Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфологическая характеристика реактивных изменений миокарда в условиях воздействия витамина A и хронического стресса

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфологическая характеристика реактивных изменений миокарда в условиях воздействия витамина A и хронического стресса"

На правах рукописи

ШУРЫГИН СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕАКТИВНЫХ ИЗМЕНЕНИИ МИОКАРДА В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ ВИТАМИНА А И ХРОНИЧЕСКОГО СТРЕССА

03.03.04 -клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

12 ДЕК 2013

0055433ол

Саранск, 2013

005543352

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный работник высшей школы РФ

Николай Васильевич Ямщиков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Виктор

Владимирович Валиуллин, профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

доктор медицинских наук, профессор Лариса Михайловна Меркулова, заведующая кафедрой нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией имени В.В. Амосовой ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия»

Защита диссертации состоится «21» декабря 2013 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.117.01 в ФГБОУ ВПО "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева" по адресу: 430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевисткая, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» по адресу: 430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

Объявление о защите и автореферат диссертации размещены на официальном сайте Мордовского государственного университета

им. Н. П. Огарёва www.mrsu.ru и интернет-сайте ВАК http://vak2.ed.gov.ru

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор В.П. Балашов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение структурных основ и реактивных свойств миокарда остается актуальной проблемой современной морфологии. В связи с появлением новых современных иммунопкжшшических методов исследования вопросы эмбрионального гистогенеза и регенерации миокарда по-прежнему привлекают внимание морфологов (Epstein JA., 2010; Asrih М., 2011; Freire CM, 2011). Исследование морфологических изменений органов и тканей на фоне стресса является важным направлением современной теоретической и практической медицины (Писарев В.Б., 1980; Красных И.Г. др., Меерсон Ф.З., 1984; Павлович ЕР., 2001; Балашов ВН., 2001,2006,2010; Герасимова Н.Г., 2008).

Применение элеюронно-микроскопических, морфометрических и др. методов исследования позволило значительно расширить существующие представления о миокарде (Швалев В Н. и соавт., 1992; Данилов Р.К., 1996; Ямщиков Н.В., 1991, 1997; Hirakov R., Montgomery Н., 1994; Lyons G.E., 1996; Icardo J.M., 1996). Многие результаты этих исследований стали фундаментальными и лежат в основе современных представлений о строении миокарда, а также объясняют возникновение врожденных пороков сердца и патогенез заболеваний органа.

Однако данное направление нельзя считать полностью исчерпанным, по крайней мере, по двум причинам. Во-первых, благодаря развитию молекулярной биологии перед исследователями открываются все новые тайны тонкой регуляции процессов эмбрионального развития сердца. Становятся известными молекулярные факторы, контролирующие миофибриллогенез и миокардиогенез, определяющие дефинитивное строение органа (Horb М.Е., Thomsen G.H., 1999, Sanger J.M., Sanger J.W., 2008). Вскрываются новые причинно-следственные связи в цепи молекулярно-генетических, биохимических, морфогенетических и структурных событий, что позволяет взглянуть с новых позиций на эмбриональное развитие сердца. Во-вторых, среди факторов внешней и внутренней среды, действие которых на эмбриогенез относительно хорошо исследовано, внимание морфологов привлекают новые агенты, роль которых только начинает проясняться.

В этом плане следует обратить внимание, что развитие медицины в целом и увеличение доступности для населения большинства стран мира различных лекарственных средств, все острее ставит проблему необходимости исследования морфологических основ адаптации к хроническому использованию медицинских препаратов. Одной из таких групп препаратов являются витамины и в частности витамин А.

Несмотря на то, что биологические эффекты витамина А изучаются уже более века, сведения о его влиянии на структуру миокарда относительно немногочисленны. Возможной причиной этого является устоявшееся мнение клиницистов и экспериментаторов о высокой безопасности витамина.

Между тем, в мировой научной литературе, все чаще публикуются данные опровергающие миф о безвредности витамина А. По данным Forman D., AItman D. (2004) комплексные витаминные препараты, содержащие витамин А не снижают смертность пациентов и, даже напротив, статистически достоверно повышают риск возникновения опухолевых заболеваний.

Учитывая, вышесказанное, а также появление в научной литературе последних десятилетий данных (Duester G., 2008, Kin R. et al., 2012) о регуляторной роли витамина А и негативном влиянии его терапевтических доз на развитие многих органов и в том числе на кардиогенез (Pan J., Baker К.М., 2007; Kikuchi К. et al., 2011), на наш взгляд не вызывает сомнения актуальность изучения морфологических основ адаптации миокарда млекопитающих к хроническому действию терапевтических доз витамина А. Появление новых современных иммуногистохимических методик в настоящее время позволяют решить многие задачи, которые ранее не могли быть решены.

Цель исследования - морфологический анализ эмбрионального и постнатального развития, структурной организации миокарда у взрослых животных в условиях экспериментально измененного эмбриогенеза путем введения витамина А и на фоне хронического стресса.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: 1. На светооптическом и ультрастругаурном уровнях выявить особенности морфологии миокарда крыс в различные периоды онтогенеза при хроническом введении терапевтических доз витамина А

2. Дать морфологическую характеристику процессов пролиферации, дифференцировки и табели кардиомиоцитов в эмбриональном кардиомиогенезе.

