Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие альфа-токоферола со свободными жирными кислотами как нерадикальный механизм стабилизации биологических мембран

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие альфа-токоферола со свободными жирными кислотами как нерадикальный механизм стабилизации биологических мембран"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.161.3

СКРЫПИН Василий Иванович

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ сг-ТОКОФЕРОЛА СО СВОБОДНЫМИ ЖИРНЫМИ КИСЛОТАМИ КАК НЕРАДИКАЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ СТАБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук А.Н.ЕРИН

Москва - 1991

• л ,

-" ) -л ' / "

Работа выполнена в Институте экспериментальной кардиологии Всесоюзного кардиологического научного центра Академии медицинских наук СССР

Научный руководитель: кандидат биологических наук А.Н.Ерин

Официальные оппоненты:

лауреат Государственной премии, профессор,

доктор биологических наук И.И.Иванов

старший научный сотрудник,

кандидат биологических наук Е.В.Никушкин

Ведущее учреждение - Институт биохимии им. А.Н.Баха АН СССР

Защита состоится "19" декабря 1991 г. в 15.30 на заседании Специализированного совета К 053.05.68 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу: 117324, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан "/(5" • 1991 г.

я ....... .....

Отдол

Ученый секретарь Специализированног совета доктор биологических наук

Б.А.Гуляев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Среди множества факторов, определяющих устойчивость и нормальную жизнедеятельность биологических систем, значительную роль играет структурно-функциональное состояние биологических мембран. Известно также, что в обеспечении структурно-функциональной стабильности биологических мембран ключевую роль играют токоферолы (витамин Е), нарушение уровня содержания которых приводит к разнообразным патологическим отклонениям [Dam et al., 1958; Zalkin et al., 1960; Bieri et al., 1970]. Вместе с тем, молекулярные механизмы стабилизирующего действия витамина Е на биологические мембраны до настоящего времени однозначно не определены. Имеется ряд гипотез, предлагающих различные механизмы действия витамина Е. Наиболее распространенной и получившей широкое экспериментальное подтверждение является антиоксидантная гипотеза, согласно которой основной или даже единственной функцией витамина.Е является защита мембранных фосфолипидов от окислительной деструкции [Tappel, 1972; Grams et al., 1972a; Иванов и др., 1979, 1986; McCay, 1985]. Однако в настоящее время накоплен значительный материал, позволяющий сделать вывод, что антиокислительная активность токоферолов не является их единственной функцией в биологических мембранах. В частности, среди альтернативных гипотез внимание привлекает концепция Люси-Диплока [Lucy, 1972; Diplock et al., 1973; Maggio et al. 1977], согласно которой структурно-функциональная стабилизация мембран а-токоферолом осуществляется за счет стерического взаимодействия между метильными группами токоферола и двойными связями жирнокислотных цепей фосфолипидов, в результате чего достигается более плотная укладка гидрофобных цепей липидов в мембране. Важнейшим следствием этой гипотезы является возможность прямого влияния а-токоферола на такие фундаментальные параметры мембраны, как микровязкость липидной фазы, трансмембранный потенциал, пассивная проницаемость, фазовое состояние липидного бислоя.

Интерес к антиоксидантной гипотезе механизма действия витамина Е во многом объясняется тем, что перекисное окисление липидов в биологических мембранах является одним из двух физиологически и патофизиологически значимых способов модификации липидных мембран. Вторым способом модификации является гидролиз фосфолипидов фосфолипазой А2, в результате которого образуются свободные жирные кислоты (СЖК) и лизофосфолипиды, появление

которых в составе биомембран вызывает изменение их структурно-функциональных свойств.

Однако возможность стабилизации свойств мембран витамином Е при действии СЖК и лизофосфолипидов изучена недостаточно. Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение взаимодействия а-токоферола с СЖК и лизофосфолипидами как одного из возможных механизмов биологического действия витамина Е.

Для достижения данной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) Изучить механизмы взаимодействия ог-токоферола с СЖК и лизофосфолипидами в органических растворах;

2) Исследовать стабилизацию физических свойств модельных фосфолипидных мембран а-токоферолом при действии СЖК;

3) Уточнить локализацию а-токоферола в липидном бислое;

4) Оценить возможность стабилизации структурно-функциональных свойств мембран синаптосом при действии СЖК и фосфолипазы А2. Научная новизна

В работе впервые с использованием методов ЯМР-спектроскопии высокого разрешения, парамагнитных и флуоресцентных зондов, спектрофлуорометрии исследованы механизмы взаимодействия а-токоферола со свободными жирными кислотами и лизофосфолипидами, а также влияние этого взаимодействия на физико-химические параметры искусственных и структурно-функциональные свойства биологических мембран. Обнаружено, что в растворе реализуются два типа взаимодействия между молекулами а-токоферола и СЖК: полярное взаимодействие ОН-группы хроманового ядра токоферола с С=0-группой СЖК и взаимодействие ацильных цепей СЖК с метильными группами хроманового ядра а-токоферола. Последнее взаимодействие резко усиливается при увеличении числа двойных связей в молекуле СЖК и проявляется в ограничении молекулярной подвижности молекулы токоферола. В растворе аналогичное взаимодействие наблюдается между СЖК и пентаметилхроманом, в котором фитольная цепь замещена на метильную группу, а также с синтетическим антиоксидантом ионолом. Установлено, что взаимодействие реализуется также между токоферолом и такими продуктами фосфолипазного гидролиза как фосфатидная кислота и лизофосфатидилхолин.

Методом ЯМР-спектроскопии высокого разрешения с использованием парамагнитных сигнал-сдвигающих реагентов уточнена оценка топографии токоферола в фосфолипидном бислое. Показано,

что хромановое ядро а-токоферола локализовано в области глицериновых остовов фосфолипидов.

