Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика АТФазной активности в субклеточных структурах тканей куриных эмбрионов

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Динамика АТФазной активности в субклеточных структурах тканей куриных эмбрионов"

На правах рукописи

РЕВИНА АННА БОРИСОВНА

ДИНАМИКА АТФазной АКТИВНОСТИ В СУБКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУРАХ ТКАНЕЙ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005044131

Курск-2012

1 7 МАЙ 2012

005044131

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия им. проф. И.И.Иванова»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Рыжкова Галина Федоровна

Ярован Наталья Ивановна, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет», зав. кафедрой химии;

Фурман Юрий Васильевич, доктор биологических наук, профессор, Курский институт социального образования (филиал РГСУ), декан факультета социальной работы, педагогики и психологии

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» РАСХН

МОиЯ 2012 года в ¿0

часов

Защита состоится « 30» на заседании диссертационного совета Д 220.040.03 при ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И.Иванова» по адресу: Россия, 305021, г. Курск, ул. К.Маркса, 70. Тел. (4712)53-13-30, факс (4712)53-84-36.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова».

Автореферат разослан «

_» Ш 2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Рыжкова Г.Ф.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инкубационные качества яиц зависят от множества факторов, как внешних, так и внутренних. Одним из важнейших является биологическая полноценность яиц, не в последнюю очередь зависящая от адекватного транспорта всех необходимых для эмбриона питательных веществ, в особенности таких компонентов, как витамины, аминокислоты, моносахариды, макро- и микроэлементы, содержание которых играет исключительно важную роль в эмбриональном развитии птицы. В связи с этим, разработка биохимии транспорта питательных веществ - задача, непосредственно связанная с практическими путями улучшения качества яиц.

По мнению ряда исследователей, важными показателями оценки предрасположенности птицы к ускоренному росту можно считать выводимость яиц, массу суточных цыплят и продолжительность эмбриогенеза. В последнее время к этим параметрам прибавился ещё один - эффективность использования эмбрионами питательных веществ яиц. Он, очевидно, является наиболее важным, хотя до настоящего времени не получил должного распространения и находится на стадии изучения.

Современные достижения молекулярной биологии, особенно за последние годы, связаны с изучением биологических мембран и транспортных АТФаз, которые классифицируются по переносимым ими ионам. Транспортные АТФазы, встроенные в биологические мембраны, образуют ионные насосы, изучение которых является ведущей проблемой целого ряда лабораторий.

Хотя в последнее время накоплено много материала по проблемам ионного транспорта и функционированию АТФаз, в доступной нам научной литературе функционирование транспортных аденозинтрифосфатаз в мембранных структурах различных органов и тканей куриных эмбрионов, а также многие вопросы, связанные с особенностями образования и утилизации энергии на различных стадиях эмбрионального развития животных и, в частности птиц, почти не освещено.

Кроме того, одним из малоизученных и интересных аспектов развития куриного эмбриона является изучение особенностей его реакции на действие вирусов, вероятность контакта с которыми в процессе жизни у птицы велика.

Цель и задачи исследований. Целью работы явилось изучение активностей транспортных АТФаз в субклеточных структурах тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов в онтогенезе и после введения вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота.

В задачи исследований входило:

• Определить активность транспортных АТФаз Ыа+, К+ -;

М§2+ , Са2+ -; НСОз") в митохондриальной и ядерной субклеточных фракциях тканей (скелетной мускулатуры, печени, желудка, головного мозга) 10-17-ти суточных куриных эмбрионов в онтогенезе и провести сравнительный анализ полученных результатов;

• Установить взаимосвязь между АТФазной активностью и временем закладки внутренних органов;

• Определить содержание белка в митохондриальной и ядерной субклеточных фракциях тканей (скелетной мускулатуры, печени, желудка, головного мозга) 10-17-ти суточных куриных эмбрионов в онтогенезе и провести сравнительный анализ полученных результатов;

• Установить влияние вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота, на активность транспортных АТФаз и содержание общего белка в митохондриальной и ядерной фракциях тканей куриных эмбрионов;

• Исследовать взаимосвязь между АТФазной активностью и содержанием общего белка в митохондриальной и ядерной субклеточных фракциях тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов.

Научная новизна. Впервые изучена динамика функционирования транспортных ионных насосов (М§ , К+ -; М^ , Са2+ -; НС03" -АТФаз) в митохондриальных и ядерных субклеточных фракциях тканей (скелетной мускулатуры, печени, желудка, головного мозга) 10-17-ти суточных куриных эмбрионов в онтогенезе и при введении- вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота; установлена взаимосвязь между АТФазной активностью и временем закладки внутренних органов; определены наиболее критические сроки развития куриного эмбриона по отношению к вирусу; выявлена корреляционная зависимость между АТФазной активностью и содержанием общего белка в субклеточных фракциях тканей куриных эмбрионов.

Практическая и теоретическая значимость работы. Проведённые исследования раскрывают особенности изменений АТФазной активности в субклеточных фракциях тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов на различных стадиях эмбрионального развития и позволяют установить взаимосвязь между данными показателями и временем закладки внутренних органов.

Полученные результаты о взаимосвязи содержания белка и АТФазной активности в тканях 10-17-ти суточных куриных эмбрионов могут быть использованы для дальнейшей разработки биохимических тестов, позволяющих оценить состояние обмена веществ и степень пригодности инкубируемого яйца для изготовления эмбриональных иммунобиологических препаратов.

Полученные данные дополняют и расширяют общеизвестные представления об эмбриогенезе птиц и могут быть использованы в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных занятий по биохимии и эмбриологии.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Активность транспортных ферментных систем (М§2+, К+ -; М8 , Са -; НСОз- - АТФазы) и содержание общего белка в митохондриальной и ядерной субклеточных фракций тканей (скелетной мускулатуры, печени, желудка, головного мозга) куриных эмбрионов в онтогенезе;

2. АТФазная активность митохондриалыюй и ядерной субклеточных фракций тканей (скелетной мускулатуры, печени, желудка, головного мозга) куриных эмбрионов, заражённых вирусом болезни Ньюкасла;

3. Взаимосвязь между АТФазной активностью и временем закладки внутренних органов куриных эмбрионов;

4. Корреляционная связь между АТФазной активностью и содержанием общего белка в субклеточных фракциях тканей куриных эмбрионов.

Апробация работы и публикации. Основные материалы диссертационной работы доложены на научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава, научных работников и аспирантов Курской государственной сельскохозяйственной академии им. проф. И.И.Иванова в 2009-2011 годах, XII международной научно-практической конференции «Новейшие достижения Европейской науки» (София, 2011г.), международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Агропромышленный комплекс: контуры будущего» (Курск, КГСХА, 2011г.)