3. Изучить влияние витамина А на кардиомиогенез и структуру дефинитивного миокарда крыс, находящихся в условиях стресса.

4. Выявить изменения морфометрических показателей кардиомиоцитов различных отделов сердца в ходе экспериментально измененного кардиомиогенеза. '

Научная новизна полученных данных.

Используя комплекс морфологических методов, впервые в рамках одного исследования проведено детальное изучение гистогенеза сердечной мышечной ткани в различные периоды развития млекопитающих на фоне введения витамина А. Полученные данные существенно дополняют сведения об основных закономерностях гистогенеза сердечной мышечной ткани. Данные, полученные методом нммуногистохимии с применением антител к десмину, тропонину Т свидетельствуют о том, что они могут служить критериями степени дифференцировки кардиомиощггов и пространственной организации данного процесса.

Выявлены особенности кардиомиоцитов атриального и вешрикулярного миокарда. Представлены морфометрические особенности кардиомиоцитов дефинитивной сердечной мышечной ткани, изучено их процентное соотношение в условиях хронического стресса и введения витамина А.

Впервые проведено комплексное гистологическое, иммуногистохимическое, морфометрическое и элетронно-микроскопическое исследование структурной организации миокарда белых крыс в условиях хронического стресса на фоне введения витамина А. С помощью комплекса методов гистологического исследования изучены реактивные изменения и регенераторные процессы, происходящие в миокарде на фоне введения витамина А в условиях хронического стресса. Показано цитопротекторное свойство витамина А на кардиомиоциты в условиях хронического стресса.

Научно-практическая значимость.

Полученные в работе сведения об эмбриональном развитии миокарда, углубляют современные представления о кардиомиогенезе и становлении межтканевых взаимоотношений в ходе формирования миокарда.

Морфометрические, иммуногистохимические и электронно-микроскопические аспекты о структурной организации миокарда в эмбриональном и постэмбриональном развитии сердечной мышечной ткани, полученные в результате данного исследования, могут быть использованы в качестве базовых в научно-практической работе и при проведении экспериментов на лабораторных животных.

Данные о гистогенезе сердечной мышечной ткани, включающем генетически детерминированные процессы пролиферации, дифференцировки и клеточной гибели, могут

быть использованы при моделировании врожденной патологии сердца. Кроме того обнаружено, что эти процессы обладают определенным диапазоном изменчивости.

В связи с широким применением витамина А в практической медицине, результаты исследования, полученные при воздействии витамина А в эмбриогенезе, представляют несомненный интерес. Они расширяют ныне существующие представления о реактивных изменениях миокарда при различных воздействиях. Особенно полезными могут быть данные, полученные при применении витамина А на фоне хронического стресса. Эти данные могут быть использованы в практической медицине.

Научно-практическую ценность имеют сведения о закономерностях пролиферации, дифференцировки и клеточной гибели миокарда, а также особенностях регенерации кардиомиоцитов при воздействии витамина А.

Результаты проведенного исследования целесообразно использовать в изложении соответствующих разделов общей, сравнительной, частной гистологии и эмбриологии медицинских и биологических ВУЗов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Закономерные процессы эмбрионального гистогенеза сердечной мышечной ткани: пролиферация, дифференцировка, интеграция и клеточная гибель имеют свои особенности проявления в нормальном и экспериментально измененном гистогенезе

2. Степень выраженности иммуногистохимической реакции к белку промежуточных филаментов - десмину и к структурному калышй-рецептивному белку - тропонину Т может служить критериями процесса специфической дифференцировки сердечных мышечных клеток, а также пространственной организации данного процесса

3. Экспериментальное изменение эмбриогенеза в результате введения витамина А вызывает комплекс реактивных ультраструктурных изменений миокарда в эмбриональном и постнатальном развитии. Введение витамина А на фоне хронического стресса взрослым животным не вызывает усиления дистрофических изменений в миокарде, а напротив, скорее оказывает цитопротекторное воздействие.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на IX конгрессе Международной ассоциации морфологов (2008г.), на Всероссийской конференции, посвященной 85-летию Д.С.Гордон (Чебоксары, 2008 г.), Всеросс. научн. конф.

«Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации», (18-19 ноября 2008 г., Оренбург), на Региональной научно-практической конференции "Вопросы клинической и экспериментальной медицины" (Чебоксары, 2009), на VI Всеросс. съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Саратов, 23-26 сентября 2009 г.), на X Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010), XI Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Самара 29-31 мая 2012), на заседании Самарского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов (2012).

Внедрение результатов исследования. Результаты исследований используются в учебном процессе в Самарском государственном медицинском университете при чтении лекций и проведении практических занятий по темам "Мышечные ткани", "Сердечно-сосудистая система".

Публикации. По материалам диссертации опубликованы в печати 11 работ из них 7 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждешм, выводов и списка литературы, включающего 152 источников, из которых - 117 иностранные. Иллюстративный материал представлен 1 таблицей, 94 рисунками, которые включают гистограммы, электронограммы и микрофотографии.