Методом HX-HMP спектроскопии высокого разрешения и ЭПР-спинового зондирования продемонстрирована способность а-токоферола оказывать холестериноподобное действие на физическое состояние бислоя - упорядочивать ненасыщенные и разупорядочивать насыщенные фосфолипидные бислои. С использованием регистрации потенциал-зависимой флуоресценции (ПЗФ) зонда 3,3'-дипропил-2,2'-тиодикарбоцианина (diS-C3(5)) установлено, что в отличие от пентаметилхромана и ионола а-токоферол способен стабилизировать трансмембранный потенциал мембран синаптосом от деполяризующего действия фосфолипазы А2 и СЖК.

Обнаружена повышенная чувствительность синаптосом, изолированных из мозга Е-дефицитных крыс, к деполяризующему действию СЖК. Продемонстрирована способность экзогенного а-токоферола восстанавливать чувствительность синаптосом к действию СЖК. Научно-практическая значимость

Полученные результаты расширяют представление о молекулярных механизмах, обеспечивающих биологическое действие витамина Е. Данные, указывающие на возможность стабилизации структурно-функциональных свойств нейрональных мембран при действии фосфолипазы А2 и продуктов гидролиза фосфолипидов фосфолипазой (\2, позволяют рассматривать возможность использования витамина Е цля преодоления патологических состояний мозга, сопровождающихся аномалиями липидного обмена. Апробация диссертаиии

Результаты работы докладывались на I Всесоюзной конференции "Принципы и механизмы деятельности мозга человека" (Ленинград,

1985), симпозиуме "Drug metabolizing enzyme systems" (Sofia,

1986), межинститутской конференции Института экспериментальной кардиологии и Института клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова ЗКНЦ АМН СССР (Москва, 1987) и на V Всесоюзном семинаре "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине" (Рига, 1988). "Io материалам дисертации опубликовано 13 научных работ, получено авторское свидетельство.

Рбъем и структура работы Диссертация изложена на 127 страницах, зключая 29 рисунков, 6 таблиц и список цитируемой литературы (127 1сточников). Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения и зыводов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Введение Во введении показана актуальность исследования, сформулированы цель и экспериментальные задачи работы.

2. Обзор литературы В этой главе дан обзор исследовательских работ, затрагивающих проблемы, связанные с выполненной работой Обзор литературы включает следующие разделы: Основные сведения о витамине Е; Физиологические проявления дефицита витамина Е; Влияние <*-токоферола на физические свойства модельных липидных мембран; Витамин Е как ингибитор липидных свободных радикалов; Витамин Е как тушитель синглетного молекулярного' кислорода; Структурные эффекты витамина Е в биологических мембранах; Структурно-функциональная стабилизация биологических мембран с<-токоферолом при повреждениях, вызванных действием фосфолипазы А2.

3. Материалы и методы В экспериментах по изучению взаимодействия а-токоферола с СЖК в растворах использовали спектрофотометры "Регк1п-Е1тег 555" (Великобритания), "Н^асМ-220А" , "Hi.tachi.-350" (Япония) со стандартными кюветами. Спектры Н1-ЯМР регистрировали на Фурье-спектрометре УЩ-270 ("Вгикег", ФРГ) в ампулах диаметром 5 мм, объем образцов составлял 1 мл, в качестве растворителя использовали дейтерированный хлороформ С0С13, в качестве внутреннего стандарта использовали сигнал хлороформа - 7.25 м.д. (миллионные доли), измерения проводили с использованием термоприставки, точность термостатирования - +1°С. Обработку спектров проводили на ЭВМ ВИС-12 ("М1со1е^", США) по программе ЫТСЕТ, полуширина сигналов рассчитывалась как отношение площади пика к его амплитуде. Аналогичным образом исследовали взаимодействие ионола с СЯК. При исследовании взаимодействия а-токоферола с фосфатидной кислотой и лизолецитином был использован ЯМР-спектрометр "Вгикег" Ш-500 (ФРГ).

В экспериментах по изучению взаимодействия а-токоферола с СЖК в липидных мембранах использовали липосомы, приготовленные в калий-фосфатном буфере на тяжелой воде (020) методом ультразвуковой обработки на дезинтеграторе "Боп1ргер" (МБЕ, Великобритания) при 0°С в атмосфере аргона. Спектры ЯМР липосом регистрировали на спектрометре "Вгикег" ЮН-270 (ФРГ) в 5 мм кюветах, с точностью поддержания температуры +1°С. При изучении температурных зависимостей измерения производили во всех случаях от более низких температур к более высоким. При изучении локализации а-токоферола в липидном бислое липосомы как для ЯМР-, так и для флуоресцентных измерений также готовились на

ультразвуковом дезинтеграторе "Soniprep" на основе Трис-буфера. Полученные образцы центрифугировали для осаждения многослойных липосом при 140000 g в течение 40 мин., для измерений использовали супернатант. Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре "Perkin-Elmer" MPF-44 (Великобритания). При оценке микровязкости липидного бислоя по данным ЭПР-спектроскопии в качестве зонда использовали 12-имоксилстеариновую кислоту из расчета 1 молекула кислоты на 200 молекул липида. Спектры ЭПР регистрировали на малогабаритном ЭПР-спектрометре производства объединения "Светлана" (Санкт-Петербург). Для оценки фазового состояния использовали температурные зависимости двух расченых характеристик: 1) времени вращательной корреляции зонда в бислое и 2) коэффициента распределения зонда между водной и липидной фазами.