По материалам диссертации опубликовано ? научных работ, из которых 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 135 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 29 рисунками, 30 таблицами, и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы. Список литературы включает 224 источника, в том числе 84 — иностранных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования проводились в лаборатории кафедры физиологии и химии Курской государственной сельскохозяйственной академии им. проф. И.И. Иванова и в отделе эмбриональных вакцин № 1 ФГУП «Курская биофабрика».

Для опыта использовались биологически полноценные яйца, полученные от кур ФГУП «Щёлковский биокомбинат» для целей вакцинного производства Курской биофабрики. Всего было проинкубировано 400 яиц, из них исследовано 320 яиц.

Яйца инкубировали в инкубаторе «Универсал-55» по режиму и технологии, принятым на производстве с учетом инструкции по инкубации яиц сельскохозяйственных птиц (при температуре 37,5±0,5 °С; влажности 50 - 54 %).

Материалом исследования явились ткани заражённых и незаражённых 10-17-суточных эмбрионов. Для биохимических исследований использовали органы и ткани: головной мозг, печень, желудок и мышцы, полученные путём декапитации эмбрионов. Органы промывали физиологическим раствором, взвешивали и гомогенизировали в 2,5 объёмах 0,25 М сахарозы.

Субклеточные фракции органов и тканей получали методом дифференциального центрифугирования (Робертис Э., 1967; Мосс Д.В., Баттер-вортП.Дж., 1978; Оборотова T.A., 1979) (рис. 1).

i Разрушение митохондрий ] I методом трёхкратного замо- ; : ражипания-оттаивания ;

Рис. 1. Схема выделения субклеточных фракций методом дифференциального центрифугирования

Активности Mg2+,K+,Na+-, Mg2+,Ca2+- и НС03" -АТФаз определяли по приросту неорганического фосфата, отщепившегося от АТФ под действием АТФазы, в средах, рекомендованных в работе Иващенко А.Т., Бушне-вой И.А. (1981). Содержание неорганического фосфата в субклеточных фракциях тканей 10-17-суточных эмбрионов определяли модифицированным методом Chen et al. (1957). Белок определяли биуретовым микрометодом.

Статистическую обработку данных производили на ПК с помощью программы Excel из пакета прикладных программ MS Office 2003. Результаты представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки с использованием t-критерия Стьюдента. Различия рассматривались как достоверные при Р<0,05.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Содержание белка в субклеточных фракциях тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов

Проведёнными исследованиями установлено, что в митохондриаль-ной субклеточной фракции тканей печени и желудка наблюдается уменьшение количества общего белка с 10-х по 17-е сутки инкубации. В тканях скелетной мускулатуры и головного мозга с 10-х суток инкубации также отмечается снижение содержания белка вплоть до 15-х суток, однако далее, к 17-м суткам, происходит некоторое его накопление (рис. 2).

10 11 12 13 14 15 16 17 Возраст эмбрионов, сут

10 11 12 13 14 15 16 17 Возраст эмбрионов, сут

12 13 14 15 Вшраст эмбрионов, сут

- - Митохондриальная субклеточная фракция

- - Ядерная субклеточная фракция

Рис. 2. Содержание белка (мг/г ткани) в субклеточных фракциях тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов

В ядерной фракции в ткани скелетной мускулатуры с 10-х по 11-е сутки инкубации куриных эмбрионов отмечается резкое снижение количества белка (в 33 раза). Затем вплоть до 17-х суток инкубации существенных изменений в содержании общего белка не происходит. Не обнаружено существенных изменений количества белка и в ядрах тканей желудка за исследуемый период инкубации. В ткани головного мозга ядерной субклеточной фракции, также, как и в митохондриапьной, увеличение уровня белка наблюдается с 15-х по 17-е сутки инкубации. Скачкообразные изменения содержания белка регистрируются в ткани печени.

Согласно графикам, в исследуемых тканях, за исключением ткани печени, в ядерной субклеточной фракции количество белка ниже, по сравнению с митохондриальной. Особенно это заметно на тканях головного мозга (рис. 2).

3.2. АТФазная активность субклеточных фракций тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов

Анализ результатов исследований активности изучаемых ферментных систем в митохондриях скелетной мускулатуры куриных эмбрионов показал, что первый пик ферментативной активности всех исследуемых АТ-Фаз приходится на 13-е сутки, второй пик ]У^2+,К+,Ма+- и 1У^2+,Са2+- АТ-Фаз отмечается на 15-е сутки и превышает показатель активности НС03" -АТФазы в этот период в 1,6 раза (рис. 3).

х 1,000 2 :

^ 0,600 « \ ■¡н |||||2

г / \ /

■■■

10 11 12 13 14 15 16 17 Возраст эмбрионов, суг

ядра

я пт _

| 6,000 1 ш ч 5,000 4-

¡¡¡я

1 4,000 1

3 3,000 | V >Ж' МЯЩ!

5 2,000 I - /

Х 1.000 1 0,000 1

10 11 12 13 14 15 16 17

Возраст эмбрионов, суг

--М§2+,1Ча+,К+-АТФаза;--Мд2+,Са2+-АТФаза;

...................- - НСО3 -АТФаза

Рис. 3. АТФазная активность тканей скелетной мускулатуры 10-17-ти суточных куриных эмбрионов

В ядерной же фракции значительное увеличение активности всех видов АТФаз наблюдается с 10-х по 11-е сутки (в 11,4 раза) и с 14-х по 16-е сутки (в 14,2 раза), достигая пика на 11-е и 16-е сутки. Таким образом, в динамике активности данных ферментных систем ядерной субклеточной фракции скелетной мускулатуры куриных эмбрионов существенных различий не наблюдается (рис. 3).

Исследование активности транспортных ионных насосов в митохонд-риях+ печени показало, что у куриных эмбрионов активность общей (М§ ,К ,№+-) и анионной (НС03") АТФазы достигает своего максимального значения к 15-тым суткам. У 1\^2+,Са2+- АТФазы следует выделить два пика ферментативной активности - 12-е и 14-е сутки инкубации. Именно 14-15-е сутки являются критическими для развития эмбрионов с максимумом смертности (рис. 4).

В ядерной же фракции печени в отличие от митохондриальной наблюдается значительное снижение активности всех изучаемых АТФаз с небольшим подъёмом на 15-е сутки (рис. 4).

. |Г|....... П ______ ~ __ ____ ш

10 11 12 13 И 15 16 17 Возраст эыбриомов, оуг

2,000

. • ..... .......

