Модификация структуры биологических мембран α-токоферолом в широком диапазоне концентраций

Белов, Василий Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Модификация структуры биологических мембран α-токоферолом в широком диапазоне концентраций
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Модификация структуры биологических мембран α-токоферолом в широком диапазоне концентраций"

На правах рукописи

БЕЛОВ Василий Викторович

МОДИФИКАЦИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН а-ТОКОФЕРОЛОМ В ШИРОКОМ ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ

Специальность 03 00 02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 мам 2007

Мое <ва-2007

003059790

Работа выполнена в Институте биохимической физики им Н М Эмануэля Российской академии наук

Научный руководитель-

доктор биологических наук Пальмина Надежда Павловна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Гендель Леонид Яковлевич

дсктор физико-математических наук, профессор

Тихонов Александр Николаевич

Ведущая организация

Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится <¿0 » мая 2007 г в 11 часов на заседании Дисс ерта-ционного Совета Д 002 039 01 в Инстигуте биохимической физики им НМ Эмануэля РАН по адресу 119334, г Москва, ул Косыгина, 4

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им Н Н Семенова РАН

Автореферат разослан «•£?» апреля 2007 г

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 002 039 01 кандидат химических наук

М А Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одним из самых поразительных открытии последних двух десятилетии является обнаружение действия биологически активных веществ (BAD) - гормонов, пептидов, пестицидов, ядов, антноксндан-тов (АО) и других агентов, в сверхмалых дозах (СМД, <10"13 М) на живые системы различной степени сложности (от фермешов и мембран до целостных организмов и популяций) (Бурлакова, 1986, Ашмарин, 1992, Зайцев, 1993, Bonavida, 1991, Doultemepuich, 1991, Benvemste, 1988, Ямсков, 1999) Несмотря на лавинообразное увеличение количества фактов разнообразного характера о действий БАВ в СМД, механизм этого явления до конца не установлен Тем не менее, анализ имеющихся данных позволил выделить ряд общих особенностей, наблюдающихся при действии БАВ в СМД, которые оказались инварианшыми но отношению как к природе самого вещества и особенностям его метаболизма, так и к характеристикам его специфической мишени (Бурлакова, 1999, 2003) Среди них можно выделить следующие немонотонная, нелинейная но-лнмодальная зависимость "доза-эффект", изменение чувствительности бпообь-екта к действию разнообразных агентов, как эндогенных, так и экзо1енных, проявление различных кинетических парадоксов, зависимость "знака" эффекта от начальных характеристик объекта, "расслоение" свойств БАВ по мере уменьшения ею концентрации, при котором еще сохраняется активноеib, но исчезают побочные эффекты

Природа таких общих закономерностей действия БАВ в СМД может быть связана с общностью критических мишенеи На основании ряда работ (Пальмина, 1992, 2004, Мальцева, 1992, 2003, Жерновков, 2003, 2005, Поле-зина, 1999) можно полагать, что в качестве таких мишепен могут Bbiciyimib клеючные и субклеточные мембраны Именно в биологических мембранах локализованы важнейшие регулягорные системы, отвечающие за функционирование клетки и организма системы вторичных посредников и пероксидного окисления липидов (ПОЛ) (Владимиров, 1972, Бурлакова, 1967, Nishizuka, 1984), которые находятся в тесном взаимодействий и оказывают влияние друг на друга (Пальмина, 1992, 1995, 1999, Мальцева, 1998) Существенную роль в регуляции ПОЛ играют природные АО, среди которых одним из наиболее нз-весшых н эффективных является а-токоферол (а-ТФ) Этот АО принадлежит к группе витамина Е и является его наиболее физиологически активной формой (Machlin, 1984), недостаток которой в организме приводит к тяжелым биохимическим нарушениям (Pentyuk, 1989, Keaney, 1999) Благодаря своей липо-филыюсти и строению, а-ТФ сосредоточен в лшшдном бнелое мембраны и поэтому способен непосредственно влиять на ее структурные и динамические свойства (Quinn, 2004, Wassail, 1991), в частности, образуя домены с определенной стехиометрнен и фосфолипидным составом (Quinn, 1995), а также связываясь с продуктами гидролиза липидов, оказывающих детергентпо-подобное действие на мембрану (Kagan, 1989) При этом состав и структурно-динамическое состояние лииидного бислоя занимают центральное месю в це-

ни регуляции ПОЛ и являются одними из наиболее важных факторов для клеточного метаболизма Это во многом обусловлено тем, что изменение этих параметров влияет на активность и чувствительность мембранно-связанных и лнинд-зависнмых регуляторных белков, ферментов и рецепторов

До недавнею времени денсгвие а-ТФ как на химических, так и биологических моделях, исследовалось в интервале относительно высоких концентрации 106-10 3М Однако в последние годы появились биохимические исследования, в которых достоверно установлено влияние а-ТФ на ПОЛ (Пальмина, 2003, 2004) и на активность одного из ключевых ферментов фосфоинозитнд-ного цикла, являющегося одновременно пероксилипид-зависимым, протеин-киназы С (пк-С), в ультранизких концентрациях ( вплоть до 10"'® М) (Пальмина, 1994, 1999, МаИвеуа, 1998)

В связи с вышесказанным, изучение взаимодействия а-ТФ с различными регионами лнпидного бислоя биологических мембран, отличающихся но своим биохимическим и регуляторным свойствам, может приблизить нас к решению весьма актуального и важного вопроса о механизме действия БАВ в сверхнизких концентрациях

Цель данной работы заключалась в изучении влияния природного АО а-ТФ в широком диапазоне концентраций (104-1025 М) на структурные характеристики различных регионов линндного бислоя биологических мембран клеток печенн мышей т уШо

В качестве объектов исследования были выбраны а) мембраны эндо-плазматического ретнкулума (ЭР), которые являются традиционной моделью для исследования процессов ПОЛ н влияния на него антн- н нрооксидантов, б) плазматические мембраны (ПМ), в которых локализованы регуляторные системы вторичных посредников

Основными задачами исследования являлись

1 Исследование методом спиновых ЭПР-зондов влияния а-ТФ в интервале концентрации (Ю^-Ю'^М) на жесткость поверхностных (~8А) и микровязкость глубоколежащнх (~20А) областей лнпидного бислоя мембран ЭР и ПМ клеток печени мышеи при температуре 293 К Получение зависимостей доза-эффект

2 Изучение методом спиновых ЭПР-зондов влияния концентрации а-ТФ, соответствующих экстремумам на дозовых зависимостях и не влияющих на определяемые параметры, на термоиндуцнрованные структурные переходы в различных областях лнпидного бислоя, а также эффективную энергию их акшвацин в глубоколежащнх областях липидов мембран ЭР и ПМ

3 Конкретизация механизмов действия различных концентраций и-ТФ на исследуемые структурпо-диигшнческие параметры мембран ЭР и ПМ

4 Выяснение роли полярности растворителя а-ТФ в механизме действия ею так называемых «мнимых» концентрации (10"|8-1025 М) путем сравнительного изучения влияния а-ТФ, приготовленного в полярном (спирт-водные растворы) гг неполярном (вазелиновое масло) растворителях, на вязкостные

свойства глубоколежащих (~ 20 А) и поверхностных (~ 8 Á) областей ЭР ш viíro

5 Выяснение роли динамических характеристик воды в механизме полученных ранее эффектов «мнимых» (1018-1025 М) и сверхмалых (10 9-10 |8М) концентраций а-ТФ на структуру биологических мембран путем изучения различия на основе многомерного критерия Махаланобиса флуктуации показателен пропускания тонких слоев воды в 9 областях ИК-спектра 35003200, 3085-2832, 2120-1880, 1710-1610, 1600-1535, 1543-1425, 1430-1210, 1127-1057, 1067-963 см'1 в водно-спиртовых растворах а-ТФ в широком спектре концентраций (104— 1 О*"25 М) по сравнению с соответствующими спиртовыми растворами в бидистнллированнон деионизованнон воде, взятыми в качестве эталонов

Основные положения, выносимые на защиту

1 Действие а-ТФ в широком диапазоне концентраций (104-1025 М) при температуре 293 К на вязкостные характеристики различных по глубине регионов липидного бнслоя в мембранах ЭР и Г1М носит во многом аналогичный нелинейный, полимодальный характер, связанный с наличием статистически достоверных эффектов в трех областях концентраций «физиологических» - 10"4-10"9 М, СМД- 109-10-18 М и «мнимых» - Ю^-Ю"25 М

2 Основной вклад в механизм действия а-ТФ в каждой из грех области его концентраций вносят различные процессы

а в области традиционных «физиологических» концентрации (104-109 М) - ограничения при упаковке углеводородных цепей липпдоп вблизи молекулы а-ТФ за счет его неснецифичеекого встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами фосфолипндов, б в области СМД (109-1018 М) - специфического связывания а-ТФ с лигандамп на мембране (в частности, получена высокая корреляция изменения жесткости поверхностных областей лнпидов мембран ЭР и ПМ и степени ингнбированпя активности мембранно-связанного фермента ик-С (рецептора а-ТФ)), инициирования а-ТФ'ом образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) или модификации уже имеющихся, в в области «мнимых» концентрации (10 10"25 М) - изменения структурно-динамических характеристик воды, выступающей в роли полярного растворителя а-ТФ п среды окружающей мембраны

3 Концентрации а-ТФ, которым соответствовали максимумы на дозовых зависимостях, полученных при температуре 293 К, по сравнению с кошролем вызывают появление дополнительного термоиндуцпрованного структурного перехода в липидном бнслое в области физиологических температур 307-314 К (34-41 °С)

4 Полярность растворителя (воды) а-1Ф имеет принципиальное значение для эффекта его «мнимых» концентрации (10 |8-10"5 М)

5 В присутствии сверхмалон (1015 М) и «мнимон» (10'2° М) концентрации а-ТФ происходят значительные статистически достоверные изменения структурно-динамического состояния водной основы растворителя

Диссертационная работа выполнена в Институте биохимической физики им Н М Эмануэля РАН в соответспшн с планом научно-исследовательских работ Института в рамках программы фундаментальных исследовании Отделения химии и наук о материалах РАН «Бномолекулярная и медицинская химия»

Научная новизна. Впервые показано, что природный АО а-ТФ в широком диапазоне концентрации (10"4-10"25М), включающем сверхмалые (109-10 18 М) и даже так называемые «мнимые» концентрации (<10"' М), существенно модифицирует структурно-динамические параметры различных липидных ре-I ионов биологических мембран, выделенных из печени мышей При этом зависимость эффекта от дозы водимою вещества имеет нелинейны» полнмо-дальныи характер с максимумами в каждой из указанных областей и разделяющими их «мертвыми зонами», где эффект отсутствует

Впервые обнаружено, что а-ТФ в концентрациях, вызывающих максимальные изменения в параметрах микровязкости и упорядоченности липидной компоненты, индуцируе1 появление дополнительного термоиндуцированного структурного перехода липидов в области физиологических температур (307314 К, 34-41 °С)

Впервые установлено, что каждый из наблюдаемых максимумов на кривых доза-эффект обусловлен своим особым механизмом взаимодействия а-ТФ с биомембранами в области «физиологических» концентраций (10"4-107М) -ограничением при упаковке углеводородных цепей лнпндов вблизи молекулы а-ТФ за счет его неспецнфического встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами фосфолииидов, в области СМД (109-10|8М) -высокоэффективным специфическим взаимодействием со связывающими центрами на мембране (в частности, с пк-С), инициированием а-ТФ образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) пли модификацией уже имеющихся, в области «мнимых» концентраций а-ТФ (<1018 М) - опосредованным влиянием на мембрану через изменение структурно-динамических характеристик воды В связи с этим впервые экспериментально установлено, что именно полярные свойства растворителя (воды) играют основную роль в механизме действия «мнимых» концентрации БАВ вообще и а-ТФ в частности

Научно-практическое значение. Изменение структурно-динамических характеристик биологических мембран может быть использовано в качестве чувсгвтелыюй модели для скрининга БАВ, действующих в ультранизких кон-цен [рациях

Обнаружение эффекта а-ТФ в СМД на структурное состояние липидной компоненты биологических мембран, являющейся одним из важнейших нара-мефоп системы регуляции ПОЛ, весьма существенно для возможною еннже-

пня терапевтической дозы а-ТФ при использовании его для коррекции ряда заболеваний, сопровождающихся нарушениями или изменениями функционирования данной снс1емы

Личный вклад соискателя. Все результаты, предсшвленные в pa6oie, получены диссертантом лично, либо в соавторстве при его непосредственном участии в постановке н проведении экспериментов, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положении и выводов работы

Апробация работы. Материалы работы докладывались на ежеюдных молЬдежных конференциях ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2002, 2004, 2005), XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), VI и VII Международных конференциях «Биоанпш-оксидант» (Москва, 2002, 2006), III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), XLV1I Научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Москва-Долгопрудный, 2004), First Dijon International Workshop on Lipids "Recent Advances m Lipid Metabolism and Related Disoiders" (Dijon, France, 2005), 46-th International Conference on the Bioscience of Lipids (Ajaccio, Corsica, France, 2005), Всероссийской конференции молодых ученых н II школе им академика H M Эмануэля «Окисление, окислительный стресс, антиокшданты» (Москва, 2006), IV Международном Конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2006), 4lh Euro Fed Lipid Congress «Oils, Fats and Lipids Joi a Healthier Futwe» (Madrid, Spain, 2006)

Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 19 печатных работах (6 журнальных статьях и 13 1езисах докладов), и 2 статьи поданы в печать

Объел» и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, основных выводов и списка литературы Работа изложена на 193 страницах, иллюстрирована 4 схемами, 50 рисунками и 6 таблицами Бнблио! рафия включае1 список из 288 работ

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении обоснована актуальность и научная новизна предлагаемого исследования, приводятся цель и основные задачи работы, а также ее научно-прикладное значение

Перваи глава содержи i обзор современной литературы по теме данною исследования, в котором приводятся основные данные о структуре и номенклатуре витамина Е, транспорте а-ТФ в биологические мембраны и его локализации в них Подробно рассмотрены современные преде 1авлення о роли а-1Ф в обеспечении структурно-функциональной целостности мембран, как за счет его ангпокислительных способностей и участия в регуляции ПОЛ в мембране,

ion и путем непосредственного влияния на вязкостные характеристики липид-ного бнслоя прн встраивании в него и образования комплексов с веществами, оказывающими деструктивное действие на мембрану Большое внимание уделено также рассмотрению основных закономерносген действия БАВ в СМД и имеющимся на данный момент представлениям о механизмах таких сверхслабых взаимодепетвин, так или иначе объясняющих эти закономерности При этом отдельно обсуждается действие БАВ в СМД на клеючные и субклеточные мембраны

Обьекты, материалы н методы исследовании

Приводятся во в юрой главе диссертации. В качестве объектов изучения были взягы мембраны ЭР и ПМ, которые выделялись из клеток печени мышей линии F|(C57xDBA2) методом последовательного центрифугирования (Hostetlei, 1976, Loten, 1986). Содержание белка в мембранах определяли но методу JIoypii (Lowry, 1951) В результате содержание белка в мембранах ЭР составило 4 мг/мл, а в ПМ - 2,5 мг/мл Сиирто-водные (полярные) растворы а-ТФ были получены методом последовательного разведения в кварцевой посуде через один порядок по концентрации исходного 10"' М раствора а-ТФ спиртом высокой очистки фирмы "Merck" (Германия) до концентрации 103 М, а затем дистиллированно» водой Для приготовления неполярных растворов а-ТФ использовалось вазелиновое масло, которое является побочным продуктом перегонки нефти и представляет собой смесь минеральных масел с твердыми парафиновыми yi леводородами