При изучении влияния а—токоферола на структурно-функциональную стабильность биологических мембран использовали синаптосомы, выделенные из серого вещества крыс линии Вистар по методу Хайоша [Hajos, 1975]. Изменение трансмембранного потенциала (ТМП) регистрировали с помощью флуоресцентного зонда diS-C3(5), причем снижение ТМП соответствовало увеличению интенсивности ПЗФ diS-C3(5), встроенного в мембраны синаптосом [Ерин и др., 1985]. Измерения проводили на спектрофлуориметре "Hitachi-850" (Япония). Концентрация синаптосом (по белку) в образцах составляла 0.3 мг белка на 1 мл, концентрация зонда -10 мкМ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 4.1 Механизмы взаимодействия ог-токоферола со свободными жирными кислотами и лизофосфолипидами в растворах. Простейшей моделью для определения механизмов взаимодействия а-токоферола с липидами может служить раствор этих соединений в гидрофобном растворителе, таком как хлороформ. Известно, что в хлороформе липиды могут образовывать инвертированные лабильные мицеллы, в центре которых расположены полярные "головы". Поскольку размер этих мицелл очень невелик и входящие в их состав молекулы обладают высокой подвижностью, то любые взаимодействия, приводящие к уменьшению подвижности отдельных групп, будут заметно сказываться на ширине сигналов в спектрах ЯМР. Поэтому для идентификации групп атомов, участвующих во взаимодействии а-токоферола с СЯК использовали HJ-HMP спектроскопию высокого разрешения. На рис.1А представлен протонный спектр ЯМР а-токоферола в дейтерированном

хлороформе. В спектре а-токоферола сигнал с 6=4.31 м.д. соответствует протонам ОН-группы хроманового ядра, сигналы с 6=1.76 и 2.59 м.д. - протонам гетероцикла в положениях 3,4, дублет с 6=2.10-2.15 м.д. - протонам метильных групп хроманового ядра, сигнал с 6=1.21 м.д. - протонам метиленовых групп, триплет с 6=0.84, 0.82, 0.80 м.д. - протонам метильных групп фитольной цепи. Введение в раствор а-токоферола СЖК приводит к изменениям в спектре, которые можно разделить на два типа (рис.1Б). Первый тип представляет собой уширение сигнала протонов ОН-группы а-токоферола (6=4.31 м.д.), которое наблюдается при внесении в раствор а-токоферола как насыщенных, так и ненасыщенных СЖК. Второй тип изменений - это уширение сигналов метильных групп хроманового ядра и метиленовых групп фитольной цепи а-токоферола, возникающие только при добавлении к раствору а-токоферола ненасыщенных СЖК.

В наибольшей степени уширяется сигнал ОН-группы, наличие которой, как принято считать, определяет биологическую активность а-токоферола. Такое уширение сигнала с 6=4.31 м.д. свидетельствует об участии ОН-группы хроманового ядра а-токоферола во взаимодействии как с ненасыщенными (олеиновая, линолевая,

Рис.1 Н1-ЯМР-спектры высокого разрешения растворов а-токоферола (5"10-2 М) (А) и а-токоферола в присутствии арахи-доновой кислоты (5*10_3 М) (Б) в дейтерированном хлороформе .

арахидоновая), так и с насыщенной пальмитиновой кислотой, и отражает наличие протонного обмена между а-токоферолом и СЖК.

Уширение дублетного сигнала а-токоферола с 6=2.10-2.15 м.д., который соответствует протонам метильных групп хроманового ядра в положениях 5,7,8 практически не зависит от температуры, но зависит от числа двойных связей в молекуле СЖК. При взаимодействии а-токоферола с ненасыщенными СЖК уширение этого сигнала резко увеличивается в ряду олеиновая, линолевая и арахидоновая кислоты, тогда как уширения этого сигнала при взаимодействии с пальмитиновой кислотой зарегистрировать не удается.

Таким образом, совокупность полученных данных позволяет заключить, что в растворе хлороформа между а-токоферолом и СЖК имеется два типа взаимодействий: 1) полярное взаимодействие между ОН-группой хроманового ядра а-токоферола и карбоксильной группой СЖК; 2) взаимодействие углеводородных цепей СЖК с метильными группами хроманового ядра молекулы а-токоферола. Последнее взаимодействие резко усиливается при увеличении числа двойных связей в молекуле СЖК, что приводит к ограничению подвижности молекулы а-токоферола и проявляется в уширении сигналов в протонном спектре ЯМР.

Существенной особенностью предлагаемой модели взаимодействия а-токоферола с СЖК является то, что фитольная цепь а-токоферола не принимает участия во взаимодействии. Если предложенная модель взаимодействия верна, то оно должно наблюдаться и в результате связывания СЖК с ПМХ, в котором фитольная цепь замещена на метильную группу. Действительно, взаимодействие ПМХ с пальмитиновой кислотой выражается только в уширении сигнала протона ОН-группы ПМХ (6=4.00 м.д.). Взаимодействие ПМХ с линолевой кислотой, помимо уширения сигнала с 5=4.00 м.д., сопровождается также уширением дублета с 6=2.32-2.29 м.д., который соответствует протонам метильных групп ПМХ в положениях 5,7,8, и не влияет на сигнал метильных групп в положении 2.