Материал и истоды исследования.

Для решения поставленных задач в работе был проведен эксперимент по изучению эмбрионального гистогенеза и постнатального развития миокарда в экспериментально измененных условиях В качестве объекта исследования были использованы белые беспородные крысы различных сроков эмбрионального и постнатального развишя. Животные содержались в виварии, уход за ними осуществляли по нормам и правилам обращения с лабораторными животными (Западнкж И.П., 1983), в соответствии с «Международными рекомендациями по проведении медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ от 19.06.2003 №267) и законом «О защите животных от жестокого обращения» гл. V, ст. 10 4679-ГД от01.12.1999.

Крыс с датированным сроком беременности получали по стандартной методике (Методы биологии развития, 1977). Первым днем беременности животных считали день обнаружения сперматозоидов во влагалищных мазках.

Животные были разделены на несколько групп:

1. Интактные крысы (контроль)

2. Животные, подвергнутые хронической иммобилизации в течение 30 дней

3. Животные, подвергнутые хронической иммобилизации и получавшие витамин А в дозе 10000МЕ ежедневно в течение 30 дней

4. Животные, получавшие витамин А в дозе 10000 МЕ ежедневно с первого дня беременности

Иммобилизационный стресс воспроизводили ежедневным помещением животных в тесные пеналы, ограничивающие подвижность животных. Длительность иммобилизации составляла б часов (25%) в течение 30 дней (Балашов В.П. и соавт., 2001).

Плоды необходимых сроков развития получали сразу после вскрытия беременных самок, усыпленных эфирным наркозом в соответствии с условиями, изложенными в приказе МЗ РСФСР №754. Изучены плоды крыс в возрасте 17,18,19, 20 суток эмбрионального развития. Для изучения посгнатального развития миокарда брали материал от новорожденных, 3, 7 - дневных крысят, 4-х недельных крысят и половозрелых крыс.

В целом в работе изучен материал от 118 животных. Количество животных, их возраст и методы исследования приведены в таблице № 1.

Таблица №1.

Характеристика материала и методов исследования нормального и экспериментально измененного кардиомиогенеза

Объект Методы исследования, Возраст Число

экспериментальная модель особей

Белые беспородные Общегистологические Плоды крыс 17-20-х 24

крысы Морфометрическая оценка суток эмбриогенеза

Изучение эмбриогенеза изолированных кардиомиоцитов Новорожденные

Изучение посгнатального Иммуноцитохимическое крысята, 30

развития исследование с применением 3,7 — дневные, 4-х

моноклональных антител недельные,

Электронная микроскопия половозрелые

Белые беспородные Введение витамина А в дозе 10000 Плоды крыс 17-20-х 24

крысы МЕ крысам с первого дня суток эмбриогенеза

Изучение реактивности беременности до завершения Новорожденные

миокарда на введение эксперимента крысята. 40

витамина А в Введение витамина А в дозе 10000 3,7-дневные, 4-х

эмбриональном и МЕ крысам на фоне хронического недельные,

постнатальном периодах стресса половозрелые

Изучение реактивности Общегистологические

миокарда у взрослых Морфометрическая оценка

животных при введении изолированных кардиомиоцитов

витамина А на фоне Электронная микроскопия

хронического стресса

Характеристика методов исследования

Метод световой микроскопии срезов сердца.

Для изучения срезов сердца методом световой микроскопии материал фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина на фосфатном буфере (рН=7,0) или в фиксаторе Карнуа, с последующей заливкой в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм, сделанные с помощью роторного микротома, окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике (О.В.Волкова, Ю.К.Елецкий, 1982), железным гематоксилином. Коллагеновые волокна в соединительно-тканном остове миокарда, эндокарда и эпикарда выявляли гематоксилином и пикрофуксином по способу Ван-Гизон и окраской по Маллори. Эластические волокна окрашивали орсеином по Унна-Тенцеру (Г.А. Меркулов, 1961).

Особенности строения и развития стенки сердца, а также локализации пролиферирующих кардиомиоцитов и митотической активности мышечных клеток различных отделов сердца определяли на микроскопе С-11.

Метод щелочной диссоциации кардиомиоцитов.

Для получения изолированных кардиомиоцитов использовали метод щелочной диссоциации тканей В.Я. Бродского и соавт. (1983), который применительно к миокарду куриного эмбриона, был модифицирован нами для повышения степени разделения кардиомиоцитов. Для этого кусочки миокарда предсердий и желудочка фиксировали в холодном 10% нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН=7,0). После фиксации в течение 10-14 дней производили поперечные срезы ткани толщиной 1-2 мм и помещали в 50%КОН на двое суток. Затем пипеткой отбирали КОН, а кусочки ткани перекладывали в холодильник в дистиллированную воду на 7-10 суток. После двухчасовой экспозиции при комнатной температуре воду осторожно сливали, добавляли свежую дистиллированную воду из расчета 1 мл на 2 мг миокарда.

