Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика альфа-фетопротеина, минеральных элементов и показатели физического развития у куриных эмбрионов в онтогенезе

ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Динамика альфа-фетопротеина, минеральных элементов и показатели физического развития у куриных эмбрионов в онтогенезе"

На правах рукописи

ЧЕРНИКОВ Сергей Валерьевич

ДИНАМИКА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА, МИНЕРАЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ И ПОКАЗАТЕЛИ ФИЗИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ У КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ В ОНТОГЕНЕЗЕ

03.03.05 - биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 мар тг

Ставрополь - 2012

005015695

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный университет» и Южном научном центре Российской академии наук.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Тимченко Людмила Дмитриевна.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Иванов Виктор Михайлович;

кадидат биологических наук Гутникова Людмила Валерьевна.

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Кабардино-Балкарская

государственная сельскохозяйственная академия».

Защита диссертации состоится_ V фМл-^^^дЯ._2012 г.

в 1Ч',£Р часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан __ "iS ejydL^&yxS^ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета /Г^УУчОО ¡1 J&l Ржепаковский И.В.

e-mail: Iabim@stavsu.ru

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Изучение общих закономерностей онтогенеза имеет большое значение для решения теоретических и практических вопросов биологии развития. В условиях современности не теряет актуальности выяснение механизмов регуляции роста и развития клеток и тканей организма, нарушение которых приводит к возникновению различных патологий (Шилов В.Н., 2006). Знание таких механизмов особенно важно в эмбриональный период, когда происходит формирование будущего организма, закладываются ткани и органы. В основе формообразовательных процессов лежат такие взаимосвязанные явления, как пролиферация, дифференцировка и апоптоз (Ярыгин В.Н. и др., 2001), интенсивность и интеграция которых в онтогенезе регулируется многочисленными биохимическими факторами, в том числе белками и различными минеральными веществами, представленными в организме как моносубстанциями, так и в виде сложных, и прежде всего, ферментных соединений (Авцын А.П., 1991; Шилов В.Н., 2006; Reiser S. et al., 1985; Harris E.D., 1992; Репа М.О. et al., 1999; Araya M. et al., 2003).

Большинство веществ-регуляторов обладают низкомолекулярной структурой, и соответственно реализуют свои функции на молекулярном уровне (Ширшев C.B., 1993). К таким веществам относят альфа-фетопротеин, являющийся по своей структуре уникальным соединением белковой природы. Эффекты его реализуются на уровне комплексной регуляции клеточной пролиферации, механизмов апоптоза, обеспечения клетки энергетическим и пластическим материалом, иммунорегуляции, индукции регуляторных сигналов через усиление экспрессии рецепторов и других жизненно важных процессов (Ширшев C.B., 1993; Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003; Черешнев В .А. и др., 2004; Hooper D.C. et al., 1987; Geuskens M., 1991; Geuskens M. et al., 1994; Nunes E.A., 1994; Filella X. et al., 2001). Однако установление его функций остаётся на протяжении продолжительного периода самой загадочной и противоречивой областью в исследовании этого белка (Абелев Г.И., 1989; Виноградская Г.Р., Маринец О.В., 2001; Гранов A.M. и др., 2008).

Широкий спектр воздействия на организм обусловливает использование АФП в биотехнологических целях (Рощин Е.М. и др., 1997; Стариков В.В. и др., 1997; Родионов С.Ю. и др., 1998; Родионов С.Ю., Стариков В.В., 2000, 2001; Черкасов В.А. и др., 2000; Черешнев В.А. и др., 2004). Поэтому изучение содержания и механизмов регуляции синтеза этого белка в различных биологических объектах - крайне интересное и многообещающее направление в биологии. В настоящее время эти вопросы наиболее детально изучены у человека и некоторых млекопитающих. У них исследовано содержание АФП в различных органах: желточном мешке, печени, крови, желудочно-кишечном тракте плода (Абелев Г.И., 1994; Пустотина О.А., 2006; Leung W.T. et al., 1994).

В то же время общепризнано, что куриный эмбрион - это классическая модель для изучения особенностей эмбрионального развития, механизмы которого и сегодня являются предметом неослабевающего интереса исследователей. Тем не менее, практически отсутствуют сведения о содержании АФП в развивающемся эмбрионе птицы, являющемся важным

биологическим объектом исследования и перспективной сырьевой субстанцией для использования в биотехнологии. Имеются лишь единичные сообщения о наличие у куриного эмбриона АФП в нервной ткани и сетчатке глаза в отдельные периоды эмбриогенеза (Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003).

Считается, что наиболее полно уровень развития организма, как в норме, так и при патологии, отражает комплекс морфометрических показателей. Однако их перечень, установленный для куриных эмбрионов, сравнительно невелик и представлен, преимущественно массой тела, органов и линейными размерами (Задарновская Г.Ф., 1966; Шмапьгаузен И.И., 1984; Долгорукова А.Н., 2007; Хохлов Р.Ю., 2009; и др.). Также узок спектр показателей физического развития, в частности, имеются единичные сообщения лишь о некоторых простейших индексах (Трунова А.П., 2008), перечень которых, по нашему мнению, недостаточен для полноценной характеристики его пропорциональности и гармоничности. Заслуживает внимание и отсутствие точных сведений о динамике в тканях развивающегося куриного эмбриона уровня минеральных элементов, являющихся важнейшим фактором обеспечения не только функций отдельных клеток, но и механизмов межклеточного взаимодействия.

В связи с вышеизложенным, представляется актуальным получение новых сведений о морфофункциональных преобразованиях в курином эмбрионе, в том числе о критериях физического развития, содержании АФП, и характере взаимосвязей между этими показателями, а также о динамике минеральных элементов, которые могут заложить основы для управления эмбриогенезом особи.

Цель исследования: изучить динамику ал ьф а-ф его проте и на, общего белка и минеральных элементов в курином эмбрионе, а также дать комплексную оценку уровня его физического развития в онтогенезе, с выявлением характера взаимосвязей между изучаемыми показателями.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи.

1. Определить содержание альфа-фетопротеина в гомогенате куриного эмбриона и его процентное соотношение в составе общего белка в процессе развития.

2. Изучить морфометрические показатели эмбрионов птицы на разных этапах развития и на их основе вычислить основные индексы развития куриного эмбриона.

3. Провести корреляционный анализ взаимосвязи уровня альфа-фетопротеина в процессе развития куриного зародыша с его морфометрическими показателями и уровнем общего белка.

4. Исследовать содержание кальция, магния, натрия, калия, железа цинка, марганца, меди, хрома, селена и кобальта в курином эмбрионе в процессе развития.

Научная новизна. Установлено содержание альфа-фетопротеина, определена его динамика в гомогенате куриного эмбриона, а также доля в составе общего белка в процессе развития.

Впервые в эмбриогенезе кур проведена оценка физического развития куриного зародыша с использованием широкого перечня показателей, в том числе с помощью метода индексов.

Впервые в эмбриогенезе кур выявлен характер коррелятивной взаимосвязи между уровнем АФП, общего белка в гомогенате куриного эмбриона и его морфометрическими показателями.

Проведены исследования комплекса минеральных элементов (кальций, магний, натрий, калий, железо, цинк, марганец, медь, хром, селен, кобальт) в тканях куриного эмбриона в процессе развития.

Теоретическая и практическая значимость. Данные о динамике АФП в процессе развития куриного эмбриона существенно дополняют и расширяют представление о его роли в эмбриогенезе. Установленные взаимосвязи уровня альфа-фетопротеина в эмбриональном гомогенате с другими морфофункциональными показателями дают основание обозначить его регуляторную роль в соматическом эмбриогенезе, что может быть использовано для регуляции эмбрионального развития в хозяйственных, научных, а также в биотехнологических целях, в частности для получения АФП-содержащего сырья.

Результаты исследования внедрены и используются в научной деятельности и учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных занятий по биологии размножения и развития, гистологии, цитологии, эмбриологии, физиологии и биологии клетки в Ставропольском государственном университете, Ставропольском филиале Московского государственного гуманитарного университета им. М.А. Шолохова, Брянском государственном университете им. академика И.Г. Петровского и в Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии.

Полученные данные используются в научно-исследовательской работе НИИ биологии Южного федерального университета.

Результаты исследования используются в практической деятельности при разработке АФП-содержащих биологически активных препаратов на основе активированной эмбрионально-яичной массы на базе ПНИЛ «Экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии» Ставропольского государственного университета, и в практической деятельности ООО НПО «Биомодуль» и ООО Малое инновационное предприятие «Кормовые концентраты» и в качестве вспомогательных данных при разработке технологий производства и схем применения новых БАП и кормовых добавок для животных и птицы.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-методических конференциях: «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2007, 2008, 2009, 2011); на 6-й Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2008); 5-й ежегодной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2009), где доклад был отмечен почётной грамотой; международной научно-практической конференции

«Современные проблемы теории и практики инновационного развития АПК» (Нальчик, 2011).

