Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и свойства альфа-фетопротеина человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Томашевский, Андрей Юрьевич, Б. м.

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ РАН

На правах рукописи Томашевский Андрей Юрьевич

Выделение и свойства альфа-фетопротеина человека

03.00.04 - Биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Доктор физико-математических наук Уверский Владимир Николаевич Кандидат биологических наук Ксензенко Владимир Николаевич

Оглавление

Введение---------------------------------------------------------------------------------------5

Раздел 1. ОБЗОР Литературы-----------------------------------------------------------8

1.1. Открытие АФП и его свойства.---------------------------------------------------8-

Иммунорегуляторные свойства АФП--------------------------------------------14

1.2. Взаимодействие АФП с различными типами клеток------------------------16

1.3. Стурктура и физико-химические свойства-------------------------------------18

1.4. Схемы выделения альфа-фетопротеина-----------------------------------------23

Раздел 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы----------------------------------------------------------------------------25

2.2. Методы исследования--------------------------------------------------------------27

2.2.1 Синтез аффиных сорбентов-------------------------------------------------------27

2.2.2 Очистка альфа-фетопротеина-----------------------------------------------------27

2.2.3 Электрофорез белков---------------------------------------------------------------27

2.2.4 Определение концентрации белков---------------------------------------------27

2.2.5 Обработка модифицированного сахарозой АФП инвертазой------------27

2.2.6 Удаление гидрофобных лигандов-----------------------------------------------27

2.2.7 Калориметрические измерения--------------------------------------------------29

2.2.8 Исследования флуоресценции---------------------------------------------------29

2.2.9 Спектры кругового дихроизма--------------------------------------------------30

3. Основные физико-химические методы---------------------------------------

3.1 Круговой дихро изм.................................................................31

3.2 Сканирующая калориметрия-----------------------------------------------------32

3.3 Флуоресцентная спектроскопия-------------------------------------------------34

3.4 Определение степени кооперативности переходов-------------------------38

Результаты и обсуждение

Глава 1. Схема очистки высоко гомогенного АФП--------------------------------41

Глава 2. Исследование стабильности молекулы альфа-фетопротеина по

отношению к внешним воздействиям--------------------------------------------------49

Глава 3. Сравнение физико-химических характеристик АФП, выделенного

различными способами--------------------------------------------------------------------60

Глава 4. а -фетопротеин связывает сахарозу специфически---------------------70

Глава 5. Сравнение свойств гомологичных белков

сывороточного альбумина и АФП-----------------------------------------------------80

Заключение....................................................................89

Выводы--------------------------------------------------------------------------92

Список литературы----------------—----------------------------------------------------95

Приложение: Обозначения и сокращения---------------------------------------111

Введение

Данная работа посвящена разработке метода выделения и изучению некоторых физико-химических свойств апьфа-фетопротеина человека. Исследование свойств данного белка представляет собой актуальную задачу, лежащую на стыке различных областей биологической науки, поскольку понимание механизма функционирования исследуемого белка может стать ключом к решению ряда проблем современной иммунологии, эмбриологии и онкологии. АФП -выполняет в организме ряд важных функций, основными из которых, являются транспортная и иммуннорегуляторная. АФП единственный известный на сегодняшний день специфический переносчик ненасыщенных жирных кислот, в частности арахидоновой, которая является основным соединением при синтезе простагладнинов и лейкотриенов. В норме максимальная концентрация АФП (5-7мг/мл) обнаруживается в сыворотке плода. В сыворотке взрослого организма обычная концентрация АФП менее 5 нг/мл. Однако его уровень возрастает до 1-3 мг/мл при развитии различных патологий в частности гепатом, тератокарцином.

Как видно из выше изложенного, роль АФП в организме существенна. В связи с этим данный белок интенсивно изучается с момента его обнаружения по настоящее время. Однако по ряду объективных причин (сложность очистки, выраженная микрогетерогенность) структурные, физико-химические свойства и молекулярный механизм его функционирования в организме до конце не изучены.

Целью данной работы являлось разработка высоэффективной схемы очистки АФП и изучение ряда его физико-химических

свойств. Для решения данной задачи применялся ряд современных физико-химических методов, позволяющих получать сведения о структуре белковой молекулы, таких как круговой дихроизм, флуоресцентная спектроскопия, сканирующая микрокалориметрия и другие.

В результате проведенных исследований была разработана оригинальная схема высокоэффективной очистки данного белка. Определены границы стабильности АФП по отношению к внешним воздействиям. Обнаружено не описанное ранее свойство АФП специфически связывать сахарозу. Установлено, что удаление природных лигандов приводит к необратимой потере белком уникальной третичной структуры и переходом в состояние расплавленной глобулы.

