Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конформационная динамика альфа-фетопротеина, его пептидных фрагментов и их биологическая активность

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Молдогазиева, Нурбубу Тентиевна, Москва

ГБОУ ВПО «РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И. ПИРОГОВА» МИНЗДРАВА РФ Кафедра биохимии

05201351511 На правах рукописи

УДК 577.3

МОЛДОГАЗИЕВА Нурбубу Тентиевна

КОНФОРМАЦИОННАЯ ДИНАМИКА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА, ЕГО ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Специальность 03.01.02 - Биофизика 03.01.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: член-корр. РАМН, д.м.н.,

профессор А.А. Терентьев

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

N по порядку Наименование раздела Стр

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ 7

ВВЕДЕНИЕ 9

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 19

1.1 Биосинтез альфа-фетопротеина во время эмбрио- и 19 канцерогенеза

1.2 Строение белков семейства альбуминоидных генов 23

1.3 Эволюция альбуминоидных генов 28

1.4 Конформационные состояния альфа-фетопротеина 30

1.5 Возможные функции альфа-фетопротеина 36

1.5.1 Связывание гидрофобных лигандов 37

1.5.2 Иммуносупрессорная активность 41

1.5.3 Регуляция пролиферации, дифференцировки и 44 апоптоза клеток

1.6 Рецептор(ы) альфа-фетопротеина 49

1.7 Структурно-функциональные взаимоотношения 53 альфа-фетопротеина с другими физиологически активными белками

1.7.1 Факторы роста 53

1.7.2 Белки клеточной адгезии 58

1.7.3 Белки, содержащие ЭФР-подобные модули 62

1.8 Пептидные (линейные) мотивы альфа-фетопротеина 65

1.8.1 Роль коротких линейных мотивов белков в 65 функционировании клетки

1.8.2 Инвертированные линейные мотивы белков 72

1.8.3 Функционально важные пептиды альфа-фетопротеина 75

«к

1.8.3.1 Гептапептид LDSYQCT (АФП14-20) 75

1.8.3.2 Пептид, ингибирующий рост (GIP), его аналоги и 77 активные фрагменты

1.8.3.3 Участки связывания гидрофобных лигандов и ионов 81 металлов

1.8.3.4 Эпитопные участки 83

1.8.3.5 Другие предполагаемые функционально важные 86 участки

1.9 Участие альфа-фетопротеина в белок-белковых 88

взаимодействиях и формировании белковых сетей

1.9.1 Белок-белковые взаимодействия. Принципы 88 формирования белковых сетей

1.9.2 Медико-биологические значение изучения белковых 95 сетей

1.9.3 Белковые сети с участием альфа-фетопротеина 98

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 102

2.1 Филогенетический анализ белков семейства 102 альбуминоидных генов

2.1.1 Метод глобального выравнивания 102

2.1.2 Подсчет степени гомологии между парами белков 107

2.2 Моделирование трехмерной (3D) структуры альфа- 108 фетопротеина человека на основании гомологии

2.2.1 Поиск шаблонов для построения модели и 108 выравнивание аминокислотных последовательностей

2.2.2 Построение модели, его оптимизация и валидация 109

2.2.3 Конструирование молекулы гормона 111

2.2.4 Метод молекулярного докинга 111

2.2.5 Оптимизация и релаксация комплексов АФП-ДЭС с 113

помощью метода молекулярной динамики

2.3 Поиск АФПн.го-подобных мотивов по базам данных 113

2.3.1 Методы локального выравнивания 113

2.3.2 Структурно-функциональная характеристика белков 116

2.3.3 Подсчет количества аминокислотных замен 116

2.4 Компьютерное конструирование пептидов 117

2.4.1 Получение аналогов гептапептидного фрагмента 117 альфа-фетопротеина LDSYQCT (АФП14.20)

2.4.2 Конструирование пента- и тетрапептидов PSG и СЕА 119

2.4.3 Конструирование зрелой молекулы эпидермального 120 фактора роста (ЭФР) и его пептидов