Предложенная структура комплексов а-токоферола с СЖК подтверждается на молекулярных моделях: при взаимодействии между карбоксильной группой линолевой кислоты и ОН-группой а-токоферола 9,10- и 12,13-цис-двойные связи СЖК образуют структуру, комплементарную метильным группам хроманового ядра. Аналогичная структура образуется при связывании СЖК с ПМХ. Таким образом, приведенные результаты свидетельствуют об образовании комплексов

а-токоферола с СЖК, что позволяет перейти к рассмотрению возможности такого рода взаимодействия в липидном бислое. 4.2 Стабилизирующее действие и локализация сг-токоферола в липидных мембранах. Известно, что СЖК обладают хаотропным (разжижающим) действием на липидный бислой биомембран [Свищук, Басалкевич, 1975]. Хотя их содержание в биомембранах в норме невелико (менее 1%), оно резко увеличивается при ряде патологических состояний, таких как стрессорное повреждение, гипоксия, ишемия и т.д. [Kunze et al. , 1975]. В то же время, микровязкость липидного бислоя биомембран существенным образом влияет на структурные и функциональные свойства их белковых компонентов: ферментативную активность, лиганд-рецепторные взаимодействия, каналообразующие характеристики [Gozlan et al.,1989]. Это обстоятельство предполагает наличие механизмов стабилизации микровязкости липидного бислоя биомембран. В этой связи следующая серия экспериментов была посвящена исследованию взаимодействия а-токоферола с СЖК как возможного механизма стабилизации микровязкости липидного бислоя.

Для исследования взаимодействия а-токоферола со свободными жирными кислотами как возможного механизма стабилизации липидного бислоя биомембран наиболее удачным объектом, по-видимому, являются однослойные липосомы. Преимущества такого подхода заключаются в следующем: во-первых, однослойные липосомы обладают наиболее общими свойствами липидного бислоя биологических мембран; во-вторых, в случае липосом не нужно учитывать возможное взаимодействие СЖК с гидрофобными белками биомембран, что позволяет наиболее адекватным образом изучать их взаимодействие с сг-токоферолом; в-третьих, при таком подходе можно использовать чувствительные методы регистрации состояния липидного бислоя -импульсные методы радиоспектроскопии и флуоресцентные зонды.

В первой серии экспериментов исследовали влияние сг-токоферола и СЖК на микровязкость насыщенных липосом с помощью метода Н1-ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. На рис.2 приведены Н1-ЯМР-спектры высокого разрешения липосом из дипальмитоил фосфати-дилхолина (ДПФХ) с различными добавками в диапазоне температур от 30 до 50°С. Сигналы при 0.9, 1.3, 3.2 м.д. относятся к протонам СН3-, ог-СН2-групп жирнокислотных ацилов и N(CH3)3+-rpynn ДПФХ, соответственно. Видно, что фазовый переход липосом из ДПФХ наблюдается в районе 40°С, что хорошо согласуется с литературными данными. Внесение 20 мольных процентов линолевой кислоты в

липосомы из ДПФХ значительно изменяет характер перехода гель-жидкий кристалл, сдвигая точку фазового перехода в область низких температур и увеличивая ширину области температур фазового перехода (рис.2В). Аналогичное действие оказывает внесение в бислой 5 мольных %

сг-токоферола (рис.2Б). В то же время, внесение в бислой а-то-коферола и линолевой кислоты в тех же концентрациях совместно в значительной мере приближает картину плавления бислоя к той, которая имеет место для чистого ДПФХ (рис.2Г). Такой же, но несколько менее выраженный эффект наблюдается при введении в липидный бислой липосом из ДПФХ 15 мольных % линолевой кислоты и 5 мольных % сг-токоферола.

В следующей серии экспериментов исследовали влияние а-токо-ферола и свободных жирных кислот на микровязкость ненасыщенных липосом с помощью ЭПР-спинового зондирования. На рис.3 представлены температурные зависимости распределения 12-имоксилстеариновой кислоты между водной и липидной фазами в суспензии липосом из олеил-пальмитоил фосфатидил этаноламина (ОПФЭА). Как видно из данных, представленных на рис.3, кривая плавления липосом из ОПФЭА представляет собой типичную Б-образную кривую с точкой перегиба при 15°С (в координатах

1 а б в г

Рис.2 Спектры Н -ЯМР липосом различного состава при темпера-

турах от 30 до 50°С. а - липосомы из чистого ДПФХ; б - липосомы из ДПФХ + 5 мол.% а-токоферола (молярное соотношение ДПФХ-ЛК-а-токофер'ол 100:0:5); в - липосомы из ДПФХ + 20 мол.% ЛК (100:20:0); г - липосомы из ДПФХ + 20 мол.% ЛК + 5 мол.% а-токоферола (100:20:5)

270 290 310 330

Рис.3 Температурные зависимости изменения относительного содержания 12-имоксилстеариновой кислоты в водной фазе суспензии липосом, приготовленных из ОПФЭА (1), ОПФЭА + + 15 мол.% арахидоновой кислоты (2), ОПФЭА + 15 мол.% арахидоновой кислоты + 5 мол.% ПМХ (3), ОПФЭА + 15 мол.% арахидоновой кислоты + 5 мол.% а-токоферола (4). А - количество зонда в водной фазе, А0 - общее количество зонда.

(1-А/А0) от температуры, в точке перегиба (1-А/Ао)=0.5. Введение в состав липосом из ОПФЭА 15 мольных % арахидоновой кислоты приводит к отчетливому разупорядочивающему действию. Это выражается в том, что во всем измеряемом диапазоне температур (от О до 40°С) липосомы находятся в жидко-кристаллическом состоянии (значение (1-А/А0) близко к 1).

Введение в липосомы из ОПФЭА на фоне арахидоновой кислоты 5 мольных % а-токоферола полностью снимает ее хаотропное действие. Более того, при этом температура фазового перехода сдвигается в область более высоких температур по сравнению с контрольными липосомами. Аналог а-токоферола, лишенный фитольной цепи, ПМХ в той же концентрации не стабилизирует микровязкости липосом, хотя так же как а-токоферол способен образовывать комплексы с СЖК в органических растворителях. Как видно из данных, представленных на рис.3, кривая плавления липосом в координатах (1-А/А0) от температуры в присутствии арахидоновой кислоты практически не меняется при введении ПМХ. Аналогичные результаты были получены при другом способе обсчета спектров - расчете времени

зращательной корреляции 12-имоксилстеариновой кислоты тс в зислое.

