Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные особенности АПО- и Холо-Форм онкоэмбрионального белка альфа-фетопротеина человека

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурные особенности АПО- и Холо-Форм онкоэмбрионального белка альфа-фетопротеина человека"

од

На правах рукописи

НАРИЖНЕВА НАТАЛЬЯ ВАЛЕНТИНОВНА

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ АЛО- И ХОЛО-ФОРМ ОНКОЭМБРИОНАЛЬНОГО БЕЛКА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ПУЩИНО - 1998 г.

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель - кандидат физико-математических наук

В.Н.Уверский

Официальные оппоненты - доктор физико-математических наук В.П. Кутышенко

доктор биологических наук Е.А. Пермяков

Ведущая организация - Институт канцерогенеза РАМН г. Москва

, ,, оо

Защита состоится « 2,0 » /Ц,Си$1 1998 г. в ' ^ часов

на заседании диссертационного совета Д 200.22.01 Института теоретической и

экспериментальной биофизики РАН по адресу:

142292, Московская область, г. Пущино, ИТЭБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН

Автореферат разослан «_» ' _ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследование структурных свойств сс-фетопротеина (АФП) является важным этапом в процессе определения молекулярного механизма функционирования этого белка, роль которого в организме очень важна и многообразна. Действительно, АФП выполняет в организме ряд функций, наиболее важными из которых, по-видимому, являются транспортная и иммунорегулятор-ная. АФП появляется в организме на ранних стадиях развития эмбриона. В этот период АФП работает как белок - иммуносупрессор, подавляя иммунный ответ организма матери на развивающийся" плод. Кроме того, АФП переносит гидрофобные лиганды, в частности полиненасыщенные жирные кислоты. После рождения ребенка концентрация этого белка в организме резко падает, и к концу второго месяца жизни он остается в здоровом организме только в следовых количествах. Повышение содержания этого белка в крови взрослого организма отражает развитие ряда патологий, в частности некоторых онкологических заболеваний. В эгом случае АФП синтезируется клетками опухоли и отвечает за их толерантность по отношению к организму - хозяину. В процессе своего функционирования молекула АФП может находиться в различных физиологических условиях (в кровотоке, у поверхности клеточных мембран, внутри клеток), а также быть связашю;"; с различными лигандами. Все эти факторы, несомненно, в той или иной степени могут влиять на структуру и стабильность АФП. Изучение влияния этих факторов на структуру АФП дает ключ к пониманию молекулярного механизма функционирования этого белка, а, следовательно, и к более детальному осмыслению процессов, происходящих в организме на стадии онтогенеза.

Цель работы. Основной целью данной работы было проведение исследований структурных свойств АФП в различных условиях в двух предельных случаях - белка, содержащего свои основные лиганды и белка без лигандов.

Научная новизна. Было установлено кардинальное влияние лигандов на структурные характеристики эмбрионального АФП человека. Показано, что удаление лигандов из молекулы АФП приводит к денатурации белковой молекулы. Со структурной точки зрения безлигендная форма АФП представляет собой компактное состояние с близким к нативному содержанием вторичной структуры, однако не обладающее уникальной третичной структурой. Другими словами, мо-

лекула АФП в безлигандной форме обладает всеми свойствами расплавленной глобулы. Показано также, что при переходе к условиям, моделирующим условия вблизи поверхности мембраны нативная (содержащая природные лиганды) молекула АФП претерпевает конформационный переход, переходя в состояние типа расплавленной глобулы.

Апробация работы и научные публикации. Материалы диссертации докладывались на 23 Международной конференции по проблемам биологии и медицины канцерогенеза, 1995 год, Монреаль (Канада); на ежегодной научной конференции Института белка РАН, 1995 год, Пущино (Московская область). Стендовое сообщение было представлено на Городской Научной конференции Молодых ученых, 1996 год, Пущино (Московская область). По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 130 страницах печатного текста и состоит из Введения, Литературного обзора, главы «Материалы и методы», трех глав, посвященных описанию и обсуждению полученных экспериментальных данных, Заключения, Выводов и Списка цитируемой литературы. Литературный обзор посвящен трем темам: промежуточные состояния белковой молекулы, возникающие на пути её сворачивания; физико-химические и биологические свойства онкоэмбриональиого белка АФП; влияние лигандов на структуру белковых молекул. Описание экспериментальных результатов разбито на три главы, посвященные структурным свойствам АФП, содержащего лиганды; безлигандной форме АФП и структурным свойствам белка в условиях., моделирующих условия вблизи поверхности мембраны соответственно. Материал иллюстрирован 24 рисунками и 3 таблицами. Список цитируемой литературы включает 141 работу.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.Структурные свойства АФП человека, содержащего природные лнганлы