Сфуктурное динамическое состояние мембран ЭР и ПМ изучалось на ЭПР-спектрометрах "Bruker 200D" и "Bruker ЕМХ" (Германия) методом спинового зонда (Кузнецов, 1976, Гриффит, 1979) В качестве зондов были взяты стабильные нигроксильные радикалы 5- и 16-докснлстеариновые кислоты (зонды С5 и С|б), локализующиеся на различных глубинах в липидном бислое (8 н 20 А, соответственно) (рис 1) Конечная концентрация зондов в мембранах не превышала 6*10 5М Спектральные характеристики зондов С5 и С|б (параметр упорядоченности S или 2Амтс, который пропорционален S, и время вращательнон корреляции тс) использовали в качестве формальных показателей жесткости поверхностных н микровязкости глубоколежащих областей мембраны при заданной температуре Термостатирование образцов в резонаторе спектрометра ЭПР осуществляли с помощью термопрнставки Bruker ER 4131 VT с точностью ±0,05 °С. Измерение параметров спектров ЭПР, входящих в формулы для S и тс (рис 1), осуществляли в автоматическом режиме с помощью оригинальных программ в вычислительной среде Origin 6 1с использованием стандартных алгоритмов поиска экстремумов при заданном шаге дискретизации 0,06 Гс Так, погрешность измерения расстояния между внутренним и внешними экстремумами в хорошо разрешенном cneKipe ЭПР зонда С5 составляла 0,2 Гс, а суммарная ошибка вычисления отдельных значений тс и S но экспериментальным спектрам ЭПР зондов Ci6 и С5, Полученным в резуль-1ате 3-х накоплений, не превышала 0,04 нсек и 0,002, соответственно

5-доксилстеаршювая кислота (зонд С5)

16-доксилстеаршювая кислота (зонд С if,)

S = 1,66

Л А-0 л

"лмкс мин

6,5 Дн0(

-1) 10~'°,сек

PIIL

Нсхолная за мороженная

1 Структурные формулы н спектры ЭПР зондов С; и С|6 в ПМ, иллюстрирующие методику расчета искомых параметров S (или 2АШКС) и тс

Схема, иллюстрирующая работу с образцами мембран, приведена на рнс

2, а на рнс 3 в качестве иллюы рации изображены типичные графики, описывающие изменение во времени параметров S и тс Средние контрольные значения тс в мембранах ЭР и ПМ составляли (1,50±0,03)нс и (1,71±0,03)нс, соответственно, н находились в диапазоне быстрых вращении радикала С|6 (Кузнецов, 1976) Среднее контрольное значение S в мембранах ЭР равнялось 0,61±0,01, а в ПМ - 0,64±0,01 И S, н тс по порядку величины совпадали с немногочисленными данными других авторов (Рууге, 1986, Curtis, 1984, Whetton, 1983, Гендель, 2002) Для каждой концентрации а-ТФ было произведено от 3 до 5 параллельных измерений на мембранах, выделенных независимо друг от друга в различные времена года, а эффект выражался в процентах по отношению к контролю

Проба 2

,1 мкл растворителя а ТФ Ком |роль \j Инкубация при

(Инкубация при «омнатноИ температуре комнатноП температуре 15 минут

+3,3 мкл роствора а ТФ

Инкубация при :ммературе 15 минут

комнатноП температуре I г |

\att

Рис 2 Методика экспериментов с мембранами при постоянной температуре

В качестве еще одной характеристик» изменении, происходящих в мембране, использовалось представление о термонндуцнрованных структурных перестронках («переходах») в липидиом бислое, которые отображались точками излома между линеаризованными участками температурных зависимости тс зонда С|й н S зонда С5, представленных в Аррениусовых координатах -Lgxc или -LgS or 1/Т (Chapman, 1975) (рнс 4) Точками излома считали те точки, добавление коюрых к спрямленному участку графика выводило коэффициент корреляции за пределы норм, определяемых числом степеней свободы н иагпсгнческои надежностью 95% Эффективная энергия активации перехода двычислялась на основе тангенса угла наклона спрямленного участка тем-nepaiypiion зависнмосш в Аррениусовых координатах (Slumtzky, 1976)

10 "Ма-!Ф

20 30 40 50 60 70 80 время (мин)

10 Мп-ТФ

9,10 905 900 ^ 895 га 890 8 85 880 875

65 75 85 В|)СМЯ (М1111 >

310 115 3 20 3 25 3 30 3,35 3,40 3 45 3,50 3 55 l/ICttf)

tga--b, C±E?*=2,3bR, где Л = 8,31 Джмоль 'К1

Рнс 3 Типичные графики, описывающие Рнс 4 Характерная температурная зависимость изменение во времен» параметров Б (для тс зонда С.|6 в Аррениусовых координатах на

10 16 М а-ТФ) н хе (для 107 М) в ПМ

примере действия контрольной пробы

Для измерения флуктуации показателей пропускания тонких слоев водных растворов в девяш диапазонах ИК-спектра 3500-3200, 3085-2832, 21201880, 1710-1610, 1600-1535, 1543-1425, 1430-1210, 1127-1057, 1067-963 см1 использовался новый тип ИК-спектромегра - аппаратно-программный комплекс ИКАР, разработанный на кафедре общей и биоорганической химии ТГМА Усфонспад снектромегра позволяло повторять измерения в каждой полосе через 0,1 с Для каждой пробы делалось 50 измерений в кюветах из КЯ8-стекол с 10ЛЩШЮИ водного слоя 20 мкм Эксперимент повторяли 3 раза Анализируемые образцы готовились непосредственно перед снятием показателен пропускания В качеств формальной характеристики и целостного показателя изменении сосюяння воды в присутствии различных количеств а-ТФ использовался критерии Махаланобиса, позволяющий учесть корреляционные связи

между инфракрасными показателями эталона н образца и являющийся весьма чувствительным к дисперсиям показателей пропускания

Статистическая обработка данных осуществлялась методами параметрической н непараметрической статистики с использованием пакетов компьютерных программ Microsoft® Office Excel н Origin® 6 1 при статистической надежности 95%

Результаты исследовании н их обсуждение

Приводятся в третьей главе диссертации

Влияние а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10~4-10~2S M) на вязкостные характеристики различных по глубине регионов мембран ЭР и ПМ при постоянной температуре 293 К.

Известно, что функциональное состояние биологических мембран зависит от их текучести, которая меняется в зависимости от глубины погружения в липндный бислой Следовательно, характер воздействия БАВ на вязкостные характеристики мембраны может отличаться в различных но глубине областях лнпидного бнслоя Кроме того, биологические мембраны являются важным объектом исследования действия БАВ в СМД, поскольку предполагается, что они при этом могут выступать в роли критических мишеней Поэшму представляло интерес изучить m vitio влияние различных концентраций а-1Ф, в том числе и сверхмалых, на вязкостные характерношки различных pei ионов липидов мембран ЭР и ПМ, имеющих биохимические и функциональные отличия Мембраны ЭР являются распространенным объектом изучения процессов Г10Л и антиокислительных свойств БАВ, а ПМ интересны с точки зрения взаимодействия различных регуляторных систем, таких как ПОЛ и циклов вторичных посредников Нами установлено, что зависимости эффектов а-ТФ от его концентрации в широком диапазоне (10 4-10 25 М) на мнкровязкос1ь i лубо-колежащнх (рнс.5а) и жесткость поверхностных (рис.5б) областей мембран ЭР и ПМ при температуре 293 К имеют в значительной степени аналошчныи нелинейный, полимодапьный характер, типичный для действия БАВ в широком диапазоне концентраций, включающем СМД Полимодальность дозовых зависимостей связана с наличием достоверных изменении в трех областях концентраций области «физиологических» концентрации а-ТФ (104-10 9 М), в которых он обычно действует в организме, его СМД (109-10*18 М) н даже «мнимых» концентрации (10"'8-10 25 М), при которых вероятность нахождения хотя бы одной молекулы а-ТФ в мембранной суспензии близка к нулю Необходимо отметить при этом, что значения эффектов в каждой из приведенных обллсюп вполне сравнимы между собой по величине Максимумы и минимумы разделены так называемыми «молчащими» или «мертвыми» зонами, где эффект н-ТФ на исследуемые структурно-динамические характеристики мембран отсутствовал Таким образом, а-ТФ но характеру своего воздеисгвня на мем-

браны можег быть отнесен к тину БАВ, проявляющих эффект в ультраннзких концентрациях (< 10 13 М)

Рис 5 Концентрационные зависимости эффектов а-ТФ на микровязкость глубоколежащих (~20А, а) н жесткость поверхностных (~8А, б) областей лннндного бнслоя мембран ЭР и ПМ при температуре 293 К

Влияние отдельных концентраций а-ТФ на шермоиндуцированные структурные переходы в различных по глубине регионах линидного бнслоя, а также эффективную энергию активации переходов в глубоколежащих областях липидов мембран ЭР и ПМ

Биологические мембранные структуры являются гетерогенными системами, характеризующимися наличием субмезофаз, поэтому помимо изменении вязкостных характеристик мембраны прн постоянной температуре очень важными параметрами, описывающими происходящие изменения в струк1уре ее лннндного бислоя, являются количество и качество гермоиндуцированных структурных переходов в нем, а также эффективная энергия их активации Д£„'^в глубоколежащих областях лнпидов Поэтому на очередном этапе для концентрации а-ТФ, соответствующих экстремумам и «мертвым зонам» на до-зовых зависимостях на рнс 5, в обоих типах мембран были изучены температурные зависимости параметра упорядоченности Б (характеристики жесткости поверхностных областей линндов) и времени вращательной корреляции тс (характеристики микровязкости глубоколежащих областей липидов) в диапазоне 285-319 К Для выявления термоиндуцировапных структурных переходов липидов (габл 1 и 2) и определения эффективной энергии их активации полученные кривые были преде швлены в Аррениусовых координатах или -

Рис 6 Температурные зависимости тс в диапазоне 285-320 К в контроле и при денствнп различных концентраций а-ТФ ш уШо в мембранах ЭР

1л1*103 (к1) l/tmo^k1)

Рис 7 Темперагурпые зависимости Э в диапазоне 285-319 К в контроле и при действии различных концентрации а-ТФ ш \чио в мембранах ЭР

Рис 8 Температурные зависимости тс в диапазоне 285-319 К в контроле и при действий различных концентрации а-ТФ in vilio в Г1М

Рис 9 Температурные зависимости S в диапазоне 285-319 К в контроле и при действий различных концентрации а-ТФ т vid о в ПМ

Как ппдно из данных табл 1-2, те концентрации а-ТФ, которые соответствуют максимумам и минимумам на дозовых кривых на рнс 5, в обоих типах мембран вызывают появление дополнительных (а в глубоколежащих областях лпиидов микросом также более высококооперативных с пониженной А) по сравнению с кошролем термонпдуцированных структурных переходов лнпид-ного бнслоя, чю может быть связано, по нашему мнению, с образованием мик-

родоменных структур в мембране. Важно отметить, что большинство таких дополнительных перестроек в лнпндном бнслое (в табл. ! и 2 - заштрихованы) обнаруживайся в области физиологических температур 307-314 К (34-41°С). Учитывая большое значение в жизнедеятельности клет ки (в изменении проницаемости мембраны, образовании пор, слиянии мембран, возбудимости нервных тканей и проведении нервного импульса по аксону, терморегуляции, сн-нагггнческом экзоцитозе и т.д.) фазовых переходов в ли пи д ах биологических мембран (Антонов, 1992, Харвкоз, 2001), этог факт может иметь важное рег у-ляторное значение при действии не только «физиологических», но п сверхнизких и даже «мнимых» концентраций а-ТФ.

Табл. 1 г 1!1II11 /'Ч: 11 я я термом цдуцирищнтых с1 р у г-: I урмых перекидав и Ц|фск питая энергия мх активации (кДж/моль) п глуби кол ежащих областях (—20 А) лкшшиого бнелоя мембран ЭР (Л) и ИМ (Б) и КОШроле н при действии различ.....х концентрации «-ТФ т VIIго.

кашрцль.

коиiроль

Л Б

Табл. 2. Положения терниииду цнрова!¡ных структурных переходов в поверхностных об-лнстях (~кЛ) ЛШШДИ01 о Енслоя мембран ЭГ (к) и ИМ (íí) п контроле и при действии различных концентраций «-ТФ m vfírai

Ноии'тные .ncxaitu шы deüciiteuii а-ТФ на структуру микрасамаяышх и плазматических мембран в трех областях концентраций

Представленный экспериментальный материал позволяем чакшчичь, что для обоих типов используемых мембран обнаруживаются одинаковые особенности действия различных концентраций а-ТФ на структуру их лншщного бнслоя, ключом для понимания которых Могут являться общие механизмы наблюдаемых эффектов. При этЬм в зависимости от концентрации w-ТФ преобладающий вклад могут давать различные процессы, чем и обусловлен, по-видимому, пол н модальны и характер зависимостей доза-эффект (рис. 5), одинаковый дня мембран 31* и ИМ.