1,000 ИМЯ ...... ___________

0,500

0,000

10 11 12 13 14 15 16 17

-- М§2+,Ыа+,К+-АТФаза; - -М§2+,Са2+-АТФаза;

- - НСО3 "-АТФаза

Рис. 4. АТФазная активность тканей печени 10-17-ти суточных куриных

эмбрионов

Анализируя активность ионной транспортной системы в митохондриях тканей желудка куриных эмбрионов, можно отметить, что активность исследуемых транспортных АТФаз, особенно анионной, постепенно увеличивается, достигая максимального значения к 13-м суткам, затем на 14-е сутки инкубации регистрируется наименьшее значение этих показателей и дальнейшее постепенное увеличение к 16-м суткам. Это, по-видимому, связано с тем, что у кур плодный период длится с 13-х по 19-е сутки и, в отличие от предплодного, в течение которого происходит быстрый рост временных органов зародыша, в плодном периоде имеет место более быстрый рост его постоянных органов, к таковым, в частности, относится функциональная деятельность желудочно-кишечного тракта, сопровождаемая интенсивным развитием пищеварительных желез (рис. 5).

митохондрии

10 11 12 13 14 15 16 17 Возраст эмбрионов, оуг

1.600

1,400

а 1.200 а

I 0,800

I 0,600

Х 0,400

X

0,200 0,000

10 11 12 13 14 15 16 17 Возраст эмбрионов, суг

7,000

х 6,000 х

в 5'°°°

| 4,000 £

I 3,000

£ 2,000 г

* 1,000

- - М82+№+,К+-АТФаза;--М£2+,Са2+-АТФаза;

-------------- - НСО3 -АТФаза

Рис. 5. АТФазная активность тканей желудка 10-17-ти суточных куриных

эмбрионов

В ядерной же фракции тканей желудка пики активности данных АТ-Фаз приходятся на 11-е сутки, причём максимальную активность проявляет^ НС03" - АТФаза, и на 15-е сутки - здесь следует выделить М§ +,Са"+- АТФазу. Подобные различия исследуемых ферментных систем митохондриальной и ядерной субклеточных фракций можно объяснить тем, что происходит изменение энергетических потребностей клеток, определяемых неравномерностью скорости роста на разных этапах онтогенеза, а также изменение активности механизмов поддержания ионной асимметрии клеток (рис. 5).

Анализируя активность ионных транспортных систем в митохондриях головного мозга куриных эмбрионов, можно отметить, что в динамике активностей всех изучаемых АТФаз наиболее значительных подъёмов и спадов не наблюдается, идёт постепенный их рост с 10-х по 17-е сутки. Наибольшее увеличение М§2+,К",Ка+- и НСО, " - АТФазной активности регистрируется на 12-е и 16-е сутки, а М£2+,Са2 - АТФазы - на 13-е и 16-е сутки инкубации (рис. 6).

В ядерной фракции тканей головного мозга максимальные значения АТФазной активности приходятся на 13-е и 15-е сутки инкубации куриных эмбрионов. Следует отметить, что показатели анионной АТФазы на 13-е+и 15-е сутки инкубации достоверно выше, чем М§2+, К+ - и ЗУ^ +,Са т - АТФаз в 1,3 и 1,8 раз соответственно. Таким образом, можно предположить, что поскольку 13-15-е сутки являются критическими для развития эмбрионов, то изменение биоэнергетики в этих субклеточных структурах в сторону увеличения в процессе онтогенеза могут являться критерием, характеризующим преобразование функциональных возможностей организма на рубежах, разделяющих периоды индивидуального развития (рис. 6).

митохондрии

10 11 12 13 14 15 16 17 Возраст эмбрионов, сут

20,000 18,000 | 16,000 £ 14.000 2 12,000 I 10,000

I в.000 £ 8.000 ? 4.000 2,000

10 11 12 13 14 15 16 17 Возраст эмбрионов, сут

- - М£2+,Ыа+,К+-АТФаза;--М§2+,Са2+-АТФаза;

-НСО3 -АТФаза

Рис. 6. АТФазная активность тканей головного мозга 10-17-ти суточных

куриных эмбрионов

3.3. Сравнительная оценка АТФазной активности митохондриальной и ядерной субклеточных фракций различных тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов

Максимальную активность в митохондриальной фракции скелетной мускулатуры проявляет Мц2+,К+^а+ - АТФаза, в печени - Мя +,Са + -АТФаза. Минимальная активность в этих же тканях наблюдается у анионной АТФазы. В желудке и головном мозге наиболее активна НС03" -АТФаза, а наименее активна М§2+,Са2+ - АТФаза (табл. 1).

Таблица 1 - Активность транспортных АТФаз митохондриальных субклеточных фракций тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов

Вид ткани Активность транспортных АТФаз (нМ Р1/мг белка/мин)

Мй2+,К+,Ыа+ - АТФаза Мк2+,Са2+- АТФаза НСО3--АТФаза

Мышцы 5Д67±0,090 5,087±0,249 4,598±0,150

Печень 9,573±0,212 10,061±0,393 8,994±0,328

Желудок 4,23 8±0,308 4,010±0,353 4,500±0,268

Головной мозг 13,128±0,332 11,531±0,183 14,611±0,191

По показателю АТФазной активности митохондриальной субклеточной фракции исследуемые ткани располагаются в следующей последовательности: головной мозг > печень > скелетная мускулатура > желудок.

Это можно объяснить тем, что различные органы у эмбрионов закладываются в разное время и имеют неодинаковую скорость роста.

Уже ко вторым суткам инкубации куриного эмбриона передний отдел нервной трубки представляет собой зачаток головного мозга. Эмбриональный мозг разделяется перетяжками на передний, средний и задний мозговые пузыри. Передний мозг образует боковые выпячивания - зачатки глазных пузырей. Задний мозговой пузырь без резкой границы переходит в спинной мозг.

Ткани печени принадлежит весьма важное место в обменных процессах в эмбриогенезе. Печень появляется на третьи сутки инкубации в виде двух выростов закладки печеночных протоков, к концу пятых суток печень представляет собой уже крупный орган. На 10-е сутки инкубации печень эмбриона оказывается самым крупным органом брюшной полости.

С 13-х по 19-е сутки инкубации в обменных процессах начинают принимать участие системы органов желудочно-кишечного тракта, что сопровождается интенсивным развитием пищеварительных желез. Однако железистый отдел желудка начинает функционировать не ранее 19-х суток инкубации, после втягивания желточного мешка в брюшную полость.

Махинько В.В. (1966) установил, что позднее закладывающиеся органы растут быстрее тех, которые образовались раньше. Так, мышцы и сердце (органы, обладающие высокой скоростью роста) характеризуются более низким уровнем тканевого дыхания, чем печень и мозг (органы с меньшими темпами роста), и поэтому в мышцах отмечается более низкая АТФазная активность, что свидетельствует о снижении энергетического обмена.