Первая часть работы посвящена исследованию стабильности молекулы АФП при различных значениях рН. Стабильность белковой молекулы по отношению к тепловому воздействию исследовалась при помощи метода сканирующей микрокалориметрии. На рис. 1 представлены кривые зависимости молярной теплоемкости белковой молекулы от температуры при рН 10.4; 8.0; 7,0; 5.0 к 3.1. Из рисунка видно, что при всех значениях рН АФП плавится единой кооперативной

единицей, что достаточно необычно для белков такого молекулярного веса (около 70 кДа). Кривые плавления, полученные ?, щелочных и нейтральных рН. очень он! ■];::' (см. также таблицу 1V И районе 69.5"С >'аб /'олаети п»!К ,;соператиы:ого теп-дспоглощенш.. чгг> указывает на плавление жесткой третичной структуры. Энтальпия перехода также практически не меняется в области рН 7 -10.4. Этот факт говорит о том, н:.ч-;нение рН раствора в этом диапазоне практически не сказывается на устойч&т гч молекулы АФП по отношению к тепловому воздействию. Однако прн переходе в кислые рН (рН 5) картина заметно меняется. Точка плавления сдвигается в сторону меньших температур, а энтальпия плавления заметно уменьшается, отражая факт дестабилизации молекулы АФП в этих условиях. При значении рН 3 кривая плавления не имеет пика кооперативного теплопоглощеиия, что указывает на отсутствие у белка жесткой третичной структуры уже при комнатной температуре. То есть при рН Ъ молекула АФП находится в денатурированном состояния.

Рисунок 1. Зависимость молярной теплоемкости АФП человека, полученные при различных значениях рН раствора. Сплошной линией указаны кривые первого прогрева, пунктирной - кривые повторного прогрева. Кривые повторного плавления АФП при всех значениях рН практически идентичны. Поэтому на рисунке приведена только кривая, полученная при рН 7.2.

ТАБЛИЦА 1.

Термодинамические параметры тепловой денатурации АФП человека

РН Тд,иС •ДНд,фф, кДж/Моль ДНя,ка-\ кДж/Моль ДН*МНкал

10.4 69.3 510±20 480±20 1.06

10.0 69.2 510±20 490+20 1.04

8.0 69.8 510±20 '490±20 1.04

7.0 69.0 490±20 460±20 1.07

5.0 58.7 280±10 270+10 1.04

Очень важным является тот факт (к которому мы будем возвращаться еще не раз), что кривые повторного прогрева АФП при всех значениях рН не имеют пика кооперативного теплопоглощения. Это свидетельствует о необратимости процесса тепловой денатурации этого белка.

Устойчивость АФП при различных значениях рН по отношению к воздействию сильных де-натурантов исследовалась при помощи. метода флуоресцентной спектроскопии. На рис.2 представлены кривые разворачивания АФП мочевиной при значениях рН 10.7, 7.2 и 3.1. Видно, что при нейтральных рН АФП достаточно устойчив по отношению к воздействию этого денатуранта - процесс разворачивания происходит очень кооперативно в интервале от 7 до 8 М мочевины. Изменение рН раствора, как видно из рисунка, приводит к уменьшению стабильности этого белка, а процесс разворачивания становится менее кооперативным. Таким образом, из всего вышесказанного можно сделать вывод, что изменение рН раствора в целом приводит к дестабилизации молекулы АФП. Причем, если увеличение значения рН не дена-

Концетрация мочевины (М)

Рисунок 2. Кривые разворачивания АФП мочевиной при разных значениях рН, представленные в нормированном виде как зависимость доли денатурированного состояния от концентрации денатуранта. Квадратиками представлена кривая разворачивания при рН 7.2, треугольниками - при рН 10.7, кружочками - при рН3.1.