Неспецифическое ¿страивание а-ТФ в мембрану как механизм его действия а «физиологических» концентрациях (10Г—10~9 М)

Упорядочивание поверхностиьи*. и глубоколежащих областей лтшдиото бнслоя микросомальиых и плазматических мембран при введении н них а-ТФ в «ф изнологич ее к их» концентрациях (10-10"* М) обусловлено, прежде всего, ограничениями при упаковке углеводородных цепей липндов вблизи молекулы а-ТФ, что снижает их конформациоиную подвижность, lío многом эти процессы могут бы ть связаны с взаимодействием «-ТФ с молекулами фоефолнипдов, приводящим к образованию комплексов с определенной стехиометрией (GoiHeZfFemaíKlez, 1989). Их распределение в плоское!« мембраны может иметь произвольный характер, а также они могут образовывать домены н пы-зывать фазовое разделение, что проявляется в виде дополнительных термо-нндуинровшшмх структурных переходов в различных областях лииидного

бислоя микросомальных и плазматических мембран печени (табл 1 н 2) Увеличение вязкости или снижение текучести мембраны при встраивании в нее а-ТФ в «физиологических» концентрациях было не раз показано различными физическими методами в опытах на бноло1 нческнх и модельных мембранах, в том числе п методом спиновых зондов ЭПР (Wassail, 1991), и наши данные согласуются с их результатами

Специфическое взаимодействие а-ТФ со связывающими центрами па мембране и инициирование образования микродомеииых структур в пей в качестве возможных механизмов действия а-ТФ в СМД (Iff -10 М)

Одним нз возможных объяснении эффектов СМД а-ТФ (109-10'18 М) на вязкостные свойства поверхностных и глубоколежащнх областей микросомальных и плазматических мембран может являться его специфичное, высокоэффективное взаимодействие со связывающими центрами на мембране, изменяющее их конформационное состояние В качестве такого связывающею центра в данном случае мы предполагаем поверхностный мембранно-связан-ный фермент пк-С, поскольку ранее в работах Мальцевой EJI и соавторов (Пальмнна, 1994) показано ингнбирование его активности а-ТФ в СМД В пользу высказанного предположения говорит н высокая cieneiib корреляции, полученная при сопоставлении этих данных с изменением жесткости поверхностных областей, как микросомальных (Р<0,0001, т=0,95, рис 10а), так и плазматических (Р=0,0047, г=0,87, рнс 106) мембран В этой связи стоит отметить, что содержание активной формы пк-С в микросомальных мембранах печени значительно ниже, чем в плазматических, при этом и эффект а-ТФ в СМД на вязкостные характеристики поверхностных областей мнкросом в 3 раза меньше по величине, чем в плазматических мембранах (рнс 56) По-видимому, индуцированные в области локализации зонда С5 изменения, затем передаются в глубоколежащие области липидов мембран, что проявляется в виде максимумов в интервале концентраций 10"-10 |6М на рнс 5а

-1.К|а-юкофе[Н>л| "*" S -Lg[a-loKui|>epoj|| S

Рис 10 Изменение жесткости поверхностных областей мембран ЭР (а) и ПМ (б) и пнгнбп-рованне активности пк-С ш vitio в зависимости от концентрации а-ТФ

Другим вероятным объяснением упорядочивания лшшдного бнслоя мембран ЭР и ПМ при действии а-ТФ в СМД, по нашему мнению, может являться инициирование им образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране или модификация уже имеющихся В ПМ в их роли могут выступать рафты, которые представляют собой особые области в мембране, значительно более упорядоченные по сравнению со своим микроокружением Высказанное предположение основывается на юм, что многие белки, участвующие в передаче сигналов в клетке, способны локализоваться в рафтах, в том числе и пк-С (Pike, 2003) Время жизни таких комплексов невелико (меньше 1 мс), однако действие внещних сигналов (в роли которых могут выступать лнганды), вызывающих конформацнонные изменения в белковых молекулах, может ею значительно увеличить (вплоть до нескольких минут) и, кроме того, привести к объединению отдельных рафтов в более крупный домен Поэтому мы предполагаем, что подобные процессы сопровождают взаимодействие а-ТФ в СМД с пк-С в процессе ингибирования ее активности

Присутствие а-ТФ в мембране, как в «физиологических», так и в сверхнизких концентрациях может влиять и на сам процесс формирования рафтов Так, в качестве одною из механизмов их образования в литературе рассматривается пространственная несовместимость в жидко-кристаллнческон фазе между твердой стеролыюн структурой молекулы холестерина и жестким изгибом ненасыщенной углеводородной цепи соседней молекулы фософлипнда, имеющей i/1/с-двонную связь в положении С9-С10 (Subczynski, 2003) Такая затруд-HeiHiocib во взаимной упаковке молекул приводит к выталкиванию холестерина из областей с ненасыщенными фосфлипндами, с носледующен его концентрацией и стабилизацией в областях с преимущественно насыщенным характером жирнокнслотных цепей фосфолипидов В этой связи стоит отметить, что а-ТФ, в свою очередь, с большим предпочтением взаимодействует с нолпненасыщеннымн фосфолнпидамн, способствуя, таким образом, вытеснению холестерина и облегчая образование рафтов при действии а-ТФ как в «физиологических» концентрациях, так и в СМД

Предложенные механизмы с участием рафтов могут быть рассмотрены с определенной долен вероятности и в микросомах печени, если принять во внимание, что существуют работы, в которых высказываются обоснованные предположения об их существовании там (Muniz, 2001, Mayor, 1998)

Роль полярных свойств растворителя (воды) в механизме действия «мнимых» концентраций а-ТФ (10 "-10'2S М)

В диапазоне «мнимых» концентраций а-ТФ (10| 8-10 25 М) вероятность нахождения хотя бы одной его молекулы в мембранной суспензии близка к нулю В связи с этим для объяснения механизмов действия а-ТФ в этой области, но нашему мнению, имеет смысл обратиться к свойствам растворителя Для выяснения, насколько важна при этом его полярность, мы провели сравнительное изучение действия а-ТФ, приготовленного в полярном (спирт-водные растворы) и неполярном (вазелиновое масло) растворителях, на вязкое-

-Lg|ain,фа-токоферол]

Й*

L 2 Л ' 1 / V \ '■/Xl,

/ i л. i. 1 XSJ

тные свойства глубоколежащих (-20Â) п поверхностных (~8А) обласген мембран ЭР m viti о В результате для обоих растворителе!i были получены полимодальные дозовые зависимости, имеющие фазовый характер, противоположный в глубоколежащих (рис 11а) и поверхностных (рис 116) областях лииидного бислоя Эффекты, не превышающие по величине 2%, для зонда Cíe приняю считать находящимися в пределах ошибки метода (заштрихованная обласгьна рис 11 я).

Оказалось, что если в областях «физиологических» М) н сверхмалых М) концентрации статистически достоверными (р<0 05) эффектами обладают растворы а-ТФ в обоих растворителях, то в области

(Ю^-Ю9 (10-1018

(10'МО25 М)

б ^[альфл-токоферол]

Рис 11 Действие а-ТФ в полярном (/) и неполярном (2) растворителях на мнкровязкость глубоколежащих (а) и жесткость поверхностных областей (б) мембран ЭР при температуре 293 К

10 12 14 16 18 20 22 24 26

«МНИМЫХ»

концентрации достоверный эффект на вязкостные свойства поверхностных и глубоколежащих областей лнин-дов имеют только растворы а-ТФ в полярном растворителе, в данном случае водном, что говорит о существенной роли полярности растворителя в механизме передачи «информации» о веществе в том или ином виде в процессе приготовления растворов Полярные свойства воды связывают, прежде всего, со способностью ее молекул образовывать водородные связи друг с другом, что приводит в п тоге к формированию короткоживущих водных ассоциатов (кластеров) небольшого размера (8аука11у, 1993, Ьш, 1996) Мы предположили, что их динамические характеристики (например, параметры флукгуацпй, а также взаимодействия между ними) могут играть особую роль в процессе хранения и передачи информации о веществе, причем изменение их будет сказываться на целостной динамической структуре полярной среды В качестве показателей, характеризующих с! рук гуру н динамику, а, следовательно, состояние воды в определенных ус-

ловиях н при различных воздействиях, в час пики и БАВ, могут использовался флуктуации показателей пропускания воды в ИК-обласш спектра (Фесенко, 1999, Каргаполов, 2006)

В связи с вышесказанным с целью выяснения роли динамических харак-1ернстик воды в механизме полученных нами ранее эффектов «мнимых» и сверхмалых концентраций а-ТФ на структуру биологических мембран мы совместно с сотрудниками кафедры общей н биоорганической химии Тверской государственной медицинской академии изучили различие флуктуации показателен пропускания тонких слоев воды (20 мкм) в девяти диапазонах ИК-снектра 3500-3200, 3085-2832, 2120-1880, 1710-1610, 1600-1535, 1543-1425, 1430-1210, 1127-1057, 1067-963 см"1 в водно-спиртовых растворах а-ТФ в широком спектре концентраций (10 4—1025 М) по сравнению с соответствующими спиртовыми растворами в бидистнллированной денонизованнои воде, взятыми в качестве эталонов В качестве формальной характеристики изменений структурно-динамическою состояния воды при отсутствии и в присутствии различных количеств а-ТФ использовался многомерный дискриминантный анализ на основе критерия Махаланобиса, который учитывает корреляции н дисперсии инфракрасных показателей эталона и образца, что позволило использовать его в качестве целостного показателя

В результате изучения влияния различных концентрации а-ТФ (10"4- 10"

25 М) на структурное динамическое состояние водного растворителя, оцененное по критерию Махаланобиса, была получена по-лпмодальная дозовая зависимость (рис 12) с наибольшими отклонениями при действии а-ТФ в СМД 10"15 и «мнимой» концентрации Ю"20 М. Дальнейший анализ позволил выявить две узкие области ИК-спектра (2120-1880 см 1 и 1710-1610 см-1), в которых а-ТФ не поглощает, соответствующие дефор-оценешюе по критерию Махаланобиса Процентная точка мационным 11 Деформации-распределения составляет 16,9 (Р=95%,/=9) онно-либрацнонным колебаниям молекулы воды, в которых дисперсии показателей пропускания 10 15 (рис 13) и Ю20М (рис 14) растворов а-ТФ но отношению к эталону и 10 9 М раствору были гораздо выше, чем п остальной области спектра

-{^[токоферол]

Рис 12 Влияние различных концентраций а-ТФ (10 4-10 25 М) на структурное состояние водного растворителя,

Номер канала

—I оо О

Номер канала

О г

Заключение

Приведено в четвертой ишве диссертации, где кратко суммированы основные результаты предлагаемо! о исследования

В данной работе изучалось действие природного ангиокснданга а-ТФ в широком диапазоне концентрации (104-102 М) на структуру различных по глубине обласгеи биологических мембран с целью понимания общих механизмов действия БАВ в СМД, поскольку предполагается, что н роли критических мншенеи при такого рода взаимодействиях могут выступать клеточные и субклеточные мембраны Именно в них сосредоточены важнейшие регуля-юрные системы клетки - ПОЛ и циклы вторичных посредников, - эффективная работа которых во многом определяется структурно-динамическим состоянием мембран, зависящим от глубины погружения в лнпндный бислой

В качестве объектов исследования были выбраны мембраны ЭР и ПМ, имеющие различные лнпндный состав и функциональные особенности Мембраны ЭР являются распространенным объектом изучения процессов ПОЛ и антпокнслнтельных свопств БАВ, а ПМ интересны с точки зрения взаимодействия различных регуляторных систем, таких как ПОЛ и циклы вторичных посредников Несмотря на имеющиеся биохимические и функциональные отличия для обонх типов мембран обнаружены одинаковые особенности влияния а-ТФ па их структурно-динамическое состояние В частности, зависимости изменений жесткости поверхностных (~8А) и мнкровязкостн глубоколежащих (~20А) областей липндного бислоя от концентрации вводимого а-ТФ при температуре 293 К в обоих типах мембран имеют в значительной степени аналогичный немонотонный, нолимодальныи характер, связанный с наличием эффектов в трех областях доз области «физиологических» концентраций а-ТФ (10 4— 10 9 М), в которых он обычно действует в организме, его СМД (10"9-10"18 М) и даже «мнимых» концентрации (10 1 -10"25 М), при которых вероятность нахождения хотя бы одной молекулы а-ТФ в мембранной суспензии близка к нулю При изучении температурных зависимостей характеристик микровяЗкости глубоколежащих и жесткости поверхностных областей липндов как мнк-росомальных, так и плазматических мембран оказалось, что концентрации а-ТФ, соответствующие максимумам и минимумам на дозовых кривых, вызывают появление дополнительных (а в глубоколежащих областях липидов мик-росом также более высококооперативных) по сравнению с контролем термо-иидуцнрованных структурных переходов липндного бислоя, большинство ко-юрых обнаруживается в области физиологических температур 307-314 К (3441 °С) Учитывая большое значение в жизнедеятельности клетки фазовых переходов в липидах биологических мембран, этот факт может иметь важное ре-¡уляторное значение при действии не только «физиологических», но и сверхнизких и даже «мнимых» концентраций а-ТФ Объяснение таким общим закономерное 1ям, по-видимому, кроется в общих для обоих типов мембран механизмах наблюдаемых эффектов, зависящих от области действующих концентрации а-ТФ В области «физиоло! ических» концентраций а-ТФ (Ю^-Ю-9 М)

наибольшее значение имеют ограничения при упаковке углеводородных цепей лигшдов вблизи молекулы а-ТФ за счет его неспецнфнческого встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами фосфолипндов с образованием комплексов с определенной стехиометрией, способствующих фазовому разделению в мембране В области СМД а-1Ф (10 9-10 18 М) на первый план выступает специфическое взаимодействие его молекул со связывающими центрами па поверхности мембраны (в частности, получена высокая корреляция изменения жесткости поверхностных областей липидов мембран ЭР и ГШ и степени ингнбирования активности мембрано-связанного фермента пк-С (рецептора а-ТФ)), либо инициирования а-ТФ'ом образования новых высокоупо-рядоченных мнкродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) пли модификации уже имеющихся В области «мнимых» концентрации а-ТФ (10 18-10" 5М), как нами впервые было экспериментально показано, основную роль ■и рает полярность растворителя а-ТФ, в данном случае воды Полярные свойства воды связывают, прежде всего, со способностью ее молекул образовывать водородные связи друг с другом, что приводит в итоге к формированию Kopoi-кожнвущих водных ассоцнатов (кластеров) небольшого размера Как нами в дальнейшем было показано, в присутствии сверхмалон 10"'5 М и «мнимой» 10 20 М концентрации а-ТФ происходят значительные изменения структурно-дннамического состояния водной основы растворов Таким образом, судя по полученным нами результатам, с большой долей уверенности можно утверждать, что ведущую роль в процессах хранения и передачи «информации» о растворенном веществе, лежащих в основе механизма действия СМД и в первую очередь «мнимых» концентраций БАВ вообще и а-ТФ в частности, играют структурно-динамические характеристики воды, а сама вода представляет собой не только некую среду, в которой могут находиться молекулы действующего вещества, но и являе1ся активным участником происходящих в ней процессов взаимодействия на пуш БАВ к своей мишепн Учитывая, что живые организмы состоят в основном из воды (по массе), полученные в данной работе сведения могут существенно дополнить имеющиеся представления о механизмах функционирования многих БАВ in vivo

ВЫВОДЫ

1 Изучено действие природного АО а-1Ф в широком диапазоне концентрации (10"М0"И М) на структурные характеристики мембран ЭР и ИМ клеюк печени мышей »i vitio Установлено, что для мембран ЭР и ПМ, несмофя на их биохимические и функциональные отличия, характерны полимодальпые дозовые зависимости эффектов а-ТФ на жесткость поверхностных (~8 А) и мнкровязкость глубоколежащих (-20 А) областей линидного бнслоя, имеющие во многом аналогичный характер и типичные для БАВ, проявляющих активность в широком диапазоне концентрации, включающем СМД

2 Показано, чю полнмодальность полученных дозовых зависимостей связана с наличием статистически достоверных эффектов а-ТФ в трех областях концентраций, каждый из которых обусловлен преобладающим вкладом одного из возможных механизмов действия а-ТФ А именно

а) в обласш традиционных «физиологических» концентраций (104— 109 М) - ограничения при упаковке углеводородных цепей липндов вблизи молекулы а-ТФ за счет его неспецифического встраивания в мембрану н взаимодействия с окружающими молекулами фосфолипидов,

б) в области СМД (10 9-1018 М) - специфического связывания а-ТФ с лн-гандами на мембране (в частности, получена высокая корреляция изменения жесткости поверхностных областей липидов мембран ЭР и Г1М и степени ингнбирования активности мембранно-связанною фермента нк-С (рецептора а-ТФ)), инициирования а-ТФ'ом образования новых высокоунорядоченных микродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) или модификации уже имеющихся,

в) в области «мнимых» концентраций (10 |8—10"25 М) — изменения структурно-динамических характеристик воды, выступающей в роли полярно! о растворителя а-ТФ и среды, окружающей мембраны