2.4.3.1 ЭФР и его прямые пептиды 120

2.4.3.2 Инвертированные пептиды 120

2.5 Расчеты методом молекулярной динамики 121

2.6 Обработка траекторий, полученных методом МД 123

2.6.1 Анализ дву- и трехмерных карт уровней свободной 123 энергии

2.6.2 Графики автокорреляционных функций 124

2.6.3 Кластерный анализ 125

2.6.4 Построение карт и графиков, визуализация МД 126 траекторий

2.7 Выделение и получение очищенного препарата АФП 127 человека

2.7.1 Экстракция АФП из биологического материала 127

2.7.2 Аффинная хроматография на ДЭС-сефарозе 127

2.7.3 Гель-фильтрация 128

2.7.4 Диск-электрофорез 128

2.8 Тестирование биологической активности АФП 129

человека и его пептидов

2.8.1 Синтез пептидов 129

2.8.2 Биологический материал 130

2.8.3 Выделение лимфоцитов 130

2.8.4 Реакция бласттрансформации лимфоцитов 131

2.8.5 Тест цитотоксичности лимфоцитов 131

2.8.6 Метод непрямой иммунофлюоресценции 132

2.8.7 Культивирование лимфоцитов с АФП и пептидами 133 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 134

3.1. Филогенетический анализ белков семейства 134 альбуминоидных генов

3.1.1 Анализ результатов попарного выравнивания 134

3.1.2 Сравнение степени гомологии в парах АФП-АФП и 138 альбумин-альбумин у разных биологических видов

3.1.3 Использование белков альбуминоидных генов для 143 решения трихотомной проблемы

3.1.4 Филогенетическое дерево семейства 145

3.1.5 Выявление диагностических для семейства 147 альбуминоидных генов аминокислотных остатков

3.2 Моделирование трехмерной структуры АФП человека 149

3.2.1 Общая архитектура полученной модели 149

3.2.2 Валидация построенной 3D модели АФП человека 155

3.2.3 Докинг диэтилстильбэстрола в построенную 3D 160 модель АФП

3.2.4 Анализ эстрогенсвязывающего участка АФП 162

3.3 Результаты поиска функционально важных участков 166

3.3.1 Структурно-функциональное картирование АФП 166

3.3.2 Выявление линейных АФП^о-подобных мотивов в 170

физиологически активных белках

3.3.2.1 Прямые АФП14-2о-подобные мотивы. 170

3.3.2.2 Функциональные классы белков, содержащих 171 АФП 14-2о-п°д°бные мотивы

3.3.2.3 Количественный и качественный анализ 176 аминокислотных замен в прямых АФП¡^а-подобных мотивах

3.3.2.4 Инвертированные АФП ¡^о-подобные и 22-членные 179

мотивы

3.3.2.5 Качественный и количественный анализ 182 аминокислотных замен в инвертированных АФПц^п-подобных мотивах

3.3.3 АФПм-20 -подобные мотивы и их фрагменты в 185 онкофетальных белках

3.3.3.1 Семейство эпидермалъного фактора роста 185

3.3.3.2 Трансформирующие факторы роста TGF-/3 187

3.3.3.3 Ингибиторы циклинзависимых киназ 188

3.3.3.4 PSGuCEA 191 3.4 Конформационно-динамические свойства 194

аминокислотных остатков в пептидах

3.4.1 Влияние точечных аминокислотных замен 196

3.4.1.1 Анализ 2D и 3D карт уровней свободной энергии 196

3.4.1.2 Графики автокорреляционных функций 4 202

3.4.2 Роль внутримолекулярных взаимодействий 209

3.4.2.1 Анализ 2D и 3D карт уровней свободной энергии 209

3.4.2.2 Графики автокорреляционных функций 217

3.4.3 Направление и длина полипептидной цепи 223 3.4.3.1 Анализ 2D и 3D карт уровней свободной энергии 224

3.4.3.2 Графики автокорреляционных функций 234

3.4.3.3 Кластерный анализ 241 3.4.4 Взаимосвязь между относительной гибкостью 245