Следует отметить что, кроме возможного прикладного значения, исследование физико-химических свойств сложного по своей структуре белка а-гликоггротеина, несущего на себе разнообразные лиганды - является с нашей точки зрения, само по себе интересной задачей в области физико-химии белка и дополняет наши знания о структуре и возможных свойствах белковых молекул.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора

литературы, раздела "Материалы и методы", пяти глав в которых описаны основные результаты иследований, заключения, выводов и списка литературы. Во введении дано краткое описание задач и результатов исследования. Обзор литературы посвящен описанию и анализу литературных данных, касающихся схем выделения, физико-химических и биологических свойств, онко-эмбрионального

белка а-фетопротеина. В следующем разделе дано описание используемых методов и материалов. Главы 1-5 посвящены описанию и анализу полученнх результатов. В главе 1 рассматривается разработанная схема выделения АФП. В главе 2 описаны результаты исследований структурных свойств а-фетопротеина. В главе 3 проведен сравнительный анализ свойств АФП, выделенного различными способами. Глава 4 описывает влияние сахарозы на структурные свойства АФП. В главе 5 описано сравнение структурных свойств АФП и его гомолога сывороточного альбумина. Раздел "Заключение» содержит описание основных результатов данной работы. В конце диссертации приведены выводы, вытекающие из проделанных экспериментов.

Диссертация написана на основе материалов, опубликованных в 11 работах

Раздел I.. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Открытие АФП и его свойства.

Альфа-фетопротеин человека а-гликопротеин с молекулярной массой 67-70 kD, содержащий 4% углеводных остатков (Smith and Kelleher, 1980; Pucci et al., 1991), был впервые обнаружен в 1956 году в сыворотке эмбриона человека (Bergstrand & Czar, 1956), а позднее в сыворотке мыши и других млекопитающих (Deutcsh, 1991). После обнаружения АФП в крови больных гепатомой (Tatarinov, 1964), а затем в сыворотке больных рядом других онкологических заболеваний (Abelev et.al.,1967, Masopust et. al., 1968), интерес к данному белку резко возрос. Так как АФП характерен как для эмбрионов, так и для опухолей, он был отнесен к классу онко-эбриональных белков.

Альфа-фетопротеин синтезируется в желточном мешке, а позднее - в печени зародыша на протяжении всего периода развития эмбриона (Deutsch, 1991). Существуют данные, что возможен также локальный синтез данного белка в других тканях зародыша, в частности в головном мозге (Naval et,al., 11992) Наибольшая концентрация АФП наблюдается в сыворотке 14-16 недельного эмбриона (5-7 мг/мл), после чего происходит постепенное снижение его концентрации. В течение первых двух недель после рождения концентрация АФП резко падает, и к концу второго месяца после рождения в сыворотке обнаруживаются только следовые его количества (8-10 нг/мл) (Deutsch, 1991). Повышение концентрации данного белка в сыворотке взрослого организма (до уровня сравнимого с его концентрацией в сыворотке плода) как правило происходит при развитии ряда онкологических заболеваний (Deutsch, 1991). Причем синтез АФП происходит в глубоко

дифференцированных опухолевых клетках ( Iseki & Kondo, 1990, Deutsch, 1991).

Одной из главных функций АФП является транспортная функия, обусловленная его способностью связывать различные лиганды. Основными лигандами АФП человека являются полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) (Deutsch, 1991). Относительное количество жирных кислот несколько отличается в различных препаратах белка. Были выявлены следующие жирные кислоты: пальмитиновая ( 8-10 %), стеариновая (2-5 %), олеиновая (10-28 %), линоленовая (7-15 %), арахидоновая (12-70%) и

100

80

о.

U-<

0 60

СП

с

1 40 CÛ

20

О

cl 6:0 Cl8:1 С20:4 022:6 des

Таблица 1 .Количественное содержание лигандов (жирных кислот) в составе АФП. Белые столбика АФП быка, темные человека.С16:0 пальмитиновая, С18:1 олеиновая, С20:4 арахидоновая, С22:6 докасагексаноиковая жирные кислоты.

4,7,10,13,16,19 докасаексоеновая (16-42 %). АФП содержит от 2.39 до 3.09 моль жирных кислот на моль белка, причем доля ненасыщенных кислот порядка 86-89 % ( количество 20:4 и 20:6

кислот составляет 54-70 % от общего количества). Константа связывания АФП с ненасыщенными жирными кислотами на пять порядков выше, чем у сывороточного альбумина и имеет значение 106 - 107 М"1 [Vallette et. al., 1989 Deutsch, 1991]. Можно сделать вывод, что АФП обладает не только большим сродством к жирным кислотам, но также имеет большую специфичность к полиненасыщенным жирным кислотам. (Parmelee,1978; Parmelee et al.,1978).