На защиту выносится:

1) динамика альфа-фетопротеина, его абсолютные значения и характер взаимосвязи с уровнем общего белка в супернатанте гомогената, массой и длиной тела и массой внутренних органов в процессе развития куриного эмбриона;

2) особенности физического развития и уровень минеральных элементов в гомогенате куриных эмбрионов в процессе инкубации.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 12 печатных работ, в том числе 3 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой учёной степени.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 168 страницах компьютерного набора, иллюстрирована 21 рисунками, 13 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и приложений. Список использованной литературы содержит 327 источников, в том числе 112 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнялась в течение 2007-2012 гг. на кафедре общей биологии, на базе ПНИЛ «Экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии» Ставропольского государственного университета и базовой кафедре иммунологии и микробиологии Южного научног о центра РАН при СГУ.

Материалом для исследований послужили 3200 куриных эмбрионов на разных этапах развития. Исследования всех морфометрических показателей, а также уровня альфа-фетопротеина (АФП) и общего белка на каждом этапе развития проводили у одних и тех же 1600 эмбрионов. Морфометрические показатели измеряли у каждого эмбриона. При определении содержания АФП и общего белка в каждые изучаемые сутки готовили по 20 проб гомогената пяти эмбрионов. Определение минеральных элементов на каждые сутки развития проводили в 20 пробах гомогената, также состоящих из пяти эмбрионов (всего 1600 эмбрионов).

Для получения эмбрионов использованы сертифицированные оплодотворённые яйца яйценосной породы кур белый леггорн. Яйца инкубировались при температуре плюс 37,5±2°С и относительной влажности 80% в вентилируемом инкубаторе ИПХ-10И (Россия). Контроль качества яиц и степень развития зародыша и эмбриона осуществляли с помощью овоскопа ПКЯ-10 (Россия). Результаты, полученные в процессе визуального осмотра куриных яиц во время инкубации и при их вскрытии, легли в основу критериев выбора эмбрионов для экспериментальной работы.

Морфометрические исследования эмбриона начинали с 5-х, а внутренних органов с 10-х суток инкубации.

На каждые сутки развития проводили вскрытие яиц, определяли степень оперения, развитость кровеносной системы и провизорных органов, а также выявляли различные аномалии развития и уродства. Эмбрионы, которые не соответствовали общепринятым критериям, изложенным в руководствах по инкубации яиц (Третьяков Н.П., 1990; Рахманов А.И., 2005; Бессарабов Б.Ф., 2006) выбраковывались.

Содержимое вскрытого яйца извлекали из скорлупы и выливали в чашку Петри. Затем эмбрион отделяли от провизорных органов и выполняли с ним комплекс манипуляций, заключающийся в исследовании содержания АФП, общего белка и минеральных веществ, морфометрических показателей роста и развития, с последующим вычислением индексов развития и анализом степени взаимосвязи изучаемых критериев.

Массу тела эмбрионов определяли с помощью электронных весов ВЛТЭ-150 (класс точности II, ГОСТ 24104-2001) (Россия). После этого с помощью скальпеля, ножниц и препаровальных игл выделяли внутренние органы: печень, сердце и лёгкие, и проводили их взвешивание на тех же весах. Абсолютный и относительный прирост массы тела и органов, а так же относительную массу органа к массе тела определяли с помощью формул предложенных И.И. Шмальгаузеном (1984).

Линейные размеры тела определяли с помощью штангенциркуля, линейки с ценой деления 0,5 мм, нитки и сантиметровой ленты.

Длину тела (Ь) и окружность грудной клетки (Т) измеряли в сантиметрах, причём за критерий длины тела принимали линейный краниокаудальный размер, измеряемый от верхушки черепа до конца хвоста. Массу тела эмбриона (Р) измеряли в граммах.

Полученные морфометрические данные использовали для вычисления комплекса критериев физического развития. Вычисляли посуточный абсолютный и относительный прирост массы тела и органов, отношение массы органов к массе тела, индексы физического развития Кетле I, Кетле II, Ливи, Рорера, Боргарндта I, Эрисмана, Вервека и индекс гармоничного морфологического развития (ИГМР).

Для вычисления индексов физического развития использовали общепринятые формулы для млекопитающих, предложенные В.Ф. Красота, В .Т. Лобановым, Т.Г. Джапаридзе (1983); Е.Я. Борисенко, К.В. Барановой, А.П. Лисицыным (1984); С.И. Изааком, Т.В. Панасюком, Р.В. Тамбовцевой (2005). Выбор перечня исследуемых индексов проводили с учётом величины объекта и особенностей периода его онтогенеза. •

Для исследования содержания АФП и общего белка были адаптированы методики, используемые для определения этих показателей в сыворотке крови. Адаптация заключалась в использовании вместо сыворотки крови гомогенизированной массы тканей куриного эмбриона, которую готовили с помощью гомогенизатора фирмы Уйек (Австрия). Полученная гомогенизированная масса центрифугировалась на 8000 об/с в течение 20

минут с использованием центрифуги Hettich Universal 320 (Германия). Затем с помощью пипетки супернатант отбирался в пробирки. При необходимости набора большого количества проб допускалось замораживание в морозильной камере при температуре минус Ю...15°С. Перед исследованием супернатант подвергали разморозке при комнатной температуре, с последующим определением в нем АФП и общего белка.

Содержание общего белка в супернатанте гомогената исследовали колориметрическим биурепговым методом с помощью биохимического фотометра Stat Fax 1904+R (США) и набора реагентов ПРОТЕИН-НОВО (В-8012).

Содержание альфа-фетопротеина определяли с использованием иммуноферментного анализатора марки Stat Fax 303 Plus (США) с помощью набора реагентов АФП-ИФА-БЕСТ (Т-8456) для определения АФП в сыворотке крови.

Исследования содержания минеральных элементов проводили в нецентрифугированной эмбриональной массе с использованием атомно-абсорбционного спектрофотометра PERKIN-ELMER 2280 (США).

Результаты экспериментов подвергали вариационно-статистической обработке с использованием программы Primer of Biostatistics (Version 4.03). Используя критерий Стьюдента, вычисляли среднюю арифметическую величину (М) и стандартную ошибку среднего (m). Для сравнения варьирующих признаков измеряемых в различных единицах использовали ту же программу с критериями расчета коррелятивной зависимости.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Содержание альфа-фетопротеина в гомогенате куриных эмбрионов

и его уровень в составе общего белка на разных этапах развития

Куриный эмбрион все чаще используется не только в качестве удобной биологической модели, но и в качестве субстанции для производства биологически активных препаратов, иммунотропных и косметических средств (Ржепаковский И.В., 2003; Тимченко Л.Д., Косик Н.В., 2004; Маханьков О.В., Сумеркина В.А., 2006; Каузова A.C., 2009). Такой интерес обусловлен широким комплексом биологически активных веществ, в том числе и АФП, входящих в состав яйца и образующихся непосредственно в процессе развития эмбриона (Ржепаковский И.В., 2003). Однако отсутствуют рекомендации о конкретных сроках развития, в которые содержание АФП в эмбриональных тканях кур достаточно для его использования в качестве сырьевого субстрата. Кроме того, уровень содержания АФП в процессе развития куриного зародыша представляет и научный интерес, как фактор регуляции процессов онтогенеза.

Установлено, что АФП в курином эмбрионе присутствует с 5-х по 20-е сутки развития, его содержание не постоянно, а динамика имеет волнообразный характер (табл. 1).

В период с 5-х на 6-е сутки наблюдается достоверное увеличение содержания белка на 3,82 МЕ/мл, а к 7-м суткам концентрация АФП снижается на 4,24 МЕ/мл. Тенденция снижения уровня АФП сохраняется вплоть до 10-х суток развития. На 9-е сутки отмечено минимальное содержание АФП за всё время эксперимента - 1,12±0,02 МЕ/мл. С 9-х по 10-е сутки развития концентрация АФП вновь увеличивается на 0,8 МЕ/мл, а с 10-х по 11-е сутки -еще на 2,17 МЕ/мл. С 11-х по 12-е сутки эмбриогенеза отмечена наиболее выраженная за весь период развития суточная динамика АФП, его концентрация достоверно увеличивается на 38,71 МЕ/мл. При этом к 12-м суткам, исследуемый показатель, достигает своего максимального значения -42,8±0,29 МЕ/мл. Далее, в промежутке между 12-ми и 13-ми сутками концентрация АФП резко снижается - на 30,9 МЕ/мл. С 13-х по 15-е сутки содержание АФП возрастает, и если к 14-м суткам прирост содержания АФП составляет 1,2 МЕ/мл, то к 15-м суткам он более существенен (12,40 МЕ/мл), а уровень АФП достигает второго по величине значения за весь период инкубации - 25,5±0,31 МЕ/мл. Между 15-ми и 17-ми сутками наблюдается снижение концентрации АФП, выраженное с разной посуточной интенсивностью. Концентрация АФП в промежутке между 17-ми и 18-ми сутками снова достоверно увеличивается на 7,78 МЕ/мл. На 18-е сутки развития наблюдается очередной всплеск концентрации белка (13,7±0,17), он является третьим по величине, за весь период развития. В период между 18-ми и 19-ми сутками отмечено выраженное снижение уровня АФП (на 11,29 МЕ/мл). С 19-х суток содержание АФП продолжает снижаться, но с меньшей интенсивностью, достигая на 20-е сутки 1,51±0,03 МЕ/мл.

