Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли витамина Е и альфа-токоферолосвязывающих белков в функционировании клеточного ядра

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли витамина Е и альфа-токоферолосвязывающих белков в функционировании клеточного ядра"

ОРЛЕ! 1А ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМ!« НАУЕ

УКРАИНЫ

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ. А.Е ПАЛЛАДИНА

На правах рукописи

ПЕТРОВА Галина Вадимовна

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ВИТАМИНА Е И <^-ТОКОФЕРОЛСЕЯгыВШЩК БЕЛКОВ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ КЛЕТОЧНОГО ЯДРА.

03. 00. 04 - Биохимия

Автореферат диссертации яа соискание ученой степени кандидата биологических нале

¡'лев - 1992 г.

Расста ¿шюлнеяа в Институте биохимии им А. 3. -¡адеынша Академии наук Украины

Научный руководитель - до1стор биологических наук,

старший научный сотрудник ДОНЧЕНКО Г. Е Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старишй научный еотиулник

ШЛЕНЕВ'В. И. доктор медицинских наук, старший научный сотрудник ЧАЯЛО П. П.

Ведущая организация - Киевский медицинский институт

им. А. А. Богомольца

Зашта диссертации состоится '' -',, г

в ГО. 00 на заседании специализированного совета_

К 016.07.01. в Институте биохимии им. А. К Палладина АН Украина. '

Адрес: 252601, ГСП, Киев, ул. Леонтовича, 9

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им. А. Е Палладина АН Украины.

Автореферат разослан " " ¡.сор^&уч*, 1992 г. ■

Ученый секретарь специализированного совета /?

кандидат биологических наук " // > с. В. Кипоэяко

СБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Экспериментальные подхода в рамках классической витаминологии, изучающей изменения, происходящие при недостаточности витаминов в организме или при дополнительном их введении, позволили обнаружить широкий спектр биологического действия таких жрораетворимых витаминов, как А. Б и Е- Однако, вопрос о молекулярных механизмах их действия остается открытым, что заставляет исследователей применять нетрадиционные методы и подходы. Одниы из новых методологических подходов,. получивши!/! достаточно большое распространение за последние года, является изучение витаминсвя-зываших белков.

Согласно современным представлениям, процессы всасывания в зшлудочно-кишечном тракте витаминов, их транспорта с кровью и через биологические мембраны, проявление их" коферментной я некоферментной функции осуществляется при участии специфических белков [Хадыурадов А. Г. и др. , 19803. Допускается, что изучение биохимических'свойств и функций витаминсвязываюдах белков и особенности процесса связывания ими лигандов позеолит ответить на вопрос о молекулярных механизмах действия жирорастворимых витаминов в клетке.

В 1992 году исполняется 70 лет со времени открытия витамина Е, однако механизм его биологического действия до сих пор окончательно не установлен. В настоящее время накоплен обширный экспериментальный материал о широком спектре биологического действия витамина Е, для объяснения которого привлекается целый ряд гипотез [Афанасьев Ю. И. и др. , 1987; Бурлакова Е. Б. и др. , 1975; Донченко Г.Е , 1988; Ерин А. Р. и др., 19873. В то

время данные о витамин Е-связывающих белках носят поверх-. ностньгй характер, фрагментарны и касаются а основном вопросов особенностей связывания витамина Е с различными биологическими структурами [НаиэчггЪЬ еЬ а1. , 1972; Ка^г е! а1. ,1978; Ра1па1к et а1. , 1975, .1977, 19813. Вопрос о функциях этих белков остается открытым.

Учитывая множественность и разнообразие воздействия на ¡слетку витамина Е, по нашему мнению, лишь исследование токофе-ролсвязывакших белков позволит вычленить из большого разнообразия функций витамина Е его специфические функции, проявление

- г -

которых не может быть заменено другими антиоксидантами иди веществами-стабилизаторами биологических мембран.

Особую важность для выяснения специфических функций витамина Е имеют данные литературы о его способности связываться с клеточными ядрами и их компонентами С Мэ±зиига еЬ а1., 1978; Райпа1к, 1981]. Именно ядро является местом хранения генетической информации клетки, обуславливающей особенности его функционирования. Исходя из имеющихся данных о способности (¿-токоферола связываться с хроматином [ МаЬзиига еЬ а!.., 1978; РаЬпа1к, 1981] и ядерным матриксом [Колосова Н.Г. и др. , 1990] и влиять на процессы транскрипции [Паливода О. М. и др. , 1981; Сиагшегч е1 а1. , 1980], мотао предположить, что исследование ядерных токоферолсвязывающих белков может, с одной стороны, быть очень полезным для выяснения специфичности действия /--токоферола, а с другой - способствовать более глубокому пониманию процессов функционирования клеточного ядра, поскольку, согласно современным представлениям, именно белки хроматина и ядерного матрикса играют важную роль в. регуляции дифференциальной активности генома [Георгиев Г.Е 1989; Збарский КБ. , 1988]. 1 1 : :

Однако, из имеющихся на настоящий момент данных литературы о способности ¿¿-токоферола взаимодействовать с клеточными ядрами нельзя сделать однозначный вывод о том, является ли оно специфичным. Не выяснены также вопросы, касающиеся особенностей субъядерной локализации оС-токоферола и(£токоферолсвязы-вающих белков, а также выполняемых ими функций в составе клеточного ядра.