3 Изучены температурные зависимости вязкостных характеристик различных по глубине областей липидов и обнаружено, что те концентрации а-ТФ, в том числе и СМД, которым соответствовали максимумы на дозовых зависимостях при температуре 293 К, по сравнению с контролем вызывают появление дополнительного термонндуцнрованного структурного перехода в лшшдиом бислое в области физиологических температур 307-314 К (34-41 "С)

4 Установлена принципиальная роль полярности растворителя (воды) а-ТФ в механизме действия его «мнимых» концентраций (10"' -10 25 М) путем сравнительного изучения эффектов полярных (снирто-водных) и неполярных (в вазелиновом масле) растворов а-ТФ в широком диапазоне концентрации (104-10 25 М) на вязкостные характеристики различных регионов мембран ЭР

5 С помощью нового типа ИК-сиектрометра - аппаратно-программного комплекса ИКАР - на основе критерия Махаланобиса обнаружены значительные изменения в структурном динамическом состоянии водного растворителя при введении как «мнимой» (1020 М), так и СМД (1015 М) а-ТФ, в окрестностях коюрых ранее наблюдались изменения структурных характеристик микросомальных и плазматических мембран,

6 Выявлены две узкие области в ИК-спектре, в которых дисперсии показателей пропускания 10 15 М и 10"20М растворов а-ТФ по отношению к эталону н 10 9М раствору были гораздо выше, чем в остальной области спектра

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. В В Белов, ЕЛ Мальцева, II П. Пальмина Влияние а-токоферола в широком спектре концентрации на структурные характеристики мембран эндо-нлазматического ретикулума клеток печени мышей in vitio // Радиационная биология Радиоэкология 2003 Т 43 №3 С 306-309

2. В В Белов, Е Л Мальцева, Н П Пальмина, Е Б Бурлакова Роль полярности растворителя в механизме действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах//Доклады Академии Наук 2004 Т 399 №4 С 1-3

3 Н П Пальмина, Л В Кледова, Т В Панкова, Е Л Мальцева, В В Белов, В Е Жерновков Действие биологически активных веществ в сверхнизких концентрациях на физико-химические свонства мембран in vitro // Вопросы биохимической, медицинской и фармакологической химии 2004 №4 С 3137

4 N Р Palmina, V V. Belov, Е L Maltseva Modification of microsomal lipid domains by a-tocopherol in a wide concentration range in vitro // Chem Pliys Lipids 2005 V 136 №2 P 141-142

5 В В Белов, ЕЛ Мальцева, Н П Пальмнна Действие а-токоферола в широком спектре концентраций на структуру микросомальных мембран // Биофизика 2007 Т 52 вып 1 С 75-83

6 V V Belov, Е L Mal'tseva, N Р Pal'mina, Е В Burlakova The role of solvent polarity in the mechanism of action of biologically active compounds at ultra low concentrations // In «New Aspects of Biochemical Physics» Ed S D Var-folomeev, E В Burlakova, A.A Popov, О E Zaikov Nova Science Publisheis, New York 2007 P 11-18

7 В В Белов, E Л Мальцева, Н П Пальмнна Влияние а-токоферола в широком спектре концентраций на структурные характеристики гидрофобных областей лнпидного бислоя мембран эндоплазматнческого ретикулума клеток печени мышей m vitro // Тезисы докл II Ежегодной молодежной конференции ИБХФ РАИ-ВУЗЫ «Биохимическая физика», 13-14 июня 2002г, Москва, с 26-27

8 В В Белов, Е Л Мальцева, II П Пальмина Влияние а-токоферола в широком спектре концентраций на структурные характеристики гидрофобных областей лнпидного бнслоя мембран эндоплазматнческого ретикулума клеток печени мышей in vitro // Тезисы докл XIV зимнен международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии u биотехнологии», 11-15 февраля 2002г, Москва, с 70-71

9 В В Белов, Е Л Мальцева, Н П Пальмина Влияние а-токоферола в широком cneKipe концентрации на структурные характеристики гидрофобных областей лнпидного бислоя мембран эндоилазматическою ретикулума клеток печени мышей in vitro // Тезисы докл VI Международной конференции «Биоантиоксидант», 16-19 апреля 2002г, Москва, с 658-659

10 В В Белов, ЕЛ Мальцева, Н П Пальмина Влияние а-токоферола в широком спектре концентраций на структурные характеристики лппидною бис-

лоя мембран эндоилазматического регнкулума клеток печени мышей in vitro // Тезисы докл III Международного симпозиума «Механизмы действия сверхмалых доз», З-б декабря 2002г, Москва, с 7

11 В В Белов, EJI Мальцева, II П Пальмнна Роль полярности растворителя в обеспечении эффекта сверхмалых доз биоло! ически активных веществ // Тезисы докл III Съезда биофизиков России, 24-29 шоня 2004г, Воронеж, с 620-621

12 В В Белов, Е JI Мальцева, Н П Пальмнна Роль полярности растворителя в проявлении эффекта сверхмалых доз биологически активных веществ // Труды IV молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика», 25-26 октября 2004г, Москва, с 24-25

13 В В Белов, EJI Мальцева, Н П Пальмнна Влияние полярности растворителя на действие биологически активных веществ в сверхмалых дозах // Тезисы докл XLVII Научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», 26-27 ноября 2004i , Москва-Долгопрудный, с 4

14 VV Belov, EL Mal'tseva, N Р Pal'mina The effect of a-tocopherol in a wide range of concentiations on the structure of microsomal membranes // Abstract book of First Dijon International Woikshop on Lipids "Recent Advances in Lipid Metabolism and Related Disoidets", June 21-241'1, 2005, Dijon, France, p 50

15 В В. Белов, EJI Мальцева, НП Пальмнна Модификация структуры плазма шческнх мембран печени под действием а-токоферола in vitro // Труды V Международной молодежной конференции ИБХФ РАН - ВУЗЫ «Биохимическая физика», 14-16 декабря 2005г, Москва, с 22-30

16 В В Белов, EJI Мальцева, IIП Пальмнна Природный антноксндант а-токоферол - модификатор плазматических мембран печени в широком спектре концентрации // Тезисы докл Всероссийской конференции молодых ученых и II школы им академика IIМ Эмануэля «Окисление, окислительный стресс, аитиоксиданты», 1-3 нюня 2006 г , Москва, с 162-164

17 Белов В В , Рощина И А , Шматов Г П , Зубарева Г М , Пальмнна Н П Роль динамических характеристик воды в механизме действия а-токоферола в сверхмалых дозах // Тезисы докл IV Международно! о Конгресса «Слабые и сверхслабые ноля и излучения в биологии и медицине», 3-7 июля 2006г., CaiiKi-Пегербург, с 223

18 NP Pal'mina, V V Belov, Е L Maltseva Modification of lipid domains in liver plasmatic membranes by a-tocopherol in a wide concentration range m vitro II Abstiact book of the 4lh Euro Fed Lipid Congress «Oils, Fats and Lipids for a I leal tin ei Futwe», 1-4 October 2006, Madrid, Spain, p 209

19 В В Белов, EJI Мальцева, НП Пальмнна Природный антноксндант а-юкоферол-модификатор плазматических мембран печени в широком спектре концентрации // Тезисы докл VII Международной конференции «Био-антиоксидапт», 25-26 октября 2006г, Москва, сгр 73-74

Л V

Подписано в печать О Ч 2007 г Формат 60x84/16 Заказ № г& Тмраж^оо экз. П л Отпечатано в Редакционно-издательской и информационной службе Физического института им П Н Лебедева РАН с оригинап-макега заказчика, 119991 Москва, Ленинский проспект, 53. Тел 13251 28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белов, Василий Викторович

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. а-Токоферол (а-ТФ) и особенности его действия.

1.1.1. Структура, номенклатура, транспорт и локализация витамина Е.

1.1.2. Функции а-ТФ.

1.1.2.1. Антиоксидантная роль токоферолов.

1.1.2.1.1. Антиокислительные способности а-ТФ.

1.1.2.1.2. Участие а-ТФ в регуляция пероксидного окисления липидов в биологических мембранах.

1.1.2.2. Структурные и динамические особенности мембран и модификация их а-ТФ.

1.2. Действие биологически активных веществ в сверхмалых дозах - новая область исследований.

1.2.1. Общие закономерности действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах и существующие теории, объясняющие их.

1.2.1.1. Роль специфических (рецепторных) взаимодействий в механизме действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах.

1.2.1.2. Особенности структуры жидкой воды и их роль в механизме действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах.

1.2.2. Действие биологически активных веществ в сверхмалых дозах на биологические мембраны.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Методика приготовления растворов а-ТФ в спирте и вазелиновом масле.

2.2. Выделение мембран эндоплазматического ретикулума и плазматических мембран из клеток печени мышей.

2.3. Определение концентрации белка в мембранах.

2.4. Применение метода спинового зонда для изучения структурно-динамического состояния микросомальных и плазматических мембран.

2.4.1. Измерение вязкостных характеристик различных областей липидного бислоя мембран.

2.4.2. Определение термоиндуцированных структурных переходов в липидном бислое мембран и расчет эффективной энергии их активации.

2.5. Статистическая обработка данных.

2.5.1. Интервальные оценки распределения средних показателей.

2.5.2. Сравнение двух средних показателей.

2.5.2.1. /-Тест или /-критерий Стьюдента (параметрический критерий).

2.5.2.2. Критерий Уилкоксона (непараметрический критерий).

2.5.3. Корреляционный анализ.

2.5.4. Сравнение двух стандартных отклонений (F-критерий Фишера).

2.5.5. Вычисление суммарной ошибки в определении эффекта.

2.6. Использование инфракрасной спектроскопии для изучения структурно-динамического состояния водных растворов а-ТФ.

2.6.1. Измерения флуктуаций показателей пропускания тонких слоев водных растворов в средней части ИК-спектра.

2.6.2. Использование расстояния Махаланобиса в качестве формального критерия происходящих в воде изменений.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Влияние а-ТФ на структурное состояние глубоколежащих областей микросомальных мембран клеток печени мышей in vitro.

3.1.1. Изменение микровязкости глубоколежащих областей липидного бислоя микросомальных мембран под действием а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10'4-10"25М) при температуре 293 К.

3.1.2. Температурные зависимости тс и термоиндуцированные структурные переходы в глубоколежащих областях микросомальных мембран.

3.1.3. Эффективная энергия активации термоиндуцированных структурных переходов в глубоколежащих областях липидов микросомальных мембран.

3.2. Влияние а-ТФ на структурное состояние поверхностных областей микросомальных мембран клеток печени мышей in vitro.

3.2.1. Изменение жесткости поверхностных областей липидного бислоя микросомальных мембран под действием а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25М) при температуре 293 К.

3.2.2. Температурные зависимости S и термоиндуцированные структурные переходы в поверхностных областях микросомальных мембран.

3.3. Влияние а-ТФ на структурное состояние глубоколежащих областей плазматических мембран клеток печени мышей in vitro.

3.3.1. Изменение микровязкости глубоколежащих областей липидного бислоя плазматических мембран под действием а-ТФ в широком диапазоне концентраций (Ю^-Ю'^М) при температуре 293 К.

3.3.2. Температурные зависимости тс и термоиндуцированные структурные переходы в глубоколежащих областях плазматических мембран.

3.3.3. Эффективная энергия активации термоиндуцированных структурных переходов в глубоколежащих областях липидов плазматических мембран.

3.4. Влияние а-ТФ на структурное состояние поверхностных областей плазматических мембран клеток печени мышей in vitro.

3.4.1. Изменение жесткости поверхностных областей липидного бислоя плазматических мембран под действием а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25М) при температуре 293 К.

3.4.2. Температурные зависимости S и термоиндуцированные структурные переходы в поверхностных областях плазматических мембран.

3.5. Роль полярности растворителя, в частности, воды в эффектах сверхнизких и «мнимых» концентраций а-ТФ.

3.5.1. Сравнительное изучение эффекта полярных (водно-спиртовых) и неполярных (в вазелиновом масле) растворов а-ТФ на вязкостные свойства микросомальных мембран.

3.5.2. Влияние а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25М) на показатели ИК-спектра тонких слоев воды.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Модификация структуры биологических мембран α-токоферолом в широком диапазоне концентраций"

Актуальность исследования.

Одним из самых поразительных открытий последних двух десятилетий является обнаружение действия биологически активных веществ (БАВ) -гормонов, пептидов, пестицидов, ядов, антиоксидантов (АО) и других аген

11 'JO тов, в сверхнизких концентрациях (10' -10" М) на живые системы различной степени сложности (от ферментов и мембран до целостных организмов и популяций) [126-128,133]. Каждому из веществ может соответствовать своя специфическая мишень, свои особенности метаболизма, но при действии их в сверхмалых дозах (СМД) наблюдается ряд общих свойств [128,133]:

• Немонотонная, нелинейная полимодальная зависимость "доза-эффект". В большинстве случаев максимумы активности наблюдаются в определенных интервалах концентраций, разделенных между собой так называемой "мертвой зоной", где эффект не проявляется или минимален;

• Изменения чувствительности (как правило, увеличение) биообъекта к действию разнообразных агентов, как эндогенных, так и экзогенных;

• Проявление кинетических парадоксов, а именно возможность уловить эффект СМД БАВ, когда в клетке или в организме имеется то же вещество в концентрациях, на несколько порядков превышающих вводимую дозу. Влияние на рецептор вещества в концентрациях, на порядки более низких, чем константы диссоциации комплекса лиганд-рецептор;

• Зависимость "знака" эффекта от начальных характеристик объекта;

• "Расслоение" свойств БАВ по мере уменьшения его концентрации, при котором еще сохраняется активность, но исчезают побочные эффекты.

Несмотря на лавинообразное увеличение количества фактов разнообразного характера о действии БАВ в СМД, механизм этого явления до конца не установлен. Природа таких общих закономерностей действия БАВ в СМД может быть связана с общностью критических мишеней. На основании ряда работ [155,158-163,233,256] можно было полагать, что в качестве таких мишеней могут выступать клеточные и субклеточные мембраны. Именно в биологических мембранах локализованы важнейшие регуляторные системы, отвечающие за функционирование клетки и организма: системы вторичных посредников и пероксидного окисления липидов (ПОЛ) [1,48,59], которые находятся в тесном взаимодействии и оказывают влияние друг на друга [161,165,166,264]. Система регуляции ПОЛ контролирует скорость пероксидного окисления липидов в биомембранах, и ее параметрами являются: состав липидов, их способность к окислению и радикалообразованию, скорость выхода из мембраны, а также ее структурно-динамическое состояние [57-59]. Существенную роль в регуляции ПОЛ играют и природные антиоксиданты, встроенные в мембрану и ингибирующие ПОЛ как за счет обменных реакций со свободными радикалами в липидах, так и благодаря созданию более компактной структуры, уменьшающей доступ кислорода к липидам [59,98]. Одним из наиболее известных и эффективных природных АО является а-токоферол (а-ТФ), принадлежащий к группе витамина Е и являющийся его наиболее активной формой, чем и обусловлена его витаминная и физиологическая активность [3-6], недостаток которой приводит к тяжелым биохимическим нарушениям [2,7-9]. Благодаря своей липофильности и строению, а-ТФ сосредоточен в липидном бислое мембраны и поэтому способен непосредственно влиять на ее структурные и динамические свойства [91,98], в частности образуя домены с определенной стехиометрией и фосфолипидным составом [15,104], а также связываясь с продуктами гидролиза липидов, оказывающих детергентно-подобное действие на мембрану [99,100]. Однако, как уже указывалось выше, состав и структурно-динамическое состояние липид-ного бислоя являются одними из наиболее важных факторов для клеточного метаболизма, занимающими центральное место в цепи регуляции ПОЛ, изменение которых влияет на активность и чувствительность мембранно-связанных и липид-зависимых регуляторных белков, ферментов и рецепторов. До недавнего времени действие а-ТФ как на химических, так и биологических моделях, исследовалось в интервале относительно высоких концентраций 10"6-10'3М. Однако в последние годы появились биохимические исследования, в которых достоверно установлено влияние а-ТФ на ПОЛ

155,168] и на активность одного из ключевых ферментов фосфоинозитидного цикла, являющегося одновременно пероксилипид-зависимым, протеинки

18 назы С (пк-С), в ультранизких концентрациях ( вплоть до 10" М) [164,165].