Таблица 1

Содержание АФП в гомогенате куриных эмбрионов в процессе развития

Сутки развития, п=20 Содержание АФП МЕ/мл

5 2,11±0,03

6 5,93±0,06*

7 1,69±0,02*

8 1,47±0,02*

9 1,12±0,02*

10 1,92±0,04*

11 4,09±0,03*

12 42,8±0,29*

13 П,9±0,П*

14 13,1±0Д7*

15 25,5±0,31*

16 12,1±0,19*

17 5,92±0,09*

18 13,7±0,17*

19 2,41±0,02*

20 1,51±0,03*

*(Р<0,05) - достоверная разница в сравнении с предыдущими сутками п - количество проб гомогената 5-ти эмбрионов на каждые сутки исследования.

Таким образом, динамика АФП в супернатанте эмбрионального гомогента в процессе развития куриного эмбриона характеризуется

чередованием, в разной степени выраженных пиков спадов и подъёмов. Наиболее видимые пики роста концентрации АФП отмечены на 6-е, 12-е, 15-е и 18-е сутки инкубации. Следует отметить, что каждый указанный пик увеличения содержания АФП сопровождается снижением его концентрации. В целом, к концу эмбрионального развития просматривается закономерное снижение уровня АФП, который приближается к значениям, зарегистрированным на начальных этапах эксперимента.

Учитывая научный интерес к АФП, как к белку участвующему в процессах роста и развития, нами вычислено его процентное содержание от уровня общего белка в супернатанте гомогената куриных эмбрионов с 5-х по 20-е сутки инкубации (табл. 2).

Таблица 2

Содержание общего белка и доля в нем АФП в гомогенате куриных эмбрионов

в процессе развития

Сутки развития, п=20 Общий белок, г/л Доля АФП (%)

5 6,7±0,05 0,39x10"*

6 8,0±0,07* 0,93x10"4

7 8,8±0,07* 0,24x1 о4

8 8,7±0,08 0,21x10"

9 15,1±0,22* 0,09x10"4

10 15,0±0,22 0,16x10""

11 22,0±0,26* 0,23x10"

12 38,0±0,37* 1,41x10""

13 56,4±0,33* 0,26x10"4

14 51,1±0,33* 0,32x10"

15 45,0±0,38* 0,71x10"

16 40,0±0,34* 0,38x10"

17 40,3±0,33 0,18x10"

18 34,0±0,46* 0,50x10"

19 38,0*0,41* 0,08x10"

20 47,4±0,41* 0,04x10"

*(Р<0,05) - достоверная разница в сравнении с предыдущими сутками п - количество проб гомогената 5-ти эмбрионов на каждые сутки исследования.

Установлено, что уровень общего белка не постоянен и изменяегся в процессе развития. На 13-е сутки достигается его максимальная концентрация за весь период исследования, которая составила 56,4±0,33 г/л, что в 8,4 раза больше, чем на 5-е сутки инкубации.

Сопоставляя динамику общего белка и изменения содержания АФП, можно сделать заключение о том, что в целом она характеризуется общей тенденцией нарастания концентрации данных веществ до 18-х суток развития. При этом, вплоть до этих суток инкубации, оба показателя после достижения максимального пикового значения (12-е сутки для АФП и 13-е для общего белка), постепенно снижаются. После 18-х суток динамика АФП и общего белка противоположна. Интересно отметить, что пороговых изменений в динамике уровня общего белка меньше, и они менее выражены по сравнению с динамикой уровня АФП. Не всегда посуточный подъём или спад уровня общего белка совпадает с такой же динамикой уровня АФП.

Установлено, что доля АФП (%) в объёме общего белка в эмбриогенезе характеризуется пороговым характером, с чередованием пиков нарастания и снижения уровня данного показателя, совпадающими с таковыми в динамике абсолютных значений АФП в процессе развития. Максимальная доля альфа-фетопротеина (1,41х1(Г4%) в объёме общего белка, также как и его абсолютное количество в эмбриогенезе, отмечено на 12-е сутки развития, а минимальное достигается на 20-е сутки (0,04><10"4 %), что не совпадает с динамикой абсолютного показателя содержания АФП в супернатанте эмбрионального гомогената. В процессе эмбрионального развития наблюдаются периоды (5-6-е, 10-11-е, 11-12-е сутки), в которые концентрация общего белка возрастает параллельно с увеличением содержания альфа-фетопротеина, что в свою очередь может свидетельствовать о взаимосвязи динамики этих показателей и об активно идущих пролиферативных процессах в данное время.

По нашему мнению, эти данные могут служить основой выбора оптимальных сроков инкубации куриного эмбриона для дальнейшего его использования в качестве субстрата для разработки и производства белковых препаратов, содержащих альфа-фетопротеин.

Показатели физического развития куриных эмбрионов в онтогенезе

Нет сомнения в том, что установленную динамику и абсолютные значения АФП можно считать нормативными только в том случае, если они не сопровождаются отклонениями в развитии, наличие которых принято оценивать по ряду морфологических критериев. Кроме того, морфометрические показатели тела и отдельных органов, при сопоставлении с установленными нами количественными значениями АФП конкретного эмбриона, по нашему мнению, могут послужить важным дополнением для объяснения механизма изменчивости уровня АФП в онтогенезе. В свете этого возникает потребность в расширении для куриных эмбрионов перечня морфометрических показателей, позволяющих судить не только об интенсивности роста и развития, но и об их пропорциональности.

В связи с вышеизложенным, физическое развитие куриного эмбриона на разных этапах онтогенеза (начиная с 5-х суток инкубации), оценивали по комплексу критериев (масса тела и внутренних органов, длина тела и окружность грудной клетки, прирост массы, отношение массы органов к массе тела), рассчитывали различные индексы развития.

Установлено, что масса тела куриного эмбриона, начиная с 5-х суток развития, постепенно увеличивается, достигая на 20-е сутки максимального значения - 32,86±0,215 г. Несмотря на закономерное увеличение массы тела в процессе развития куриного эмбриона, интенсивность её посуточного прироста различна. С 5-х по 10-е сутки масса тела увеличивается с низкой интенсивностью. После 10-х суток интенсивность посуточного прироста массы тела увеличивается вплоть до 20-х суток инкубации.

Абсолютный прирост массы тела куриного эмбриона с 5-х по 20-е сутки развития увеличивается равномерно, за исключением периода с 17-х по 18-е сутки. Относительный прирост массы тела, напротив, на 5-е сутки достигает

максимального значения, после чего снижается вплоть до 20-х. В динамике данного показателя можно отметить два существенных периода его уменьшения: с 6-х по 7-е и с 12-х по 13-е сутки эмбриогенеза.

Масса сердца, печени и лёгких, как и масса тела эмбриона, увеличивается в процессе развития (с 10-х по 20-е сутки).

Динамика массы сердца и лёгких на протяжении всего периода исследования примерно одинакова, но её абсолютные значения во все сроки исследования отличаются: масса лёгких всегда выше, чем масса сердца.

На всём протяжении исследования наибольшей абсолютной массой, среди органов, обладает печень. К концу эксперимента (20-е сутки) она достигает 0,743±0,0026 г, что в 26,5 раз больше, чем на 10-е сутки инкубации.

Динамика абсолютного и относительного прироста массы сердца, печени и лёгких отличается от динамики абсолютных значений массы данных органов. Абсолютный прирост массы печени характеризуется нарастающими колебаниями в процессе развития данного органа. Абсолютный прирост массы сердца и лёгких изменяется менее значительно по сравнению с абсолютным приростом массы печени. Относительный прирост массы печени и сердца в целом уменьшается с 10-х по 20-е сутки. Как и в динамике абсолютного прироста массы данных органов, межсуточные колебания относительного прироста массы печени наиболее выражены, чем для массы сердца.

Относительный прирост массы лёгких незакономерно изменяется в процессе развития куриного эмбриона. Так максимальное значение данного показателя отмечено в период с 12-х по 13-е сутки, а минимальное с16-х по 17-е. Динамика относительного прироста массы печени к массе тела имеет волнообразный характер. Минимальное значение данного показателя отмечено на 10-е сутки - 1,43±0,009%, максимальное приходится на 17-е - 2,50±0,009%.

Динамика относительной массы сердца и лёгких до 12-х суток противоположна, далее динамика исследуемых показателей изменяется примерно одинаково. Максимальное значение относительной массы органа к массе тела для серда отмечено на 14-е сутки (1,10±0,009%), для лёгких - на 10-е (1,38±0,007%), минимального значения данный показатель для сердца достигает на 20-е сутки (0,65±0,008%), для лёгких - на 19-е (1,01±0,008%).