Совокупность полученных результатов позволяет сделать ряд :ущественных заключений. а-Токоферол действительно способен :табилизировать микровязкость липидного бислоя при действии СЖК. 5 отличие от а-токоферола, его аналог ПМХ, лишенный фитольной ;епи, хотя и способен образовывать комплексы с СЖК в растворах, 1е стабилизирует микровязкости липосом при введении СЖК. Это указывает, что для связывания СЖК в бислое и проявления тем :амым стабилизирующего действия на микровязкость в равной степени 1еобходимы как хромановое ядро, так и фитольная цепь молекулы 1-токоферола.

Обнаруженный стабилизирующий эффект не зависит существенным эбразом от степени ненасыщенности как СЖК, так и жирнокислотных 1цилов фосфолипидов бислоя, так как наблюдается и в насыщенных, и 5 ненасыщенных липосомах. Стабилизирующее действие а-токоферола т микровязкость мало зависит также от химической структуры юлярной функциональной группы фосфолипидов, поскольку фоявляется в липосомах из фосфатидилхолина, и из эосфатидилэтаноламина - основных фосфолипидов, входящих в состав Зиологических мембран. Наконец, обнаруженный эффект стабилизации ш зависит от гидрофобности группы атомов, входящих в состав юсфолипидов, так как по данным ЯМР-спектроскопии проявляется и в 'идрофильной, и в гидрофобной областях бислоя. Все это ¡видетельствует о том, что обнаруженный эффект стабилизации шкровязкости бислоя а-токоферолом при действии свободных жирных сислот не носит частного характера, не зависит от состава сомпонентов липидного бислоя и поэтому должен проявляться в >азличных биологических мембранах. Это в свою очередь позволяет ¡читать, что стабилизацию микровязкости липидного бислоя а-то-соферолом при действии СЖК можно рассматривать как один из юлекулярных механизмов мембранного гомеостаза. Можно полагать, [то значимость такого молекулярного механизма многократно юзрастает при патологических ситуациях, связанных с резким гвеличением содержания СЖК в биомембранах, таких как стрессорное ювреждение, гипоксия, ишемия и другие.

Каким образом данные о необходимости фитольной цепи а-•окоферла для образования комплексов с СЖК в бислое согласуется с юзультатами, полученными при исследовании природы комплексов -токоферола с СЖК в растворах? По-видимому, возможны два

объяснения. Первое сводится к следующему: можно полагать, что и в липидном бислое ПМХ, так же, как а-токоферол, способен связывать СЖК, но при этом образовавшийся комплекс в силу особенностей архитектоники липидного бислоя вызывает в нем дефекты, аналогичные тем, которые связаны с влиянием СЖК, что не позволяет устранить хаотропного действия и ионных утечек, обусловленных присутствием в бислое СЖК. Схематично эти различия в комплексообразовании СШК а-токоферолом и ПМХ представлены на рис.4.

Рис. 4 Схема образования комплексов а-токоферола и ПМХ с СЖК в липидном бислое.

Второй вариант объяснения различий в действии ПМХ и а-токоферола связан с особенностями локализации а-токоферола и ПМХ в бислое. Действительно, а-токоферол достаточно жестко фиксирован в липидном бислое, тогда как ПМХ обладает высокой подвижностью [Тюрин и др., 1986]. В силу этого можно предположить, что высокая подвижность ПМХ приводит к его пространственному разделению с СЖК. Иными словами, высокая подвижность может существенно снижать концентрацию ПМХ в местах локализации СЖК в бислое. В этой связи необходимо было более подробно рассмотреть вопросы, связанные с топографией а-токоферола в липидном бислое.

Решение вопроса о локализации а-токоферола в липидном бислое практически сводится к выяснению локализации хроманового ядра. Известно, что хромофорной группой а-токоферола является хромановое ядро. Поэтому в первой серии экспериментов мы исследовали флуоресцентные свойства а-токоферола как функцию гидрофобности его окружения. Величины максимумов как возбуждения, так и испускания флуоресценции зависят от полярности растворителя. В неполярном растворителе максимум возбуждения флуоресценции лежит в более длинноволновой области, а максимум

[спускания флуоресценции в более коротковолновой области, чем в юлярном растворителе. При исследовании спектров флуоресценции токоферола в ряду спиртов с увеличивающейся гидрофобностью >бнаружено, что в неполярных спиртах, а также в углеводородах бензоле, гексане, гептане) положения максимумов в спектрах шуоресценции а-токоферола такие же, как и в липосомах, [риготовленных из насыщенных и ненасыщенных фосфолипидов, и >тличаются от соответствующих величин в более полярных спиртах ^метиловом, этиловом, пропиловом и бутиловом) (табл.1). С учетом •ого, что за флуоресценцию а-токоферола ответственно его :романовое ядро, приведенные результаты показывают, что фоматическая часть молекулы а-токоферола локализована в [ипосомах в гидрофобной области бислоя.