Как видно из таблицы 2, в скелетной мускулатуре ядерной субклеточной фракции, также, как и в митохондриальной, наибольшую активность проявляет М§2+,К+,На+ - АТФаза, а наименьшую - анионная. В печени,

желудке и головном мозге ведущее место занимает НС03" - АТФаза, а наименьшей активностью в этих органах обладает М§2+,Са2+ - ферментативная система.

По показателю АТФазной активности ядерной субклеточной фракции исследуемые ткани располагаются в следующей последовательности: головной мозг > скелетная мускулатура > желудок > печень.

Таблица 2 - Активность транспортных АТФаз ядерных субклеточных фракций тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов_

Вид ткани Активность транспортных АТФаз (нМ Рі/мг белка/мин)

М^ГЖ-АТФаза ї^2+,Са2+-АТФаза НСО3"- АТФаза

Мышцы 27,119±2,652 26,823± 1,293 25,861±1,322

Печень 8,808±0,253 8,787±0,130 9,025±0,299

Желудок 22,115±0,674 21,693±0,477 22,706±0,797

Головной мозг 44,098±0,984 38,073±2,383 54,490±2,536

Метаболические процессы в ядре менее изучены, чем в митохондриях. Известно, что в ядре присутствует около 40 различных ферментов. Важнейшая функция ядер - репликация ДНК и транскрипция генетической информации на нити матричной РНК. Ядра способны генерировать энергию в форме АТФ путём гликолиза, что, вероятно, является источником энергии для репликации и транскрипции нуклеиновых кислот. Поэтому несмотря на то, что основные окислительные процессы и аккумуляция энергии сосредоточены в митохондриях, можно предположить, что у интенсивно растущего организма (или ткани) более высокие (в 3-5 раз) показатели АТФазной активности у 10-17-ти суточных куриных эмбрионов отмечаются именно в ядерной субклеточной фракции.

Сопоставив данные ферментативной активности Са2+ - и анионной АТФаз видно, что в ядерной субклеточной фракции, в отличие от митохондриальной, наименьшим показателем активности исследуемых ионных насосов обладает печень. Это может быть связано с тем, что печень - орган, который формируется быстрее остальных представленных и начинает полноценно функционировать раньше других и, следовательно, ферментативная активность на ядерном уровне быстро снижается.

3.4. Активность ]У^2+,К+,Ш+- АТФазы митохондриальной и ядерной субклеточных фракций различных тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов, после введения вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота

Одним из малоизученных и интересных аспектов развития куриного эмбриона является изучение особенностей его реакции на многочисленные вирусы, вероятность контакта с которыми в процессе жизни у птицы велика.

Однако сведений об исследованиях, связанных с изучением особенностей работы ионных насосов куриного эмбриона под действием вирусного агента, в доступной литературе найти не удалось.

Одним из наиболее опасных вирусных заболеваний, наносящих огромный ущерб птицеводству, является болезнь Ньюкасла, характеризую-

щаяся пневмонией, энцефалитом и поражениями внутренних органов. Несмотря на то, что природа этого заболевания была выяснена сравнительно давно, многие вопросы, связанные с ее ликвидацией, требуют дальнейшего изучения.

В этой связи представляется интересным изучение клеточной проницаемости и ионного транспорта электролитов в митохондриальной и ядерной субклеточных фракциях внутренних органов куриных эмбрионов, зараженных вирусом болезни Ньюкасла (штамм Ла-Сота), в динамике. Заражали 9-ти суточных куриных эмбрионов в аллантоисную полость. Для сравнения изучали активность только общей АТФазы.

Анализ результатов исследований общей АТФазной активности в митохондриях тканей скелетной мускулатуры показал, что пики активности, приходящиеся на 13-е и 15-е сутки инкубации, у эмбрионов после введения вируса болезни Ньюкасла достоверно ниже в 1,5 раза. К 17-м суткам показатели исследуемой ферментной системы снижаются примерно до одного уровня (рис. 7).

1,200

| 1,000 т

и 0,600

5 о,боо

г 0,400

Е 0.200 0,000

митохондрии

12 13 14 15 16 Возраст эмбрионов, с/т

-Незаргжённые куриные эмбрионы - Заражённые куриные эмфионы

7,000

% 6,000 -I

X I

« 5,000 |

с 4,000 4

« I

" 3,000

| 2,000 I | 1,000 | 0,000 I

ядра

10 11 12 13 14 15 16 17 Возраст эмбрионов, сут

- Неэараженные куриные эмбрионы

- Зараженные куриные эмбрионы

Рис. 7. Активность ]У^2+,К+,Ма+ - АТФазы тканей скелетной мускулатуры 10-17-ти суточных куриных эмбрионов в норме и после введения вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота

В ядерной субклеточной фракции тканей скелетной мускулатуры у куриных эмбрионов после введения вируса болезни Ньюкасла до 14-х суток инкубации существенных различий в АТФазной активности по сравнению со здоровыми эмбрионами не наблюдается. Однако, начиная с 15-х и до 17-х суток инкубации происходит некоторое подавление ферментативной активности (рис. 7).

Анализ активности общей АТФазы в митохондриях тканей печени показал, что с 13-х по 15-е сутки инкубации у заражённых куриных эмбрионов отмечается рост данного показателя, достигая максимального значения на 14-е и 15-е сутки, но по сравнению с контрольными эмбрионами, эти показатели достоверно ниже. Но, прослеживая динамику, можно отметить, что именно на эти же сутки приходится наибольшее снижение ферментативной активности у заражённых эмбрионов (рис. 8).

В ядерной фракции печени у заражённых и незаражённых 10-17-ти суточных куриных эмбрионов отмечается схожая динамика 1\^2+,К+,Ка+-АТФазной активности. Достоверное снижение ферментативной активности у заражённых эмбрионов приходится на 11-е, 13-е, 15-е и 16-е сутки инкубации (рис. 8).

Незараженные куриные эмбрионы » Зараженные куриные эмбрионы

митохондрии

-Незаражёниые куриные эмбрионь - Заражённые куриные эмбрионы

2,500

* 2,000 со

1 1,500 о

V)

£ 1,000

£ 0,500 £ х

0,000

10 11 12 13 14 15 16 17 Возраст эмбрионов, сут

Возраст эмбрионов, сут

1,800

£ 1,600

1 1,400 ш

„ 1,200 | 1,000 ® 0,800 I 0,600

Е 0,400 1 0,200 0,000

Рис. 8. Активность М£2+.К+,Ма+ - АТФазы тканей печени 10-17-ги суточных куриных эмбрионов в норме и после введения вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота

Анализ полученных данных показал, что в активности общей АТФазы тканей желудка у куриных эмбрионов как в норме, так и после введения вируса болезни Ньюкасла, прослеживается аналогичная динамика данных показателей. При этом пик АТФазной активности, приходящийся на 13-е сутки у заражённых эмбрионов, ниже в 2 раза, чем у незаражённых. К 17-м суткам значения активности исследуемой АТФазы у заражённых и незаражённых куриных эмбрионов становятся максимально приближенными (рис. 9).