В связи с вышесказанным, изучение взаимодействия а-ТФ с различными регионами липидного бислоя биологических мембран, отличающихся по своим биохимическим и регуляторным свойствам, может приблизить нас к решению весьма актуального и важного вопроса о механизме действия БАВ в сверхнизких концентрациях.

Цели и задачи исследования.

Цель данной работы состоит в изучении влияния природного АО а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25 М) на структурные характеристики различных регионов липидного бислоя биологических мембран клеток печени мышей in vitro.

В качестве объектов исследования использовались: а) мембраны эндо-плазматического ретикулума (ЭР), которые являются традиционной моделью для исследования процессов ПОЛ и влияния на него анти- и прооксидантов; б) плазматические мембраны (ПМ), в которых локализованы регуляторные системы вторичных посредников.

Конкретными задачами исследования являлись:

1. Исследование методом спиновых зондов ЭПР влияния а-ТФ в интервале концентраций (10"4-10"25М) на жесткость поверхностных (~8А) и микровязкость глубоколежащих (~20А) областей липидного бислоя мембран ЭР и ПМ клеток печени мышей при температуре 293 К. Получение зависимостей доза-эффект.

2. Изучение методом спинового зонда ЭПР влияния концентраций а-ТФ, соответствующих экстремумам на дозовой зависимости и не влияющих на определяемые параметры, на термоиндуцированные структурные переходы в различных областях липидного бислоя, а также эффективную энергию их активации в глубоколежащих областях липидов мембран ЭР и ПМ.

3. Конкретизация механизмов действия различных концентраций а-ТФ на исследуемые структурно-динамические параметры мембран ЭР и ПМ.

4. Выяснение роли полярности растворителя а-ТФ в механизме действия его «мнимых» концентраций (10"18-10'25 М) путем сравнительного изучения влияния а-ТФ, приготовленного в полярном (спирт-водные растворы) и неполярном (в вазелиновом масле) растворителях, на вязкостные свойства глубоколежащих (~ 20 А) и поверхностных (~ 8 А) областей ЭР in vitro.

5. Выяснение роли динамических характеристик воды в механизме полу

1Q лс Q ченных ранее эффектов «мнимых» (10"'М0"" М) и сверхмалых (10""—10" 18М) концентраций а-ТФ на структуру биологических мембран путем изучения различия на основе многомерного критерия Махаланобиса флуктуаций показателей пропускания тонких слоев воды в 9 областях ИК-спектра: 3500-3200, 3085-2832, 2120-1880, 1710-1610, 1600-1535, 1543-1425, 1430-1210, 1127-1057, 1067-963 см"1 в водно-спиртовых растворах а-ТФ в широком спектре концентраций (10"4-10"25 М) по сравнению с соответствующими спиртовыми растворами в бидистиллированной деионизованной воде, взятыми в качестве эталонов.

Научная новизна.

Впервые показано, что природный АО а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25М), включающем сверхмалые (10'9-10'18 М) и даже так называемые «мнимые» концентрации (<10'18 М), существенно модифицирует структурно-динамические параметры различных липидных регионов биологических мембран, выделенных из печени мышей. При этом зависимость эффекта от дозы водимого вещества имеет нелинейный полимодальный характер с максимумами в каждой из указанных областей и разделяющими их «мертвыми зонами», где эффект отсутствует.

Впервые обнаружено, что а-ТФ в концентрациях, вызывающих максимальные изменения в параметрах микровязкости и упорядоченности липид-ной компоненты, индуцирует появление дополнительного термоиндуциро-ванного структурного перехода липидов в области физиологических температур (307-314 К, 34-41 °С).

Впервые установлено, что каждый из наблюдаемых максимумов на кривых доза-эффект обусловлен своим особым механизмом взаимодействия а-ТФ с биомембранами: в области «физиологических» концентраций (10"4-10" 7М) - ограничением при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы а-ТФ за счет его неспецифического встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами фосфолипидов (ФЛ); в области

Q 1 Q

СМД (10" -10" М) - высокоэффективным специфическим взаимодействием со связывающими центрами на мембране (в частности, с пк-С), инициированием а-ТФ образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) или модификацией уже имеющихся; в области «мнимых» концентраций а-ТФ (<10"18 М) - опосредованным влияние на мембрану через изменение структурно-динамических характеристик воды. В связи с этим впервые экспериментально установлено, что именно полярные свойства растворителя (воды) играют основную роль в механизме действия «мнимых» концентраций БАВ вообще и а-ТФ в частности.

Таким образом, вода представляет собой не только некую среду, в которой могут находиться молекулы действующего вещества, но и является активным участником происходящих в ней процессов «записи» и «передачи» информации о веществе в том или ином виде на пути к его мишени. Учитывая, что живые организмы состоят в основном из воды (по массе), полученные в данной работе сведения могут существенно дополнить имеющиеся представления о механизмах функционирования многих БАВ in vivo.

Научно-прикладное значение работы.

Изменение структурно-динамических характеристик биологических мембран может быть использовано в качестве чувствительной модели для скрининга БАВ, действующих в ультранизких концентрациях.

Обнаружение эффекта а-ТФ в СМД на структурное состояние липид-ной компоненты биологических мембран, являющейся одним из важнейших параметров системы регуляции ПОЛ, весьма существенно для возможного снижения терапевтической дозы а-ТФ при использовании его для коррекции ряда заболеваний, протекающих на фоне нарушения или изменения функционирования данной системы.

Апробация диссертационной работы.

Материалы работы докладывались на ежегодных молодежных конференциях ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2002, 2004, 2005), XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), VI и VII Международных конференциях «Биоантиоксидаит» (Москва, 2002, 2006), III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), XLVII Научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Москва-Долгопрудный, 2004), First Dijon International Workshop on Lipids "Recent Advances in Lipid Metabolism and Related Disorders " (Dijon, France, 2005), 46-th International Conference on the Bioscience of Lipids (Ajaccio, Corsica, France, 2005), Всероссийской конференции молодых ученых и II школе им. академика Н.М. Эмануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2006), IV Международном Конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2006), 4th Euro Fed Lipid Congress «Oils, Fats and Lipids for a Healthier Future» (Madrid, Spain, 2006).

Публикации.

Основные положения диссертационной работы опубликованы в 19 печатных работах (6 журнальных статьях и 13 тезисах докладов) и 2 статьи поданы в печать.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, 4 глав, основных выводов и списка литературы. Работа изложена на 193 страницах, иллюстрирована 4 схемами, 50 рисунками и 6 таблицами. Библиография включает список из 288 работ.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Белов, Василий Викторович

ВЫВОДЫ

1. Изучено действие природного АО а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10'25 М) на структурные характеристики мембран ЭР и ПМ клеток печени мышей in vitro. Установлено, что для мембран ЭР и ПМ, несмотря на их биохимические и функциональные отличия, характерны полимодальные дозовые зависимости эффектов а-ТФ на жесткость поверхностных (~8 А) и микровязкость глубоколежащих (-20 А) областей липидного бислоя, имеющие во многом аналогичный характер и типичные для БАВ, проявляющих активность в широком диапазоне концентраций, включающем СМД.

2. Показано, что полимодальность полученных дозовых зависимостей связана с наличием статистически достоверных эффектов а-ТФ в трех областях концентраций, каждый из которых обусловлен преобладающим вкладом одного из возможных механизмов действия а-ТФ. А именно: а) в области традиционных «физиологических» концентраций (10"4-10"9 М) - ограничения при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы а-ТФ за счет его неспецифического встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами ФЛ;

Q 1Я б) в области СМД (10" -10" М) - специфического связывания а-ТФ с лигандами на мембране (в частности, получена высокая корреляция изменения жесткости поверхностных областей липидов мембран ЭР и ПМ и степени ингибирования активности мембранно-связанного фермента пк-С (рецептора а-ТФ)); инициирования а-ТФ'ом образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) или модификации уже имеющихся; to лг в) в области «мнимых» концентраций (10" -10* М) - изменения структурно-динамических характеристик воды, выступающей в роли полярного растворителя а-ТФ и среды окружающей мембраны.

3. Изучены температурные зависимости вязкостных характеристик различных по глубине областей липидов и обнаружено, что те концентрации а

ТФ в том числе и СМД, которым соответствовали максимумы на дозовых зависимостях при температуре 293 К, по сравнению с контролем вызывают появление дополнительного термоиндуцированного структурного перехода в области физиологических температур 307-314 К (34-41 °С).

4. Установлена принципиальная роль полярности растворителя (воды) а-ТФ

18 25 в механизме действия его «мнимых» концентраций (10" -10" М) путем сравнительного изучения эффектов полярных (спирто-водных) и неполярных (в вазелиновом масле) растворов а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25 М) на вязкостные характеристики различных регионов мембран ЭР.

5. С помощью нового типа ИК-спектрометра - аппаратно-программного комплекса ЖАР - на основе критерия Махаланобиса обнаружены значительные изменения в структурном динамическом состоянии водного растворителя при введении как «мнимой» (10"2° М), так и СМД (10'15 М) а-ТФ, в окрестностях которых ранее наблюдались изменения структурных характеристик микросомальных и плазматических мембран;

6. Выявлены две узкие области в ИК-спектре, в которых дисперсии показателей пропускания 10"15 М и Ю'20 М растворов а-ТФ по отношению к эталону и 10"9 М раствору были гораздо выше, чем в остальной области спектра.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

4.1. Особенности и возможные механизмы действия а-ТФ на структуру микросомальных и плазматических мембран в трех областях концентраций.

Основная цель данного исследования состояла в изучении in vitro особенностей действия природного АО а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25 М) на структурно-динамическое состояние поверхностных (~8А) и глубоколежащих (~20А) областей микросомальных и плазматических мембран клеток печени мышей, а также в выяснении механизмов, лежащих в основе этого действия.

В результате были обнаружены следующие закономерности. Несмотря на различный состав липидов используемых биологических мембран и их функциональные особенности, зависимости изменений жесткости поверхностных и микровязкости глубоколежащих областей липидного бислоя от концентрации вводимого а-ТФ при температуре 293 К в обоих типах мембран имеют в значительной степени аналогичный немонотонный, полимодальный характер, связанный с наличием эффектов в трех областях доз: области «физиологических» концентраций а-ТФ (10"4-10"9 М), в которых он обычно дей

Q 18 ствует в организме, его СМД (10' -10' М) и даже «мнимых» концентраций

18 25

10" -10* М), при которых вероятность нахождения хотя бы одной молекулы а-ТФ в мембранной суспензии близка к нулю (рис. 12, 19, 28, 37). Максимумы и минимумы разделены так называемыми «молчащими» или «мертвыми» зонами, где эффект а-ТФ на исследуемые структурно-динамические характеристики мембран отсутствовал. Таким образом, а-ТФ по характеру своего воздействия на мембраны может быть отнесен к типу БАВ, проявляющих эффект в СМД.

При изучении температурных зависимостей характеристик микровязкости глубоколежащих и жесткости поверхностный областей липидов как микросомальных, так и плазматических мембран (рис. 13, 14, 20-22, 29-31,

38, 39; табл. 3-6) оказалось, что концентрации а-ТФ, соответствующие максимумам и минимумам на дозовых кривых, вызывают появление дополнительных (а в глубоколежащих областях липидов микросом также более высококооперативных) по сравнению с контролем термоиндуцированных структурных переходов липидного бислоя, большинство которых обнаруживается в области физиологических температур (307-314 К, 34-41 °С) [268]. Учитывая большое значение в жизнедеятельности клетки фазовых переходов в липидах биологических мембран [75,265-267], этот факт может иметь важное регуляторное значение при действии не только «физиологических», но и сверхнизких и даже «мнимых» концентраций а-ТФ.

Одинаковый полимодальный характер дозовых зависимостей эффектов а-ТФ на вязкостные характеристики поверхностных и глубоколежащих областей липидного бислоя микросомальных и плазматических мембран может быть связан с преобладанием в определенных интервалах доз роли различных механизмов действия а-ТФ, общих для разного типа биологических мембран.

4.1.1. Неспецифическое встраивание а-ТФ в мембрану как механизм его действия в «физиологических» концентрациях (10~4-10"9 М).

Упорядочивание поверхностных и глубоколежащих областей липидного бислоя микросомальных и плазматических мембран при введении в них а-ТФ в «физиологических» концентрациях (10"4-10"9М) обусловлено, прежде всего, ограничениями при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы а-ТФ, что снижает их конформационную подвижность [98]. Во многом эти процессы могут быть связаны с взаимодействием а-ТФ с молекулами ФЛ [120], приводящим к образованию комплексов с определенной стехиометрией [15,104,114,120]. Их распределение в плоскости мембраны может иметь произвольный характер, а также они могут образовывать домены и вызывать фазовое разделение [111], что проявляется в виде дополнительных термоиндуцированных структурных переходов в различных областях липидного бислоя микросомальных и плазматических мембран печени (табл. 3-6). Увеличение вязкости или снижение текучести мембраны при встраивании в нее а-ТФ в «физиологических» концентрациях было не раз показано различными физическими методами в опытах на биологических (см., например, [96,97]) и модельных мембранах, в том числе и методом спиновых зондов ЭПР [98,269,270], и наши данные согласуются с их результатами.

4.1.2. Специфическое взаимодействие а-ТФ со связывающими центрами на мембране и инициирование образования микродоменных структур в ней в качестве возможных механизмов действия а-ТФ в СМД (10"9-1018 М).

Одним из возможных объяснений эффектов СМД а-ТФ на вязкостные свойства поверхностных и глубоколежащих областей микросомальных и плазматических мембран может являться его специфичное, высокоэффективное взаимодействие со связывающими центрами на мембране, изменяющее их конформационное состояние. В качестве такого связывающего центра в данном случае мы предполагаем поверхностный мембранно-связанный фермент пк-С, поскольку ранее в работах Мальцевой E.JI. и соавторов [164] показано ингибирование его активности а-ТФ в СМД. В пользу высказанного предположения говорит и высокая степень корреляции, полученная при сопоставлении этих данных с изменением жесткости поверхностных областей, как микросомальных (рис. 26), так и плазматических (рис. 42) мембран. В этой связи стоит отметить, что содержание активной формы пк-С в микросомальных мембранах печени значительно ниже, чем в плазматических [271,272], при этом и эффект а-ТФ в СМД на вязкостные характеристики поверхностных областей микросом в 3 раза меньше по величине, чем в плазматических мембранах (ср. рис. 19 и 37).