Линейные размеры тела куриного эмбриона, так же как и показатели абсолютной массы тела и органов, постепенно увеличиваются в процессе развития. Длина тела КЭ на 5-е сутки равна 1,4±0,02 см, а к 20-м достигла значения 8,5±0,04 см.

Обхват грудной клетки исследовался, начиная с 7-х суток инкубации, на которые составил 2,1±0,03 см, а к 20-м увеличился до значения 7,1±0,03 см.

Наибольшим показателем отношения массы органа к массе тела обладает печень. Динамика данного показателя печени характеризуется чередованием пиков увеличения и уменьшения. Максимальное значение достигнуто на 17-е сутки - 2,50±0,009%, минимальное на 10-е - 1,43±0,009%.

Динамика отношения массы сердца и лёгких к массе тела характеризуется менее выраженными колебаниями, чем динамика этого критерия для печени.

Максимальное значение отношения массы лёгких к массе тела отмечено на 10-е сутки, оно составило 1,38±0,007%, а минимальное значение, достигнуто на 17-й день инкубации и составило 1,03±0,008%.

В динамике исследуемого показателя для сердца максимальное значение отмечено на 14-е сутки (1,10±0,009%), а минимальное на 20-е (0,65±0,008%).

В целом за весь период исследования отношение массы печени к массе тела достоверно увеличивается с 10-х по 20-е сутки. Напротив, отношение массы лёгких, а также массы сердца к массе тела, с 10-х по 20-е сутки достоверно уменьшается.

Установленная динамика, а также абсолютные и относительные значения массы, линейных размеров тела и жизненно важных органов (печень, сердце и лёгкие), посуточный прирост массы на протяжении онтогенеза, принципиально не противоречат данным, полученным многими другими авторами (Задарновская Г.Ф., 1966; Шмальгаузен И.И., 1984; Долгорукова A.M., 2007; Трунова А.П., 2008; Голубцова В.А., 2008; Беличенко В.М., Шошенко К.А., Кислякова Л.П. и др., 2010; и др.), что позволяет считать нормативными и представленные выше значения уровня АФП.

Различные сутки развития куриного эмбриона характеризуются конкретными числовыми значениями индексов физического развития {табл. J).

Индекс Кетле I с 5-х по 20-е сутки закономерно увеличивается, соответственно минимальное значение индекса приходится на 5-е сутки (0,152±0,001), а максимальное на 20-е (3,866±0,009). Индекс «степени», в отличие от индекса Кетле I, с 7-х по 20-е сутки закономерно снижается, максимальное значение приходится на 7-е сутки (0,687±0,006), а минимальное на 20-е (0,117±0,001).

Анализ индексов Кетле II, Борнгардта I и Ливи, не выявил закономерностей их посуточной динамики. Так индекс Кетле И с 5-х по 6-е, с 9-х по 10-е, с 11-х по 12-е и с 15-х по 16-е сутки снижается, в остальные периоды возрастает. Индекс Борнгардта I снижается с 11-х по 12-е и с 15-х по 16-е сутки, в остальные периоды отмечается его посуточный рост. Индекс Ливи с 11-х по 12-е и с 15-х по 16-е сутки снижается, а между всеми остальными сутками инкубации возрастет. Однако, в целом, к 20-м суткам инкубации по сравнению с началом исследования, значения этих трех индексов достоверно увеличиваются. Максимальные значения для индексов Кетле II (0,455±0,006), Борнгардта I (0,544±0,003) и Ливи (0,180±0,005) приходятся на 20-е сутки, а минимальные для индексов Борнгардта I (0,119±0,001) и Ливи (0,039±0,001) на 7-е, а индекса Кетле II (0,109±0,001) на 5-е сутки инкубации.

Индекс Эрисмана, характеризующий пропорциональность развития грудной клетки, с 7-х по 20-е сутки увеличивается.

Достоверных различий, при посуточном сравнении ИГМР (индекса гармоничного морфологического развития) обнаружить не удалось, за исключением периодов с 8-х по 9-е и с 9-х по 10-е сутки.

В целом показатель индекса Рорера с 5-х по 20-е сутки уменьшается с 7,762±0,05 до 5,351±0,04, несмотря на то, что максимальное значение индекса приходится на 9-е (8,262±0,06), а минимальное на 16-е сутки (3,976±0,02).

Таблица 3

Показатели индексов физического развития куриного эмбриона__

Сутки развития (п=100) Кегле I Кетле II Ливи Рорера БорнгардтаI ИГМР Эрисмана Индекс «степени»

5 0,152±0,001 0,109±0,001 - 7,762±0,05 - - - -

6 0,186±0,001* 0,098±0,001* - 5,146±0,04* - - - -

7 0,251±0,002* 0,114±0,001* 0,039±0,001 5,184±0,04* 0,119±0,001 104,76±0,6 1,01±0,017 0,687±0,006

8 0,368±0,002* 0,160±0,002* 0,053±0,001* 6,953±0,05* 0,160±0,001* 104,54±0,6 1,15±0,016* 0,576±0,005*

9 0,516±0,003* 0,206±0,001* 0,059±0,001* 8,262±0,06* 0,178±0,001* 97,961±0,5* 1,65±0,018* 0,486±0,005*

10 0,611±0,005* 0,191±0,002* 0,065±0,002* 5,963±0,04* 0,197±0,001* 103,12±0,6* 1,50±0,017* 0,457±0,004*

11 0,841±0,005* 0,240±0,003* 0,084±0,003* 6,867±0,05* 0,25 5±0,001* 103,03±0,7 1,55±0,017* 0,381±0,004*

12 0,961±0,007* 0,209±0,002* 0,081±0,003* 4,543±0,02* 0,246±0,001* 100,38±0,6 1,60±0,018* 0,361±0,004*

13 1,182±0,007* 0,223±0,003* 0,095±0,003* 4,207±0,02* 0,288±0,001* 100,64±0,5 1,45±0,016* 0,319±0,003*

14 1,498±0,008* 0,263±0,002* 0Д18±0,003* 4,610±0,02* 0,357±0,002* 99,023±0,4 1,35±0,015* 0,270±0,003*

15 1,850±0,007* 0,298±0,002* 0,142±0,004* 4,813±0,02* 0,430±0,002* 99,171±0,3 1,20±0,017* 0,228±0,003*

16 2,061±0,008* 0,286±0,002* 0,133±0,004* 3,976±0,02* 0,404±0,002* 99,442±0,4 1,50±0,017* 0,207±0,002*

17 2,495±0,009* 0,333±0,003* 0,135±0,004* 4,435±0,02* 0,409±0,002* 99,982±0,3 2,35±0,019* 0,172*0,002*

18 2,932±0,008* 0,376±0,003* 0,149±0,005* 4,819±0,02* 0,451 ±0,003* 99,280±0,4 2,60±0,019* 0,149±0,002*

19 3,401±0,009* 0,420±0,005* 0,167±0,005* 5,182±0,04* 0,507±0,003* 99,589±0,5 2,65±0,019* 0,131±0,001*

20 3,866±0,009* 0,455±0,006* 0,180±0.005* 5,351±0,04* 0,544±0,003* 99,379±0,3 2,85±0,021* 0,117±0,001*

*(Р<0,05) - достоверная разница в сравнении с предыдущими сутками.

п - количество эмбрионов на каждые сутки исследования.

Корреляционная зависимость между уровнем альфа-фетопротеина, общего белка в гомогенате куриного эмбриона и его морфометрическими

показателями

Акцентируя внимание на регуляторной роли АФП в пренатальном онтогенезе, сочли необходимым провести коррелятивные параллели его уровня с содержанием общего белка на разных этапах онтогенеза, а также с динамикой массы, длины тела и массы внутренних органов, поскольку именно эти критерии являются интегрированным отражением реализации всех регуляторных механизмов и эффекторных структурных преобразований в эмбриональном развитии (табл. 4).

Таблица 4

Корреляции уровня АФП и морфофункциональных показателей куриных

эмбрионов в онтогенезе

Сутки Масса тела Длина тела Масса лёгких Масса печени Масса сердца Общий белок

5 0,645 0,501 не исследовали не исследовали не исследовали 0,738

6 0,571 0,439 не исследовали не исследовали не исследовали 0,602

7 0,351 0,350 не исследовали не исследовали не исследовали 0,240

8 0,379 0,363 не исследовали не исследовали не исследовали 0,124

9 0,403 0,378 не исследовали не исследовали не исследовали 0,223

10 0,444 0,409 0,448 0,864 0,502 0,315

11 0,563 0,453 0,406 0,780 0,406 0,459

12 0,739 0,486 0,541 0,943 0,672 0,660

13 0,644 0,361 0,364 0,851 0,444 0,250

14 0,396 0,315 0,271 0,783 0,311 0,339

15 0.336 0,287 0,227 0,755 0,124 0,278

16 0,232 0,266 0,184 0,746 0,114 0,254

17 0,261 0,105 0,114 0,732 0,084 0,229

18 0,113 0,078 0,036 0,669 0,079 0,154

19 0,089 0,053 0,015 0,565 0,026 0,110

20 0,078 0,051 0,014 0,439 0,024 0,090

Установлено, что уровень АФП и общего белка в гомогенате на протяжении всего эксперимента зависят друг от друга. На 5-е сутки наблюдается максимальная корреляция (0,738 - тесная). На б-е сутки она составляет 0,602 (выраженная), а к 7-м суткам снижение продолжается. С 8-х по 12-е сутки она увеличивается вновь, достигая значения выраженной (0,660). Начиная с 12-х суток, коэффициент корреляции АФП и общего белка в целом снижается, соответствуя слабой корреляции, достигая к концу развития минимального значения, свидетельствующего об исчезновении коррелятивных связей. Исключение составляют 14-е сутки, на которые отмечена заметная корреляция.