-•— Незараженные куриные эмбрионы Заражённые куриные эмбрионы

-♦— Незараженные куриные эмбрионы »■- Зараженные куриные эмбрионы

митохондрии

1,21)0

X

I 1,000 " 0,800 | 0,600 | 0,400 г 0,200 0,000

10 11 12 13 14 15 16 17 Возраст эмбрионов, сут

6,000 I 5,000 « 4.000

1 3,000 5 2,000

2 1,000 1 0,000

10 11 12 13 54 15 16 17

Возраст эмбрионов, сут

Рис. 9. Активность М£2+,К+,Ка+ - АТФазы тканей желудка 10-17-ти суточных куриных эмбрионов в норме и после введения вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота

В ядерной фракции тканей желудка в обеих группах с 10-х по 11-е сутки инкубации наблюдается 3-х кратное увеличение М§2+,К+,Ка+ - АТ-Фазной активности. Затем отмечается её спад вплоть до 14-х суток - у здоровых эмбрионов и до 15-х суток - у заражённых. Угнетение общей ферментативной активности у заражённых куриных эмбрионов прослеживается, начиная с 15-х суток инкубации (рис. 9).

В тканях головного мозга куриных эмбрионов после введения вируса с 10-х по 13-е сутки инкубации отмечается некоторый рост исследуемой ферментативной активности. Затем, в отличие от незаражённых эмбрионов, к 15-м суткам происходит заметное снижение данного показателя, и затем АТФазная активность растёт, достигая значения незаражённых куриных эмбрионов. Следует отметить, что с 14-х по 16-е сутки под действием вируса происходит значительное подавление активности фермента по сравнению с контролем (рис. 10).

митохондрии ядРа

2,500 I 2СОО-

т

1 ',500 -

а

ю

5 1,000-^ 0,500 ■

т

0,000 -

11 12 13 14 15 16 Возраст эмбрионов, сут

-Незараж&нные куриные эмбрионы - Заражённые куриные эмбрионы

16,000 * 14,000 - • о 12,000 ™ 1 П Г|."П ............................................

С ' " ■ . V й лпп I < л-■'..»>■'.. <'• -•■ ■ >. /..->:. ; ,:>У.

Ю ] / у.1 У а 6,000 £ 4,000 ¡^Щ^йШ^тИМ'"!!' 2 О ППП И!'|М1-| 1114■•цп'.^Г..:......И . п и.мг щ.н-иищипи 1111111■ ■

0,000 "

10 11 12 13 14 15 16 17 Возраст эмбрионов, с/г

- Незаражанные куриные эмбрионы

- Зараженные куриные эмбрионы

Рис. 10. Активность М§2+,К+,Ма+ - АТФазы тканей головного мозга 10-17-ти суточных куриных эмбрионов в норме и после введения вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота

В ядерной фракции тканей головного мозга у эмбрионов после введения вируса болезни Ньюкасла, в отличие от здоровых, с 10-х по 11-е сутки инкубации наблюдается 5-ти кратный рост №+, К+ - АТФаз-ной активности; затем происходит её постепенное снижение. Следует отметить, что достоверное подавление активности по сравнению с неза-ражёнными эмбрионами приходится на 13-е, 15-е и 16-е сутки инкубации (рис. 10).

3.5. Корреляционная связь АТФазной активности с содержанием белка в тканях 10-17-ти суточных куриных эмбрионов

На основании экспериментальных значений АТФазных активностей и содержания белка были установлены коэффициенты корреляции.

При анализе корреляционных связей в зависимости от вида АТФазы в митохондриальной субклеточной фракции в соответствии с табл. 3, можно сделать следующие выводы: белок в тканях скелетной мускулатуры

находится в слабой положительной связи с анионной АТФазой и в слабой отрицательной связи с М§2+, Иа+, К+ - и М§2+,Са2+ - АТФазами. В желудке белок находится в слабой положительной связи со всеми видами АТФаз. В достаточно выраженной положительной связи находится белок со всеми видами АТФаз в тканях печени и головного мозга.

Таблица 3 - Сводная таблица коэффициентов корреляции содержания белка с АТФазной активностью в митохондриальной субклеточной фракции тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов__

Наименование ткани Скелетная мускулатура Печень Желудок Головной мозг

Активность АТФаз -0,172 0,644* 0,107 0,623*

М82+,Са2+- -0,285 0,437 0,184 0,591

НС03-- 0,289 0,696* 0,187 0,289

(* Р<0,05)

У 10-17-ти суточных куриных эмбрионов в ядерной субклеточной фракции (табл. 4) корреляция всех видов АТФаз с содержанием белка -отрицательная. Наиболее выражено она проявляется в тканях скелетной мускулатуры и печени.

Таблица 4 - Сводная таблица коэффициентов корреляции содержания белка с АТФазной активностью в ядерной субклеточной фракции тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов_____

Наименование ткани Скелетная мускулатура Печень Желудок Головной мозг

Активность АТФаз Мё2+,Ыа\К+- -0,775* -0,920* -0,529 -0,336

Мё2+,Са2+- -0,803* -0,919* -0,349 -0,185

НС03'- -0,662* -0,923* -0,494 -0,425

С Р<0.05)

выводы

1. Активность транспортных АТФаз в митохондриальной и ядерной субклеточных фракциях тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов зависит не только от функционального состояния живого организма, но и от интенсивности формирования его структур, а следовательно, биосинтеза веществ, участвующих в образовании структурно-функциональных элементов.

2. За выбранный период инкубации куриных эмбрионов наибольшую активность как в митохондриальной, так и в ядерной субклеточных фракциях в тканях скелетной мускулатуры проявляет +,Ыа+,К+ - АТФаза, в тканях желудка и головного мозга - НС03" - АТФаза, в тканях печени в митохондриальной субклеточной фракции - К^2+,Са2+- АТФаза, а в ядерной - НС03" - АТФаза.

3. По показателям активности всех видов транспортных АТФаз в митохондриальной субклеточной фракции 10-17-ти суточных куриных эмбрионов, исследуемые ткани располагаются в следующей последовательности: головной мозг > печень > скелетная мускулатура > желудок.