турирует белковую молекулу (белок сохраняет жесткую третичную структуру), то при рН 3.1 молекула АФП не имеет уникальной пространственной структуры. Спектры КД АФП в пептидной области при рН 3.1 практически идентичны спектрам КД нативного белка, что указывает на отсутствие заметного изменения вторичной структуры в «кислой форме» белка по сравнению с нативным белком. Как показывают спектры флуоресценции АФП, компактность кислой формы белка также близка к нативной (максимум триптофановой флуоресценции практически не сдвигается).

На рис. 3 представлены спектры флуоресценции АНС в присутствии АФП в различных условиях. Флуоресценция АНС в растворе с белком при нативных условиях выше, чем в присутствии 9 М мочевины. Это говорит, о наличии в белке

гидрофобных кластеров, экспонированных на растворитель (что неудивительно, если учесть тот факт, что АФП переносит гидрофобные лигандь1). Однако интенсивность флуоресценции АНС в присутствии «кислой формы,) ДФП увеличивается еще более чем в 2 раза. Это указывает на возникновение ночых доступных растворителю гидрофобных кластеров, ранее экранированных жесткой третичной структурой.

„ „ , Из всего вышесказанного сле-

Рисунок 3. Спектры флуоресценции гидрофобного зонда АНС в присутствии АФП при ра)- дует, что при рН 3.1 АФП представляет личных значениях рН.

собой компактное денатурированное состояние с близким к нативному содержанием вторичной структуры, то есть, обладает всеми свойствами состояния расплавленной глобулы.

2.Сравнение свойств гомологичных белков сывороточного альбумина н а-фетопро теина человека

Как уже говорилось выше, тепловая денатурация АФП является необратимым процессом. Кроме того, АФП обладает еще рядом особенностей, отличающих его от белков близкого молекулярного веса. Следует отметить, что гло-

булярные белки с молекулярным весом около 70 кДа обычно состоят из нескольких независимых (или квазинезависимых) структурных доменов, которые плавятся отдельными кооперативными единицами, в то время как АФП плавится как единое целое. Энтальпия плавления АФП сравнительно мала. Кроме особенностей, проявляемых этим белком при термической обработке, следует отметить тот факт, что и при разворачивании мочевиной он ведет себя как однодоменный белок. Кооперативность процесса разворачивания АФП мочевиной достаточно высока и соответствует значению кооперативное™, полученному путем экстраполяции расчетов для однодоменных белков соответствующего молекулярного веса (АУэксп = 42±2; Дутеор = 44).

С другой стороны, АФП имеет 40% гомологии и близкий молекулярный вес с мажорным белком крови взрослого человека - сывороточным альбумином (СА). Поскольку пространственная структура АФП не известна, обычно, по аналогии с СА, предполагают наличие в его структуре трех доменов. Транспортные функции АФП и СА в организме во многом совпадают - оба белка переносят гидрофобные лиганды. Синтез этих двух белков на эмбриональной стадии развития взаиморегулируется. В течении первых двух месяцев после рождения ребенка АФП практически полностью исчезает из организма человека, замещаясь СА и как бы передавая ему свои функции. С функциональной точки зрения АФП отличается от сывороточного альбумина наличием иммунорегуляторной активности. Со структурной точки зрения важным отличием является углеводный «хвост», ко-валентно присоединенный к молекуле АФП. Исходя из всего выше сказанного мы сочли интересным провести сравнительный анализ структурных' характеристик этих двух белков.

На рисунке 4 еще раз приведена кривая плавления АФП и кривая плавления сывороточного альбумина при нейтральных значениях рН. Исследование плавления сывороточного альбумина проводилось ранее, мы лишь повторили эти эксперименты. Видно, что плавление сывороточного альбумина представляет собой полностью обратимый процесс (при повторном нагревании кривая плавления полностью воспроизводится). Анализ кривой плавления сывороточного альбумина указывает на наличие трех структурных доменов, плавящихся при различных температурах. Энтальпия плавления сывороточного альбумина более чем в два раза превышает соответствующую величину, определенную для АФП (1100

кДж/Моль и 500 кДж/Моль, соответственно). Таким образом, мы видим кардинальное различие в поведении двух белков в ответ на увеличение температуры раствора. Причем поведение сывороточного альбумина является довольно типичным для белков такого молекулярного веса. Чтобы посмотреть, что происходит со вторичной структурой обоих белков при нагревании мы использовали метод КД. На рисунке 5 представлены спектры КД АФП и СА в пептидной области. Вид-

Рисунок 4. Кривые плавления АФП и СА. Пунк- к0> чт0 ПРИ нагревании вторичная тирными линиями обозначены кривые повторно- структура обоих белков в значи1еЛьной го плавления белков.