пептидного остова и биологической активностью

3.4.4.1 Анализ 2И и ЗИ карт уровней свободной энергии 246

3.4.4.2 Графики автокорреляционных функций 255

3.4.4.3 Кластерный анализ 260

3.5. Выделение и очистка АФП с сохранением его 265

нативной конформации

3.5.1 Влияние способа элюции на чистоту препарата АФП 265

3.5.2 Конформационные состояния АФП могут 267 обуславливать различия в биологической активности

3.6 Биологическая активность АФП, его гептапептида 269 АФП14_2о и пептидных фрагментов PSG и СБА

3.6.1 Влияние АФП и его гептапептида АФП^о на 270 пролиферативную активность лимфоцитов

3.6.2 Влияние гептапептида АФП^о на активность NK- 272 клеток

3.6.3 Экспрессия маркеров активированных Т-лимфоцитов 273 под воздействием АФП и его синтетического пептида LDSYQCT

3.6.4 Влияние пента- и тетрапептидов СБА и PSG на 276 экспрессию маркеров активированных В- и Т-

лимфоцитов

3.7 Возможный механизм действия АФП и его 280 гептапептида ЬОЭУСЮТ (АФП14_20)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 287

ВЫВОДЫ 304

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 307

ПРИЛОЖЕНИЯ 392

БЛАГОДАРНОСТИ 398

Список принятых сокращений

АФП - альфа-фетопротеин

ВДСБ — витамин Д-связывающий белок

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГС-ЭФР - гепаринсвязывающий ЭФР-подобный фактор роста

ДЭС - диэтистильбэстрол

Е2 - эстрадиол-17|3

КонА - конканавалин А

МАПК - митоген-активируемая протеинкиназа

МкА - моноклональные антитела

МД - молекулярная динамика

ПААГ - полиакриламидный гель

РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов

РСА - рентгеноструктурный анализ

РЭФР - рецептор для эпидермального фактора роста

СА - сывороточный альбумин

ТБГ - трофобластспецифический бета-глобулин

ТФУ - трифторуксусная кислота

ФАК - фокальная адгезивная киназа

ФГА — фитогемагглютинин

ФРСК - фактор роста стволовых клеток

ФРТ - фактор роста тромбоцитов

ЭЦМ - экстрацеллюлярный матрикс

ЭФР - эпидермальный фактор роста

ЯМР - ядерно-магнитная резонансная

BLAST (basic alignment search tool) - программа локального выравнивания

CDK (cyclin-dependent kinase) - циклинзависимая киназа

CEA (carcino-embryonic antigen) - раковоэмбриональный антиген

CKI (cyclin-dependent kinase inhibitor) - ингибитор циклинзависимых киназ

ERK (extracellular signal-regulated kinase) - киназа, регулируемая внеклеточным сигналом

GIP (growth inhibitory peptide) - пептид, ингибирующий рост HCC (hepatocellular carcinoma) - гепатоцеллюлярная карцинома HSP (heat shock protein) - белок теплового шока IGF-II (insulin-like growth factor) - инсулиноподобный фактор роста LGA (Lamarckian genetic algorithm) - генетический алгоритм Ламарка MGF (molten globule form) - форма расплавленной глобулы NK (natural кШег)-клетки - клетки-естественные киллеры NF-кВ (nuclear factor-кВ) - ядерный фактор-кВ

NCBI (National center for biotechnology information) - Национальный центр биотехнологичекой информации

PDB (protein data bank) - база данных трехмерных структур белков PI-3K (phosphatidylinositol-3-kinase) - фосфатидилинозитол-3-киназа PSG (pregnancy-specific pi-glycoprotein) - специфичный для беременности Р1 -гликопротеин