С помощью магнитной мешалки в течение 20-30 минут производили окончательное разделение кардиомиоцитов. Визуально контролировали качество разделения кардиомиоцитов по возрастанию степени опалисценции суспензии. Полученную суспензию наносили на предметное стекло, мазок подсушивали на воздухе при комнатной температуре, затем окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике (О.В.Волкова, Ю.К.Елецкий, 1982).

В исследованном материале имела место определенная доля неразделившихся миоцитов (8-10 на 100 клеток).

Морфометрический метод.

Морфометрические исследования кардиомиоцитов производились в мазках изолированных клеток. По полученным цифровым данным рассчитывали ядерно-цитошгазменное отношение в кардиомиоцитах.

Измерения линейных размеров кардиомиоцитов и их ядер производили при 10-кратном увеличении биологического микроскопа ALPHAPHOT-2 YS2-H с помощью видеокамеры CCD Camera КСС-310 PD Nicon China.

По полученным цифровым данным вычисляли объемы ядер кардиомиоцитов, используя формулу элипсоида вращения (К.Ташкэ, 1980):

v=7i/6d|j2dg2,

где dk - малый диаметр измеряемого объекта;

dk— большой диаметр измеряемого объекта.

Для вычисления размеров кардиомиоцитов использовали формулу цилиндра v=ji/4d2L, где d — диаметр, L - длина клетки.

На каждой изученной стадии онтогенеза проводили замер 16 клеток от трех объектов исследования.

Полученные в работе данные обработаны методами вариационной статистики с определением средних, их ошибок. Степень вероятности отличий измеряемых структур вычисляли с помощью критерия Стьюдента при Р=0,95.

Статистическая обработка и графические построения проведены с использованием стандартного статистического пакета STATGRAPHICS, электронных таблиц Excel 97 в среде Windows 3.11.

Получение фотографического изображения микропрепаратов.

Микрофотографии с препаратов получали на микроскопе С-11 с помощью микрофотонасадки МФН-12 У.4.2 и фотоаппарата Nicon China.

Электронно-микроскопический метод.

Материал для электронно-микроскопического исследования подвергали префиксации в течение 2-х часов в 2,5 % растворе глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере с рН=7,2-7,4 (G.Millonig, 1961), а затем фиксировали в 1% растворе тетраокиси осмия на том же фосфатном буфере при температуре О- 4°С в течение 1 часа (G.E.Pallade, 1962). Потом материал промывали в растворе фосфатного буфера при температуре 0-4°С, безвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в аралдит по методике A.M. Glauert, R.H. Glauert (1958). Для обеспечения прицельного электронно-микроскопического анализа со всех блоков получали серийные полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм, которые окрашивали 1% раствором метиленового синего. После идентификации необходимых объектов блоки затачивали и с помощью ультрамикротома LKB 4804А получали прицельные ультратонкие срезы толщиной 200-500 нм, которые помещали на сетки. После контрастирования срезов в 2,5% растворе уранилацетата на 50% этиловом спирте и 0,3%растворе цитрата свинца по E.S.Reynolds (1963) срезы просматривали в электронном микроскопе Hitachi-HU-12.

Данный фрагмент работы выполнен в лаборатории электронной микроскопии РГМУ. Приносим искреннюю благодарность член-корреспонденту РАМН, профессору В.В.Банину за помощь при проведении электронно-микроскопического исследования.

Иммуногистохимический метод.

Иммуногистохимические исследования выполнялись в соответствии со стандартными протоколами. Дифференцировку мышечных тканей определяли иммуногистохимически с помощью антител к специфическим сократительным белкам. Исследование проведено с помощью непрямого иммунопероксидазного метода в прописи А.П.Киясова (1988). В качестве маркера гладкой мышечной ткани использовали а-гладкомышечный актин, а в качестве белка промежуточных филаментов, экспрессирующегося в кардиомиоцитах, -десмин, структурному кальций-рецептивному белку - тропонину Т. В данной работе использованы моноклональные антитела к ct-гладкомышечному актину, десмину, тропонину Т, р-53 фирмы DACO.

Контролем чувствительности и специфичности реакции служили неиммунизированные кроличьи и мышиные сыворотки, а также срезы контрольных тканей.

Депарафинированные срезы, после промывки в 0,1 М трис НС1 буфере и в 1%Н:02, подвергали обработке 5% раствором неиммунной кроличьей сыворотки, после чего препараты инкубировали с мышиными моноклональными антителами. Затем срезы тщательно промывали в буфере и обрабатывали кроличьими антителами (гаЬЬЦ-агШтоизе), меченными пероксидазой хрена. После этого, под контролем микроскопа, выявляли активность пероксидазы раствором хромогена З-амино-9-этилкарбазола в перекиси водорода. Промытые буфером препараты докрашивали гематоксилином Карацци и заключали в глицерин-желатину.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

С помощью классического гистологического исследования было установлено, что, начиная с 17-х суток эмбриогенеза, сердце крыс представляет собой четырехкамерный орган. Миокард стенок предсердий в этот период образован 3-4 пластами кардиомиоцитов. Миокард желудочков образован большим количеством слоев (до 7-8) с хорошо развить™ трабекулярным миокардом. Снаружи развивающийся миокард покрыт эпикардом. Интратрабекулярные щели выстланы эндотелием.