Попытка решить указанные проблемы и обусловила цели нашего исследования.

Пель и задачи исследования. Основной целью работы является изучение специфичности взаимодействия^-токоферола с изолированными ядрами и внутриядерными структура!,и печени крыс и выяснение возможности влияния витамина Е и витамин Е-связьта-ющих белков на процессы транскрипции. Конкретные задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Изучить особенности и специфичность связывания ГШ-^С -токоферола с изолированными ядрами печени коыс.

2. Исследовать (/.-токоферолсвязываюшую способность различ-

- з -

них субъядерных фракций и выяснить, какие белки этих фракций ' участвуют в специфическом связывании витамина Е.

3. Выяснить возможное влияние ¿¿-токоферола на РНК-полимеразную реакцию в системе in vitro и участие в этом процессе т о кофе ро дс в я з ываапмх белков.

Научная новизна. Показано, что связывание свободного Ли -/-токоФерола с изолированными ядрами печени крыс имеет неспецифический характер. Специфическое связывание проявля-. ется лишь при при обработке ядер тритоном Х-100 или при до- • бавлении в инкубационную среду цитозоля печени.

Несмотря на то," что при инкубации изолированных ядер с меченым лигандом, значительная часть последнего неспецифическим образом сорбируется на гидрофобных компонентах мембраны, в.то ж время в экстракте ядер 1% тритоном Х-100 присутствует белковая фракция, способная специфически связывать [%)-/.-токоферол. Эта белковая фракция была выделена и частично очищена с использованием адсорбционной хроматографии на гидроксиапатите и ионообменной хроматографии на колонке Mono Q.

Обнаружены места специфического связывания Г НЗ-«£.- токоферола в составе хроматина. При центрифугировании предварительно инкубированного с меченым лигандом хроматина в градиенте плотности сахарозы показано, что для взаимодействия витамина Е с хроматином in vitro необходимо сохранение высших порядков уровня упаковки хроматина.

Установлено достоверное снижение РНК-полимеразной агаив-ности в ядрах и ядерном матриксе печени витамин Е-недостаточ-ных крыс по сравнению с контролем. Обнаружены различия во влиянии выделенной нами -фракции 1, специфически связывающей токоферол, на РНК-полимеразную активность хроматина'печени нормальных и витамин Е-недостзточных крыс. Показано, что для проявления действия витамина Е на РНК-полимеразную активность in vitro необходимо наличие комплекса «С-токоферол-белок.

Полученные данные позволяют предположить, что витамин Е способен оказывать влияние на функции клеточного ядра, связанные с реализацией наследственной информации.

Практическая ценность. Полученные. результаты. кмепдае

важное теоретическое значение как для понимания функций витамина Е в клетке, так и для выяснения механизмов функционирования клеточного ядра, могут быть использованы для исследования процессов, происходящих при недостаточности витамина Е в ' организме. Принимая во внимание тот факт, что с витамин Е-недостаточностью связано значительное число патологий, в дальнейшем полученные данные могут бьггь использованы в медицине и сельском хозяйстве при разработке методов диагностики и лечения патологий, связанных с дефицитом витамина Е.

Апробация работа Основные положения диссертационной работы. обсувдались на Всесоюзных симпозиумах "Структура и функции клеточного ядра" (Пушно,1984; Черноголовка 1987; Гродно 1990), на III Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1S90), на конференции молодых исследователей " Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Моск-ва,1990), на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторных систем" (Таллин,1990), а также на конференции молодых ученых Института биохимии им. А.В. Палладина.АЕ,УССР (Киев,1989).

Публикации. Шматериалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, семи глав, включающих обзор литературы, описание примененных методов исследования, полученных результатов, а также из. заключения, выводов и списка литературы ( 300 наименований, из них 87 отечественных и 213 иностранных авторов). Работа изложена на 148 страницах машинописного текста (без списка литературы) и иллюстрирована з таблицами и 34 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. .

В работе использовали печень самок белых крыс массой тела 150-200 г. Для моделирования Е-гиповитаминоза крыс-отъемышей с начальной массой тела 40-50 г содержали на синтетическом Е-авитаминозном рационе А.^д в течение 2 мес [Edvin et al., 1961Д. ¡¿-Токоферол in vivo вводили внутрибркшинно в количестве 30 мкг/г массы тела.