степени разрушается, однако практически полностью восстанавливается при охлаждении. То есть разрушение вторичной структуры этих белков при нагревании - процесс обратимый.

Для того, чтобы проверить способность АФП и СА к ренагурацни после разворачивания в мочевине мы провели эксперименты по сворачиванию белка, предварительно развернутого в 9 М мочевины путем простого разбавления до 0.5 М мочевины. На рисунке 6 представлены результату таких экспериментов. За конформационными перестройками в белках следили по изменению параметров триптофановой флуоресценции. Видно, что для АФП кривая сворачивания белка отличается от кривой разворачивания - она заметно менее кооперашвна. Рисунок 6 также показывает, что кривая повторного разворачивания совпадает с кривой сворачивания. (Для повторного разворачивания белок диализом переводили из 9 М мочевины в нативные условия.) Данный факт указывает на то, что не происходит полной ренатурации белка и формирования нативной структуры. Что касается СА, то, как видно из рисунка, процесс разворачивания данного белка мочевиной является полностью обратимым (как и индуцированная теплом денатурация). Данное заключение следует из того факта, что кривые разворачивания, ренатура-

ции и повторного разворачивания сывороточного альбумина полностью совпадают.

Рисунок 5. Спектры КД ЛФП и СА в пептидной области.

Концентрация мочевины (М |

Рисунок 6. Зависимость доли развернутого состояния (£,) АФП и СА от концентрации мочевины, отслеживаемая по изменению положения максимума триптофановой флуоресценции, Кружочки представляют кривые разворачивания белков; треугольники - кривые сворачивания; квадратиками обозначено повторное разворачивание.

Эксперименты по разворачиванию в мочевине еще раз подтвердили отличие в поведении АФП и СА при денатурации. Возникает вопрос, в чем же может заключаться причина столь непохожего поведения двух гомологичных белков, выполняющих в организме схожие функции? Мы предположили, что это отличие может определяться характером их взаимодействия с лигандами. Как уже говорилось выше, АФП и СА относятся к классу транспортных белков, переносящих гидрофобные лиганлы и, в частности, жирные кислоты. Причем мажорными лигандами для АФП являются полиненасыщенные жирные кислоты, в то время как СА имеет к этим соединениям заметно меньшее сродство. Константы связывания АФП с переносимыми им полиненасыщенными жирными кислотами в среднем на 2 порядка превышают соответствующие величины, определенные для СА. Мы предположили, что необратимость денатурации АФП связана с необратимостью выхода лигандов из данного белка в наших условиях in vitro. Чтобы проверить

это, было проведено сравнительное исследование апо-форм (безлигандных форм) двух белков.

З.Сравнение свойств апо-форм сывороточного альбумина н а-фетопротеина человека

Тот факт, что связывание с лигандами может оказывать существенное влияние на структуру белковых молекул хорошо известен. Вопрос о влиянии ли-гандов на структуру АФП особенно актуален, поскольку показано взаимное инги-бирование связывания многочисленных лигандов этого белка и их влияние на

иммунные свойства АФП. Для того, чтобы сравнить степень влияния лигандов на структуру молекул АФП и сывороточного альбумина, мы повторили наши эксперименты для апо-форм этих белков На рисунке 7 представлены кривые плавления апо-форм АФП и СА. Видно, что кривая плавления АФП не имеет пика кооперативного - теплопоглощения, что указывает на отсутствие жесткой третичной структуры в безли-гандной форме белка. То есть апо-форма белка представляет собой денатурированную белковую молекулу. Плавление

Рисунок 7. Кривые плавления АФП и СА. Цифрами 1 обозначены кривые плавления холо-форм белков; цифрами 2 - апо-формы СА также сущест-апо-форм. Штрих-пунктирные линии соответствуют кривым повторного плавления. венно отличается от плавления холо- формы. Однако анализ кривой кооперативного теплопоглощения указывает на то, что при удалении лигандов во всех трех доменах этого белка сохра-

320 340

Температура (К)

няется третичная структура [Тиктопуло и др. Молекулярная Биология 19 (1985), 1072-1078].