Другим вероятным объяснением упорядочивания липидного бислоя плазматической и микросомальной мембран при действии а-ТФ в СМД, по нашему мнению, может являться инициирование им образования новых вы-сокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране или модификация уже имеющихся. В плазматической мембране в их роли могут выступать рафты, которые представляют собой особые области в мембране, значительно более упорядоченные по сравнению со своим микроокружением из-за повышенного содержания холестерина, сфингомиелина и ганглиозидов, а также преимущественно насыщенного характера жирнокислотных цепей ФЛ [66,67]. Высказанное предположение основывается на том, что многие белки, участвующие в передаче сигналов в клетке, способны локализоваться в раф-тах, в том числе и пк-С [67]. Время жизни таких комплексов невелико (меньше 1 мс), однако действие внешних сигналов (в роли которых могут выступать лиганды), вызывающих конформационные изменения в белковых молекулах, может его значительно увеличить (вплоть до нескольких минут) и, кроме того, привести к объединению отдельных рафтов в более крупный домен [67,68]. Поэтому мы предполагаем, что подобные процессы сопровождают взаимодействие а-ТФ в СМД с пк-С в процессе ингибирования ее активности.

Присутствие а-ТФ в мембране, как в «физиологических», так и в сверхнизких концентрациях может влиять и на сам процесс формирования рафтов. Так, в качестве одного из механизмов их образования в литературе рассматривается пространственная несовместимость в жидкокристаллической фазе между твердой стерольной структурой молекулы холестерина и жестким изгибом ненасыщенной углеводородной цепи соседней молекулы фософлипида, имеющей г/мс-двойную связь в положении С9-С10 [68]. Такая затрудненность во взаимной упаковке молекул приводит к выталкиванию холестерина из областей с ненасыщенными фосфлипидами, с последующей его концентрацией и стабилизацией в областях с преимущественно насыщенным характером жирнокислотных цепей ФЛ. В этой связи стоит отметить, что а-ТФ, в свою очередь, с большим предпочтением взаимодействует с полиненасыщенными ФЛ [99,114], способствуя, таким образом, вытеснению холестерина и облегчая образование рафтов при действии а-ТФ как в «физиологических» концентрациях, так и в СМД.

Предложенные механизмы с участием рафтов могут быть рассмотрены с определенной долей вероятности и в микросомах печени, если принять во внимание, что существуют работы, в которых высказываются серьезные предположения об их существовании там [279-281].

4.1.3. Роль полярных свойств растворителя (воды) в механизме

18 25 действия «мнимых» концентраций а-ТФ (10" -10" М).

Концентрации а-ТФ в диапазоне 10'18-10"25 М называются «мнимыми», поскольку вероятность нахождения хотя бы одной молекулы а-ТФ в мембранной суспензии близка к нулю. В связи с этим для объяснения механизмов действия а-ТФ в этой области, по нашему мнению, имеет смысл обратиться к свойствам растворителя. Для выяснения, насколько важна при этом его полярность, мы провели сравнительное изучение действия а-ТФ, приготовленного в полярном (спирт-водные растворы) и неполярном (в вазелиновом масле) растворителе, на вязкостные свойства глубоколежащих (~ 20 А) и поверхностных 8 А) областей микросомальных мембран in vitro. В результате для обоих растворителей были получены полимодальные дозовые зависимости, имеющие фазовый характер, противоположный в поверхностных и в глубоколежащих областях липидного бислоя. Оказалось, что если в областях «физиологических» (10"4-10"9М) и сверхмалых (10"9-10'18М) концентраций статистически достоверными (р<0.05) эффектами обладают растворы а

1 о с

ТФ в обоих растворителях, то в области «мнимых» (10' -10" М) концентраций достоверный эффект на вязкостные свойства поверхностных и глубоко-лежащих областей липидов имеют только растворы а-ТФ в полярном растворителе, в данном случае водном, что говорит о существенной роли полярности растворителя в механизме передачи «информации» о веществе в том или ином виде в процессе приготовления растворов. Полярные свойства воды связывают, прежде всего, со способностью ее молекул образовывать водородные связи друг с другом, что приводит в итоге к формированию коротко-живущих водных ассоциатов (кластеров) небольшого размера [286,287]. Мы предположили, что их динамические характеристики (например, параметры флуктуаций, а также взаимодействия между ними) могут играть особую роль в процессе хранения и передачи информации о веществе, причем изменение их будет сказываться на целостной динамической структуре полярной среды. В качестве показателей, характеризующих структуру и динамику, а, следовательно, состояние воды в определенных условиях и при различных воздействиях, в частности БАВ, могут использоваться флуктуации показателей пропускания воды в РЖ-области спектра [196,213-216].

В связи с вышесказанным с целью выяснения роли динамических характеристик воды в механизме полученных нами ранее эффектов «мнимых» и сверхмалых концентраций а-ТФ на структуру биологических мембран мы совместно с сотрудниками кафедры общей и биоорганической химии Тверской государственной медицинской академии изучили различие флуктуаций показателей пропускания тонких слоев воды (20 мкм) в девяти диапазонах ИК-области спектра: 3500-3200, 3085-2832, 2120-1880, 1710-1610, 1600-1535, 1543-1425, 1430-1210, 1127-1057, 1067-963 см"1 в водно-спиртовых растворах а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10-10" М) по сравнению с соответствующими спиртовыми растворами в бидистиллированной деионизован-ной воде, взятыми в качестве эталонов. В качестве формальной характеристики изменений структурно-динамического состояния воды при отсутствии и в присутствии различных количеств а-ТФ использовался многомерный дискриминантный анализ на основе критерия Махаланобиса, который учитывает корреляции и дисперсии инфракрасных показателей эталона и образца, что позволило использовать его в качестве целостного показателя. В результате изучения влияния различных концентраций а-ТФ (10"4-10"25 М) на структурное динамическое состояние водного растворителя, оцененное по критерию Махаланобиса, была получена полимодальная дозовая зависимость с наибольшими отклонениями при действии а-ТФ в СМД 10'15 и «мнимой» концентрации 10'20 М. Дальнейший анализ позволил выявить две узкие области ИК-спектра, в которых а-ТФ не поглощает, соответствующие деформационным и деформационно-либрационным колебаниям молекулы воды, в которых дисперсии показателей пропускания 10"15 и Ю"20М растворов а-ТФ по отношению к эталону и 10"9 М раствору были гораздо выше, чем в остальной области спектра.

Учитывая, что в окрестности указанных концентраций а-ТФ происходили изменения вязкостных параметров поверхностных и глубоколежащих областей липидного бислоя микросомальных мембран, которые при смене растворителя а-ТФ с полярного на неполярный в области СМД модифицировались, а в области «мнимых» концентраций пропадали вовсе, мы предполагаем и разделяем мнение других авторов [213-216], что изменения структурного динамического состояния воды играют основную роль в механизме действия «мнимых» концентраций а-ТФ и могут вносить определенный вклад при действии СМД а-ТФ.

Таким образом, основными результатами нашего экспериментального исследования являются:

S обнаружение нелинейной дозовой зависимости влияния а-ТФ при постоянной температуре на структурно-динамическое состояние различных ли-пидных регионов, типичной для действия БАВ в СМД и имеющей во многом аналогичный характер в мембранах ЭР и ПМ; S доказательство преобладания различных механизмов действия а-ТФ в определенных областях концентраций:

• в области традиционных «физиологических» концентраций а-ТФ (lO^-lO"9 М) - ограничения при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы а-ТФ за счет его неспецифического встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами ФЛ;

О 1Q

• в области СМД (10" -10* М) - специфического связывания с лиган-дами на мембране (в частности, пк-С), либо инициирования образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) или модификации уже имеющихся;

18 25

• в области «мнимых» концентраций (10" -10' М) - опосредованного влияния на мембрану путем изменения структурно-динамических характеристик воды (оцененных по флуктуациям ее показателей пропускания в ИК-области), выступающей в роли растворителя а-ТФ и среды окружающей мембраны. ^ обнаружение образования дополнительных термоиндуцированных структурных переходов в липидном бислое в области физиологических температур при действии концентраций а-ТФ, вызывающих при температуре 293 К статистически достоверные изменения вязкостных характеристик мембран ЭР и ПМ в указанных трех областях концентраций.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белов, Василий Викторович, Москва

1. Артюхов В.Г., Наквасина М.А. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами: Учеб. пособие. Воронеж: Издательство Воронежского государственного университета, 2000. - 296 с.

2. Pentyuk A. A., Yakovleva О. А. // Int. Conf. Regul. Free Radical React., Varna, 13-16 Sept., 1989, P.85.

3. Nair P.P., Kayden H.J. // Annal NY Acad. Sci. 1972. V.203. P. 1-247.

4. Machlin L.J. Vitamin E. New York: Marcel Dekker, 1980.

5. Patniac P.N., Nair P.P. //Arch. Biochem. Biophys. 1977. V.178. P.333-341.

6. Cangill C.P.J., Lucy J.A., Diplock A.T. //Biochem. J. 1971. V.125. P.407-416.

7. Sigounas G., Anagnostou A., Steiner M. // Nutr. Cancer. 1997. V.28. P.30-35.

8. Pratico D., Tangirala R.K., Rader D.J., Rokach J., FitzGerald G.A. // Nature Med. 1998. V.4. P.l 189-1192.

9. Keaney J.F, Jr., Simon D.I., Freedman J.E. // FASEB J. 1999 V.13. P.965-975.

10. Evans H.M., Bishop K.S. // Science. 1922. V.56. P.650-654.

11. Sato Y., Arai H., Myata A., Tokita S., Yamamoto K., Tanabe Т., Inoue K. // J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.l7705-17710.

12. Wolf G. //Nutr Rev. 1994. V.52. P.97-98.

13. Dutta Roy AK, Gordon MJ, Campbell FM, Duthie GG, James WPT. // J. Nutr. Biochem. 1994. V.5. P.562-570.

14. Buttriss J.L., Diplock A.T. // Biochim Biophys Acta. 1988. V.963. P.61-69.

15. Kagan V.E., Quinn P.J. //Eur. J. Biochem. 1988. V.171. P.661-667.

16. Salgado J., Villalian J., Gomez-Fernandez J.C. // Eur. Biophys. J. 1993. V.22. P.151-155.

17. Fukuzawa K., Ikebata W., Shibata A., Kumadaki I., Sakanaka Т., and Urano S. // Chem. Phys. Lipids. 1992. V.63. P.9-75.

18. Azzi A., Stocker A. // Prog. Lipid Res. 2000. V.39. P.231-255.

19. Azzi A., Gysin R., Kempna P., Ricciarelli R., Villacorta L., Visarius Т., Zingg J.-M. // Mol. Asp. Med. 2003. V.24. P.325-336.

20. Kempna P., Zingg J.-M., Ricciarelli R., Hierl M., Saxena S., Azzi A. // Free Radical Biol. Med. 2003. V.34. P.1458-1472.

21. Бурлакова Е.Б., Крашаков С.А., Храпова Н.Г. // Биологические мембраны. 1998. Т. 15. №.2. С.137-168.

22. Эмануэль Н. М., Денисов Е. Т., Майзус З.К. Цепные реакции окисления углеводородов в жидкой фазе, М.: Наука, 1965, 375с.

23. ЭмануэльН.М. //Успехи химии. 1981. Т.50. №.10. С.1721-1809.

24. Рогинский В.А., Фенольные антиоксиданты, М., Наука, 1988, 247с.

25. Barclay L.R.C., Baskin К.А., Locke S.J., Schaefer T.D. // Canad J. Chem. 1987. V.65. P.2529-2540.

26. Lambelet P., Loliger J. // Chem. Phys. Lipids. 1984. V.35. P. 185-198.

27. Mukai K., Fukuda K., Tajima K., Ishizu K. // J.Org.Chem. 1988. V.53. P.430-432.

28. Howard J.A., IngoldK.U. // Canad. J. Chem. 1963. V.41. P.l744-1751.

29. Howard J.A., Ingold K.U. // Canad. J. Chem. 1963. V.41. P.2800-2806.

30. Шамовский И.Л., Яровская И.Ю. //Хим.-фарм. ж. 1990. Т.24. №.2. С. 100103.

31. Бурлакова Е.Б., Бушелев С.И., Шамовский И.Л. // Хим. физика. 1989. Т.8. №.11. С.1471-1474.

32. Machlin L.J. Vitamin Е. In: Handbook of Vitamins. (Ed. Machlin L.J.) Dekker: New-York Bazel, 1984, 99-145.

33. Kanno C., Hayashi M., Yamauchi K. et al. // Agr. Biol. Chem. 1970. V.34. P.878-885, 886-890.

34. Kanno C., Hayashi M., Yamauchi K. et al. // Agr. Biol. Chem. 1970. V.34. P.1652-1657.

35. Храпова Н.Г. // Биофизика. 1977. T.22. №.3. C.436-442.

36. Kagan V.E., Serbinova E.A., Bakalova R.A. et al. // Biochem. Pharmacol. 1990. V.40. P.2403-2413.

37. Serbinova E.A., Bakalova R.A., Stoichev T.S., Kagan V.E. // Buill. Eksp. Biol. Med. 1986. V. 102. P.419-421.

38. Kagan V., Serbinova E., Novikov K., Ritov V., Kozlov Y., Stoytchev T. // Arch. Toxicol. Suppl. 1986. V.9. P.302-305.

39. Terao J., Matsushita M. // Lipids. 1986. V.21. P.255-260.

40. Bohm F., Edge R., McGarrey D.J., Truscott T.G. // FEBS Lett. 1998. V.436. P.387-389.

41. Constantimescu A., Plan D., Packer L. // J. Biol. Chem. 1993. V.268. P. 1090610913.

42. Kagan V.E., Serbinova E., Fork Т., Scita G., Packer L. // J. Lipid Res. 1992. V.33. P.385-397.

43. Dola Т., Burton G.W., Ingold K. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V.835. P.298-303.

44. Ingold K.U., Bowry V.W., Stocker R., Walling C. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. P.45-52.

45. Ernster L., Forsmark P., Nordenbrand K. // J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1992. V.548. P.41-46.

46. Neuzil J., Stocker R. //J. Biol. Chem. 1994. V.269. P. 16712-16719.

47. Карпухина Г.В., Эмануэль H.M. // Доклады АН СССР. 1984. Т.276. №.5. С.1163-1167.

48. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах, М.: Наука, 1972, 252 с.

49. Козлов Ю.П., Данилов B.C., Каган В.Е., Ситковский М.В. Свободноради-кальное окисление липидов в биологических мембранах, М.: МГН, 1972, 88 с.

50. Воскресенский О.Н., Левитский А.П. // Вопросы медицинской химии. 1970. Т.16. С.563.

51. Slater T.F. // Agents Actions. 1987. V.22. Р.ЗЗЗ.

52. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. // Усп. химии. 1985. Т.54. С. 1540.

53. Бурлакова Е.Б. Роль липидов мембран в передаче информации, в сб.: «Биохимия липидов и их роль в метаболизме клетки», М.: Наука, 1981, с.23.