- Ядра печени крыс выделяли по методу CBIobel et al. , i 9661. Фракционирование ядер и получение ядерного ыатрикса

проводили согласно [ Kaufmann et al. ,19863. Выделение тот-^льнего 'хроматина проводил-! методом, предложенным [Marzluff et al.. 1975].

' Для определения обшего связьтания С^Ш -.¿-токоферола 1 ыг белка ядер или хроматина печени крыс инкубировали в 0.5 мд соответствующего буфера с различными концентрациями [ -Ш-D-tL -токоферола (уд. р. а 851 ГБк/ммоль, -'Amsrsharii", Великобритания) в течение £0 мин при 20°С. Меченый «¿-токоферол вносили в среду инкубации б растворе этанола, причем концентрация последнего составляла не более Реакцию останавливали, помещая пробы на ледяную баню, добавлением 10-кратного избытка буфера инкубации, затем дважды отмывали, используя центрифугирование. Осадок.растворяли в 200 мкл 5% Na-SDS и в аликво-тах определяли содержание белка по tLowry et al., 1951] и радиоактивность, используя сцинтилляцлонную жидкость ЖС-8. Для определения неспецифического связывания пробы проинкубировали с 5 мкМ немеченого D,L-^-токоферола Специфическое связывание определяли как разность между обдам связыванием и связыванием е присутствии избытка немеченого «¿-токоферола.

В случае исследования связывания С ^НЗ-/-токоферола с ядрами в присутствии цитозоля в среду инкубации, содержащую 1 мг белка ядер, вносили комплекс «¿-токоферола с белками цитозо-ля. Для получения комплекса цитозоль печени крыс инкубировали с меченым -токоферолом из расчета 100 тыс. имя/ мг белка цито-золя. Несвязавшийся лнганд удаляли, используя систему декстрая-уголь [Milgrom et al. , 1969].

Для разделения солюбилизированных мембранных белков и одновременного удаления из смеси тритона Х-100 и свободного С^Ш -¿-токоферола был использован гидроксиапатит (ГАП). В условиях наших экспериментов, как свободный [%]-<£• токоферол, так и тритон Х-100 ке связывались с ГАД и удалялись после 2-й отмывки сорбента (рис 1).

Хроматографию солюбилизированных мембранных белкоз на ГАП проводили согласно C6asiewicz ее al. ¿1982],

При изучении связывания [%]-«¿-токоферола с солюбплизиро-занными тритоном Х-100 мембранами ядер 1 мг белка инкубировали 30 мин при 4 0 с 0.5 мл 5QZ суспензии ГАП в 20 мМ К-фосфат-

Рис. 1. Профиль элюции свободного- [■"%]- ,L-Т С А) и тритона Х-100 (Б) с гидроксиапатита.

ном буфере, рН 7,2. После двухкратной~от№шЖ~11К[фатнш-х5бъв— мом буфера инкубации (центрифугирование при 400 5 мин), ГШ с адсорбировавшимися на нем белками инкубировали с различными концентрациями [%3 -«¿-токоферола в течение 20 мин при 20°С. Процедуру отмывки повторяли, белковые фракции, акцептирующие меченый лиганд, злюировади последовательно 0,175 и 0,5 М К-фосфатным'буфером,.рН 7,2, используя центрифугирование. В надосадочиых фракциях определяли содержание белка и радиоактивность.

Ионообменную хроматографию проводили в хроматографичедкой системе FPLC, используя колонку mono Q. Образец наносили в ' 0.175 мМ К-фосфатноы буфере, рН 7,2, содержащем 0,1 М NaCl. Элкцию осуществляли линейным градиентом концентрации NaCl (0,1-2 М)'..

Определение эндогенной РНК-полимеразной активности в изолированных ядрах, хроматине и ядерном матриксе проводили

по метолу С Транскрипция и трансляция. Методы., 1987] , используя з качестве меченого предшественника С5- ^нз-урк-дин-5-тркфосфат (940 ТВк/моль, "Изотоп").

• Получение гидрокскапатита проводили по методу LHiroyuki

et al. , 1985]. • ' „

*î

Хроматографическая очистка [°НЗ-¿-токоферола проводилась с использованием тонкослойной хроматографии по методу, предложенному [ Дончекко Г. В. и др., 1979]. ■

Содержание ДНК определяли по ГBurton, 1956] реакцией с дифениламином и спектрофотометрически.

Электрофорез белков б ШАГ с Na-SDS проводили по методу [LaemrrJi, 1970], .используя линейный градиент концентрации ак-риламияа 7,5-20%. Для окраски гелей использовали кумасси Q-250. Последующую окраску гелей серебром проводили по ГБлохин Д. El, 1988].