Спектры КД в пептидной области практически не изменяются при удалении лигандов как у АФП, так и у СА, что указывает на отсутствие изменений во вторичной структуре обоих белков.

Несомненно интересным является поведение апо-форм белков при разворачивании их мочевиной. На рисунке 8 приведены кривые разворачивания и сворачивания (путем последовательного разбавления из 9 М мочевины) ano- и холо-форм АФП и СА. Видно, что для обоих белков кривые разворачивания ало- и холо-форм не совпадают друг с другом. Апо-формы обоих белков несколько менее устойчивы к воздействию денатуранта и процесс проходит менее кооперативно. Кривые разворачивания и сворачивания апо-форм совпадают для обоих белков, то есть здесь, как и в случае теплового воздействия, можно говорить об обратимости процесса. Безусловный интерес вызывает тот факт, что кривые полученные для ано-АФП совпадают с кривыми сворачивания и повторного разворачивания, измеренными для холо-белка (вернее сказать, для белка изначально содержащего природные лиганды). Этот факт является косвенным свидетельством того, что не происходит повторного связывания АФП с лигандами, стабилизирующими его структуру.

Концентрация мочевины (М)

Рисунок 8. Зависимость доли развернутого состояния (Гр) АФП и СА от концентрации мочевины, отслеживаемые по изменению пцложения максимума триптофановой флуоресценции. Заполненные значки соответствуют холо-формам белков, пустые - апо-формам, Квадратики представляют кривые разворачивания белкоа, треугольники - кривые сворачивания, кружочками обозначено повторное разворачивание.

На следующем этапе были определены гидродинамические размеры молекулы АФП в апо-форме. С этой целью был использован ряд экспериментальных

методик. Методом гель-фильтрации на хроматографической колонке Su-perose-6 было установлено, что апо-форма белков представляет собой мономер (объем эллюции нативного и обезжиренного белков практически совпадали). С помощью метода вискозиметрии было показано, что удаление лигандов приводит к незначительному увеличению гидродинамических размеров молекулы АФП ( характеристическая вязкость возрастает с 3.3 до 5.6 см3/грамм, тогда как в полностью развернутом состоянии данный параметр составляет 33.7 см3/грамм). Кроме того, на сущест-

Рисунок 9. Спектры триптофановой флуоресиен- венную компактность " апо-формы ции АФП и СА. Цифрой 1 обозначены спектры

холо-белков; цифрой 2 - спектры апо-белков; циф- белка указывает спектр его флуорес-рой 3 - спектры белков, развернутых в 9 М мочевины. ценции (рис. 9) - максимум флуоресцентного излучения апо-формы АФП приходится практически на ту же длину волны, что и у нативного белка.

Из всего вышесказанного вытекает, что:

1 .Апо-форма АФП представляет собой компактное денатурированное состояние с близким к нативному содержанию вторичной структуры. Иными словами, белок в данной форме обладает всеми свойствами состояния расплавленной глобулы.

2.Можно предположить, что за необратимость процесса денатурации АФП отвечает необратимость выхода лигандов из молекулы белка in vitro.

Длина волны (им)

Длина волнц(нм)

4. Влияние поверхности мембраны на структуру молекулы а-фетопротеина

(моделирование при помощи водно-органических растворов).

В предыдущей части работы было показано кардинальное влияние лиган-дов на структуру молекулы АФП. Возникает вопрос, имеет ли процесс денатурации АФП, коррелирующий с процессом выхода лигандов, какое-либо функциональное значение? Другими словами, существуют ли такие условия в организме, при которых молекула АФП не имеет жесткой третичной структуры'? Ранее для ряда белков было показано, что в процессе их функционирования in vivo они обратимо денатурируют, претерпевая конформационный переход в состояние, близкое по своим свойствам к состоянию расплавленной глобулы. Одним из денатурирующих факторов в клетке может служить, например, «поле мембраны» (см. ниже). Действительно, было показано, что белковая молекула может денатурировать вблизи мембраны. Предполагают, что около мембранной поверхности происходит локальное понижение рН и диэлектрической проницаемости среды. Совместное действие этих двух факторов и может вызывать денатурацию белковых молеул. Для АФП возможное влияние мембранной поверхности на его структуру может быть особенно актуальным, поскольку, являясь транспортным белком, АФП доставляет свои лиганды к клеточным рецепторам, попадая при эюм под воздействие «поля мембраны».