Коэффициент корреляции между уровнем АФП и показателями массы и длины тела изменяется примерно одинаково. Динамика показателя незакономерно изменчива от одних суток к другим, однако, к концу развития коэффициент корреляции снижается и соответствует слабой взаимосвязи.

Слабая коррелятивная зависимость АФП с массой тела отмечается с 16-х, а с длиной — с 15-х суток. Максимальный коэффициент корреляции с массой тела отмечен на 12-е сутки (тесная). На 5-е, 6-е, 11-е и 13-е сутки отмечена выраженная корреляция. После достижения 12-х суток развития коэффициент корреляции между АФП и массой тела снижается.

Коэффициент корреляции уровня АФП с длиной тела, в целом, снижается с 5-х по 20-е сутки. Максимальное значение корреляции отмечено на 5-е сутки.

Коэффициент корреляции АФП с массой печени наиболее высокий по сравнению с другими органами, на всём протяжении инкубации. Максимальная корреляция отмечена на 12-е сутки (функциональная), после которых коэффициент корреляции снижается, достигая минимального значения на 20-е сутки (заметная). Максимальная корреляция уровня АФП с массой лёгких и сердца отмечена на 12-е сутки (0,541 и 0,672 соответственно), после чего коэффициент корреляции уровня АФП с массой обоих органов снижается.

Таким образом, для всех исследуемых показателей после 12-х суток развития эмбриона, характерно постепенное снижение степени корреляционной зависимости с уровнем АФП. Для показателей массы и длины тела, а также уровня общего белка на 5-е сутки характерен высокий коэффициент. Минимальная корреляция для всех изучаемых показателей отмечена на 20-е сутки.

Содержание некоторых минеральных элементов в курином эмбрионе в процессе развития

Исследовано содержание железа, цинка, меди, марганца, кобальта, селена, хрома, натрия, калия, кальция и магния в гомогенате куриного эмбриона в процессе развития. Таких элементов, как селен, кобальт и хром в отдельные периоды онтогенеза куриного эмбриона выявить не удалось. Остальные исследуемые минералы присутствовали на протяжении всего периода инкубации.

Динамика меди заключается в постепенном нарастании содержания в гомогенате, вплоть до 12-х суток включительно, на которые её концентрация достигла максимума (0,192±0,0015 мкг/г). Далее происходило постепенное снижение количества данного элемента в гомогенате. Минимальное количество меди зафиксировано на 5-е сутки - 0,012±0,0003 мкг/г.

Кобальт и хром с 5-х по 15-е сутки обнаружить не удалось. На 16-е, 18-е и 19-е сутки были зафиксированы следовые значения кобальта. Следовые значения хрома зафиксированы на 16-е и 17-е сутки. На 17-е и 20-е сутки содержание кобальта составило 0,014±0,0003 мкг/г и 0,013±0,0003 мкг/г соответственно. Содержание хрома с 18-х на 19-е сутки достоверно увеличилось на 0,005 мкг/г, а на 20-е сутки оно составило 0,017±0,0003 мкг/г.

Следовые количества селена отмечены лишь на 11-е сутки. Максимальное количество селена, отмеченное на 14-е и 20-е сутки, одинаково и составило 0,018±0,0003 мкг/г. Минимальное значение также отмечено дважды: на 12-е (0,011±0,0003 мкг/г) и 16-е (0,011±0,0002 мкг/г) сутки.

Натрий, калий, кальций и магний (рис. 1) присутствуют в эмбриональном гомогенате кур на протяжении всего периода исследования. Их динамика не постоянна и имеет волнообразный характер.

1,4 1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2

м

л * я— Щ

Г Г ' \ * *

'Ч-Т^- ♦

а-* 1 1

ТО 11 12 13 14 15—те 17 18-19—20-Сутки развития

-Натрий 1

-Калий - А - Кальций 1

Магний

Рис. 1. Динамика натрия, калия, кальция и магния в эмбриональном гомогенате.

Наиболее высоко содержание калия. На 5-е и 6-е сутки оно составило 0,82±0,008 и 0,81±0,009 мг/г. На 7-е сутки количество элемента снизилось на 0,12 мг/г, а на 8-е достигло значения 6-х суток. На 10-е сутки отмечено снижение содержания металла на 0,20 мг/г. С 10-х суток содержание калия начинает нарастать, достигая на 13-е сутки 0,99±0,009 мг/г. С 13-х суток содержание элемента снижается, достигая к 14-м суткам 0,86±0,008 мг/г. Снижение продолжается до 15-х суток. Затем количество калия начинает достоверно увеличиваться, достигая на 17-е сутки максимального содержания-1,11±0,008 мг/г. Далее количество элемента снижается, вплоть до 20-х суток включительно, практически до первоначального значения, зафиксированного на 5-е сутки.

В динамике кальция можно отметить четыре пика увеличения его содержания - на 6-е, 14-е, 17-е и 20-е сутки. Максимальное значение данного элемента отмечено на 17-е сутки - 0,84±0,007 мг/г, минимальное на 8-е (0,02±0,001 мг/г) и 10-е (0,02±0,001). Максимальное суточное увеличение уровня кальция приходится на период между 16-ми и 17-ми сутками - 0,63 мг/г, второе по значимости в промежутке между 5-ми и 6-ми - 0,47 мг/г. Между 13-ми и 14-ми, 19-ми и 20-ми сутками повышение его уровня менее значимо, и составило 0,15 мг/г и 0,07 мг/г соответственно. Максимальное суточное снижение содержания кальция отмечено в периоде между 6-ми и 7-ми сутками

- на 0,51 мг/г, второе по значимости между 17-ми и 18-ми сутками - на 0,43 мг/г.

Динамика натрия и магния выглядит более ровной, чем калия и кальция. Максимальное содержание натрия отмечено на 5-е сутки, и составило 0,61±0,006 мг/г, а минимальное на 10-е - 0,31±0,008 мг/г.

Наибольшее среднесуточное снижение содержания натрия отмечено между 5-ми и 6-ми сутками и составило 0,25 мг/г. На 10-е сутки содержание натрия снова снижается, достигая минимального значения 0,31±0,008 мг/г. С 10-х по 11-е сутки его концентрация возрастает, достигая значения 0,41±0,009 мг/г. Далее с 11-х по 12-е сутки следует снижение концентрации на 0,06 мг/г, а с 12-х по 13-е происходит её нарастание на 0,07 мг/г. С 13-го по 15-й дни инкубации содержание натрия снижается, между 13-ми и 14-ми сутками на 0,05 мг/г, а между 14-ми и 15-ми - на 0,06 мг/г. Следующее увеличение содержания натрия наблюдается на 17-е сутки, после чего, на 18-е, количество элемента снижается на 0,06 мг/г, достигая значения 0,31±0,008 мг/г. В целом, с 6-х по 20-е сутки включительно, отмечается тенденция посуточного чередования увеличения и снижения содержания натрия в эмбриональном гомогенате.

Содержание магния в эмбриональном гомогенате колеблется от 0,04±0,003 мг/г до 0,11±0,005 мг/г. Максимальное значение достигается на 5-е -0,11±0,005 мг/г и 18-е - 0,11±0,005 мг/г, а минимальное на 10-е сутки -0,04±0,003 мг/г. С 5-х по 6-е сутки содержание магния снижается с 0,11±0,005 мг/г до 0,07±0,004 мг/г (на 0,04 мг/г). Далее, незначительно колеблясь, содержание элемента остаётся примерно на одном уровне до 17-х суток. В период между 17-ми и 18-ми сутками наблюдается увеличение содержания элемента на 0,04 мг/г, а между 18-ми и 19-ми сутками инкубации содержание магния снова падает, достигая значения 0,08±0,004 мг/г.

Содержание марганца с 5-х по 20-е сутки увеличивается. Исключение составляют два периода, между 8-ми и 9-ми, а также 13-ми и 14-ми сутками инкубации, в которые происходит достоверное снижение концентрации элемента. Минимальное значение отмечено на 5-е сутки - 0,7±0,03 мкг/г, максимальное на 20-е - 7,5±0,06 мкг/г. Между 11-ми и 12-ми сутками наблюдается максимальный прирост концентрации марганца, равный 1,2 мкг/г. Минимальное суточное увеличение концентрации (на 0,2 мкг/г) отмечено дважды, между 5-ми и 6-ми, и 7-ми и 8-ми суткам (рис. 2).