Приведенные данные указывают на то, что хромановое ядро а-•окоферола, так же как и его фитольная цепь, локализовано в •идрофобной области липидного бислоя. Однако остается неясным, [асколько глубоко погружено хромановое ядро в липидный бислой. (ля выяснения этого вопроса было использовано свойство а-то-гаферола окисляться под действием феррицианида до а-токоферил-п-:инона, который в отличие от а-токоферола не флуоресцирует, ¡ведение феррицианида в суспензию однослойных липосом, содержащих —токоферол, приводит к тому, что интенсивность флуоресценции —токоферола быстро снижается на 50%, а затем изменяется очень [едленно. Это говорит о том, что молекулы а-токоферола, гакализованные в наружном монослое однослойных липосом, доступны ;ля действия феррицианида, в отличие от молекул, локализованных ю внутреннем монослое. При этом ОН-группа хроманового ядра -токоферола, которая окисляется феррицианидом, должна быть [окализована в непосредственной близости к разделу фаз ;ода/липид. Суммируя данные флуоресцентных измерений, можно аключить, что молекула а-токоферола в липидном бислое целиком :окализована в гидрофобной области, но при этом хромановое ядро >асположено недалеко от границы раздела фаз вода/липид.

Более точное определение положения хроманового ядра молекулы -токоферола в гидрофобной области бислоя было получено с помощью одорастворимого и гидрофобного сдвигающих реагентов. Известно, то введение в суспензию липосом солей ряда редкоземельных лементов приводит к изменению химического сдвига сигналов заимодействующих с ним химических групп липидов, находящихся во нешнем монослое. При этом индуцированный парамагнитный сдвиг тем

Таблица 1

Параметры спектров возбуждения и испускания флуоресценции а-токоферола в растворителях с различной полярностью и в липосомах, содержащих насыщенные и ненасыщенные фосфолипиды

Растворитель, состав липосом

Показатель гидрофобности Ганша_

Положение максимума в спектрах Флуоресценции, нм возбуждение испускание

СПИРТЫ:

Метиловый, СН2ОН -0.66

Этиловый, С2Н50Н -0.32

Пропиловый, С3Н?0Н 0.34

Бутиловый, С4Н90Н 0.88

Амиловый, С5Н110Н 1.40

Каприловый, С8Р170Н 3.15 УГЛЕВОДОРОДЫ:

Бензол, С6Н6 2.13

Гексан, С6Н14 3.00

Гептан, С?Н16 3.50 ЛИПОСОМЫ: Из липидов мозга Из синтетических фосфатидилхолинов:

- динонаноил-

- дидеканоил- -

- дилауроил- -

- димиристоил-_-

296 296 296 296 303 303

303 303 303

303

303 303 303 303

325 325 325 325 322 322

322 322 322

322

322 322 322 322

Концентрация а-токоферола в растворах и суспензиях липосом- 10-5М Концентрация синтетических фосфолипидов - 10_3 М, липидов мозга -0.5 мг/мл, трис-НС1 буфер - 50 мМ, рН 7.2 при 25°С.

больше, чем ближе находится данная группа к месту связывания иона лантаноида [Вагэикоу еЪ а1., 1975]. Этот метод широко используется для исследования топографии и конформации липидов в липосомах. Введение в суспензию липосом из ДПФХ 10 мМ водорастворимого шифт-реагента Рг(М03)3 (рис.5) приводит к индуцированному сдвигу в низкое поле на 0.35 м.д. сигнала холиновых метилов внешнего слоя мембран липосом (метилы холинов внутреннего слоя, естественно, недоступны для водорастворимого Рг(Ш3)3). При этом отсутствует индуцированный химический сдвиг сигналов метилов хроманового ядра а-токоферола, что указывает на

u.a.

'ис. 5 А) Н1-ЯМР (500 МГц) спектры липосом, содержащих:

1) ДПМХ (20 мМ) в Трис-DCl буфере (pD 7.6, при 50°С);

2) то же, что ив (1) +25 мольных % а-токоферола;

3) то же,, что и в (2) + 10 мМ Pr(N03)3.

Б) Н1-ЯМР (500 МГц) спектры липосом в области сигнала а-СН?-групп ацильных цепей:

1) ДПФХ (20 мМ) в Трис-DCl буфере (pD 7.6; 50°С);

2) то же, что и в (1) + 5 мольных % Eu(F0D)3~d27;

3) то же, что'и в (2) + 25 мольных % а-токоферола

1едоступность хроманового ядра для водорастворимого шифт-реагента 'г(Ы03)3. Поскольку известно, что в лецитиновом бислое ионы фазеодия связываются с фосфатной группой фосфолипидов [Ваггикоу ¡Ъ а1., 1975], это означает, что хромановое ядро а-токоферола не гаходится в непосредственной близости к фосфатной группе ДПФХ, а югружено в липидный бислой ниже, т.е. за разделом фаз липид/ юда.

При введении в липосомы из ДПФХ шифт-реагента трис-2,2'-бис-тридейтерометил)1,1,1,-тридейтеро-6,6'7,7'8,8,8-гептафтор-З,5-жтандионато-европий (Еи(Г00)3-с127) наблюдается изменение сигнала г-СН2-групп ацильных цепей: этот сигнал приобретает мультиплетную :труктуру в области высокого поля. Аналогичные изменения фоисходят и с сигналом метилов хроманового ядра. Это доказывает, :то хромановое ядро а-токоферола локализовано в липидном бислое, I непосредственной близости к а-СН2-группам ацильных цепей юсфолипидов.

,.3 Влияние а-токоферола на некоторые функции мембран синаптосом.

С целью выяснения механизмов стабилизации мембран синаптосом -токоферолом и роли отдельных функциональных групп его молекулы

были сопоставлены эффекты а-токоферола, токоферол-ацетата, ПМХ и ионола при действии фосфолипазы А2 на синаптосомы.

В первой серии экспериментов сопоставляли действие а-токоферола, его производных токоферол-ацетата и ПМХ, а также ионола на потенциал-зависимую флуоресценцию (ПЗФ) в синаптосомах, обработанных фосфолипазой А2. Обработка синаптосом фосфолипазой А2 приводит к увеличению интенсивности ПЗФ флуоресцентного зонда с113-С3(5) (т.е. к их деполяризации), которая достигает максимальных величин через 1.5-2 минуты инкубации. Ранее было показано, что в этих условиях при инкубации синаптосом с фосфолипазой А2 насыщение ПЗФ достигается при гидролизе 7-10% мембранных фосфолипидов [Ерин и др., 1985]. Введение а-токоферола в концентрации Ю-4 М (т.е. около 10 мольных процентов по отношению к мембранным фосфолипидам) приводит к восстановлению величины ТМП и даже некоторой гиперполяризации. Введение таких же концентраций токоферол-ацетата, ПМХ и ионола не влияет на ПЗФ сИБ-С3(5) в суспензии синаптосом, обработанных фосфолипазой А2.

Итак, в отличие от растворов, в мембранах для связывания продуктов гидролиза фосфолипидов необходимо не только хромановое ядро а-токоферола с ОН-группой, но и фитольная цепь, которая, по-видимому, обеспечивает правильную ориентацию и влияет на локализацию молекулы в липидном бислое. Учитывая, что развитие Е-авитаминоза сопровождается изменением липидного состава биомембран и, в частности, увеличением содержания в них СЯК [МасИНп, 1980, 1984], естественно предположить, что одним из механизмов повреждения мембран при дефиците витамина Е является повышение их чувствительности к действию СШК, которые не могут быть связаны присутствующими в мембранах концентрациями а-токоферола. С целью экспериментальной проверки этого предположения была сопоставлена эффективность повреждающего действия СЖК на синаптосомы, выделенные из мозга контрольных и Е-дефцитных животных.

В следующей серии экспериментов, регистрируя потенциал-зависимую флуоресценцию сИБ—С3(5), исследовали изменения ТМП в синаптосомах мозга контрольных и Е-авитаминозных животных при добавлении свободных жирных кислот. Как следует из данных, представленных на рис.6, добавление к суспензии синаптосом в среде покоя арахидоновой кислоты вызывает их деполяризацию, что проявляется в увеличении интенсивности ПЗФ сИЗ-С3(5). При сравнении действия арахидоновой кислоты на синаптосомы

lili

F/F„

I.I

1.0

0.9

I

б мин.

'ис.6 Кинетика изменения потенциал-зависимой

флуоресценции сИЭ—С3С5), встроенного в мембраны синаптосом, выделенных из мозга контрольных (сплошная линия) и Е-дефицитных животных (пунктирная линия) при действии арахидоновой кислоты и а-токоферола. Стрелки вниз - моменты введения СЖК, стрелка вверх -■момент введения а-токоферола.

;онтрольных и Е-дефицитных животных обращают на себя внимание два эффекта: а) насыщающие концентрации арахидоновой кислоты, ¡ызывающие максимальное увеличение ПЗФ, для опытной группы (еньше, чем для контрольной (сЬответственно 4*10-бМ и 6*10_бМ), >) амплитуда максимального изменения ПЗФ при действии насыщающих юнцентраций арахидоновой кислоты в опытной группе ниже, чем в ;онтрольной.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Совокупность результатов свидетельствует о том, что а-■окоферол способен связывать продукты гидролиза фосфолипидов юсфолипазой ,А2 - СЖК и лизофосфолипиды. Необходимо отметить, что заимодействие а-токоферола с СЖК наблюдается как в гомогенных истемах (органические растворы), так и в модельных и иологических мембранах. Это взаимодействие в мембранных системах роявляется, в частности, в нормализации как физико-химических микровязкость, параметры термотропных фазовых переходов) свойств одельных бислоев, так и структурно-функциональных свойств иологических мембран (ТИП синаптосом), измененных в результате ействия СЖК.

Обнаруженная способность а-токоферола образовывать комплексы СЖК и лизофосфолипидами имеет важное биологическое значение, то значение определяется тем, что гидролиз фосфолипидов фосфоли-

пазой А2 является одним из двух физиологически и патофизиологически значимых механизмов модификации липидного бислоя. В этой связи способность а-токоферола связывать продукты гидролиза фос-фолипидов фосфолипазой А2 и тем самым устранять их модифицирующее действие можно рассматривать как один из молекулярных механизмов, обеспечивающих структурно-функциональную стабилизацию биомембран. Помимо результатов, приведенных в данном исследовании, такому заключению хорошо соответствует эффект стабилизации структурно-функциональных свойств мембран микросом печени и саркоплазмати-ческого ретикулума а-токоферолом при действии СЖК [Табидзе и др., 1983; Ананиева и др., 1984; Винер и др., 1986]. Существенная значимость данного механизма подтверждается результатами настоящей работы, согласно которым развитие дефицита витамина Е у крыс приводит к повышению чувствительности мембран мозга к действию СЖК. Этому заключению хорошо соответствуют результаты, полученные при изучении действия СЖК на систему цитохрома Р-450 микросом печени крыс [Винер и др., 1986].

Совокупность приведенных результатов свидетельствует также о том, что при рассмотрении молекулярных механизмов структурно-функциональной стабилизации мембран витамином Е необходимо учитывать как способность токоферола ингибировать перекисное окисление липидов, инактивировать синглетный молекулярный кислород, оказывать структурирующее действие на бислои, так и установленную в настоящей работе способность защищать мембраны от повреждающего действия фосфолипазы А2 путем образования комплексов с СЖК и лизофосфолипидами (рис.7).

Рис.7 Схема молекулярных механизмов стабилизации биологических мембран а-токоферолом.

выводы

а-Токоферол в органических растворах образует комплексы с СЯК. Образование комплексов, по данным Н1-ЯМР спектроскопии высокого разрешения, реализуется за счет двух видов взаимодействия: а) полярного взаимодействия ОН-группы «-токоферола с карбоксильной группой СЖК и б) неполярного взаимодействия метилов хроманового ядра а-токоферола с двойными связями жирной кислоты.

Методами Н1-ЯМР спектроскопии высокого разрешения с использованием парамагнитных сдвигающих реагентов и методами спектрофлуоресценции установлено, что а-токоферол локализован в гидрофобной зоне бислоя модельных фосфолипидных мембран. Хромановое ядро а-токоферола имеет в бислое значительно более низкую подвижность, чем холиновая группа фосфатидилхолина, и расположена в зоне глицериновых остовов липидов.

а-Токоферол снижает .хаотропное действие СЖК в фосфолипидных бислоях, стабилизируя характер термотропного фазового перехода. Стабилизация физического состояния бислоя при действии СЖК реализуется в липосомах, сформированных как из насыщенных, так и из ненасыщенных фосфолипидов. При взаимодействии а-токоферола и СЖК в липидных бислоях, в отличие от органических растворов, существенную роль играют как хромановое ядро, так и изопреноидная цепь а-токоферола. В отсутствие СЖК а-токоферол оказывает холестериноподобное действие на физическое состояние липидного бислоя упорядочивает ненасыщенные бислои и разупорядочивает насыщенные.

Установлено, что а-токоферол стабилизирует структурно-функциональные свойства мембран синаптосом при действии СЖК. Дефицит витамина Е повышает чувствительность синаптосом к повреждающему действию СЖК. Экзогенный а-токоферол нормализует чувствительность синаптосом к действию СЖК. Совокупность полученных результатов позволяет рассматривать образование комплексов а-токоферола с СЖК и лизофосфолипидами как один из молекулярных механизмов биологического действия витамина Е.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ерин А.Н., Скрыпин В.И., Каган В.Е. Образование комплексов сг-токоферола со свободными жирными кислотами. Природа комплексов. Докл. АН СССР,- 1983.- Т. 273, N 2.- С. 489-493.

2. Ерин А.Н., Скрыпин В.И., Прилипко Л.Л., Каган В.Е. Образование комплексов ионола со свободными жирными кислотами // Бюлл. эксп. биол. мед.- 1984.- N 5, 572-574.

3. Скрыпин В.И., Ерин А.Н., Братковская Л.Б., Каган В.Е. а-Токоферол - модификатор фазового состояние липидного бислоя // Бюлл. эксп. биол. мед.- 1984,- N 12.- С. 673-675.

4. Прилипко Л.Л., Ерин А.Н., Скрыпин В.И., Каган В.Е. Стабилизация синаптических мембран а-токоферолом // Тезисы докладов 1 Всесоюзной конференции "Принципы и механизмы деятельности мозга человека".- Ленинград, 18-31 ноября.- 1985,-С. 180.

5. Ерин А.Н., Скрыпин В.И., Прилипко Л.Л. Каган В.Е. Образование комплексов а-токоферола с фосфатидной кислотой // Бюлл. эксп. биол. мед., 1985,- Т. 100, N 8, С. 184-186.

6. A.N.Erin, V.Skrypin, V.E.Kagan. Formation of a-tocopherol complexes with fatty acids. Nature of complexes // Biochim. Biophys. Acta.- 1985.- N 815,- P. 209-214.

7. Скрыпин В.И. , Ерин А.Н., Прилипко Л.Л., Каган В.Е. Взаимодействие а-токоферола со свободными жирными кислотами. Пространственная организация комплекса // Бюлл. эксп. биол. мед.-1986,- Т.101, N 6, С. 682-684.

8. Каган В.Е., Скрыпин В.И., Сербинова Е.А., Райкова Д.П., Тюрин В.А., Бушуев В.Н., Ерин А.Н., Стойчев Ц.С. Локализация а-токоферола в гидрофобной зоне липидного бислоя // Докл. АН СССР,-1986,- Т. 288, N 5,- С. 1242-1246.

9. Ерин А.Н., Скрыпин В.И. Прилипко Л.Л., Каган В.Е. Механизм стабилизации синаптосом а-токоферолом при действии фосфолипазы А2 // Бюлл. эксп. биол. мед.- 1986.- N 7.- С. 25-28.

10. Скрыпин В.И., Брусованик В.И., Джапаридзе Л.М., Ерин А.Н., Селищева А.А., Прилипко Л.Л., Спиричев В.Б., Каган В.Е. Усиление повреждающего действия свободных жирных кислот при дефиците витамина Е // Бюлл. эксп. биол. мед.,- 1986.- N 11.- С. 547-549.

11. R.Viner, K.Novikov, V.Skrypin, V.Spirichev, Yu.Kozlov, V.Kagan Non-antioxidant mechanism of cytochrome P-450 stabilization by a-tocopherol: efficiency in microsomes from

itamin E-deficient animals // Abstracts of symposium "Drug letabolising enzyme systems".- Sofia.- 1986, May 20-22.- P. 127.

2. Горбунов H.B., Скрыпин В.И., Тюрин В.А., Балевска П., :рин А. Н. , Прилипко JI. JI. , Каган В. Е. Упорядочивающее и азупорядочивающее действие а-токоферола на липидные бислои.-|ИОЛ. науки,- 1987.- N 7,- С. 27-32.

3. Ерин А.Н., Скрыпин В.И., Прилипко JI.JI., Каган В.Е. Витамин 1: молекулярные механизмы действия в биологических мембранах // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине".- Рига: РМИ.-988,- С. 109-129.

4. Прилипко Л.Л., Каган В.Е., Ерин А.Н., Скрыпин В.И. Способ :табилизации синаптосом // А.С.СССР N 1383204,- Б.И.- N 9,- 1988.