Проведение морфологического анализа с помощью классической окраски гематоксилин и эозин мазков изолированных клеток, полученных методом щелочной диссоциации миокарда, показал, что для развивающейся сердечной мышечной ткани крыс характерен полиморфизм кардиомиоцитов различных отделов сердца. В пределах одной возрастной группы сердечные мышечные клетки отличаются по размерам, форме, а также количеству, положению и выраженности отростков. В ходе кардиомиогенеза кардиомиоциты желудочков становятся длиннее, приобретают полигональную, а затем форму цилиндра. Постепенно происходит редукция отростков, однако совсем они не исчезают. Кардиомиоциты предсердий также удлиняются, но приобретают чаще веретеновидную форму. Они лишены отростков, хотя встречаются и небольшие цилиндрические сердечные мышечные клетки, сохранившие отростки.

В ходе становления структурной организации сердечной мышечной ткани изменяется форма и место положения ядра в клетке. Миофибриллярный аппарат на всем протяжении эмбриогенеза лучше развит в сердечных мышечных клетках желудочков, чем предсердий. В конце эмбрионального развития в изолированных сердечных миоцитах определяется четкая поперечно-полосатая исчерченность.

С помощью электронно-микроскопического исследования удалось проследить образование соединительно-тканного остова миокарда, который к концу эмбрионального развития представлен, в основном, клетками фибробластического ряда, макрофагами, а также межклеточным веществом, содержащим, преимущественно, коллагеновые волокна. Хорошо развититый соединительно-тканный каркас, а точнее волокна соединительной ткани обеспечивают интеграцию кардиомиоцитов и выполняют буферные функции.

Миокард зародышей крыс 17-х суток эмбрионального развития представлен дифференцирующимися кардиомиоцитами, отличительной чертой которых являются четко выраженные процессы специфической дифференцировки, о чем свидетельствует протекающий миофибриллогенез. К концу эмбрионального периода сердечная мышечная ткань представлена дифференцирующимися и дифференцированными кардиомиоцитами.

С помощью иммуногистохимической реакции на а-гладкомышечный актин нам удалось выявить увеличение массы сосудистой системы в ходе кардиомиогенеза. А также показать, что формирование сосудистой сети в предсердиях происходит интенсивнее. Скорее всего это связано с особенностями формирующегося кровоснабжения. Между эпикардом и миокардом также образуются сосуды, причем в эпикарде кровеносные сосуды появляются раньше, что показано выявлением а-гладкомышечного актина.

Тропонин Т - структурный кальций-рецептивный белок, поэтому в нашем исследовании он был выбран одним из маркеров процесса специфической дифференцировки сердечной мышечной ткани. Тропонин Т демонстрирует разную степень окрашивания кардиомиоцитов на 17-20-е сутки эмбрионального развития. Это свидетельствует о разной степени зрелости кардиомиоцитов. Иммуногистохимическое исследование 17-20 суток эмбрионального развития показывает нарастание интенсивности окрашивания к тропонину Т. Также с помощью метода иммуногистохимии были установлены особенности характера распределения специфической дифференцировки в миокарде.

Также для оценки процесса специфической дифференцировки в сердечной мышечной ткани был использован др. белок промежуточных филаментов - десмин, он является одним из ранних маркеров дифференцирующихся кардиомиоцитов. В ходе гистогенеза сердечной мышечной ткани, с увеличением возраста плодов крыс, отмечается более интенсивное окрашивание на этот белок. При выявлении десмина нами также установлены пространственно-временные различия в экспрессии этого белка в кардиомиоцитах. Эти

отличия являются отражением различных сроков дифференцировки кардиомиоцитов, которое начинается в компактном слое миоцитов межжелудочковой перегородки и идет в направлении правой и левой стенок желудочков. Т.е. усиление экспрессии специфических мышечных белков - тропонина Т и десмина свидетельствует о формировании сократительного фенотипа кардиомиоцитов. Характер процесса специфической дифференцировки мышечных элементов различных отделов миокарда коррелирует с особенностями кровоснабжения миокарда в различных отделах сердца.

В настоящее время изучение закономерностей процессов гистогенеза, морфологических основ функционирования и репаративного и регенеративного потенциала сердечной мышечной ткани считается одной из основных проблем, имеющих как фундаментальные, так и прикладные аспекты.

В связи с этим неудивительно сохранение устойчивого интереса исследователей к морфологическим изменениям кардиомиоцитов, возникающим при различных патологических процессах, нарушениях в ходе эмбриогенеза и действии различных фармакологических факторов.

Витамин А - вещество, являющееся компонентом пищи и очень широко используемое как билогически активная добавка. Витамин А является уникальным в своей группе из - за очень узкого интервала концентраций при которых не проявляется ни его дефицит, ни его токсичность (малая широта терапевтического действия). По данным Dickman и Smith (1996) дефицит витамина А и его токсические эффекты обуславливают возникновение специфических пороков развития сердца на ранних этапах развития.