Статистическая обработка результатов проводилась по [Ой-вкн К. А. , i960].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Связывание [^ Ш т окоферола с изолированными ядрами печени крыс.

Результаты наших исследований показали, что связывание [ Ю -cC-TQKoic-рола с изолированными ядрами печени крыс является неспециФическим при всех использованных концентрациях меченого лиганда (1,5 нМ-7,5 мкМ). Полученные результаты согласуются с данными литература о том, что специфическое связывание с ядрами стероидных гормонов CGodovski et al. , 1989; Knovler et al., 1985] и таких жирорастворимых витаминов как А и D CLiau et al., 1381; Dame et al. 1885] наблюдается лизь в присутствии шггсзольшго или ядерного рецепторов.

Известно, что з цитозоде печени крыс присутствует оС-токо-ферслсвязываюшкй белок, Функция которого, состоит очевидно, в транспорте жпофильнаго «¿-токоферола к субклеточным структурна CCatignani et al.. 1977: Catignani. 1980]. Нами сСн£руж?ко, что при добавлении к изолированным ядрам комплекса С"КЗ -«¿-то-

коферола с белками цитсзоля имеет место специфическое связывание. которое в данном случае составляет около 20 7. от общего связывания (Рис. 2).

Рис. 2. Связывание С^Ю-сД-Т с изолированными ядрами печени крыс в присутствия', цитозоля. 1 - общее связывание;. 2 - неспецифическое связывание; 3 - специфическое связывание.

Полученные результаты позволяют высказать предположение о наличии в ядрах мест специфического связывания ^.-токоферола Причем для такого связывания необходимо присутствие белков цитозоля.

_ При фракционировании предварительно инкубированных с [^Ю-¿-токоферолом ядер было установлено, что наибольшая удельная радиоактивность и процент связанного лиганда (85,8%) наблюдается во фракции, полученной при экстракции ядер 1% тритоном Х-100. В ее состав входят главным образом гидрофобные компоненты ядерной мембраны и, возможно, ряд белков внутриядерных структур.

Наличие значительной радиоактивности (12,IX от суммарной) во фракции, полученной после обработки ядер ДНКазой I и содер-лсашеЯ преимущественно компоненты хроматина, указывает на способность ¿¿-токоферола в процессе инкубации проникать во внутренние компартменты ядра и связываться с хроматином. Фракция, полученная при обработке ядер 2 М ЫаС1, оказалась низко-

меченой.

Интересным, по нашему мнению, оказался тот факт, что 0,93%. лиганда связывается с остатком ядра, полученным после последовательной обработки вышеуказанными реагентами, и представляющей собой препарат ядерного матрикса. Причем, толь-га в этой фракции наблюдается достоверное уменьшение связывания С^Ш -с£-токоферола в присутствии избытка немеченого лиганда, что может свидетельствовать о специфичности этого процесса.

Полученные данные о способности [Зщ -¿¿-токоферола экстрагироваться из ядер при различных условиях могут свидетельствовать о наличии нескольких типов различных ядерных центров связывания витамина Е. -

Исходя из полученных результатов нам представлялось целесообразным дальнейшее изучение следующих субъядерных Фракций - экстракта ядер 11 тритоном Х-100 (солюбилизированкые ядерные мембраны), с которым связывается наибольшее количество о(-токоферола, а также фракции хроматина и ядерного матрикса, с которыми могут быть связаны функции витамина Е.

2. Токоферолсвязывающие белки в составе ядерной мембраны.

При хроматографии предварительно инкубированной с Г Ш -токоферолом фракции солюбилизированных ядерных мембран на гидроксиапатите были получены два пика радиоактивности, эяюи-рующиеся с сорбента соответственно 0,175 и 0,5 М К-фосфатным буфером, рН 7,2 (фракции 1 и 2 ) (Рис.3).

Нами обнаружено, что связывание [%] -^-токоферола с компонентами фракции 1 имеет насыщаемый характер в области концентраций лиганда 3,5-7,1 нМ (рис.4). При дальнейшем увеличении концентрации [°Ш-^-токоферола до 0,5 мкМ наблюдается увеличение общего связывания, и хотя процент специфического связывания от общего возрастает, насыщения не достигается. Такой характер связывания объясняется, по нашему мнению, наличием на ядерной мембране кроме высокоаф^инных участков связывания с низкой емкостью такжь участков, характеризующихся высокой емкостью связывания и'низким сродством. Можно предположить, что

100

53

1

16

(

; з-

1 5 3 13 17 21 25

• номер

Рис. 3. Профиль элюции с гидроксиапатита фракции, экстрагированной из ядер 1% тритоном Х-1С0.

ром (фракция 1).

А- низкие концентрации [""Ш-^-.Т;. Б- высокие концентрации [Зщ-^-т.