RECAF (receptor for alpha-fetoprotein) - рецептор для альфа-фетопротеина RMSD (root mean square deviation) - среднеквадратичное отклонение RTK (receptor tyrosine-kinase) - рецепторная тирозинкиназа SDS (sodium dodecylsulphate) - додецилсульфат натрия TGF-a (transforming growth factor-a) - трансформирующий фактор роста-a TGF-p (transforming growth factor-p) - трансформирующий фактор роста-Р TNF-a (tumor necrosis factor-a) - фактор некроза опухолей-a TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) - лиганд, индуцирующий TNF-зависимый апоптоз

VEGF (vascular endothelial cell growth factor) - фактор роста эндотелиальных клеток сосудов

VMD (visual molecular dynamics) - визуализация молекулярной динамики 2D (two-dimensional) - двумерный, 3D (three-dimensional) - трехмерный

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Альфа-фетопротеин (АФП) - основной сывороточный белок эмбрионального периода развития всех представителей класса млекопитающих, и, возможно, всех позвоночных (Mizejewski, 1995а). Он является наиболее известным опухолевым антигеном, специфичным для первичного рака печени и тератокарцином (Abelev, 1963, 1971, 1984; Татаринов, 1963, 1965), признанным «золотым стандартом» в применении молекулярных маркеров в диагностике опухолей (Debruyne, 2008).

Впервые АФП был обнаружен в 1956 году Бергстрандом и Кзаром в сыворотке крови плода человека как белковая фракция, обладающая электрофоретической подвижностью а-1-глобулинов (Bergstrand and Czar, 1956), и был иммунохимически идентифицирован Мюралем и Руле в 1961 году (Murait and Roulet, 1961). Открытие явления биосинтеза АФП в организме взрослых особей при канцерогенезе, продемонстрированное в 1963 году Г.И. Абелевым у мышей с химически индуцированной гепатомой и Ю.С. Татариновым в сыворотке крови больных первичным раком печени, положило начало интенсивным исследованиям этого белка (Abelev, 1963; Татаринов, 1963). За полвека, прошедшие с того времени, выделены, очищены разными способами и охарактеризованы физико-химически и иммунохимически альфа-фетопротеины ряда биологических видов: человека, мыши, крысы, кролика, морской свинки (Гусев и Язова, 1970; Tatarinov, 1990; Deutsch, 1991).

К настоящему времени (май, 2013г.) расшифрованы и размещены в базах данных UniProtKB/SwissProt и GenBank полные аминокислотные последовательности альфа-фетопротеинов тринадцати биологических видов, включая человека, шимпанзе, гориллу, лошадь, собаку, свинью, быка, курицу, сурка, землекопа, дельфина, мышь и крысу.

АФП принадлежит к семейству белков - продуктов альбуминоидных генов, к которым относятся также сывороточный альбумин (СА), витамин Д-связывающий белок (ВДСБ) и афамин. Белки этого семейства обладают сходными физико-химическими свойствами и способны связывать и транспортировать низкомолекулярные гидрофобные лиганды (эстрогены, жирные кислоты, билирубин, жирорастворимые витамины, некоторые лекарства) и ионы металлов. Особый интерес представляет изучение эстрогенсвязывающей способности АФП, так как она определяет уровень циркулирующих гормонов в материнской сыворотке. Однако экспериментально так и не удалось показать способность АФП человека (в отличие от АФП мыши и крысы) связывать свободные эстрогены. Нами было показано, что АФП человека эффективно связывает иммобилизованные эстрогены (Терентьев и соавт., 1988, 1990). Однако молекулярные механизмы связывания и строение эстрогенсвязывающего участка до сих пор оставались не изученными.

Установление пространственной структуры АФП с применением экспериментальных методов (таких как РСА и ЯМР-спектроскопия) также остается трудно разрешимой задачей. В связи с этим, компьютерное моделирование трехмерной (3D) структуры АФП представляет собой актуальную проблему, решение которой в настоящее время стало возможным с помощью достижений современной биоинформатики и биоинженерии. Полученная 3D модель АФП может быть использована для докинга низкомолекулярных лигандов (включая эстрогены) и изучения структуры связывающего участка с выявлением детальных механизмов взаимодействия между белком и лигандом.