4. По показателям АТФазной активности ядерной субклеточной фракции 10-17-ти суточных куриных эмбрионов, исследуемые ткани располагаются в следующей последовательности: головной мозг > скелетная мускулатура > желудок > печень.

5. Заражение куриных эмбрионов вирусом болезни Ньюкасла приводит к достоверному снижению активности общей (1У^2+,Ка+,К+ -) АТФазы в митохондриях исследуемых тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов: головном мозге - на 15,23 %; печени - на 6,90 %; мышцах - на 9,49 %; желудке - на 22,64 %. В ядерной субклеточной фракции введение вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота не вызывает достоверного снижения общей АТФазной активности в исследуемых тканях.

6. По содержанию общего белка в митохондриальной субклеточной фракции ткани 10-17-ти суточных куриных эмбрионов располагаются в следующей последовательности: желудок > печень > головной мозг > скелетная мускулатура.

7. По содержанию общего белка в ядерной субклеточной фракции ткани 10-17-ти суточных куриных эмбрионов располагаются в следующей последовательности: печень > желудок > скелетная мускулатура > головной мозг.

8. В митохондриальной субклеточной фракции достоверная +положи-тельная связь белка регистрируется: в ткани печени - с М§ +, Иа+, К+ (г = 0,644)- и НСОз' (г = 0,696) - АТФазами и в ткани головного мозга - с Г^2+,

К+ - АТФазой (г = 0,623). В ядерной субклеточной фракции достоверная отрицательная связь белка в тканях скелетной мускулатуры и печени - с Ме2+,Ка+,К+ - АТФазой (г = -0,775 и -0,920 соответственно), с М£2+,С<?+ - АТФазой (г = -0,803 и -0,919 соответственно) и с НС03" - АТФазой (г = -0,662 и -0,923 соответственно).

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Полученные данные о взаимосвязи содерггания белка и АТФаз-ной активности в тканях 10-17-ти суточных куриных эмбрионов могут быть использованы для дальнейшей разработки биохимических тестов, позволяющих оценить состояние обмена веществ и степень пригодности инкубируемого яйца для получения вакцин в биопромышленности.

2. Материалы диссертационной работы рекомендуется использовать в прикладных биологических исследованиях и в учебном процессе.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

* - работы, опубликованные в рекомендованных ВАК РФ изданиях

1. Ревина А.Б. АТФазная активность митохондрий мышц и печени куриных эмбрионов, зараженных вирусом болезни Ньюкасла, в динамике / А.Б. Ревина, Г.Ф. Рыжкова // Научное обеспечение агропромышленного производства: мат-лы междунар. научн.-практич. конф., г. Курск, 20-22 января 2010 г., ч. 3 - Курск, 2010. - С. 42-46.

2. *Рыжкова Г.Ф. Активность транспортных ферментных систем в тканях куриных эмбрионов в динамике / Г.Ф. Рыжкова, А.Б. Ревина // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. -2010. -№3.- С. 47-50.

3. Ревина А.Б. Активность анионной (НС03") в субклеточных фракциях тканей куриных эмбрионов / А.Б. Ревина, Г.Ф. Рыжкова // Наука и инновации в сельском хозяйстве: мат-лы междунар. научн.-практич. конф., г. Курск, 26-28 января 2011 г., ч. 3 - Курск: Изд-во Курск.гос.с,-х.ак., 2011.-С. 179-183.

4. * Ревина А.Б. АТФазная активность в митохондриальных и ядерных фракциях тканей куриных эмбрионов в динамике / А.Б. Ревина, Г.Ф. Рыжкова // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2011. - № 2. - С. 67-69.

5. * Ревина А.Б. АТФазная активность в митохондриальных фракциях тканей куриных эмбрионов норме и при введении вируса болезни Ньюкасла / А.Б. Ревина, Г.Ф. Рыжкова, О.В. Солдатенкова // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2011. - № 4. - С. 74-76.

6. Рыжкова Г.Ф. АТФазная активность в митохондриальных фракциях мышечной и мозговой тканей куриных эмбрионов в динамике / Г.Ф. Рыжкова, А.Б. Ревина // Новейшие достижения европейской науки: мат-лы VII междунар. научн.-практич. конф., г. София, 17-25 июня 2011 г., Т. 33 - Изд-во «Бял ГРАД-БГ» ООД 2011. - С. 32-35.

7. Ревина А.Б. Динамика АТФазной активности в митохондриальных субклеточных фракциях тканей куриных эмбрионов / А.Б. Ревина // Агропромышленный комплекс: контуры будущего: мат-лы междунар. на-учн.-практич. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых, г. Курск, 911 ноября 2011 г., ч. 2 - Курск: Изд-во Курск.гос.с.-х.ак., 2012. - С. 113115.

Формат 60x84 1/16. Бумага для множительных аппаратов.

Печать на копировальном аппарате КГСХА. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 106.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ревина, Анна Борисовна, Курск



Федеральное государственное Ьюджетное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» (ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА»)

На правах рукописи

РЕВИНА АННА БОРИСОВНА

ДИНАМИКА АТФазной АКТИВНОСТИ В СУБКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУРАХ ТКАНЕЙ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор Г.Ф. Рыжкова

Курск - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности эмбрионального развития кур.................................11

1.2. Энергетический обмен в тканях куриных эмбрионов......................26

1.3. Структура и функции субклеточных структур..............................27

1.4. Роль биологических мембран и встроенных в них транспортных ферментных систем в процессах обмена веществ и энергии...................31

1.5. Транспортные АТФазы, их биологическая функция и активность......33

1.5.1. К+ - АТФаза её роль в активном транспорте веществ через клеточные мембраны и активность......................................................34

1.5.2. Структура и биологическая роль - АТФазы...........................38

1.5.3. Структура и биологическая роль

Са - АТФазы............................39

1.5.4. Аниончувствительная АТФаза и её роль в процессах энергообеспечения клеток............................................................................42

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объект исследования..............................................................44

2.2. Методика выделения субклеточных фракций................................44

2.3. Методы биохимических исследований........................................47

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Содержание белка в субклеточных фракциях тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов...............................................................51

3.2. АТФазная активность субклеточных фракций тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов..........................................................57

3.3. Сравнительная оценка АТФазной активности митохондриальной и ядерной субклеточных фракций различных тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов................................................................81

3.4. Активность Mg2+,K+,Na+- АТФазы митохондриальной и ядерной субклеточных фракций различных тканей 10-17-ти суточных куриных эм-

брионов, после введения вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-

Сота...................................................................................88

3.5. Корреляционная связь АТФазной активности с содержанием белка в

тканях 10-17-ти суточных куриных эмбрионов............................101

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................104

ВЫВОДЫ..................................................................................112

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ......114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................115

ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность темы. Наиболее адекватной моделью, позволяющей в динамике изучить у позвоночных закономерности преобразований на протяжении эмбриогенеза без ущерба для материнского организма, являются эмбрионы птиц. Их особенностью является доступность и управляемость в процессе эксперимента, возможность получения и фиксирования результатов практически с помощью всех известных методов: эмбриологических, гистологических, цитологических, генетических, биохимических, гематологических, микрохирургических и многих других (Фисинин В.И., 1986). Работа с куриным эмбрионом (КЭ), как объектом промышленного инкубирования, сопровождается неизбежными потерями, но они не противоречат принципам биоэтики и, в отличие от работы с эмбрионами млекопитающих и человека, может быть реализована на любом этапе онтогенеза, являющемся предметом интереса исследователя (Свечкин Ю.К., 1985).