1- общее связывание; 2- неспецифическое связывание; 3- специфическое связывание

если в диапазоне низких концентраций связывание С'"Ш-^-токоферола с компонента!«! фракции 1 обусловлено лиганд-рецептсрным взаимодействием, то при повышении концентрации лиганда в инкубационной среде начинает преобладать его взаимодействие с .участками о низким сродством, представленными, главным образом, липидными компонентами ядерной мембраны.

Специфичность связывания С-/-токоферола с компонентами фракции 1 подтверждается также в экспериментах с использованием в качестве немеченого лиганда его аналогов - хикона ко-роткоцепочечного к .тскоферилацетата. Липь /-токоферол был способен конкурировать с С^ш-/-токоферолом за места связывания. Установлено также, что предварительная обработка

о

фракции 1 проназой уменьшает связывание [°Н]-«6-токоферола.на 85%, что может свидетельствовать о белковой природе мест связывания.

Связывание t Ш -/-токоферола с компонента!.»! фракции, злю- « ируемой с ГАП 0,5 1.1 К-фосфатным буфером (фракция 2), оказалось неспецифическим.

ЭлектроФоретический ai:ализ в ПААГ с Na-SDS показал, что обе исследуемые фракции (1 и 2) довольно гегерогенны по белковому составу.

Бри использовании для дальнейшей очистки фракции 1 ионообменной хроматографии на колонке Meno Q в хроматографическсй системе FPLC было получено 4 фракции С рис 5). При этом уменьшение связывания ["Ш -/.-токоферола в присутствии избытка немеченого лиганда'обнаружено для всех трех фракций, элюируемых с колонки градиентом NaCl. Полученные данные позволяют высказать предположение о существовании в составе изучаемой фракции нескольких токоферолсвязываотих белков. Электрофоретическсе исследование выделенных фракции показало наличие в их составе до 3-5 белковых полос, а такие присутствие дополнительных минорных компонентов, что свидетельствует о необходимости дальнейшей очистки.

__________j связывание в лриеут-

| J-ort-^ee свгоъ'вание М ~ ствии избытка немеченого £¿-1

Рис. 5, -Хроматографическое разделение фракции 1 на колонке Mono Q. —

1-градиент концентрации NaCl;

2-поглошение при 280 -нМ.

3. Токоферолсвязываюкиё белки в составе хроматина.

3

Установлено, что связывание свободного [ ЯЗ-<А-токоферола с хроматином in vitro имеет неспецифический характер. Из данных литературы известно, что связывание с хроматином стероидных гормонов и витамина А имеет•специфический характер лишь при использовании в экспериментах не свободного лиганда, а его комплекса с белковым рецептором [Anderson, 1984; Knovler et al. , 1935; Parker, 1988; Steglles et al. , 1971]. Мы предположили, что белок, способствующий связыванию [%] -токоферола с внутриядерными структурами, может входить в состав выделенной нами фракции 1 мембран „ядер. Обнаружено, что в'присутствии фракши 1 связывание [иН]-«/-токоферола с хроматином приобретает специфический характер (Рис. 6). В то же время, при добавлении в среду инкубации фракции, злюируе-мой с ГАП 0,5 М K-фосфатным буфером (фракция 2), которая, по нашим данным, не обладает специфичностью связывания с [^Hi-iA

- 13 -

-токоферолом, этот зфСект не наблюдается.

Таким образом, фракция 1 мембран ялер, содержащая токофе-оолсвязывавшие белки, обуславливает специфическое связывание [°НЗ -Д.-токоферола с хроматином in vitro.

Рис. б. Связывание С-Щ-рб-? с хроматином печени крыс з присутствии фракции 1. (Отношение белок хроматина/бедок фракции -1:0,03) 1- общее связывание;2- неспецифическое связывание 3- специфическое связывание

Исходя из полученных данных о способности витамина Е специфически взаимодействовать с хроматином мы.попытались зыде-лить белки хроматина, участвующие в связывании ¿¿-токоферола.

При хроматографическом разделении на гидроксиапатите предварительно меченого хроматика, полученного после обработки ядер ДНКазой I, наибольшая радиоактивность обнаоузхивалась во фракции, злюируемой с сорбента раствором 2М МаС1- 5М мочеви-на80 1лМ К-фосфатный буфер, рН 7,2 (фракция А) и во фракции, злюируемой 1 М К-фосфатным буфером (фракция В) (рис. 7). Первая фракция содержит в основном негистоновые белки хроматина, а вторая - свободную ДНК и комплекс ДНК с прочно связанными белками. Достоверное уменьшение связывания [^н]-»4-токсФерсла в присутствии избытка немеченого лиганда сбнаружно только во фракции А. Можно предположить, что белки фракции А

хроматина, могут принимать участие в специфическом связывании витамина Е.с хроматином.