До сих пор остается до конца невыясненной биологическая роль АФП,

как во время эмбрионального развития, так и во взрослом организме (в норме

и канцерогенезе). В многочисленных экспериментальных моделях in vitro и

ю

in vivo показано, что АФП обладает несколькими видами биологической активности и, на этом основании сформировано представление об его полифункциональности. Это свойство обеспечивается мультимодульностью строения АФП (Mizejewski, 1997, 2001, 2004, 2010а; Zaretsky and Wreschner, 2008).

Интенсивные исследования последних двадцати лет убедительно показали, что, наряду с глобулярными доменами (Cesareni, 2004), в составе АФП существуют другие структурные модули, такие как короткие линейные мотивы (состоящие из 3-10 аминокислотных остатков (а.о.)). Пептидные мотивы обнаруживаются в составе многих регуляторных белков и опосредуют белок-белковые взаимодействия, участвуют в передаче сигнала внутрь клеток, регуляции клеточного цикла и др. (Hunt, 1990; Liu and Hsu, 2005; Neduva and Russel, 2005; Saito et al., 2007; Diella et al., 2008).

Системный анализ структурно-функциональных взаимосвязей между гомологичными и негомологичными белками позволяет предсказать их функции (Pal and Eisenberg, 2005; Zaretsky and Wreschner, 2008). Современные биоинформатические ресурсы, включая базы данных (UniProtKB/SwissProt, PDB, PIR и др.) и компьютерные программы (BLAST, FASTA, ClustalW), обеспечивают исследователей набором необходимых инструментов для осуществления сравнительного анализа первичных структур белков и пептидов с целью обнаружения в их составах сходных аминокислотных последовательностей и выявления функционально важных участков (Mizejewski, 2010а).

В 1997 году A.A. Терентьевым было обнаружено наличие сходства между гептапептидным сегментом LDSYQCT, расположенным в iV-концевой части полипептидной цепи АФП, и частью рецепторсвязывающего участка эпидермального фактора роста (ЭФР) человека с последовательностью

LDKYACN. Гептапептид LDSYQCT включает остатки с 14 по 20 в зрелой молекуле АФП и поэтому был обозначен как АФП^о- Этот сегмент представляет собой один из биологически активных участков АФП человека. Однако механизмы его функционирования и, особенно, роль отдельных аминокислотных остатков остаются до сих пор невыясненными.

Известно, что доступность функционально важных участков в нативной молекуле белка зависит от его конформационного состояния (Ptitsyn and Uversky, 1994). Конформационные варианты АФП изучаются с начала 1980-х годов, но особенно впечатляющие результаты были получены в течение последних пятнадцати лет (Нарыжнева и соавт., 1997; Uversky et al., 1997а, 1997b). Существенное значение в функционировании биомакромолекул имеет также их внутренняя динамика. При функционировании белков (например, при связывании с лигандом или с рецептором) их конформация может заметно не изменяться, однако динамические характеристики аминокислотных остатков могут претерпевать существенные изменения (Gohlke, et al., 2003; Шайтан и соавт., 1999, 2002, 2003; Case et al., 2005). Однако, взаимосвязь между конформационно-динамическими свойствами и биологической активностью АФП и его пептидов и корреляция между этими двумя важнейшими параметрами, определяющими структурно-функциональные взаимоотношения в молекуле АФП, остаются неизученными.

Математические расчеты траекторий движения атомов, реализованные в методах молекулярной динамики (МД), позволяющие получать детальные данные о структуре и механизмах внутри- и межмолекулярных взаимодействий, а также информацию о параметрах, которые трудно измерить экспериментально, в настоящее время являются наиболее эффективным приемом в решении задач, описанных выше (Шайтан и соавт., 1999, 2002, 2003). Особый интерес представляет использование системного

12

подхода в изучении структуры и функций АФП с применением комбинации как экспериментальных, так и вычислительных методов, вкупе с биоинформатическими ресурсами.

Интенсивные исследования альфа-фетопротеина связаны также с поиском возможностей для его (или его пеп