Одним из главных вопросов, возникающих при исследовании связывания АФП ненасыщенных жирных кислот, является вопрос, есть ли различие в уровне связывания лигандов белком из нормальных тканей и из опухолей. В таблице 2 представлены данные сравнительного анализа содержания жирных ненасыщенных кислот в образцах АФП, выделенного из нормальных и патологических тканей. Как видно из приведенных данных, арахидоновая и докасаексоевая жирные кислоты присутствуют во всех образцах белка, выделенного из нормальных эмбриональных источников (Parmelee et al.,1978; Nagai ei al.,1982), в то время как содержание этих лигандов у белка, выделенного из гепатом, сильно варьирует вплоть до полного отсутствия (Yaclmin et al., 1980). Является ли такое явление характерным для белка из опухолей или это возможно связано с процессом выделения представляет ' собой вопрос, требующий изучения. К сожалению, отсутствуют количественные данные по содержанию лигандов у АФП, выделенного из материнского организма человека. Такого рода исследования были проведены на крысином АФП, выделенном из сыворотки беременных крыс. Из таблицы 2 видно, что уровень лигандов в этом случае низок. Возможно, это связано с потерей лигандов при

прохождении плацентарного барьера белком (Nagai et al.,1982). По всей видимости, крысиный АФП, как модель, мало пригоден для экстраполяции полученных данных на человеческий АФП, поскольку белок крыс, как показано, имеет большее сродство к эстрогенам, нежели к жирным кислотам. Нагаи и Дойч (Nagai and Deutsch, 1980) показали, что при делипидизации крысиного АФП его микрогетерогенность лишь частично изменяется и практически не восстанавливается при ределипидизации, в то время как в случае АФП человека наблюдается обратная картина (Pannelee et al.,1978). Возможно это связано с тем, что (по данным Ауссела и Массеува (Aussei and Masseyeff, 1983а)) крысиный АФП имеет один сайт связывания жирных кислот, а АФП человека три. Разброс данных по содержанию лигандов возможно связан со схемой выделения, так, по данным Калво, при выделении АФП методом иммунно-аффинной хроматографии элюция белка низким значением pH (2.8) может приводить к потере до 80% ненасыщенных жирных кислот (Calvo et al.,1985). Аффинное связывание полиненасыщенных жирных кислот было обнаружено практически у всех препаратов АФП, выделенных из различных видов животных: свиньи (Ingvarsson and Carlsson,1978; Lampreave et al.,1982), коровы (Carlsson et al.,1980), крысы, мыши и человека (Benassayag etal.,1980; Vallette et al., 1980). Таким образом, несмотря на видоспецифические различия в связывании эстрогенов и ненасыщенных жирных кислот, основной функцией АФП по мнению ряда авторов является строго специфическое связывание полиненасыщенных жирных кислот (Pannelee etal.,1978; Carlsson et

al.,1980; Hsia et al.,1980). Хотя в работе Саву (Savu et al.,1981) приводятся данные о том, что мышиный сывороточный альбумин лучше связывает арахидоновую кислоту чем фетальный АФП это

скорее исключение из правила. Ряд авторов исследовал способность АФП связывать другие лиганды помимо жирных кислот и эстрогенов. Оказалось, что еще одно соединение способно связываться с АФП с достаточно высокой аффиностью. Аналогично сывороточному альбумину, АФП, выделенный из различных источников: человека (Aoyagi et al., 1979), быка (Ruoslahti etal.,1979; Hsia et al., 1980), крысы (Versee and Barel, 1979) оказался способен связывать билирубин. Особенно эффективно билирубин связывался АФП, выделенным из сыворотки крупно-рогатого скота (Hsia et al.,1980). В случае человеческого белка билирубин выступал в качестве конкурента жирным кислотам, по всей видимости экранируя сайт связывания жирных кислот (Aussei and Masseyeff,1984b). Так же была обнаружена способность крысиного АФП, предварительно обработанного активированным углем при нейтральных значениях pH, связывать ряд лекарственных препаратов, таких как: варфарин, фенилбутазон, азапропазон, диазепам, дигитоксин и холиевая кислота (Herve et al., 1984). И, наконец, показана способность АФП связывать ионы двух валентных металлов - никеля и меди (Aoyagi et al.,1978; Lau et al.,1989).