Из данных литературы известно, что изменение структуры хроматика при транскрипции коррелирует с его гиперчувствительностью к гидролизу низкими концентрациями ДНКазы I. Нами установлено, что хроматин тавотных контрольной группы 'более чувствителен к действию фермента, чем хроматин витамин Е-недостаточных животных С рис.8). Это позволяет предположить, что при недостатке витамина Е происходит нарушение структуры транскрипцконно-активных участков хроматина. При увеличении степени гидролиза хроматина путем повышения концентрации ДНКазы I, когда происходит гидролиз ДНК, расположенной за пределами гиперчувствктелькьк участков, данные различия кевдзакгг. Однако, предварительная инкубация хроматина с токоферолом не изменяет достоверно степень гидролиза хроматина в обеих группах животных. Очевидно, в данном случае /-токоферол, добавленный in vit.ro в отсутствие белка не успевает за достаточно короткое время инкубации вызвать изменения конформации хроматина.

Тагам образом полученные данные свидетельствуют о том, что ь составе белков ядерной мембраны существуют белки, способствующие специфическому связыванию витамина Е с хроматином 1Г) vitro. Витамин Е-сЕязываюшке белки в составе хроматина экстрагируется из него раствором, содержащим 2 М MaOI-5 М мочевину и представляют собой, очевидно, негистоновые белки.

4, Рлияние витамина Е на транскрипцию.

Учитывая полученные нами, данные о наличии токоФеролсвя-зыьаюшх белков в составе хроматина печени крыс, а тага® данные литературы о влиянии ьитамкна Е на процессы транскрипции и биосинтеза белка в экспериментах in vivo и на изолированных кгетках [ Пздивсда О. tí. и др., 1981; Hauswirt.h et al., 1972; G.jarr.seri t-t ai., 19S03. нам представлялось целесообразным Дальнейшее изучение действия витамина Е ка синтез РНК в системах, солержнзих ивслимвакные субъядерные структуры, а такж? влияние на зт» процессы вотамина Е-свяаыБашкх белкзЕ.

Согласно полученным дачнш,_' .РНК-полимеразнал активность

, -яр

|ЛИ»/ ггЮ3

80мм ¡мм а гммас/ гмнва О¡. К-±осря -ЗМт> *1

чеЬинафЗ

м

■зз ■и

I

Л

/Л

И« ч

к и г

4 У

к к

30

Рис. 7. Хроматографическсе разделение содзсбилизирован-ного хроматина на гидроксиалатите. 1- экстинция при 280 кМ; 2- радиоактивность.

2

7сз-1

зо-

•»23-геэ-

1+Э

о

X К КОНТРОЛЕ

20

ШКГ ©«Сема)

Рис. 8. Гидролиз ДНКазой I хроматина печени крыс с различным уровнем обеспеченности витамином Е. 1- контроль; 2- контроль + /-Т; 3- Е-гиповита-миноз; 4- Е-гиповитаминоз + ¿.-1.

ядер животных, содержащихся на Е-авитаминозном рационе, досто-веоко ниже (на 31Z). чем у нормальных животных. В тоже время добавление б'среду инкубации «¿-токоферола в концентрациях 0,25 мкМ и 1 мкМ не приводит к достоверному изменению исследуемого показателя (рис.9). Очевидно, в данном случае необходимо учитывать обнаруженный нами факт, что при инкубации (¿.-токоферола с изолированными ядрами наблюдается, главным образом, неспецифическое связывание лиганда Беролтно, большая часть лиганда связывается с липидными компонентами ядерной мембраны и не достигает акцепторных участков на хроматине.

Рис. 8. РНК.-полимеразная активность ядер печени крыс ■в норме и . при Е-гиповитаминозе. 1- без добавления ¡¿-Т; 2- в присутствии 0,25 мкЫ ¿¿-Т; 3- Е присутствии 1 мкМ oL-1.

ISjstow,' б качестве экспериментальной модели была кспохъ -гоьт'л система транскоигахии in Vitro хроматика. Лля более полнот:; удаления клирной мембраны ядра перед получением хроматика ойг^атапалй IX тгитзном Х-1С0. В этом случае различия ь РШ- погиые-раккзй активности хроматкна нормальных и витамин Е-¡•ёиостаточклх крыс ке обнаружены (рис.10).

Х10-3 ИИП/МИН

ШШТД-НОРИЙ

вит*>мии е-

НЕДОСТПТОЧНЫЕ КРЫСЫ

Рис.10. РНК-полимеразная активность хроматина печени крыс в контроле и при Е-гиповитаминозе в присутствии фракции 1, полученной из ядер животных контрольной группы.