Интерес к куриному эмбриону, как объекту исследования, появился еще у Аристотеля, который стоит у истоков эмбриологии и биологии развития. С XVII века ученые сделали ряд открытий, используя в качестве объекта исследований куриный эмбрион. Поэтому невозможно переоценить значение куриного эмбриона не только на этапе становления, но и на дальнейших этапах развития учения об онтогенезе. Эмбрион является экологически чистым максимально изолированным от внешней среды объектом, что снижает вероятность спонтанного влияния внешних факторов в процессе эксперимента (ВеИштвЩ 1993).

Именно на глубоких знаниях биологических особенностей роста и развития птицы в эмбриональный и постэмбриональный периоды основаны разработки новых технологий, особенно в инкубации яйца, кормлении и выращивании поголовья (Лесли Д.Ф., 1982).

Инкубационные качества яиц зависят от множества факторов, как внешних, так и внутренних. Одним из важнейших является биологическая

полноценность яиц, зависящая от адекватного транспорта всех необходимых для эмбриона питательных веществ: витаминов, аминокислот, моносахаридов, макро- и микроэлементов и других, содержание которых играет важную роль в эмбриональном развитии птицы. В связи с этим разработка биохимии транспорта питательных веществ - задача, связанная с практическими путями улучшения качества яиц (Фисинин В.И., 1976).

В эмбриогенезе при относительно стабильных условиях инкубации необходимо знать биохимические показатели для объективной оценки генетических качеств нарождающегося молодняка птицы, чтобы адекватно прогнозировать их продуктивность во взрослом состоянии (Станишевская О.И., 1988).

По мнению ряда исследователей, важными показателями оценки предрасположенности птицы к ускоренному росту можно считать выводимость яиц, массу суточных цыплят и продолжительность эмбриогенеза (Варакина Р.И., 1969; Позднякова Н.С., 1987; Marks H.L., 1975; Garwood V.A., Lowe P.C., 1982; Tullet S.G., Burton F.G., 1983; Shanawany M.M., 1985; Tullet S.G., 1990). Однако к этим параметрам прибавился ещё один - эффективность использования эмбрионами питательных веществ яиц. Он, очевидно, является наиболее важным, хотя до настоящего времени не получил должного распространения и находится на стадии изучения (Аристархова Э.А., 1992).

Куриное яйцо и развивающийся в нем цыпленок являются удобным объектом для биохимических исследований. Это объясняется тем, что искусственное инкубирование яиц делает возможным точное определение стадии развития эмбриона. Кроме того, в тканях развивающегося зародыша, изолированного от внешней среды скорлупой, происходит самобытный обмен веществ. Важно отметить и то, что изучение физиологических и биохимических свойств развивающегося цыплёнка позволит выявить особенности филогенетического развития животного мира (Бадалян Р.В., 1980).

Изучение динамики изменения биохимических показателей при инкубации яиц сельскохозяйственной птицы привлекает внимание многих иссле-

дователей. Однако использование полученных научных данных явно недостаточно для того, чтобы прогнозировать развитие у эмбрионов полезных зоотехнических признаков. В связи с этим требуется более глубокое изучение эмбриогенеза кур на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях. Следует также учесть, что для правильного ведения инкубации необходимо познание биохимических процессов развития птичьих эмбрионов.

Исследование механизмов, лежащих в основе превращений энергии в биологических системах, представляет особый интерес. Известно, что в центре всех превращений энергии в клетке находится АТФ. За счёт световой энергии или энергии, выделяющейся при гликолизе, брожении и тканевом дыхании, синтезируется АТФ из АДФ и Н3Р04. При гидролизе АТФ до АДФ и Н3РО4 выделяется энергия, необходимая для совершения всех видов работы в организме. В приведённых реакциях особое место отводится энзимам биологического окисления, ресинтеза и распада АТФ на различных стадиях эмбрионального и онтогенетического развития животных (Вишняков С.И., 1995).

Современные достижения молекулярной биологии связаны с изучением вопросов утилизации энергии в виде макроэргических связей АТФ в мембранных структурах клетки, осуществляемых встроенными в них АТФазами, являющимися обязательными компонентами различных ионных насосов, которые классифицируются по переносимым ими ионам (Болдырев A.A., 1985; Кометиани З.П., Векуа М.Г., 1988).

С работой ионных насосов связаны процессы транспорта электролитов, Сахаров, аминокислот, органических кислот в клетку, генерации биотоков и нервного импульса, сопряжения окислительного фосфорилирования. Поэтому показатель активности АТФазных ионных насосов является очень чутким критерием оценки метаболического состояния организма.

Хотя в последнее время накоплено много материала по проблемам ионного транспорта и функционированию: K+,Na+-, Ca2+-, Mg2+-, анионной (НС03>, Н+-АТФаз (Болдырев A.A., 1985; Кагава Я., 1985; Вишняков С.И.,

1989; Скулачев В.П., 1989; Рыжкова Г.Ф., 2005 и др.), в доступной нам научной литературе функционирование транспортных аденозинтрифосфатаз в мембранных структурах различных органов и тканей куриных эмбрионов, а также многие вопросы, связанные с особенностями образования и утилизации энергии на различных стадиях эмбрионального развития животных и, в частности птиц, почти не освещено.

Кроме того, одним из малоизученных и интересных аспектов развития куриного эмбриона является изучение особенностей его реакции на действие вирусов, вероятность контакта с которыми в процессе жизни у птицы велика.

В связи с вышеизложенным представляется актуальным изучение особенностей развития эмбриона, с точки зрения биохимии, как в онтогенезе, так и в процессе экспериментального воздействия вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью работы явилось изучение активностей транспортных АТФаз в субклеточных структурах тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов в онтогенезе и после введения вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота.