В качестве простой модели окружения белковой молекулы вблизи поверхности мембраны можно использовать водно-органические смеси при умеренно низких значениях рН. Применяя этот способ моделирования мы провели исследование изменений структуры АФП вблизи поверхности мембраны без каких-либо дополнительных "воздействий со стороны клетки". В наших экспериментах был использован метанол, влияние которого на структуру белковых молекул наиболее хорошо изучено. рН раствора поддерживался равным 5.5 - значение, которое предположительно может реализовываться вблизи поверхности мембраны. Поскольку переходы, индуцированные метанолом, оказались незавершенными (при очень высоких концентрациях растворителя исследования нельзя было проводить из-за сильной агрегации белка) мы использовали также сильный органический растворитель трифторэтанол (ТФЭ). Поскольку воздействие этого растворителя на белковую молекулу может быть несколько специфичным (по сравнению с другими применяющимися обычно органическими соединениями), то мы его исполь-

зовали только для оценки масштаба возможных конформационных изменений молекулы АФП, индуцируемых органическими растворителями.

На рис. 10 представлены зависимости молярной эллиптичности раствора АФП на длине волны 220 нм и положения максимума триптофановрй флуоресценции от содержания метанола и ТФЭ. Видно, что начиная с 25% ТФЭ или 55% метанола имеет место симбатное изменение гидродинамических размеров молекулы АФП, фиксируемое по "красному сдвигу" флуоресценции и увеличение содержания а-спиралыгой структуры в молекуле белка, на что указывает изменение интенсивности сигнала КД. Следует отметить, что высокоспиральное некомпактное состояние белковых молекул, реализующееся в высоких концентрациях органиче-

{фиксируется по .вменению сигнала КД на 220 нм) СК11Х растворителей, описано в лите-

- пустые значки -в зависимости от концентрации довольно хорошо. Однако с

органических растворителей.

точки зрения возможной функциональной активности нас интересовали структурные особенности молекулы АФП в условиях, предшествующих началу процессов декомпактизации и гиперспнрализации белковой молекулы. На рис. 11 представлены калориметрические кривые, полученные для АФП при рН 5.5 в водном растворе и в растворах, содержащих 45% метанола и 20% ТФЭ. Как уже говорилось ранее, при этом значении рН в водном растворе молекула АФП обладает жесткой третичной структурой, хотя и заметно дестабилизированной по сравнению с нейтральными и щелочными значениями рН среды. Однако в 45% метанола, также как и в 20% ТФЭ, пик кооперативного теплопоглощения не наблюдается, что говорит об отсутствии уникальной упаковки боковых групп в молекуле АФП. Отметим, что, как было показано выше, в данных условиях вторичная структура этого белка еще не претерпевает заметных изменений и молекула остается достаточ-

Содержание органического растворителя (%, v/v)

Рисунок 10. Нормированные изменения компактности АФП( определяется по сдвигу максимума триптофановой флуоресценции) - заполненные значки - и вторичной структуры этого белка

310 320 330 340 350 360 370 Температура (К)

но компактной. Другими словами, в растворе, содержащем 45% метанола или 20% ТФЭ при рН 5.5 молекула АФП находится в компактном денатурированном состоянии с нативопо-добным содержанием вторичной структуры, то есть состоянии, обладающем всеми свойствами расплавленной глобулы.

Исследуемые условия среды -

Рисунок И. Кривые зависимости удельной теп- рН 5.5 и £-58 (расчигано исходя из лоемкости АФП от температуры при рН 5.5.

Цифрой I обозначена кривая плавления в водном содержания 45% метанола в растворе) растворе, цифрой 2 - в растворе, содержащем

45% метанола, цифрой 3 - в растворе, содержа- вполне могут реализовываться вблизи

щем 20 % ТФЭ. , „

поверхности мембраны. Следовательно, исходя из описанных выше свойств молекулы АФП in vitro, мы можем предположить, что молекула АФП может претерпевать конформационный переход из нативного состояния с жестко упакованными боковыми группами в состояние расплавленной глобулы вблизи поверхности клеточной мембраны (т.е. иг vivo). Параллельно с этим процессом происходит процесс потери белковой молекулой своих гидрофобных лигандов.