глин-: in

Fatty Лели Contents ok Various Soi;*ck AFP Isolates and of Serum Ai.rumjns

Source Protein* Total 12 0 14:0 16:0 18:0 18:1 18:2 C20:0 C20:4 C22:6 % PUFA' Investigator

Human leial AFP

1 2.39 0.21 0.65 0 66 0.17 0.29 1.01 55 Parmelee

2 2.66 0.20 0.14 0.58 0.17 0.99 0.88 70 Hal. {1978)

3 3.09 0.33 0.11 0.51 0.16 1.20 0.49 55

4 5.58 0.27 0.08 M8 0.31 0.87 057 56

Average 2.6R 0.25 0.12 0.48 0.28 0.84 0.74 59

Human fetal Alb 0.7 0.10 0.02 0.37 0.10 0.05 0.03 12

Adult human Alb 2.44 0.83 0.83 0.48 (1.24 0.05 0 2

Human hepatoma AFP

1 2.12 0.49 0.14 0.49 0.26 0.58 0.18 35 Nagat

2 0.45 0.18 o.ot 0.09 0.06 0.08 0 18 el «1. (1982)

3 0.70 0.35 0.02 0.20 0.13 0 0 0

4 1.2« 0.58 0.18 0 30 0.20 0 0 0

Humau hepatoma AFP

1 3.3 — 0.2 2.05 0.S6 — 0.19 — 5.8 Yaclmin

2 2.3 0.14 0.29 (1.95 11.76 0.05 0.1 — 1.3 ctal. (1980)

3 8 0.38 0.67 5.90 2.76 0.29 — — 0

4 4.8 0.12 0.43 2.65 1.60 — — — 0

5 l.j 0.1 0.29 2.05 20 — 0.05 1.1

6 4.9 0.19 0.42 2,38 1.62 0.14 0.1 2.0

7 3.9 0.14 0.S3 171 1.52 0.1 0.115 — 1.3

Fetal Rat AFP (1.93 0.14 0.03 0.29 0.16 П.16 0.15 33.3 Nagai

tltil. (1982)

Pregnant rat AFP 0.58 0.16 0.07 0.28 0.05 0.02 0 3.4

Morris 7777 rat 0.86 0.22 0.09 0.43 0.08 0.04 0 4.6

hepatoma AFP

a The various human fetal AFP isolates were cadi obtni ncd from a pool of 4 to 7. 12- to 1 (•¡•week-old fetuses. AU rat AFP preparations were from pooled maceria! from 10 to 20 animals. Alb. Albumin.

* Polyunsaturated fatty acids (PUFA) arc .iin«.hi<lonit (C20:4) ;in<l clocosahrxnenoic (C22:ii).

Таблица 2. Содержание лигандов (жирных кислот) в составе АФП и сывороточного альбумина выделенных из нормальных патологических образцов.( С 16:0 пальмитиновая, С 18:1 олеиновая, С 20:4 арахидоновая, С 22:6 докосагексаноевая жирные кислоты.

1.2. Иммуннорегуляторные свойства АФП.

В настоящий момент в различных лабораториях проводятся исследования по выяснению влияния АФП на различные иммунные процессы. По всей видимости, первым исследованием в этом направлении является работа Пармели (Parmely and Hsu, 1973), в которой было показано, что сыворотка мышей больных, гепатомой Морриса, способна ингибировать стимуляцию

фитогемоагглютинином крысиных лимфоцитов в культуре. Ряд исследований был посвящен влиянию АФП, выделенного из амниотической жидкости мыши. Было отмечено ингибирование продукции различных подклассов иммуноглобулинов, в основном IgA и IgG, клетками селезенки. Причем апликация не влияла на способность В-клеток продуцировать антитела, а происходила супрессия популяций Т -супрессоров и Т-хелперов.(Мищйа et al., 1975а,b; Murgita et al.,1977). Так же была показана супрессия формирования NK-киллерных клеток низкими концентрациями АФП (Dattwyler and Tomasi,1975). Связывание АФП Т-клетками было показано при обработке мышиных спленоцитов амниотической жидкостью (Dattwyler et al., 1975). Позднее было установлено, что АФП способен супрессировать Т-лимфоцит зависимую цитотоксическую реакцию (Peek et al.,1982; Hooper et al.,1982). Так же оказалось, что АФП способен взаимодействовать с фракцией лимфотитов, ответственных за трансплатационный ответ (Dattwyer and Tomasi,1975; Dattwyer et al.,1975). Таким образом, данные, приведенные выше позволяют предположить, что АФП

является одним из основных иммунномодуляторов (in vivo), мишенью для которого является в основном популяция Т -клеток (Murgita et al.,1981; Peck et al.,1982). По аналогиии с АФП животного происхождения были проведены исследования с АФП человека, выделенным из различных источников. Так, было показано, что данный белок, выделенный из сыворотки и асцидной жидкости больных гепатомой, так же ингибировал стимуляцию лимфоцитов ФГА. Причем отмечались различия в воздействии белка из нормальной и патологической сыворотки (Yanchin,1976). В дальнейшем авторами было исследовано влияние на пролиферацию фитогемаагглютинин стимулированных лимфоцитов АФП, выделенного из пяти различных гепатом и фетального белка. Было показано, что данные белки различаются по активности на три порядка, причем уровень активности не изменялся при обработке белков нейроминедазой (Yanchin and Lester, 1976), в то время как в случае АФП мышиного пр