В отличие от динамики марганца содержание железа и цинка с 5-х по 20-е сутки неоднократно ступенчато изменяется (рис. 2).

Содержание цинка с 5-х по 7-е сутки увеличивается на 6,92 мкг/г. С 7-х суток содержание цинка снижается на 3,32 мкг/г, достигая на 8-е сутки 4,81±0,08 мкг/г. Максимальное повышение содержания цинка отмечено между 13-ми и 14-ми сутками - 6,28 мкг/г. Начиная с 14-х суток его содержание снова снижается. Такая тенденция сохраняется до 17-х суток включительно, после которых отмечается увеличение концентрации этого металла. С 17-х на 18-е сутки прирост его уровня составил 0,86 мкг/г, а с 18-х на 19-е - 2,48 мкг/г. С 19-х по 20-е сутки его содержание снижается на 0,8 мкг/г, достигая значения 11,4±0,09 мкг/г.

1 Железо Цинк ~ Марганец

Рис. 2. Динамика содержания железа, цинка и марганца в эмбриональном гомогенате.

Максимальный уровень содержания железа отмечен на 19-е сутки, минимальный - на 13-е. Причём с 7-х по 13-е сутки наблюдается неоднократное снижение концентрации железа, даже по сравнению с содержанием этого металла на 5-е сутки эмбриогенеза, чередующееся с выраженным подъёмом его концентрации. Между 18-ми и 19-ми сутками наблюдалось максимальное увеличение содержания металла, равное 4,5 мкг/г. Минимальное суточное увеличение уровня железа отмечено между 17-ми и 18-ми сутками - 0,55 мкг/г. Максимальное суточное снижение содержания элемента зафиксировано в период между 12-ми и 13-ми сутками - 5,62 мкг/г. В целом в эмбриогенезе, содержание железа в эмбриональном гомогенате возрастает.

Таким образом, все исследуемые элементы присутствуют в курином эмбрионе на разных этапах эмбрионального развития, их содержание не постоянно и характеризуется различными по времени и по амплитуде колебаниями концентрации, что вероятно связано с различной интенсивностью химических процессов, происходящих в организме.

ВЫВОДЫ

1. АФП присутствует на всех этапах развития куриного эмбриона с 5-х по 20-е сутки. Динамика содержания АФП в супернатанте гомогената эмбриона волнообразна и характеризуется повышением вплоть до 12-х суток, с последующим снижением к концу инкубации практически до исходного уровня. Выявлено четыре пика повышения уровня АФП. Максимальное абсолютное значение АФП (42,8±0,286 МЕ/мл) в эмбриогенезе отмечено на 12-е сутки, а минимальное (1,12±0,004 МЕ/мл) - на 9-е сутки.

2. С 5-х по 20-е сутки эмбриогенеза кур содержание АФП с разной степенью положительной корреляции связано с уровнем общего белка в

супернатанте эмбрионального гомогената. До 14-х суток коэффициент корреляции колеблется, после чего закономерно снижается. Максимальный коэффициент корреляции отмечен на 5-е, а минимальный - на 20-е сутки развития. Максимальное (МЫЮ-4 %) содержание АФП в составе общего белка отмечено на 12-е, а минимальное (0,04x10"'%) - на 20-е сутки эмбриогенеза.

3. Для куриного эмбриона на каждые сутки инкубации характерны различные абсолютные значения восьми индексов физического развития, использование которых в комплексе с показателями массы тела и органов и линейными размерами тела, позволяет характеризовать рост и развитие как целостный пространственно организованный процесс, направленный на достижение видоспецифической формы. Индекс Кетле I закономерно посуточно возрастает, а индекс «степени» закономерно - снижается. Индексы Кетле II, Ливи, Борргната I и Эрисмана в целом в онтогенезе увеличиваются, а индекс Рорера снижается, однако закономерности их посуточной динамики не отмечено. Индекс гармоничного морфологического развития в онтогенезе меняется незначительно.

4. Коррелятивная зависимость уровня АФП с массой и длиной тела куриного эмбриона наиболее четко выражена с 5-х по 12-е сутки онтогенеза. Максимальный коэффициент корреляции с массой тела отмечен на 12-е сутки (0,739 - тесная), а с длиной тела - на 5-е сутки (0,501 - выраженная). Начиная с 12-х суток, коэффициент корреляции АФП с обоими показателями закономерно снижается, достигая к 20-м суткам развития минимальных значений, свидетельствующих о слабой взаимосвязи. Слабая коррелятивная зависимость АФП с массой тела отмечается уже с 16-х, а с длиной - с 15-х суток.

5. С 10-х по 20-е сутки развития уровень АФП в гомогенате куриного эмбриона коррелятивно взаимосвязан с массой печени, сердца и лёгких. В течение всего этого периода коэффициент корреляции АФП с массой печени наиболее высок по сравнению с другими органами. Для всех исследуемых органов после 12-х суток развития характерно постепенное снижение степени корреляционной зависимости массы с уровнем АФП, однако степень коррелятивной взаимосвязи с массой печени вплоть до 20-х суток остаётся высокой (0,439 - заметная). На 12-е сутки развития с массой печени отмечена функциональная корреляция (0,943), а с массой лёгких и сердца - выраженная (0,541 и 0,672 соответственно).

6. В гомогенате куриного эмбриона с 5-х по 20-е сутки развития обнаружены натрий, калий, кальций, магний, железо, цинк, марганец и медь. Селен выявлен с 11-х, а хром и кобальт - с 18-х суток развития. Содержание всех минеральных элементов на протяжении онтогенеза изменчиво, посуточная динамика не закономерна и характеризуется различными по времени и по амплитуде колебаниями концентрации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

I. Полученные результаты могут быть использованы в качестве дополнительной информации при составлении учебно-методических материалов по биологии развития, гистологии, эмбриологии.

2. Результаты исследования могут быть учтены в научной и практической деятельности биологов широкого профиля в качестве дополнительных критериев, характеризующих эмбриогенез кур, а также в практике специалистов ветеринарной медицины и сельского хозяйства при антенатальном прогнозировании здоровья и качества птицы, оптимизации процесса инкубации, определении путей регуляции роста и развития куриных эмбрионов.

3. Сведения о содержании АФП в гомогенате куриного эмбриона, его динамике, взаимосвязях с уровнем белка, а также данные о динамике минеральных элементов в отдельные периоды эмбриогенеза, расширяют сырьевые возможности эмбрионально-яичной массы и могут использоваться биотехнологами при разработке белковых, в том числе АФП-содержащих и содержащих минеральные элементы биологически активных препаратов. Двенадцатые сутки развития куриного эмбриона рекомендуются в качестве оптимального срока для использования эмбрионального гомогената в биотехнологических целях при получении АФП-содержащих субстанций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тимченко, Л.Д. Содержание альфа-фетопротеина (АФП) в эмбрионах кур на ранних стадиях эмбриогенеза / Л.Д. Тимченко, А.П. Трунова, В.Н. Стрекалова, C.B. Черников // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: мат-лы научной конференции / СГУ. - Ставрополь, 2007. -С. 245-246.

2. Тимченко, Л.Д. Взаимосвязь массы печени с содержанием альфа-фетопротеина в крови куриных эмбрионов в процессе развития / Л.Д. Тимченко, А.П. Трунова, C.B. Черников, В.Н. Стрекалова, Р.В. Горбовский // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: мат-лы 53-й научно-метод. конф. «Университетская наука - региону». -Ставрополь: Изд-во СГУ, 2008. - С. 182-184.

3. Тимченко, Л.Д. Содержание альфа-фетопротеина в гомогенате куриного эмбриона и его взаимосвязь с морфометрическими показателями роста и развития организма / Л.Д. Тимченко, А.Г1. Пономарснко, C.B. Черников // Вестник Московского государственного областного университета. Серия «Естественные науки». - 2009. - № 3. -С. 70-73.

4. Черников, C.B. Динамика калия и натрия в гомогенате куриного эмбриона в процессе развития / C.B. Черников // Пятая ежегодная научная конференция студентов и аспирантов базовых кафедр ЮНЦ РАН: тезисы докладов. -Ростов н/Д: Изд-во ЮНЦ РАН, 2009. - С. 43-44.

5. Черников, C.B. Содержание кальция и магния в гомогенате куриного эмбриона в процессе развития / C.B. Черников, А.П. Пономаренко, С.С. Аванесян // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: мат-лы 54-й научно-метод. конф. «Университетская наука - региону». -Ставрополь: Изд-во СГУ, 2009. - С. 79-82.

6. Черников, C.B. Содержание АФП в гомогенате куриного эмбриона в процессе развития / C.B. Черников // Сборник трудов молодых учёных: мат-лы 54-й науч.-метод. конф. «Университетская наука - региону». -Ставрополь: Изд-во СГУ, 2009. - С. 165-167.