ВЫВОДЫ

1.Показано, что при понижении рН раствора ниже 3.1 молекула а-фетспротеича переходит в денатурированное состояние, со степенью компактности и содержанием вторичной структурой близкими к таковым в натпаном состоянии. Таким образом, установлено, что "кислая" форма молекулы сс-фетопротеина представляет собой расплавленную глобулу.

2. Показано, что в условиях, моделирующих условия вблизи поверхности мембраны (умеренно низкие значения рН и диэлектрической проницаемости среды), молекула а-фетопротеина находится в состоянии расплавленной глобулы.

3. Показано, что удаление лигандов из молекулы а-фетопротеина приводит к денатурации белка; при этом белковая молекула остается высококомнактнои и обладает выраженной вторичной структурой. Таким образом, установлено, что молекула а-фетопротсина в апо-форме обладает всеми свойствами расплавленной глобулы.

4. Показано, что при сворачивании молекулы а-фетопротеина из полностью развернутого или денатурированного нагреванием состояний наблюдается формирование компактной глобулы с развитой вторичной структурой, однако жесткая третичная структура белка не восстанавливается. Другими словами, установлено, что разворачивание (или денатурация) а-фетопротеинаа являются необратимыми процессами, а сворачивание белка in vitro заканчивается на стадии формирования состояния расплавленной глобулы.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. V.N.Uversky, M.D.Kirkitadze, N.V.Narizhncva, S.A.Potekhin, A.Yu.Tomashevski. FEUS Lett. 364 (1995) 165-167. "Structural properties of а-fetoprotein from human cord serum: the protein molecule at low pll possesses all properties of the molten globule state."

2. V.N.Uversky, N.V.Narizhncva, M.D.K.irkitadz.e, A.Yu.Tomashevski. Proc. XXIII Meeting of 1SOBM, September 10-13 1995, Montreal, Canada, p.48. "Crucial role of ligands in the stabilizationof human AFP native structure."

3. Киркитадзе, Н.В.Нарижнева, к.Ю.Томатевский, С.А.Потехин, В.Н.Уверский. Кшюргапическая химия 22 (1996) 408-414. "Стабилизация структуры а-фетопротеина сахарозой."

4. V.N.Uversky, N.V.Narizhneva. S.O.Kirschtein, S.Winter and O.Lnber. Folding and Design 2 N3 ( 1997) 163-173. "Conformational transition provoked by organic solvents in (5-Iactoglobulin: can a molten globule like intermediate be induced by the decrease in dielectric constant?"

5. V.N.Uversky, N.V.Narizhneva, T.V.Ivanova, M.D.Kirkitadze, A.Yu.Tomashevski. FEBS Letters 410 (1997), 280-284. "Ligand-free form of human a-fetoprotein: evidence for the molten globule state."

6. N.V.Narizhneva, V.N.Uversky. Protein and Peptide Letters 4 N4 (1997), 243-249."Human a-fetoprotein is in the molten globule state under conditions modelling protein enviroment near the membrane surface."

7. Н.В.Нарижнева, Т.В.Ивапова, А.Ю.Томашевский, В.Н.Уверский. Молекулярная Биологоия 31 N 6 (1997), 1128-1133. "Сравнение структурных свойств гомологичных белков сывороточного альбумина и а-фетопротеина человека."

8. V.N.Uversky, N.V.Narizhneva, T.V.Ivanova, A.Yu.Tomashevski. Biochemistry 36 N44 (1997), 13638-13645. "Rigidity of human a-fetoprotein tertiary structure is under ligand control."

9. Н.В.Нарижнева, В.Н.Уверский. Биохимия 63 N4 (1998), 100-108. «Понижение диэлектрической проницаемости среды трансформирует белковую молекулу в состояние расплавленной глобулы.»

10.В.Н.Уверский, Н.В.Нарижнева. Биохимия 63 N4 (1998),68-83: «Влияние природных лигандов на структурные свойства и конформационную стабильность белков.»

Научное издание

Автореферат Нарижневой II.В.

Налоговая льгота - общероссийски!'! классификатор продукции ОК-005-93; том 2; 95.3000 - книги н брошюры.

06.0,4.98 г. 3.78971'. Т. 100 экз. У сл. нем .л. 1.0. Отпечатано на ротапринте в ОП'ГИ 1111Ц l'Ail.