- 1 - контроль;- Добавлены: 2 - +фракция 1;

3 - +фракция 1 +0,25 мкМ /-Г; 4 - +фракция 1 + 0,5 мкМ «¿-Т. •

Мы предположили, что при выделении хроматина с использованием буферов с низкой ионной силой и тритона Х-100 удаляются компоненты, которые необходимы для проявления действия витамина Е на синтез РНК и обуславливают разницу в РНК-полимеразной активности ядер нормальных и Е-гиповитаминозных животных. Возможно, таким компонентом является выделенная нами фракция 1 мембран ядер.

Обнаружено, что при добавлении в среду инкубации только фракции 1 РНК-полимеразная активность хроматина нормальных крыс увеличивается на 65%, в то время как активность хроматина витамин Е-недостаточных крыс этих условиях изменяется на 22% (рис.10). При этом различия ме.щу РНК-полимеразнкми активностями хроматина нормальных и витамин Е-недостаточных животных составляли 43X. Добавление на этом фоне экзогенного ¿-тско-

ферола не пшсеодилс к изменениям исследуемого показателя у животных обеих групп.

Добавление фракции 1, полученной из ядер Е-гиповитами-нозкых ¡газетных, к хроматину крыс этой же группы не влияет на РНК-полимеразную активность. Однако, в отличие от нормальных животных, дополнительное внесение на зтоы фоне витамина Е приводит к достоверному увеличении РКК-полимеразной активности (рис.11). Очевидно, в первом случае экзогенкый»6токофе-роа на фене эндогенного комплекса витамин Е-белок, присутствующего во фракции 1 нормальных животных. может и не оказывать дополнительного действия. Во ьтором же случае фракция 1 Е-гиповитаминозных животных практически не содержи1 эндогенного витамина Е, поэтому его экзогенное внесение является эффективным.

Ркс. 11. РЕК-пояимерагвач активность хроматина печени

Е- гиповктамкнозкых крыс в присутствии Фракции -1, полученной из ядер »квотных этой же опытной группы.

1 - контроль; Добавлены: 2 - «фракши 1; 5 - -»фракция i + 0,25 мкц «¿-Т; 4 - +фракцкя г 0,5.ккЦ /-Т.

По нааему мнению, подученные результаты псззоляют предположить, что определяющим фактором в реализации эффекта ¿-токоферола на. синтез РНК язляется наличие комплекса^-токоФерсл-бе-лок. В подтверждение этому нами были проведены эксперименты пс определению РНК-полимеразной активности препаратов ядесного матрикса В этом случае из процедуры выделения ядерного мат-рикса была исключена обработка ядер тритоном Х-100. что позволяло сохранить практически интактную ядерную мембрану.

Обнаружено, что содержание животных на Е-авитаминозном рационе приводит к достоверному снижению РНК-полимеразной активности ядерного матрикса по сравнению с контролем (рис.12). При этом если добавление витамина Е в среду инкубации не изменяет урогень включения меченого предшественника в РНК, то вве-дение«¿-токоферола ш vivo двукратно, за 18 час до забоя животного приводит к повышению РНК-полимеразной активности, а добавочное внесение на этом Фоне экзогенного витамина Е приводит к полному восстановлений исследуемого показателя до контрольных значений. .

ИИП/КИН НА I МГ БЕЖА

■»10 323 X 16 !«-♦ 32

3

i 2 3 4 S

Рис. 12. РНК-полные разная активность ядерного матрикса печени крыс.

1 - контроль; 2 - Е-гиповитаминоз-. 3 - Е-гиповитаминоз 4-оС-т in vitro; 4 - Е-гиповитаминоз <А-Т in vivo; 5 - E-гиповитаминоз ь <¿-T m v.v< in vitro.

i j 'ñ ; v j: i í : _rTi _ ••f f t 1 ' 1 Г

- 20 -

Параду с этим нами обнаружено также изменение белкового спектра ядерного матрикса при Е-гиповитаминозе. Показано, что недостаточность витамина Б приводит к количественным изменениям белкового спектра в области 40-50КД. Отмечается тагаке уменьшение количества ряда высокомолекулярных белков. Эти данные свидетельствуют о комплексных изменениях ядерных структур при Е-гиповитаминозе.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что витамин Е может оказывать влияние на синтез РНК in vitro; при его недостатке наблюдаются изменения в структуре хроматина Для проявления действия витамина Е необходимо наличие oi.-токоферолсвязывающих белков ядерных мембран, которые, возможно, принимают участие в его взаимодействии с акцепторными участками хроматина.

- ВЫВОДЫ

3

1. Специфическое связывание С Ш-с^--токоферола с изолированными ядрами печени крыс наблюдается лишь при добавлении в среду инкубации цитсзоля. 85% связанного с ядрами [^ш -¿¿-токоферола экстрагируется тритоном Х-100. В препарате хроматина обнаруживается 127. общей радиоактивности.