7. Тимченко, Л.Д. Взаимосвязь уровня альфа-фетопротеина и апоптоза в процессе развития куриного эмбриона / Л.Д. Тимченко, C.B. Черников, Г.Н. Блажнова // Аграрная Россия. Научно-производственный журнал. -2010.-№5.-С. 53-54.

8. Тимченко, Л.Д. Показатели физического развития куриного эмбриона / Л.Д. Тимченко, Д.А. Арешидзе, C.B. Черников, Г.Н. Блажнова // Вестник Московского государственного областного университета. Серия «Естественные науки». - 2011. - №. 3. - С. 98-101.

9. Тимченко, Л.Д. Динамика уровня общего белка в гомогенате куриного зародыша в процессе развития / Л.Д. Тимченко, C.B. Черников, Г.Н. Блажнова // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: мат-лы научной конференции / СГУ. - Ставрополь, 2011.-С. 148-151.

10. Черников, C.B. Использование иммуноферментного метода для определения уровня альфа-фетопротеина в гомогенате куриного эмбриона / C.B. Черников // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: мат-лы 56-й научно-метод. конф. -Ставрополь: Изд-во СГУ, 2011.-С. 181-185.

П.Черников, C.B. Содержание железа и цинка в гомогенате куриного эмбриона / C.B. Черников // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: мат-лы 56-й научно-метод. конф. - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2011. - С. 186-188.

12. Черников, C.B. Содержание марганца, селена, хрома и кобальта в гомогенате куриных эмбрионов в процессе развития / C.B. Черников // Современные проблемы теории и практики инновационного развития АПК: мат-лы междунар. научно-практ. конф. - Нальчик, 2011. - С. 147-149.

ЧЕРНИКОВ Сергей Валерьевич

ДИНАМИКА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА, МИНЕРАЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ И ПОКАЗАТЕЛИ ФИЗИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ У КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ В ОНТОГЕНЕЗЕ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подп. в печатьЮ.02.2012 г. Бумага офсетная. Формат 60/84 1/16 Зак№ 128 . Уел печ. лист.1,0. Тираж 100 экз.

Цех оперативной полиграфии СНИИЖК г. Ставрополь, пер. Зоотехнический 15.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черников, Сергей Валерьевич, Ставрополь

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ СТАВРОПОЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ЮЖНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

„ . На правах рукописи

61 12-3/1311 Ч^г^оЛ

ЧЕРНИКОВ Сергей Валерьевич

ДИНАМИКА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА, МИНЕРАЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ И ПОКАЗАТЕЛИ ФИЗИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ У КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ В ОНТОГЕНЕЗЕ

03.03.05 - биология развития, эмбриология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор Л.Д. Тимченко

Ставрополь - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

Принятые сокращения Введение Глава 1.

стр.

3

4

Обзор литературы

1.1. Морфофункциональные особенности развития куриного эмбриона 10

1.2. Альфа-фетопротеин, минеральные элементы и их системно-регуляторные связи в живом организме 25

1.3. Роль альфа-фетопротеина в нарушении развития, патологии, и его прикладное значение 45

Глава 2. Материалы и методы исследований 53

Глава 3. Результаты изучения содержания альфа-фетопротеина в онтогенезе у куриного эмбриона во взаимосвязи с показателями его роста и развития (собственные исследования)

3.1. Содержание альфа-фетопротеина в гомогенате куриных эмбрионов и его уровень в составе общего белка на разных этапах развития 66

3.2. Показатели физического развития куриных эмбрионов в онтогенезе 73

3.3. Корреляционная зависимость между уровнем альфа-фетопротеина, общего белка в гомогенате куриного эмбриона и его морфометрическими показателями 86

3.4. Содержание кальция, магния, натрия, калия, железа, цинка, марганца, меди, хрома, селена и кобальта в 89 курином эмбрионе в процессе развития

Обсуждение результатов исследования 98

Выводы 127

Практические предложения 129

Список литературы 130

Приложения 164

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АФП - альфа-фетопротеин АлАТ - аланинаминотрансфераза ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота КЭ - куриный эмбрион

МБ - международная единица измерения АФП, 1МЕ/мл = 1,25 нг/мл

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РСК - раствор для разведения сывороток и конъюгата

РНК - рибонуклеиновая кислота

СБР - субстратный буферный раствор

СОД - супероксиддисмутаза

ТМБ - тетраметилбензидин

ФСБ-Т - фосфатно-солевой буферный раствор с твином ЭФР - эпидермальный фактор роста

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Изучение общих закономерностей онтогенеза имеет большое значение для решения теоретических и практических вопросов биологии развития. В условиях современности не теряет актуальности выяснение механизмов регуляции роста и развития клеток и тканей организма, нарушение которых приводит к возникновению различных патологий (Шилов В.Н., 2006). Знание таких механизмов особенно важно в эмбриональный период, когда происходит формирование будущего организма, закладываются ткани и органы. В основе формообразовательных процессов лежат такие взаимосвязанные явления, как пролиферация, дифференцировка и апоптоз (Ярыгин В.Н. и др., 2001), интенсивность и интеграция которых в онтогенезе регулируется многочисленными биохимическими факторами, в том числе белками и различными минеральными веществами, представленными в организме как моносубстанциями, так и в виде сложных, и прежде всего, ферментных соединений (Авцын А.П., 1991; Шилов В.Н., 2006; Reiser S. et al., 1985; Harris E.D., 1992; Репа М.О. et al., 1999; Araya M. et al., 2003).

Большинство веществ-регуляторов обладают низкомолекулярной структурой, и соответственно реализуют свои функции на молекулярном уровне (Ширшев C.B., 1993). К таким веществам относят альфа-фетопротеин, являющийся по своей структуре уникальным соединением белковой природы. Эффекты его реализуются на уровне комплексной регуляции клеточной пролиферации, механизмов апоптоза, обеспечения клетки энергетическим и пластическим материалом, иммунорегуляции, индукции регуляторных сигналов через усиление экспрессии рецепторов и других жизненно важных процессов (Ширшев C.B., 1993; Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003; Черешнев В.А. и др., 2004; Hooper D.C. et al., 1987; Geuskens M., 1991; Geuskens M. et al., 1994; Nunes E.A., 1994; Filella X. et al., 2001). Однако установление его функций остаётся на протяжении продолжительного периода самой загадочной и противоречивой областью в исследовании этого

белка (Абелев Г.И., 1989; Виноградская Г.Р., Маринец О.В., 2001; Гранов A.M. и др., 2008).

Широкий спектр воздействия на организм обусловливает использование АФП в биотехнологических целях (Рощин Е.М. и др., 1997; Стариков В.В. и др., 1995, 1996, 1997; Родионов С.Ю. и др., 1998, 1999; Родионов С.Ю., Стариков В.В., 2000, 2001; Черкасов В.А. и др., 2000; Черешнев В.А. и др., 2004). Поэтому изучение содержания и механизмов регуляции синтеза этого белка в различных биологических объектах - крайне интересное и многообещающее направление в биологии. В настоящее время эти вопросы наиболее детально изучены у человека и некоторых млекопитающих. У них исследовано содержание АФП в различных органах: желточном мешке, печени, крови, желудочно-кишечном тракте плода (Абелев Г.И., 1994; Пустотина O.A., 2006; Leung W.T. et al., 1994).

В то же время общепризнано, что куриный эмбрион - это классическая модель для изучения особенностей эмбрионального развития, механизмы которого и сегодня являются предметом неослабевающего интереса исследователей. Тем не менее, практически отсутствуют сведения о содержании АФП в развивающемся эмбрионе птицы, являющемся важным биологическим объектом исследования и перспективной сырьевой субстанцией для использования в биотехнологии. Имеются лишь единичные сообщения о наличие у куриного эмбриона АФП в нервной ткани и сетчатке глаза в отдельные периоды эмбриогенеза (Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003).

Считается, что наиболее полно уровень развития организма, как в норме, так и при патологии, отражает комплекс морфометрических показателей. Однако их перечень, установленный для куриных эмбрионов, сравнительно невелик и представлен, преимущественно массой тела, органов и линейными размерами (Задарновская Г.Ф., 1966; Шмальгаузен И.И., 1984; Долгорукова А.Н., 2007; Хохлов Р.Ю., 2009; и др.). Также узок спектр показателей физического развития, в частности, имеются единичные

сообщения лишь о некоторых простейших индексах (Трунова А.П., 2008), перечень которых, по нашему мнению, недостаточен для полноценной характеристики его пропорциональности и гармоничности. Заслуживает внимание и отсутствие точных сведений о динамике в тканях развивающегося куриного эмбриона уровня минеральных элементов, являющихся важнейшим фактором обеспечения не только функций отдельных клеток, но и механизмов межклеточного взаимодействия.

В связи с вышеизложенным, представляется актуальным получение новых сведений о морфофункциональных преобразованиях в курином эмбрионе, в том числе о критериях физического развития, содержании АФП, и характере взаимосвязей между этими показателями, а также о динамике минеральных элементов, которые могут заложить основы для управления эмбриогенезом особи.

