембран Escherichia coli при инфицировал пин бактериофагом Т4, Биол. Мемб}юны. 7,1311-1317.

18. Tarahnvslcv Y S., Khusainov A.A., Deev A.A., Kim Y.V. (1991) Membrane fusion during infection of Escherichia coli cells by phage T4. FEBSLeU. 289, 18-22.

19. Боровягин B.JI., Барсуков Л.И., Василенко И.А., Деев A.A., Единнов И.М., Половникова О.Ю., Симонова Т.Н., Тараховский Ю С. (1994) Формирование кристаллической упаковки при реконструкции бактериородопсина в липосомы из яичного лсш1тинхДо/с1£и)ы РАН. 338. 113-115.

20. Тараховский Ю.С.. Хусаинов A.A., Иваннцкий Г.Р, (1994) Индуцированный бактериофагом T4 лизис клеток Escherichia coli. Доклады РАИ. 335,519-521.

21. Тараховский Ю С... Хусаинов A.A.,, Иваннцкий Г.Р. (1994) Температурные условия образования межмембранных контактов ,в клеточном окружении Escherichia coli в результате инфекции бактериофогом Т4. Доклады РАН. 335, 103* 105. .

22. Тараховский Ю.С.. Хусаинов A.A., Даугелавичус Р.Ю., Бакене D.B. (1994) Новые представления о механизмах транспорта фаговой ДНК при инфицировании грамотрицатсльных бактерий. Биом. Мембраны^ 11,12-25.

23. TarahovtVy Y.S.: Ivanitsky G.R., Khusainov A.A.. (1994) Lysis of Escherichia coli cells induced by bacteriophcge T4. FEMS Microbiol Letters. 122, 195-200.

24. Половникова О.Ю., Суханов C.B,, Тардчовский Ю С.. Симонова Т.Н., Василенко И.А., Барсуков JI.H.(1995) Влияние бактериородопсина на термотропное поведение 1,2-дипальмитоил-5п>глицеро-3-фосфатцдилхолнна в реконструированных пурпурных мембранах. Биол. Мембраны. 12,409-420,

25." Половникова О.Ю., Симонова Т.Н.." Тараховский Ю С.. Никонова Т.Н., Суханов С.В., Василенко И.А., Барсуков JI.II. (1995) Реконструкция пурпурных мембран m

■ 'делитиизированного бакгериородопсина.' с' использованием эндогенных и экзогенных лип идо в. Влияние структурных и внешних факторов. Био.1. Мембраны. 12,260-275. . - '

26. Tarahovskv Y.S.. Khusairiov A.A;, Daugelavichus R., Bakene Е. (1995) Structural changes In Escherichia coli membranes induced by bacteriophage T4 at .different temperatures. BiophysJ. 68,157-163.

27.- Tarahovsky V S.. Khusamova R.S., Gorelov A.V., Nicotaeva T.I., Deev A.A., Dawson A.K., Ivanitsfcy G.R. (1996) DNA initiates polymorphic structural transitions in lecithin. FEBS Lett. 390,133-136. ' .

28. Тараховский Ю С., Хусаинова P.C.', Горелов А.В./Давсои К.Л., Нваницкий Г.Р. (1996) Влияние ДИК на ультраструктурную организацию линосом из' лецитина в присутствии катионов кальция. Дошады РАН. 350,41М13.

29. Тараховский Ю.С. (1996) Взаимодействие липосом; содержащих ДК-холестернн

• с эритроцитами человека. Электронно-микроскопическое исследование. Бю.г.' Эксп.

Бит. Мед. 122,83-86. • • ' - ' , • "

30.' Тараховский Ю С.; Нваницкий Г.Р. (1998) Липоеомы в ' генной терапии Структурный полиморфизм -"липидов и эффективность доставки генетической информации. Биахииия. 63,5-18. ■

31. Тараховский Ю.С.. Леев А.А.; МасулнсИ.С., Нваницкий Г.Р. (1998) Структурная организация и фазовое поведение комплекса 'ДНК-кал ьцнП-дипальмитонлфосфагндилхолш. Биохимия. 63,t325-l331.

32." 'MacDonald R.C., Rozenzweig H.S.', Rakhmanova V.A., Choi K.L:, TarahovsVy Y.S.. Kennedy M.T., Macintosh T.J. (1998) Physical and biophysical-properties of cationic phospholipids. BiophysJ., 74, A310. Annual meeting of the Biophysical Society, Kansas City. • • . ''' , A J ' '

33. MacDonald R.C, Ashley O.W. Shida M.M.," Rakhmanova V.A., Tarahovsky Y.S.. Pantazatos D.P., Kennedy M.T., Pozharsky E.V., Baker K.A., Jones R.D., Rosenzwcig

. HS:, Choi K.L., Qiu R„ Mcintosh TJ. (1999) Physical and biophysical'properties of cationic tfestmofphosphatidy]cholinel£rcpA>?. J., 77,2612-2629. •

34. Tarahovsky Y.S- Arsenault A.Ll, Mcintosh T.J., Epand R.M., MacDonald R.C. (2000) Electrostatic control of phospholipid ро1>тпофЬ15т.Л'е1/>А>^. J. 79,3193-3200.

35; Tarahovsky Y.S, Rakhmanova V.A., Epand R.M., MacDonald R.C. (2001) Thermal stabilization of DNA by cationic lipids. BiophysJ.BO, 2153. Annual meeting of the Biophysical Socicty, Boston. • - 1 J ■ ' . '.''*,

36. Tarahovsky Y.S , Pozharski E.V. Mcintosh T.J., MacDonald R.C.(2002) Influence of anionic substances on the phase transition and structure of bilayers prepared from cationic triesters of phosphatidylcholine. BiophysJ.. 82," 159a! Annual meeting of the Biophysical Society, San Francisco. •

37. Koynova R.. Tarahovsky V.. MacDonald R.C. (2002) On the phase behavior of hydiated cationic triesters of phosphatidylcholine: low-temperature polymorphism liquid crystal line-to-gel transition aspects.. BiophysJ. 82, 1158a. Annual meeting of the Biophysical Society, San Francisco.

38. -Tarahovskv Y.S. Rakhmanova'V.A., Epand:R-M., MacDonald. R.C. (2002) High temperature stabilization of DNA' in complexes with cationic lipids.Bfo/iA_>,ji.7.< 52,264. 273; ' ■ . •■■ •„, ■ 1 - ■■■_■ . •

39. Tarahovskv Y.S. Koynova R,, MacDonald R. (2003) Lost in labirinths of cubic phase. Restrictions on DNA release from lipoplexex. Biophys.J., 84, 508a. Annual meeting of the Biophysical Society, San Antonio.

Подписано в печать 18.09.2003 г. Формат 60 х 847|6.

Объем 2,25 п. л. Тираж 100 экз. Заказ 2811.

ГУП МО «Серпуховская типография» Министерство по делам печати и информации Московской области

Р 1 53 4 0