54. Byczowski I.L., Gessner Т. // Int. J. Biochem. 1988. V.20. P.8569.

55. Mavelli J., Antonri R., Dini L., Spinedi A., Cirolo M., Rorilio G. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981. V.102. P.911.

56. Ланкин В.З. Метаболизм липопероксидов в тканях млекопитающих, в сб.: «Биохимия липидов и их роль в метаболизме клетки», М.: Наука, 1981, с.75.

57. Burlakova Ye.B., Molochkina Ye.M., and Pal'mina N.P. Role of membrane lipids in control of enzymatic activity, in "Advances in Lipid Research", Ed.: J. Weber, Pergamon Press, New York, 1980, 163.

58. Мальцева E.JI., Бурлакова Е.Б. // Биологические мембраны. 1986. Т.З. С.773.

59. Burlakova Е.В., Pal'mina N.P., Mal'tseva E.L. // Membrane Lipid Oxidation Vol.III / Eds. Carmen Vigo-Pelfrey. Boca Raton; Ann Arbor; Boston: CRC Press, 1991. P. 209-237.

60. Singer S.J., and Nicolson G.L. // Science. 1972. V.175. P.720-731.

61. Cullis P.R., Hope M.J., Tilcock C.P.S. // Chem. Phys. Lipids. 1986. V. 40. P. 127-144.

62. Tanford C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles in Biological Membranes. 1973. John Wiley, New York.

63. Boggs J.M. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 906. P. 353-404.

64. Jocobson K. // Cell Motility. 1983. V. 3. P. 367-373.

65. W. Dowhan and M. Bogdanov. Functional roles of lipids in membranes. In:xL

66. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes (4 Edn). Eds.: D.E. Vance and J.E. Vance. Amsterdam; Boston; London; New York; Oxford; Paris; San Diego; San Francisco; Singapore; Sydney; Tokyo: Elsevier, 2002. P. 1-35.

67. Lommerse P.H.M., Spaink H.P., Schmidt T. // Boichim. Biophys. Acta. 2004. V. 1664. P. 119-131.

68. Pike L.J. // J. Lipid Res. 2003. V. 44. P. 655-667.

69. Subczynski W.K., Kusumi A. // Boichim. Biophys. Acta. 2003. V. 1610. P. 231-243.

70. Kurzchalia Т., Parton R. // Curr. Opin. Cell Biol. 1999. V.l 1. P.424-431.

71. Chun M., Liyanage U.K., Lisanti M.P., and Lodish H.F. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V.91. P.l 1728-11732.

72. Wu C., Butz S., Ying Y-S., and Anderson R.G.W. // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.3554-3559.

73. Simons K., and Toomre D. //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2000. V.l. P.31-41.

74. Smart E.J., Graf G.A., McNiven M.A., Sessa W.C., Engelman J.A., Scherer P.E., Okamoto Т., and Lisanti M.P. // Mol. Cell. Biol. 1999. V.l9. P.7289-7304.

75. Zajchowski L.D., and Robbins S.M. // Eur. J. Biochem. 2002. V.269. P.737-752.

76. Геннис P. Биомембраны: молекулярная структура и функции: Пер. с англ. М.: Мир, 1997. 624 с.

77. Рубин А.Б. Биофизика, Т.2.: Учебник. М.: МГУ, Наука, 2004. 469 с.

78. Thewke D., Kramer М., Sinensky M.S. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V.273.P.1-4.

79. Sukharev S. // FASEB J. 1999. V.13. P.S55-S61.

80. Wood J.M. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. V.63. P.230-262.

81. Hohmann S. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V.66. P.300-372.

82. Tokishita S., Mizuno T. // Mol. Microbiol. 1994. V.13. P.435-444.

83. Sugiura A., Hirokawa K., Nakashima K., Mizuno T. // Mol. Microbiol. 1994. V.14. P.929-938.

84. Gudi S., Nolan J.P., Frangos J.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V.95. P.2515-2519.

85. Los D.A., MurataN. // Boichim. Biophys. Acta. 2004. V.1666. P. 142-157.

86. Hazel J.R. // Annu. Rev. Physiol. 1995. V.57. P. 19-42.

87. Okuyama H., Okajima N., Sasaki S., Higashi S., Murata N. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V.1084. P.13-20.

88. Mikami К., Suzuki I., Murata N. // Topics in Current Genetics, vol.4, Plant Responses to Abiotic Stress / Eds. Hirt H., Shinozaki K., Berlin: Springer-Verlag, 2003,103-119.

89. Xiong L., Schumaker K.S., Zhu J.K. // Plant Cell. 2002. S165-S183 (Suppl.).

90. Causton H.C., Ren В., Koh S.S., Harbison C.T., Kanin E., Jennings E.G., Lee T.I., True H.L., Lander E.S., Young R.A. // Mol. Biol. Cell. 2001. V.12. P.323-337.

91. Curtis M.T., Gilfor D., and Farber J.L. // Arch. Biochem. Biophys. 1984. V.235. P.644-649.

92. Quinn P.J. // Biochemistry (Moscow). 2004. V.69. P. 58-66.

93. Ahkong Q.F., Fisher D., Tampion W.,Lucy J.A. // Biochem. J. 1972. V.136. P.147-155.

94. Steiner M., Anastasi I. // J.Clin. Invest. 1976. V.57. P.732-737.

95. Steiner M„ Mower . // Ann. NY. Acad. Sci. 1982. V.393. P.289-299.

96. Fukuzawa K., Hayashi K., Suzuki A. // Chem. Phys. Lipids. 1977. V.18. P.39-48

97. Steiner M. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V.640. P. 100-105.

98. Urano S., Inomori Y. et al. //J. Biol. Chem. 1992. V.267. P.18365-18370.

99. Wassail S.R., Wang L„ McCabe R.C., Ehringer W.D., Stillwell W. // Chem. Phys. Lipids. 1991. V.60. P.29-37.

100. Erin A.N., Spirin M.M., Tabidze L.V., Kagan V.E. // Biochim. Biophys. Acta. 1984. V.l 1. P.96-102.

101. Kagan V.E. // Annal NY. Acad. Sci. 1989. V.570. P.121-135.

102. Mukherjee A.K., Ghosal S.K., Maity C.R. // Cell Mol. Life Sci. 1997. V.53. P.152-155.

103. Urano S., Matsuo M., Sakanaka Т., Ucmura I., Koyama M., Kumadaki I., Fukuzawa K. // Archiv Biochem. Biophys. 1993. V.303. P. 10-14.

104. Massey J.B., She H.S., Pownall H.J. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V.106. P.842-847.

105. Quinn P.J. //Eur. J. Biochem. 1995. V.233. P.916-925.

106. McMurchie E.J., and Mcintosh G.H. // J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1986. V.32. P.557-558.

107. Sanchez-Migallon M.P., Aranda F.J., and Gomez-Fernandez J.C. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V.1279. P.251-255.

108. Fukuzawa K., Ikeno H., Tokumura A., and Tsukatani H. // Chem. Phys. Lipids. 1979. V.23. P.13-22.

109. Kagan V.E., Quinn P.J. // Eur. J. Biochem. 1988. V.171. P.661-667.

110. Wang X, and Quinn P.J. //Biochim. Biophys. Acta. 2002. V.1567. P.6-12.

111. Wang X., Semmler K., Richter W., and Quinn P.J. // Arch. Biochem. Biophys. 2000. V.377. P.301-314.

112. Wang X., Takahashi H., Hatta I., and Quinn P.J. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V.1418. P.343-355.

113. Wang X., and Quinn P.J. // Chem. Phys. Lipids. 2002. V.l 14. P. 1-9.

114. Ortiz A., Aranda F.J.,and Gomez-Fernandez J.C. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V.898. P.214-222.

115. Stillwell W., Dallman Т., Dumaual A.C., Crump F.T., and Jenski L.J. // Biochemistry. 1996. V.35. P.13353-13362.

116. Wang X., and Quinn P.J. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V.1509. P.361-372.

117. Wang X., and Quinn P.J. // Eur. J. Biochem. 2000. V.267. P.6362-6368.

118. Diplock A.T., and Lucy J.A. // FEBS Lett. 1973. V.29. P.205-210.

119. Urano S., Iida M., Otani I. and Matsuo M. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. V.146. P.1413-1418.

120. Erin A.N., Skrypin V.V. and Kagan V.E. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V.815. P.209-214.

121. Gomez-Fernandez J.C., Villalain J., Aranda F.J. et al. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1989. V.570. P.109-120.

122. Saigado J., Villalian J., and Gomez-Fernandez J.C. // Eur. Biophys. J. 1993. V.22. P.151-155.

123. Духович Ф.С., Горбатова Е.Н., Курочкин В.К., Петрунин В.А. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №.5. С. 12-15.

124. Zaitsev S.V., Khegai L.A., Kim В.В. е.а. // Immunol. Letters. 1992. V.32. Р.27-30.

125. Song J.C. et al. // Blood. 2004. V.104. P.2065-2072.

126. Cunha J.M. et al. // Br. J. Pharmacol. 2003. V.139. P. 1135-1145.

127. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Лелекова T.B. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №.5. С.21-28.

128. Зайцев С.В., Ефанов A.M., Сазанов Л.А. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №.5. С.28-33.

129. Бурлакова Е.Б. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №.5. С.3-11.

130. Будников Г.К. // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т.6. С. 4551.

131. Бурлакова Е.Б., Греченко Т.Н., Соколов Е.Н., Терехова С.Ф. // Биофизика. 1986. Т.31. С.921-922.

132. Бурлакова Е.Б., Хохлов А.П. //Биол. Мембраны. 1985. Т.2. С.557.

133. Е. Davenas, F. Beauvais, J. Amara, M. Oberbaum, В. Robinzon, A. Miadonnai, A. Tedeschi, B. Pomeranz, P. Fortner, P. Belon, J. Sainte-Laudy, B. Poitevin & J. Benveniste // Nature. 1988. V.333. P.816.

134. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Мальцева Е.Л. // Химическая физика. 2003. T.22. C.21-40.

135. Сазанов Л.А., Зайцев С.В. // Биохимия. 1992. Т.57. С.1443-1460.

136. Faith R.E., Liang H.J., Murgo A.J., Plotnikoff N.P. // Clin. Immunol, and Immunopathol. 1984. V.31. P.412-418.

137. Rola-Pleszczynski M. // J. Lipid Mod. 1990. V.2. P.577-582.

138. Reibman J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88. P.6805.

139. Zaitsev S.V., Sazanov L.A., Koshkin A.A. et al. // FEBS Lett. 1991. V.291. P.84-86.

140. Efanov A.M., Koshkin A.A., Sazanov L.A. et al. // FEBS Lett. 1994. V.355. P.114-116.

141. Deliconstantinos G., Kopelkina-Tslboukidou L., Villotou V. // Biochem. Pharm. 1987. V.36. P.l 153-1191.

142. Пынзарь Е.И., Богданова Н.Г., Пальмина Н.П. // Биологические мембраны. 1995. Т.12. С.279-287.

143. Williamson S.A., Knight R.A., Lightman S.L., Hobbs J.R. // Brain Beh. Immun. 1985. V.l. P.329-335.

144. Zakharova L.A., Belevskaya R.G., Yanovskii O.G. // Biomed. Sci. 1990. V.l. P.139-143.

145. Williamson S.A., Knight R.A., Lightman S.L., Hobbs J.R. // Immunology. 1989. V.65.P.47-51.

146. Crain S.M., Shen K.-F. // Brain Res. 1996. V.741. P.275-283.

147. Marotta D., Marini A., Banaudha K., Maharaj S., Ives J., Morrissette C.R., Jonas W.B. // Neurotoxicology. 2002. V.23. P.307-312.

148. Jonas W., Lin Y., Tortella F. //Neuroreport. 2001. V.l2. P.335-339

149. Sergeeva M.Y., Gonchar M.V., Chistyakov V.V., Mevkh A.T. // Appl. Biochemistry and Biotechnology. 1996. V.61. P. 167-171.

150. Богатыренко Т.Н., Редкозубова Г.П., Конрадов А.А. и др. // Биофизика. 1989. Т.34. С.327-329.

151. Гладышева Т.Б., Конрадов А.А., Лебедев К.А. // Биофизика. 1989. Т.34. С.833-834.

152. Молочкина Е.М., Озерова И.Б. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т. 43. С.294-300.

153. Молочкина Е.М., Озерова И.Б., Бурлакова Е.Б. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №.5. С.63-71.

154. Трещенкова Ю.А., Голощапов А.Н., Бурлакова Е.Б. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. С.320-323.

155. В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. С.306-309.

156. Н.П. Пальмина, JI.B. Кледова, Т.В. Панкова, E.JI. Мальцева, В.В. Белов,

157. B.Е. Жерновков // Вопросы биохимической, медицинской и фармакологической химии. 2004. №4. С.31-37.

158. N.P. Palmina, V.V. Belov, E.L. Maltseva // Chemistry and Physics of Lipids. 2005. V.136. P.141-142.

159. Белов B.B., Мальцева E.JI., Пальмина Н.П. // Труды V ежегодной международной молодежной конференция ИБХФ РАН ВУЗЫ «Биохимическая физика», 14-16 декабря 2006 г., Москва, с. 22-30.

160. Жерновков В.Е., Богданова Н.Г., Пальмина Н.П. // Биологические мембраны. 2005. Т.22. С.388-395.

161. Жерновков В.Е., Богданова Н.Г., Лелекова Т.В., Пальмина Н.П. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. С.ЗЗ 1-333.

162. Жерновков В.Е., Пальмина Н.П. // Труды V ежегодной международной молодежной конференция ИБХФ РАН ВУЗЫ «Биохимическая физика», 14-16 декабря 2006 г., Москва, с. 12-17.

163. Пальмина Н.П., Богданова Н.Г., Мальцева Е.Л., Пынзарь Е.И. // Биологические мембраны. 1992. Т.9. С.810-820.

164. Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П. // Биологические мембраны. 1992. Т.9.1. C. 1023-1025.

165. Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. С.301-305;

166. Пальмина Н.П., Мальцева Е.Л., Курнакова Н.В., Бурлакова Е.Б. // Биохимия. 1994. Т.52. С. 193-203.

167. Пальмина Н.П., Мальцева Е.Л., Пынзарь Е.И., Бурлакова Е.Б. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №.5. С.55-63.

168. Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П., Бурлакова Е.Б. // Биологические мембраны. 1998. Т.15. С.199-212.

169. Kraft A.S., Anderson W.B. //Nature. 1983. V.301. P.621-625.

170. Пальмина Н.П., Кледова Л.В., Панкова Т.В., Гаинцева В.Д. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. С.310-314.

171. Фомина М.М., Островская Л.А., Корман Д.Б., Бурлакова Е.Б. // Изв. АН. Сер. биол. 1995. С.430-434.

172. Dubinin K.V., Zakharova L.A., Khegai L.A., Zaitsev S.V. // Immunopharmacol. Immunotoxicol. 1994. V.16. P.463-472.

173. Safrit J., Tsuchitani Т., Zighuboim J., Bonavida B. // In: Ultra-Low Doses. Ed. C. Doutrempuich. Univ. Bordeaux, France, 1991,27-43.

174. Крутова T.B., Островская Л.А., Рыкова В.А., Корман Д.Б. // Изв. АН. Сер. биол. 1994. №5. С.738-744.