2. Во фракции белков ядерных мембран обнаружены токофэ-рплсвязывающче белки, которые били выделены и частично очишены с помощью адсорбционной и высокоэффективной ионообменной хроматографии. Токоферолсвязываюшие белки ядерной мембраны (фракция 1) способствуют специфическому - связыванию С^Ш-«^-токоферола с хроматином in vitro.

3. Установлено, что для взаимодействия «^токоферола с хроматином in vitro необходимо сохранение наднуклеосомного уровня его организации. Акцепторные участки для Л- токоферола ка хроматине входят в состав негкстоновых белков. Недостаточность ви-тамгаа Е приводит к изменению гиперчувствителькости хроматина к низким концентрациям ДНКагы I.

4. При Е-гиповитаминозе уменьшается РНК-полимеразнач активность изолированных ядер и ядерного матрикса иечени крыс. Состояние недостаточности витамина Е не влияло ка РНК-полиме-раокую активность in vitro хроматина, лишенного ядерной мемб-

раны. Различия з данном случае проявлялись лишь при добавлении в среду инкубации фракции 1.

5. Для влияния витамина.Е на РНК-полимеразную активность in vitro необходимо наличие комплекса /.-токоферол-белок. Белки, участвующие в функционировании витамина Е, входят в состав фракции 1 мембран ядер.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Кузьменко И. В. , Куница Е И. , Петрова Г. И. , Донченко Г. Е , Халмурадов А. Г. Изучение связывания ¿¿-токоферола компонентами хроматина печени крыс // Тезисы докладов VIII Всесоюзного симпозиума "Структура и функции клеточного ядра". - Пущи-но, 1984.- С. 133.

2. Маленьких Л. Б., Капралов А. А., Петрова^ Г. Е , Еарык О. Я., Торхова С. Г., Донченко Г. Е Связывание [^НЗ-эб-токофе-рола с ядрами печени крыс и влияние на этот процесс цитозоля // Тезисы докладов X Всесоюзного симпозиума " Структура и функции клеточного ядра". - Черноголовка, 1987.- С. 158.

3. Петрова Г. R , Капралов А. А. , Донченко Г. Е 'Изучение ядерной локализации участков связывания I^H]-/.-токоферола в печени крыс // Тезисы докладов III Всесоюзной конференции "Еи-оантиоксидант". - Москва, 1989.- С. 78. *

4. Петрова Г. Е, Капралов. А. А., Кузьменко И. Е, Донченко Г. В. Исследование токоферолсвязывакяшх белков митохондрий печени крыс// Укр. биохим. ж.- 1990.- 62, N 2.- С.29-25.

5. Донченко Г. Е , Петрова F. Е , Капралов А. А. , Губский KL К , Левицкий Е. JL 0 возможной роли ¿¿-токоферола в функционировании хроматина, и ядерного матрикса печени крыс // Докл. АН УССР. - 1990. - сер. 7Б, N 3. - С. 60-62.

6. Капралов А. А., Петрова Г.. Е, Левицкий Е. Л. Локализация оС-токоферола в составе клеточного ядра и его возможные функции // В кн: Труды конференции " Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", - Москва, 1990.- С. 197-214. Деп. в ВИНИТИ 13- 02. 90, NN 816-В90.

7. Петрова Г. Е, Капралов А. А. . Донченко Г. Б. Исследование витамин Е-свяаывающего белка из ядерной мембраны печени крыс // Тезисы докладов X Всесоюзного симпозиума "Структура л

функции клеточного ядра". - Гродно, 1990.- С. 161.

8. Донченко Г. В., Петрова Г. В., Капралов А. А. Исследование ядерных рецепторов витамина Е в печени крыс // Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Биохимия рецепторных систем". Таллин, 1990-- С. 16.

9. Донченко Г. Е , Чернухина Л. А., Петрова Г. В., Маленьких Л. Б. Исследование специфических белков-акцепторова витаминов А и Е в специализированных клетках и субклеточных структурах // Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Проблемы микробиологического синтеза витаминов и их производных". - Ташкент, 1990,- С. 17-19.

10. Губский ¡0. К, Левицкий Е. Л., Чабанный В. К, Гольдш-тейн а Б., Капралов А. А., Петрова Г. а , Донченко Г. В., Волков Г. а Изменения белкового спектра, липидного состава, ДНК- и РНК-полимеразных активностей фракций хроматина и ядерного матрикса печени крыс в условиях Е-гиповитаминоза // Укр. биохим.х- 1990. - 62, N 6. - С. 22-31.

П.Петрова Г. К , Капралов А. А. , Донченко Г. В. О наличии токоферолсвязывающих белков на мембране ядер печени крыс // Виол, мембраны. - 1991. - N 10. - С. 1039-1046.

4Ц

Подписано в печать 15.01.92г. Формат 60X84/16. Бумага типограф. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5. Уч.-изд. л. 1,43. Тираж 100. Зак. 2. Бесплатно.

Типография КБЗРИУ