В задачи исследований входило:

1. Определить активность транспортных АТФаз (М§2+, К+ -; М&2+ , Са2+ -; НС03") в митохондриальной и ядерной субклеточных фракциях тканей (скелетной мускулатуры, печени, желудка, головного мозга) 10-17-ти суточных куриных эмбрионов в онтогенезе и провести сравнительный анализ полученных результатов;

2. Установить взаимосвязь между АТФазной активностью и временем

закладки внутренних органов;

3. Определить содержание белка в митохондриальной и ядерной субклеточных фракциях тканей (скелетной мускулатуры, печени, желудка, головного мозга) 10-17-ти суточных куриных эмбрионов в онтогенезе и провести сравнительный анализ полученных результатов;

4. Установить влияние вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота, на активность транспортных АТФаз и содержание общего белка в митохондри-альной и ядерной фракциях тканей куриных эмбрионов;

5. Исследовать взаимосвязь между АТФазной активностью и содержанием общего белка в митохондриальной и ядерной субклеточных фракциях тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов.

1.3. Научная новизна. Впервые изучена динамика функционирования транспортных ионных насосов (М§ , Иа , К М^ , Са -; НСОэ" - АТФаз) в митохондриальных и ядерных субклеточных фракциях тканей (скелетной мускулатуры, печени, желудка, головного мозга) 10-17-ти суточных куриных эмбрионов в онтогенезе и при введении вируса болезни Ньюкасла, штамм Ла-Сота; установлена взаимосвязь между АТФазной активностью и временем закладки внутренних органов; определены наиболее критические сроки развития куриного эмбриона по отношению к вирусу; выявлена корреляционная зависимость между АТФазной активностью и содержанием общего белка в субклеточных фракциях тканей куриных эмбрионов.

Полученные новые данные дополняют биохимию сведениями об особенностях эмбрионального развития зародышей.

1.4. Практическая и теоретическая значимость работы. Проведённые исследования раскрывают особенности изменений АТФазной активности в субклеточных фракциях тканей 10-17-ти суточных куриных эмбрионов на различных стадиях эмбрионального развития и позволяют установить взаимосвязь между данными показателями и временем закладки внутренних органов.

Результаты исследования АТФазной активности можно использовать для дальнейшей разработки биохимических тестов, позволяющих судить о состоянии метаболических процессов куриного эмбриона в онтогенезе.

Полученные данные дополняют и расширяют общеизвестные представления об эмбриогенезе птиц и могут быть использованы в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных занятий по биохимии и эмбриологии.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Активность транспортных ферментных систем

(MgZT, Na , 1С -; Mg ,

Са2+ -; НС03" - АТФазы) и содержание общего белка в митохондриальной и ядерной субклеточных фракций тканей (скелетной мускулатуры, печени, желудка, головного мозга) куриных эмбрионов в онтогенезе;

2. АТФазная активность и содержание общего белка в митохондриальной и ядерной субклеточных фракций тканей (скелетной мускулатуры, печени, желудка, головного мозга) куриных эмбрионов, заражённых вирусом болезни Ньюкасла;

3. Взаимосвязь между АТФазной активностью и временем закладки внутренних органов куриных эмбрионов;

4. Корреляционная связь между АТФазной активностью и содержанием общего белка в субклеточных фракциях тканей куриных эмбрионов.

1.6. Апробация работы. Основные материалы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава, научных работников и аспирантов Курской государственной сельскохозяйственной академии им. проф. И.И.Иванова в 2009-2011 годах, XII международной научно-практической конференции «Новейшие достижения Европейской науки» (София, 2011г.), международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Агропромышленный комплекс: контуры будущего» (Курск, КГСХА, 2011г.)

1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из которых 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1.8. Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 135 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 29 рисунками, 30 таблицами и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы. Список литературы включает 224 источника, в том числе 84 — иностранных.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Особенности эмбрионального развития кур

Куриный зародыш является объектом экспериментального изучения закономерностей эмбрионального развития. Наибольшее число исследований выполнено в условиях искусственной инкубации, что позволило изучить общие закономерности развития организма (Александровская О.В., 1987).

Однако, прежде чем изложить особенности эмбрионального развития кур, следует остановиться на химическом составе яйца.

Куриное яйцо содержит в среднем 74 % воды, 12,8 % — азотсодержащих веществ, 11,5 % — жиров, 0,9 % — углеводов и 0,8 % минеральных веществ. В структуре яйца 10 % приходится на скорлупу, 56— 61 % — на белок и 27—32 % — на желток. В жидкой смеси содержимого яйца (без скорлупы) соотношение образуется так, что на желток приходится 36 % и на белок — 64 % (Тимофеева В. А., 2006).

Белок яйца является коллоидным раствором, у которого средняя удельная масса составляет 1,035. Яичный белок состоит из четырех частей: наружной и внутренней — жидких, средней — более плотной и самой плотной — градинковой. Градинки — плотные закрученные тяжи, удерживающие желток в центре яйца (Гилберт С., 1995).

Часть яйца, которая называется белком, состоит преимущественно из высокоценных белков - овальбумина (69,7 %), овоглобулина (6,7 %), овоко-нальбумина (9,5 %) и содержит также менее ценные белки - овомукоиды (12,7 %), овомуцины (1,9 %) и лизоцим (3 %). Среди составных компонентов белка в наибольшем количестве присутствует вода. Содержание влаги в белке уменьшается в направлении от наружного жидкого слоя в сторону внутреннего. На основе анализа содержимого яиц отдельных партий птицы было установлено, что общая масса белка в яйце зависит от породы птицы и возраста несушек (Яхонтов А. А., 1985).

Содержание протеина в белке яйца изменяется в прямой зависимости от возраста птицы. С ростом массы яйца повышается содержание протеина: на каждый грамм прироста массы яйца содержание протеина увеличивается на 0,09 г (Chung R.A., Stadetman W.G., 1961). В белке яйца углеводы находятся частично в свободном состоянии, а частично в соединении с белком. Обычно свободные углеводы находятся в форме глюкозы и по содержанию соответствуют 0,4 % массы белка. В 0,5 % гликопротеина входят белок, ман-ноза и галактоза (Криштафович В.И. Коснырева JIM. Позняковский В.М., 2005).

В белке яйца можно обнаружить широкую гамму минеральных веществ как в свободном состоянии, так и в связанном виде (Балобин Б.В., 1998).

Овальбумин является одним из самых главных компонентов белка яйца. В очищенном альбумине его молекулярная масса 45 000 d. В состав овальбумина входят соединения AI, А2, A3, которые различаются между собой прежде всего по содержанию фосфора. Среди