Ретиноевая кислота является самым активным производным витамина А. Она участвует в регуляции эмбрионального развития, тканевого гомеостаза и клеточной дифференцировки и пролиферации.

Изменяя экспрессию ферментов метаболизма витамина А, организм эмбриона может регулировать количество ретиноевой кислоты, поддерживая ее необходимую концентрацию в разных зачатках органов в разные периоды эмбриогенеза. Тем самым эмбрион избегает вредных последствий дефицита или избытка витамина А. В поврежденном сердце мыши также усиливается синтез ретиноевой кислоты, вероятно чтобы усилить способность кардиомиоцитов к регенерации (Kazu Kikuchi at all., 2011). Ретиноиды являются антиоксидантами. Они блокируют активацию свободнорадикальных процессов и

перекисного окисления липидов клеточных мембран, имеющих место при развитии ишемическото и геморрагического инсультов, острых нарушений регионального и общего кровообращения. Их действие реализуется через восстановление свободных радикалов в стабильную молекулярную форму, не способную участвовать в цепи аутоокисления.

В своем исследовании с помощью световой микроскопии мы установили, что введение витамина А в дозе 10000 МЕ не отражается на общей организации развивающего сердца. Ультраструктурные перестройки диффренцирующихся кардиомиоцитов 18- дневных эмбрионов по нашим данным, вероятно, вызываются действием витамина А на клеточные мембраны — плазмолемму, мембраны митохондрий. Отмечены митохондрии с повреждением крист разной степени, а также частично или полностью разрушенные органеллы. Наблюдавшиеся участки повреждения плазмолеммы, явились причиной ей развития внутриклеточного отека с последующей деструкцией и других органелл. Значительные повреждения оболочки клетки, явились следствием возникновения интерстициального отека.

Витамин А вызывает возникновение инвагинаций ядерной оболочки, изменении электронной плотности кариоплазмы и количества гетерохроматина. Иногда ядерная оболочка имела участки повреждения наружной мембраны и локальные разрушения всей оболочки, что приводило к дезорганизации хроматина и нарушению функционирования ядра в целом.

В рассматриваемый период наблюдались нарушения структуры кардиомиоцитов в предсердиях и в желудочках. Однако их степень была выше в желудочках. Нами отмечена мозаичность их повреждений. Так встречались клетки с типичным строением и с повреждениями разной степени соединенные через вставочный диск.

Действие витамина А в этом периоде развития не приводило к усилению процессов апоптоза. Возможно это связано с описанным в литературе антиапоптозным влиянием метаболита витамина А - ретиноевой кислоты.

У новорожденных крысят наряду с реактивными изменениями, преобладавшими в кардиомиоцитах 18 - дневных эмбрионов, наблюдали и дегенеративные нарушения ультраструктуры. Углублялись перестройки ядер. В них появлялись глубокие инвагинации ядерной оболочки, вплоть до образования сегментов, фрагментировалась ядерная оболочка, увеличивалась электронная плотность кариоплазмы. Ядра принимали пикнотический вид.

Становились более выраженными и повреждения структур цитоплазмы. Чаще встречались клетки с обширными зонами внутриклеточного отека. Повреждение и разрушение митохондрий вынуждало клетки использовать анаэробные пути получения энергии, о чем свидетельствует уменьшение количества гранул гликогена в цитоплазме.

Развитие и накопление органелл давало клетке больше возможностей для внутриклеточной регенерации. В кардиомиоцитах новорожденных мы наблюдали скопление лизосом в участках, где наблюдалось разрушение органелл. Усиление темпов миофибриллогенеза выявляло влияние витамина А и на этот процесс. Данные литературы свидетельствуют, что ретиноевая кислота положительно влияет на образование миофибрилл (ЯоЬгег и др., 1991). По нашим данным с ростом миофибрилл становились более заметны и повреждения их структуры. Однако, учитывая стимулирующее действие ретиноевой кислоты на синтез миофибриллярных белков, наблюдаемое повреждение миофибрилл скорее вторично и, вероятнее всего, связано с деструктивным действием внутриклеточного отека.

Изучение электронно- микроскопического строения миокарда на ранних постнатальных этапах развития показало постепенное уменьшение количества деструктивно измененных кардиомиоцитов и степени их поврежденное™. В течение первой недели после рождения наблюдались реактивные изменения ультраструктуры, тогда как повреждения деструктивного характера почти отсутствовали. Возможно это объясняется увеличением устойчивости к повреждающему действию витамина А у более дифференцированных кардиомиоцитов. Также можно предположить, что увеличение количества клеток, как мышечных, так и соединительнотканных, приводит к увеличению потребности миокарда в ретиноидах и, соответственно, снижении количества витамина А, воздействующего на одну клетку. По нашим наблюдениям в этом возрасте продолжает развиваться интерстициальный компонент миокарда - растут сосуды, увеличивается количество соединительнотканных клеток.

В нашей работе на всех изученных сроках характерной чертой поврежденных кардиомиоцитов развития является развитие внутриклеточного отека разной интенсивности.

С возрастом происходит дальнейшее ослабление ультраструктурных проявлений действия витамина А. Так у одно-месячного крысенка уже практически не встречаются разрушающиеся клетки, а наблюдаемые изменения строения носят характер адаптивно-реактивных.

Морфометрические показатели кардиомиоцитов различных отделов сердца в условиях нормального гистогенеза неодинаковы. Ядра кардиомиоцитов правого предсердия имеют наибольшие размеры, что связано с высокой концентрацией секреторных клеток именно в этом отделе сердца. Высокая активность секреторных кардиомиоцитов предъявляет повышенные требования к ядерному аппарату, что и демонстрируют морфометрические показатели ядер кардиомиоцитов правого предсердия и ядерно-цитоплазменное отношение.

В своем исследовании мы показали, что у 4-х недельных крысят размеры кардиомиоцитов и их ядер при введении витамина А в эмбриональном периоде статистически достоверно не отличаются от нормы. У 10-недельных крыс размеры клеток несколько увеличиваются в размере, особенно кардиомиоциты левого желудочка. Это связано с возрастающей функциональной нагрузкой. Площадь ядер левых отделов сердца также увеличивается. После введения витамина А отличительной динамики морфометрических показателей также не наблюдается. Т.е. введение витамина А не вызывает статистически значимых отклонений размеров кардиомиоцитов, их ядер, ядерно-цитоплазменного отношения от нормы.

Несколько неожиданными оказались результаты, полученные при введении витамина А на фоне стресса. Данные, полученные в первой части работы, свидетельствуют о деструктивном влиянии витамина А на структуру кардиомиоцитов. Многочисленные литературные данные о влиянии стресса разного генеза на миокард, также говорят о его повреждающем эффекте. Казалось бы, следует ожидать, что наложение двух повреждающих факторов приведет к суммации их воздействия на кардиомиоциты. Однако, мы наблюдали незначительное увеличение как степени повреждений, так и количества поврежденных клеток. Проявление антистрессорных свойств витамина А, по всей вероятности, связано со снижением концентрации витамина А, а с другой, уменьшение чувствительности клеток к нему.

Однако, цитопротекторное влияние витамина А не смогло полностью компенсировать деструктивное влияние стресса. Об этом свидетельствуют наблюдавшиеся нами клетки в цитоплазме которых развивался отек и отмечались участки лизиса компонентов цитоплазмы. Следует отметить тот факт, что митохондрии в таких клетках не имели повреждений структуры. Это, по - видимому, также объясняется положительным влиянием витамина А. О неполном компенсировании действия стресса свидетельствуют и повреждения компонентов

интерстиция, в частности капилляров, а также, наблюдавшаяся нами склеротизация интерстиция в предсердиях. Еще одним аспектом протекторного влияния витамина А, вероятно, является его антиапоптозная активность. В нашей работе мы не наблюдали апоптоз кардиомиоцитов при введении витамина А на фоне стресса. Антиапоптозное влияние витамина А подтверждают и многочисленные работы других авторов.

Таким образом, данные проведенного исследования свидетельствуют о том, что вцелом действие витамина А на кардиомиоциты в онтогенезе характеризуется: постепенным нарастанием вплоть до рождения и последующим ослаблением в постнатальный период; более выраженным влиянием на желудочковые кардиомиоциты; преимущественным повреждением мембранных структур клетки - плазмолеммы, кариолеммы, митохондрий; более ранним ослаблением действия на ядро, по сравнению со структурами цитоплазмы; мозаичностью действия и отсутствием связи между степенью дифференцировки и интенсивностью повреждений клетки; Введение витамина А на фоне стресса частично купирует его деструктивное влияние, защищая митохондрии, а также оказывая антиапоптозный эффект. Снижение чувствительности клеток к ретиноидам на фоне стресса, по-видимому, делает оправданным введение более высокой дозы ретиноидов, чем общепринятая физиологическая норма.

ВЫВОДЫ

1. Усиление экспрессии белков тропонина Т и десмина в процессе эмбриогенеза свидетельствует о дифференцировке кардиомиоцитов и формировании сократительного фенотипа.

2. Различия в экспрессии специфических белков (десмин, тропонин Т) позволяют оценить особенности пространственной организации процесса специфической дифференцировки, которая начинается от компактного слоя кардиомиоцитов в перегородке желудочков и идет к правой и левой стенкам желудочков. Характер процесса специфической дифференцировки мышечных элементов различных отделов миокарда коррелирует с особенностями кровоснабжения миокарда в различных отделах сердца.

3. Существует полиморфизм кардиомиоцитов, входящих в состав мышечных волокон различных отделов сердца в ходе эмбриогенеза. Наличие отростков у кардиомиоцитов в этот период обеспечивает формирование сетевидной структуры миокарда. Введение витамина А в дозе 10000 МЕ не оказывает влияния на полиморфизм кардиомиоцитов различных отделов сердца.

4. Экспериментальное нарушение эмбриогенеза зародыша крыс путем введения витамина А в онтогенезе вызывает комплекс реактивно-дистрофических изменений в миокарде, проявляющийся в нарушении ультраструктуры ядер, мембранных органоидов, миофибриллярного аппарата. Восстановление структурной организации поврежденных кардиомиоцитов происходит за счет процесса внутриклеточной регенерации.

5. В условиях хронического стресса введение витамина А в дозе 10000 МЕ статистически достоверно не изменяет динамики морфометрических показателей предсердных и желудочковых кардиомиоцитов, а также усиления реактивно-дистрофических изменений. Что обусловлено цитопротекторным эффектом витамина А.

Практические рекомендации.

1. Представленные морфологические, иммуногистохимические и электронно-микроскопические характеристики малодифференцированных, дифференцирующихся и дифференцированных кардиомиоцитов могут быть

использованы как основополагающие при проведении экспериментов на плодах белых беспородных крыс.

2. Установленные особенности кардиогенеза при воздействии на зародыш витамина А следует учитывать при моделировании врожденных аномалий развития сердца с помощью препаратов, обладающих эмбриотропным действием.

3. Реактивные изменения миокарда при введении витамина А на фоне хронического стресса следует учитывать при моделировании исследовательских работ в рамках сгрессолосредованных условий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ямщиков Н.В. Ультраструктурный и иммуноцитохимический анализ кардиомиогенеза эмбрионов крыс / Ямщиков Н.В., Шурыгин С.А. // Материалы докладов IX конгресса Международной ассоциации морфологов в ж-ле «Морфология», т. 133, №2. 2008 г., с. 162.

2. Ямщиков Н.В. Современные методические подходы к изучению нормального и экспериментально измененного кардиомиогенеза / Ямщиков Н.В., Шурыгин С.А. // Материалы Всероссийской конференции, посвященной 85-летию Д.С.Гордон, Чебоксары, 2008 г., с. 152-153.

3. Ямщиков Н.В. Ультраструктурные и иммуноцитохимические особенности специфической дифференцировки кардиомиоцитов эмбрионов птиц и крыс / Ямщиков Н.В., Шурыгин С.А., Ямщикова E.H. // Матер. Всеросс. научн. конф. «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации», (18-19 ноября

2008 г., Оренбург) в ж-ле «Морфология». Т.134. №5,2008 С.106.

4. Ямщиков Н.В. Морфологические изменения миокарда крыс в экспериментальных условиях / Ямщиков Н.В., Шурыгин С.А., Ямщикова E.H. // Материалы региональной научно-практической конференции "Вопросы клинической и экспериментальной медицины". - Чебоксары, 2009, С. 257-258.

5. Ямщиков Н.В. Реактивные изменения миокарда крыс в экспериментальных условиях / Ямщиков Н.В., Шурыгин С.А., Ямщикова E.H. // Матер. VI Всеросс. Съезда анатомов, гистологов и эмбриологов (23-26 сентября

2009 г., Саратов) в ж-ле «Морфология». Т.136. №4,2009 С. 162.

6. Ямщиков H.B. Структурная организация миокарда в эксперименте / Ямщиков Н.В., Шурыгин С.А. // Тезисы X Конгресса Международной ассоциации морфологов, Ярославль в ж-ле «Морфология» Т. № 2010 С. 156.

7. Шурыгин С.А. Современные подходы к изучению регенерационного гистогенеза в экспериментальных условиях / Шурыгин С.А., Ямщиков Н.В., Шурыгина О.В. // Материалы международной научной конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники», в ж-ле «Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований» №12, 2011. С. 120-121.

8. Шуриыгин С.А. Регенерационный гистогенез миокарда крыс в экспериментальных условиях / Шурыгин С.А., Ямщиков Н.В., Ямщикова E.H. // в ж-ле «Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований», Материалы международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», №2, 2012. С.82-83.

9. Шурыгин С.А. Морфофункциональная характеристика миокарда крыс в экспериментальных условиях / Шурыгин С.А. // Материалы докладов XI Конгресса Международной ассоциации морфологов, Самара 29-31 мая 2012 в ж-ле «Морфология», т.141, №3,2012, с.182.

10. Шурыгин С.А. Морфологическая характеристика кардиомиогенеза крыс в условиях хронического стресса и воздействия витамина А / Шурыгин С.А., Ямщиков Н.В., Балашов В.П., Абрамов В.Н., Шурыгина О.В. // журнал «Фундаментальные исследования», №9, часть 5, 2013, с.112-116.

11. Шурыгин С.А. Морфологические особенности повреждения миокарда в условиях хронического стресса и введении витамина А / Шурыгин С.А., Ямщиков Н.В., Балашов В.П., Абрамов В.Н., Шурыгина О.В., Ямщикова E.H. // Современные проблемы науки и образования» (электронный журнал), 2013 -JVt- URL: http://www.science-education.ru/

Подписано в печать 19.11.2013. Формат 60x84/16. Бумага офсетаая. Печать оперативная. Объем 1,16 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 1969.

Отпечатано в типографии ООО «Офорт». 443080, г. Самара, ул. Революционная, 70, литера П. Тел.: 372-00-56, 372-00-57,931-98-59. E-mail: ofort-samara@mail.ru.