Цель исследования: изучить динамику альфа-фетопротеина, общего белка и минеральных элементов в курином эмбрионе, а также дать комплексную оценку уровня его физического развития в онтогенезе, с выявлением характера взаимосвязей между изучаемыми показателями.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи.

1. Определить содержание альфа-фетопротеина в гомогенате куриного эмбриона и его процентное соотношение в составе общего белка в процессе развития.

2. Изучить морфометрические показатели эмбрионов птицы на разных этапах развития и на их основе вычислить основные индексы развития куриного эмбриона.

3. Провести корреляционный анализ взаимосвязи уровня альфа-фетопротеина в процессе развития куриного зародыша с его морфометрическими показателями и уровнем общего белка.

4. Исследовать содержание кальция, магния, натрия, калия, железа, цинка, марганца, меди, хрома, селена и кобальта в курином эмбрионе в процессе развития.

Научная новизна. Установлено содержание альфа-фетопротеина, определена его динамика в гомогенате куриного эмбриона, а также доля в составе общего белка в процессе развития.

Впервые в эмбриогенезе кур проведена оценка физического развития куриного зародыша с использованием широкого перечня показателей, в том числе с помощью метода индексов.

Впервые в эмбриогенезе кур выявлен характер коррелятивной взаимосвязи между уровнем АФП, общего белка в гомогенате куриного эмбриона и его морфометрическими показателями.

Проведены исследования комплекса минеральных элементов (кальций, магний, натрий, калий, железо, цинк, марганец, медь, хром, селен, кобальт) в тканях куриного эмбриона в процессе развития.

Теоретическая и практическая значимость. Данные о динамике АФП в процессе развития куриного эмбриона существенно дополняют и расширяют представление о его роли в эмбриогенезе. Установленные взаимосвязи уровня альфа-фетопротеина в эмбриональном гомогенате с другими морфофункциональными показателями дают основание обозначить его регуляторную роль в соматическом эмбриогенезе, что может быть использовано для регуляции эмбрионального развития в хозяйственных, научных, а также в биотехнологических целях, в частности для получения АФП-содержащего сырья.

Результаты исследования внедрены и используются в научной деятельности и учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных занятий по биологии размножения и развития, гистологии, цитологии, эмбриологии, физиологии и биологии клетки в Ставропольском государственном университете, Ставропольском филиале Московского государственного гуманитарного университета им. М.А. Шолохова, Брянском государственном университете им. академика И .Г. Петровского и в Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии.

Полученные данные используются в научно-исследовательской работе НИИ биологии Южного федерального университета.

Результаты исследования используются в практической деятельности при разработке АФП-содержащих биологически активных препаратов на основе активированной эмбрионально-яичной массы на базе ПНИЛ «Экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии» Ставропольского государственного университета, и в практической деятельности ООО НПО «Биомодуль» и ООО Малое инновационное предприятие «Кормовые концентраты» и в качестве вспомогательных данных при разработке технологий производства и схем применения новых БАП и кормовых добавок для животных и птицы.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-методических конференциях: «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2007, 2008, 2009, 2011); на 6-й Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2008); 5-й ежегодной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2009), где доклад был отмечен почётной грамотой; международной научно-практической конференции «Современные проблемы теории и практики инновационного развития АПК» (Нальчик, 2011).

На защиту выносится:

1) динамика альфа-фетопротеина, его абсолютные значения и характер взаимосвязи с уровнем общего белка в супернатанте гомогената, массой и длиной тела и массой внутренних органов в процессе развития куриного эмбриона;

2) особенности физического развития и уровень минеральных элементов в гомогенате куриных эмбрионов в процессе инкубации.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 12 печатных работ, в том числе 3 из них в периодических изданиях из перечня ведущих

рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой учёной степени.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 168 страницах компьютерного набора, иллюстрирована 21 рисунками, 13 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и приложений. Список использованной литературы содержит 327 источников, в том числе 112 зарубежных авторов.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Морфофункциональные особенности развития куриного эмбриона

Эмбриональное развитие птиц представляет большой интерес для многих исследователей. Птичий, а особенно куриный эмбрион, достаточно часто применяется в качестве биологической модели и является объектом изучения морфологов, физиологов, биохимиков, биотехнологов, медиков, птицеводов и специалистов других прикладных областей знаний (Рольник В.В., 1968; Сюрин В.Н., 1991; Фролов И.Ю., 1993; Генчев А.Г., 1996; Трунова А.П., 2005, 2008; Гаврилов A.A., 2008; Карецкий A.B., 2008; Солдатова И.Б., 2008; Максимов В.Ф., Коростышевская И.М., 2009; Spotila J.R., Weinheimer С.J., Paganelli C.V., 1981; Jalkanen S., Korpela R., Granfors K., 1984; Thomson P.S., Carty M.T., Hale W.C., 1990; Liu Z.M., Pang S.F., 1993; и другие).

В научной литературе имеется большое количество материалов, посвященных разносторонним исследованиям онтогенеза птицы. Кроме общепринятых критериев роста и развития (масса тела и органов и её прирост, линейные размеры) (Голубцова В.А., 2008; Слуцкая Д.Р., 2008; Трифонов Г.А., Суханов A.A., Кулешов К.А., 2009; Хохлов Р.Ю., 2009; Беличенко В.М., Шошенко К.А., Кислякова Л.П. и др., 2010; и др.), изучают морфофункциональные показатели крови и обмена веществ (Сидоренко А.И., 2001; Суханова C.B., 2007; Bhattacharya R., 1977; Jan-Ho Y., Karasawa S., 1995; Suhanova S.F., 2003), морфологию, физиологию и патологию мочевыделительной системы (Донкова Н.В., 1988; Гахова H.A., 2005; Зайцева Е.В., Водяницкая Т.С., 2006), экологию и биологию размножения разных видов птиц и влияние различных факторов на данные процессы (Егорова Е.С., 1997; Паршина Ю.Э, 1997; Quinney Т.Е., Hussell J.T., 1986; Vickery P.D., Hunter M.L., Wells J.V., 1992; Cichon M., Linden M., 1995).

Среди научных трудов по изучению особенностей онтогенеза птицы, значительно меньше работ посвященных закономерностям её эмбрионального развития.

Имеются классические работы известных учёных, раскрывающие широкий перечень закономерностей эмбрионального развития куриного зародыша в норме. Наиболее известные из них принадлежат М.Н. Рагозиной (1961), Г.Ф. Задарновской (1966), В.В. Рольник (1968), И.И. Шмальгаузену (1984), Б.Ф. Бессарабову (2006) и другим.

В своей работе М.Н. Рагозина (1961) определяет важность изучения эмбрионального развития цыплёнка во взаимосвязи с временными органами, которые, по мнению автора, обеспечивают нормальный процесс обмена веществ. Используя морфологические показатели (длина и форма), а также данные о местоположении и времени закладки и дифференцировки различных тканей и органов, она делит эмбриональное развитие кур на четыре периода: зародышевый (1-8-е сутки), предплодный (8-14-е сутки), плодный (14-20-е сутки) и вылупление (21-е сутки).

Г.Ф. Задарновская (1966) рассматривает развитие куриного эмбриона с позиции сопоставления процессов морфогенеза и дифференцировки тканей с характером обмена веществ и становлением главных физиологических функций эмбриона. В своей работе автор указывает на периодичность развития зародыша, что по её мнению является универсальным свойством для эмбрионов не только птиц, но и млекопитающих, рыб и амфибий. Помимо этого автором изучено эмбриональное кроветворение в яйцах на разных этапах развития и выявлены критические периоды (8-11-е, 16-18-е сутки) и закономерности их появления, которые сопровождаются гипогликемией, снижением прироста массы зародыша, снижением числа эритроцитов, лейкоцитов и количества гемоглобина в крови. В качестве критериев развития она использует такие важные показатели, как масса тела и органов эмбриона, скорость её прироста, динамику эритро- и лейкопоэза. Автор изучает и закономерности развития провизорных органов и обмен веществ у развивающегося эмбриона. Ею установлено содержание сахара в яйце и крови, гликогена - в печени и мышцах и каталазы - в крови КЭ в процессе развития. Освещена роль провизорных органов - аллантоиса и

амниона в транспорте солей кальция из скорлупы в зародыш со второй половины инкубации. Так же указывается, что ионы кальция используются не только для построения скелета развивающегося зародыша, но и поддерживают ионное равновесие в амниотической жидкости и возбудимость гладких мышц данного органа.

В.В. Рольник (1968) использует комплексный подход, уделяя внимание вопросам эмбрионального развития временных органов, системам кровообращения, дыхания и пищеварения, нервной и половой систем, развитию мускулатуры, скелета и желёз внутренней секреции. Так же приводятся возрастные признаки куриного эмбриона, характеризующие морфологическое развитие зародыша.

И.И. Шмальгаузен (1984), изучая закономерности роста и дифференцировки на примере КЭ, установил, что скорость роста в процессе его развития, начиная с первых суток инкубации, постоянно снижается