175. Бурлакова Е.Б. //Вестн. РАН. 1994. Т.64. С.425-431.

176. Голденков В.А., Дикий В.В., Лизунова Г.В. // Росс. хим. журнал. 2002. T.XLVI. С.39-45.

177. Голденков В.А., Дикий В.В., Лошадкин Н.А. // Тез. докл. 1-го съезда токсикологов России. М. 1998. С.40.

178. Воронина Т.А., Молодавкин Г.М. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №5. С.89-96.

179. Патент РФ № 2102986, 1998.

180. Blumenfeld L.A., Grosberg A.Yu., Tikhonov A.N. // J. Chem. Phys. 1991. V.95. P.7541-7544.

181. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. Практический курс. М., 1999.

182. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Худяков И.В. // Известия АН СССР. Сер. биол. 1990. №2. С. 184.

183. Kaissling К.Е., Priesner Е. //Naturwissenschaften. 1970. V.57. Р.23.

184. Gilles R., Gilles С., Jaemicke L. // Z. Naturforsch. 1984. V.39. P.584-592.

185. Гуревич К.Г., Варфоломеев С.Д. //Биохимия. 1999. Т.64. С.83.

186. Гуревич К.Г. //Вестн. Моск. ун-та, Сер.2. Химия. 2001. Т.42. С.131-134.

187. Robertson A.D.J., Grutsch J.F. //J. Theor. Biol. 1987. V.125. P.41-60.

188. KatzL.S., Marquis J.K. //Toxicol. Appl. Pharm. 1989. V.101. P.l 14-123.

189. Хохлов А.П., Ярыгин K.H. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1988. Т.105. С.545.

190. Митчелл Дж. Акваметрия / Дж. Митчелл, Д. Смит: Пер. с англ. М., 1980.-600 с.

191. Самойлов О.Я., Носова Т.А. // Журн. структ. химии. 1956. вып.6. С.798-808.

192. Эйзенберг Д., Кауцман В. Структура и свойства воды. Л.: Гидрометео-издат, 1975. 280 с.

193. Bjerrum N. // Kan. Mat. Phys. Med. 1951. V.27. P. 1.

194. Кочнев И.Н., Винниченко М.Б., Смирнова Л.Б. Молекулярная физика и биофизика водных систем. Л. 1986. вып.6. С.53-62.

195. РодниковаМ.Н. //Журн. физ. химии. 1993. Т.67. С.275.

196. Родникова М.Н. // Сб. избранных трудов IV Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 3-7 июля 2006, с.100-108.

197. Frank H.S. // Science. 1970. V.196. Р.635.

198. Фесенко Е.Е., Терпугов Е.Л. // Биофизика. 1999. Т.44. С.5-9.

199. J.-W. Shin et al. // Science. 2004. V.304. P.l 137-1140.

200. M. Miyazaki et al. // Science. 2004. V.304. P.l 134-1137.

201. T.S. Zwier// Science. 2004. V.304. P.l 119-1120.

202. Антонченко В.Я., Давыдов A.C., Ильин B.B. Основы физики воды. -К.: Наукова Думка, 1994, 667с.

203. Смирнов А.Н., Сыроешкин А.В. // Российский Химический Журнал. 2004. T.XLVIII. №2. С.125-135.

204. Домрачеев Г.А., Родыгин Ю.Л., Селивановский Д.А. // ЖФХ. 1992. Т.66. №3. С.851-855.

205. Ikeda S., Takata Т., Komoda М., Нага М., Kondo J.N., Domen К., Tanaka A., Hosono Н., Kawazoe Н. // Phys. Chem. Chem. Phys. 1999. V.l. P.4485-4491.

206. Домрачев Г.А., Родыгин Ю.Л., Селивановский Д.А. // Доклады АН СССР. 1993. Т.329. №2. С.186-188.

207. Домрачев Г.А., Селивановский Д.А., Родыгин Ю.Л., Диденкулов И.Н. // Журн.Физ.Химии. 1998.1.12. №2. С.347-352.

208. Домрачев Г.А., Селивановский Д.А., Диденкулов И.Н., Родыгин Ю.Л., Стунжас П.А. // Журн. Физ. Химии. 2001. Т.75. №2. С.363-368.

209. Voeikov V.L., Reactive oxygen species, water, photons, and life // Rivista di Biologia/Biology Forum. 2001. V.94, p.193-214.

210. Воейков В.Л. Регуляторные функции активных форм кислорода в крови и в водных модельных системах. // Дисс. д.б.н., Москва, 2003.

211. Воейков В.Л., Колдунов В.В., Кононов Д.С. // Кинетика и катализ. 2001. Т.42. №5. С.670-672.

212. Каргаполов А.В., Плигин A.M., Зубарева Г.М., Шматов Г.П. Патент РФ № 2137126 // Бюл. изобр., 1999, №25.

213. Каргаполов А.В., Зубарева Г.М. Патент РФ № 2164685 // Бюл. изобр., 1999, №9.

214. Каргаполов А.В., Зубарева Г.М. Новые подходы к определению целостного состояния биологически активных систем. Тверь, 2006, с. 184.

215. Зубарева Г.М., Каргаполов А.В., Ягужинский Л.С. // ДАН. 2003. Т.388. №4. С.549-551.

216. Зубарева Г.М., Каргаполов А.В., Ягужинский Л.С. // Биофизика. 2003. Т.48. вып.2. С. 197-200.

217. Зубарева Г.М., Каргаполов А.В., Ягужинский Л.С. // Биофизика. 2003. Т.48. вып.4. С.581-584.

218. Черников Ф.Р. Экспериментальные исследования структурной динамики жидких гомеопатических средств // Проблемы сверхмалых концентраций в гомеопатии и структура воды / Отв. ред. Л.В. Космодемьянский. М.: Индрик, 2002, с. 17-24.

219. Черников Ф.Р. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. №3. С.367-369.

220. Черников Ф.Р. //Биофизика. 1986. Т.31. С.695.

221. Черников Ф.Р., Сорокин В.Н. // Гомеопатический ежегодник. М.: Ва-ланг, 1998, с.93.

222. Черников Ф.Р. // Гомеопатический ежегодник. М.: Валанг, 2002, с.34.

223. Черников Ф.Р. //Биофизика. 1991. Т.36. С.741.

224. Lobyshev V.I., Shikhlinskaya R.E., Ryzhikov B.D. // J. Mol. Liquids, 1999. V.82. P.73-81.

225. Лобышев В.И. // Тез. докл. II Междунар. Конгр. «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», С-Пб., 2000, с.99.

226. Лобышев В.И., Томкевич М.С., Петрушанко И.Ю. // Биофизика. 2005. Т.50. №3. С.464-469.

227. Зенин С.В., Тяглов Б.В. // ЖФХ. 1994. Т.68. №4. С.636.

228. Зенин С.В. // «Структурированное состояние воды как основа управления поведением и безопасностью живых систем», Автореф. дисс. д-ра биол. наук. М., 1999.

229. Аксенов С.И., Булычев А.А., Грушина Т.Ю. и др. // Тезисы 2-го съезда биофизиков России, Москва, 1999,750.

230. Arad D., Moss К., Elias Y., Aubar J. // World Scientific / Eds.C. Faddei-Ferretti, P.Marotta. Singapore New-Jersey - London - Hong-Hong, 1999, p.313-325.

231. Lester D.S. //Biochim. Biophys. Acta. 1990. V.1054. P.297-303.

232. Полезина А.С. и др. Некоторые особенности действия малых доз азидо-тимидина (AZT) и фактора активности тромбоцитов (PAF) на мембранутромбоцита. // Материалы II Международного симпозиума: Механизмы действия сверхмалых доз, 23 26 мая 1995, Москва.

233. Полезина А.С., Аникиенко К.А., Курочкин В.К. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №5. С.72-79.

234. Гендель Л.Я. Яковлева Н.Е., Лелекова Т.В. и др. Влияние тиролиберина на структурные особенности эритроцитов крыс. // Известия РАН. Серия биологическая. 1997. №1. С. 103-106.

235. Ашмарин И.П., Лелекова Т.В., Санжиева Л.Ц. // Изв. АН. 1992. №4. С.531- 536.

236. Торчинский А.А., Пальмина Н.П. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. №3. С.328-330.

237. Ашмарин И.П., Асанова Л.М., Аббасова К.Р., Чепурнова Н.Е., Косова Г.В., Чепурнов С.А., Инюшкин А.Н., Гончаров О.Б. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. №3. С.324-327.

238. Hostetler K.Y., Zenner D.B., Morris Н.Р. // Biochim. Biophys. Acta., 1976. V.441. P.231-238.

239. Loten E.G., Redshaw-Loten J.C. // Analitical Biochem., 1986. V. 154. P. 183185.

240. Lowry O., Rosenbrouch N., Barr A., Randall R. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.

241. Коварский А.Л. Метод спиновых зондов и меток // Применение электронного парамагнитного резонанса для исследования биологических систем / Отв. ред. Коварский А.Л. М.: МАКС Пресс, 2005, с. 31-49.

242. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. М.: Наука, 1976. 210 с.

243. Гриффит О., Джост П. // Метод спиновых меток. Теория и применение / Ред. Л. Берлинер. М.: Мир, 1979. С. 489-569.

244. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н. Метод спиновых зондов (проблемы и перспективы), под ред. Жданова Р.И. М.: Наука, 1986, с. 212-225.

245. Мальцева Е.Л. Спиновые зонды в изучении биологических мембран // Применение электронного парамагнитного резонанса для исследованиябиологических систем / Отв. ред. Коварский A.JI. М.: МАКС Пресс, 2005, с. 102-121.

246. Butterfield D.A., Whismant С.С., Chesnut D.B. // Biochem. Biophys. Acta. 1976. V.426. P.697.

247. Sauerherber R.D., Gordon L.M., Grosland R.D., Kuwahara M.D. // J. Membr. Biol. 1977. V.31.P.131.

248. Griffith O.H., Dehlinger P.J., and Van S.P. // J. Membrane Biol. 1974. V.15. P.159-192.

249. Рууге Э.К., Герасимова E.H. Метод спиновых зондов (проблемы и перспективы), под ред. Жданова Р.И. М.: Наука, 1986, с. 225-239.

250. Whetton A.D., Houslay M.D., Dodd N.J.F., Evans W.H. // Biochem. J. 1983. V. 214. #3. P. 851-854.

251. M. Shinitzky and M. Inbar // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 433. P.133-149.

252. S.M. Mahler, P.A. Wilce and B.C. Shanley // Int. J. Biochem. 1988. V.20. P.613 619.

253. Кухлинг X. Справочник по физике. М.: Мир, 1983.

254. Chapman D. // Quart. Rev. Biophys. 1975. V.8. P.185 191.

255. F. Severcan and S. Cannistraro // Chem. Phys. Lipids. 1990. V.53. P.17-26.

256. Рихирева Г.Т., Голубев И.Н., Прудченко И.А., Михалева И.И. // Биологические мембраны. 2003. Т.20. №5. С.409-418.

257. Азизова О.А., Торховская Т.Н. Метод спиновых зондов (проблемы и перспективы), под ред. Жданова Р.И. М.: Наука, 1986, с. 239-250.

258. Дерффель К. Статистика в аналитической химии, М.:Мир, 1994, 268 с.

259. Welch B.L. // Biometrika. 1947. V.34. Р.28.

260. Бронштейн И.Н., Семендяев К.А. Справочник по математике для инженеров и учащихся втузов М.: Наука, 1986, 544 с.

261. Захарова Т.В. и др. Патент РФ № 21464350 // Бюл. изобр. 2001. №8.

262. Каргаполов А.В., Зубарева Г.М., Бордина Г.Е. Патент РФ № 2148257 // Бюл. изобр., 2000, №12.

263. Сошникова Л.А., Тамашевич В.Н. Многомерный статистический анализ. М.: Юнита-Дана, 1999, с. 350.

264. Пальмина Н.П., Мальцева Е.Л., Бурлакова Е.Б. // Химическая физика. 1995. Т. 14. №11. С.47-60.

265. Антонов В.Ф., Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.В. Липидные мембраны при фазовых превращениях. М.: Наука, 1992. Гл.4.

266. Харакоз Д.П. //Успехи биологической химии. 2001. Т.41. С.333-364.

267. Шноль С.Э. Физико-химические факторы биологической эволюции. М.: Наука, 1979. Гл. 11.

268. Prosser C.L. // In: Comparative Animal Physiology / Ed. Prosser C.L. Philadelphia-London-Toronto: W.B. Saunders Company, 1973. Chap. 9.

269. Cushley R.J., Forrest B.J., Gillis A. and Tribe J. // Canad. J. Chem. 1979. V.57. P.458-465.

270. Schmidt D., Steffen H. and C. von Planta // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V.443. P. 1-9.

271. Jergil В., SommarinM. //Biochim. Biophys. Acta. 1983. V.758. P.10-16.

272. Azhar S., Butte J., Reaven E. // Biochemistry. 1987. V.26. P.7047-7057.

273. Fridriksson E.K., Shipkova P.A. et al. // Biochemistry. 1999. V.38. P.8056-8063.

274. Schneiter R., Brugger В., Sandhoff R. et al. // J. Cell. Biol. 1999. V.146. P.741-754.

275. Lange Y., Swaisgood M.H. et al. // J. Biol. Chem. 1989. V.264. P.3786-3793.

276. Sankaram M.B., and Thompson Т.Е. // Biochemistry. 1990. V.29. P. 1067010675.

277. Ramstedt В., and Slotte J.P. // FEBS Lett. 2002. V.531. P.33-37.278. van Meer G. // Trends Cell Biol. 1998. V.8. P.29-33.

278. Simons K., Ikonen E. // Nature. 1997. V.387. P.569-572.

279. Mayor S., Sabharanjak S., Maxfield F. // EMBO J. 1998. V.l7. P.4626-4638.

280. Muniz M., Mosomme P., Riezman H. // Cell. 2001. V. 104. P.313-320.

281. Бульенков Н.А. // Тезисы 2-го съезда биофизиков России. Москва, 1999, с. 761.

282. Лобышев В.И., Соловей А.Б., Бульенков Н.А. // Биофизика. 2003. Т. 48. №6. С.1011-1021.

283. Anagnostatos G.S. // High dilution effects on cells and integrated systems / Eds. Faddei-Ferretti C., Marotta P. Singapore; New-Jersey; London; Hong-Hong: World Scientific, 1998. P. 326 334.

284. Лященко A.K., Родштат И.В., Новскова T.A. // Сборник докладов 13-го Российского симпозиума «Миллиметровые волны в медицине и биологии». М., 2003. С. 157-164.

285. Saykally R.P., Blake G.A. // Science. 1993. V.259. P.1570-1575.

286. Liu K, Brown M.G., Cruzan J.D., Saykally R.P. // Science. 1996. V.271. P.62-64.

287. Ямсков И.А., Ямскова В.П., Даниленко A.H., Клеменкова З.С., Антипов Б.Г., Черников Ф.Р., Гусынина М.М., Рыбакова Е.Ю. // Российский Химический Журнал. 1999. T.XLIII. С.34-39.

Информация о работе

Белов, Василий Викторович
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Модификация структуры биологических мембран α-токоферолом в широком диапазоне концентраций - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы