Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение информативности диагностики онкологических заболеваний определением антител к рецептору α-фотопротеина и роли рецептора α-фотопротеина в противоопухолевом иммунитете

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Астахов, Дмитрий Владимирович, Москва

МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМ.

И. М. СЕЧЕНОВА

АСТАХОВ ДМИТРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ИНФОРМАТИВНОСТИ ДИАГНОСТИКИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОПРЕДЕЛЕНИЕМ АНТИТЕЛ К РЕЦЕПТОРУ а-ФЕТОПРОТЕИНА И РОЛИ РЕЦЕПТОРА а-ФЕТОПРОТЕИНА В ПРОТИВООПУХОЛЕВОМ

ИММУНИТЕТЕ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

(03.00.04. - БИОХИМИЯ)

Научные руководители:

доктор химических наук С.Е.Северин

кандидат биологических наук Н.А.Коваленко

Москва-1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений............................................................................5

ВВЕДЕНИЕ........................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................Ю

1.1. а-Фетопротеин..........................................................................10

1.1.1. Обнаружение АФП..................................................................10

1.1.2. Свойства и структура АФП,.....................................11

1.1.3. Связывающие свойства АФП и его транспортная роль. .. 13

1.1.4. Регуляторное влияние на иммунитет....................................17

1.1.5. Влияние АФП на рост клеток...........................19

1.1.6. Регуляция генной экспрессии АФП......................................20

1.2. АФПР, моноклональные антитела к АФПР................23

1.2.1. Доказательства существования АФПР..................................23

1.2.2. Очистка АФПР........................................................................24

1.2.3. Свойства АФПР......................................................................25

1.2.4. АФПР в сыворотке крови........................................................26

1.2.5. Антитела к АФПР в сыворотке крови.................. 27

1.2.6. Моноклональные антитела против АФПР............................27

1.3. Использование АФП, АФПР и МАт к АФПР в медицине..................................................................................29

1.3.1. Использование АФП в качестве опухолевого

маркёра........................................................................................29

1.3.2. Использование АФП для локализации опухолей..................29

1.3.3. Использование АФП в качестве белка-вектора

при лечении злокачественных опухолей..............................29

1.3.4. Использование МАт в гистологических исследованиях .. 31

1.3.5. Ингибирование пролиферации злокачественных

клеток МАт к АФПР..................................32

1.3.6. Возможность использования АФПР для иммунизации онкологических больных................................34

1.4. Некоторые направления в иммунопрофилактике и

иммунотерапии опухолевых заболеваний............................35

1.4.1. Иммунные факторы и механизмы, вызывающие деструкцию опухолей. Нарушение в иммунной

системе при опухолевых заболеваниях............35

1.4.2. Неспецифическая иммунотерапия........................................33

1.4.2.1. Препараты растительного и животного происхождения .. 33

1.4.2.2. Эндотоксины бактерий и препараты, разработанные

на их основе............................................................................39

1.4.2.3. Синтетические фармакологические препараты..................40

1.4.2.4. Фототерапия............................................................................40

1.4.2.5. Цитокины................................................................................42

1.4.3. Специфическая иммунотерапия............................................42

1.4.3.1. Пассивная специфическая иммунотерапия........................42

1.4.3.2. Адоптивная специфическая иммунотерапия......................43

1.4.3.3. Активная иммунотерапия аутологичными иммуномодуляторами............................................................44

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................45

2.1. Иммуноферментный анализ..........................45

2.2. Определение цитотоксической активности сывороток крови онкологических больных и больных

ангиитами кожи................................. 43

2.3. Очистка АФПР................................... 49

2.4. Электрофорез в ПААГ............................ 50

2.5. Определение концентрации белка (АФПР)........... 53

2.6. Иммунизация мышей АФПР........................ 53

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.............. 56

3.1. Определение уровня АФПР и АТ к АФПР в сыворотке крови больных различными заболеваниями................................... 55

3.1.1. Определение уровня АФПР в сыворотке

крови онкологических больных................... $5

3.1.2. Определение уровня АТ к АФПР в сыворотке

крови здоровых доноров......................... 57

3.1.3. Определение уровня АТ к АФПР в сыворотке

крови больных опухолевыми заболеваниями................57

3.1.4. Определение уровня АТ к АФПР в сыворотке крови больных ангиитами кожи и

некоторыми другими заболеваниями............... 53

3.2. Исследование цитотоксической активности некоторых сывороток крови онкологических

больных и больных ангиитами кожи............................57

3.3. Изучение влияния иммунизации животных

АФПР и фотоиммунизации на рост опухоли..............72

ВЫВОДЫ............................................... 79

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................... 80

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТ - антитела

АТЗКОЦ - антителозависимая клеточно-опосредованная

цитотоксичность

АФП - а-фетопротеин

АФПР - рецептор а-фетопротеина

ВЭЖМ - висцеральная энтодерма желточного мешка

ГКГС - главный комплекс гистосовместимости

ГЦР - гепатоцеллюлярный рак

ДР - доксорубицин

ИЛ - интерлейкин

ИФА - иммуноферментный анализ

Кон А - конканавалин А

ЛАК - лимфокинактивированные клетки

МАт - моноклональные антитела

МТТ - бромид 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилгетразолия

ОФД - ортофенилендиамин

Г1ААГ - полиакриламидный гель

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

СА - сывороточный альбумин

СПЖ - средняя продолжительность жизни

ТБ - тератобластома

ТЕМЕД - тетраметилэтилендиамин

ТРФр - трансформирующий ростовой фактор Р

УСПЖ - увеличение средней продолжительности жизни

ФИТЦ - фенилизотиоцианат

ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор

ФСБТ - фосфатно-солевой буферный раствор с 0.02% Т\уееп 20

ФЦ (Со) - фталоцианин кобальта

ЦТА - цитотоксическая активность

чАФП - человеческий а-фетопротеин

Бв-Ш - додецилсульфат натрия

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время онкологическим заболеваниям принадлежит второе место среди заболеваний, приводящих к летальному исходу, а успешность лечения связана с возможностями ранней диагностики и наблюдением за успешностью лечения для безрецидивного, в течение 5-10 и более лет, течения онкологического заболевания. В связи с этим, большое практическое значение для ранней диагностики онкологических заболеваний приобрел поиск новых опухолевых маркеров.

"Идеальным маркером" считается такой онкомаркер, который обладает высокой специфичностью и чувствительностью в отношении определенного вида опухоли, а его содержание в биологических жидкостях отражает изменения, происходящие в процессе лечения опухоли.

Современные биохимические и иммунологические методы позволяют выявить новообразование, когда число опухолевых клеток достигает Ю9-Ю10, сама опухоль весит ~ 1г, минимальный уровень маркера - несколько фемтомолей (10"15) на 1.0 мл сыворотки крови [3,9]. Клинический диагноз ставится при минимальном размере опухоли 10-100 г. Однако ни один из известных онкомаркеров не является идеальным, большинство из них не отвечает всем предъявляемым к ним требованиям. Поэтому, оправдан как поиск новых онкомаркеров, так и разработка оптимального сочетания при применении уже известных онкомаркеров.

Первым веществом, которое можно было назвать онкомаркёром, явился а-фетопротеин (АФП) - онкофетальный белок, определение

которого в сыворотке крови информативно для диагностики гепатоцеллюлярного рака, тератобластом и некоторых патологий внутриутробного развития [1,19]. Дальнейшие работы в области химии этого бежа, регуляции его биосинтеза и клинического использования определения его содержания в сыворотке крови привели к достаточно полной картине в этих областях [1,29,47]. Однако, физиологическая роль АФП, за исключением транспортной - участие в транспорте полиненасыщенных жирных кислот и других лигандов, остается не вполне ясной. Вероятно, это полифункциональный белок [47].

Особенный интерес вызывают обнаруженное в последнее время влияние АФП на рост клеток [39,45] и его иммуносупрессорное (модуляторное) влияние на иммунитет [44,59]. Вероятно, в реализации этих эффектов определенная роль принадлежит рецептору АФП (АФПР) [91]. АФПР, обнаруженный относительно недавно (1984г) [104], изучен значительно хуже, как в отношении структуры, так и в отношении его физиологической роли и возможностей клинического использования. Однако выявлена его экспрессия дифференцирующимися и неопластическими клетками широкого ряда опухолей [41,49,101].

Обнаружены антитела к АФПР в сыворотке крови [83]. Эти данные позволяют поставить вопросы о возможном применении определения рецептора и антител к нему в диагностических целях. Также вероятно участие рецептора в формировании противоопухолевого иммунитета, как это показано для некоторых специфических опухолевых антигенов [71].

Эти представления позволили сформулировать цели настоящей работы:

1) изучить возможность использования определения уровня рецептора а-фетопротеина (АФПР) и антител (АТ) к АФПР в качестве опухолевых маркеров.

2) определить возможность усиления иммунной реакции на прививаемую злокачественную опухоль после предварительной вакцинации животного раствором онкофетального антигена -АФПР.

При этом были поставлены следующие задачи исследования:

1) оценить диагностическую значимость определения АФПР в сыворотке крови онкологических больных;

2) определить уровни АТ к АФПР у здоровых доноров, у больных с ангиитами кожи и другими неопухолевыми заболеваниями;

3) оценить диагностическую значимость определения уровня АТ к АФПР при онкологических заболеваниях;

4) исследовать сыворотки крови онкологических больных и больных с ангиитами кожи, с высокими титрами антител, на цитотоксическую активность;

5) оценить возможность усиления противоопухолевого иммунитета в эксперименте по иммунизации мышей линии ЭВА/2 АФПР, выделенным из ткани легкого человека.

ГЛАВА1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. а-Фетопротеин.

1.1.1. Обнаружение АФП.

АФП - доминирующий белок эмбриональной сыворотки крови млекопитающих, впервые обнаруженный в 1957 году. Уровень АФП снижается до следовых количеств в крови взрослых особей, но вновь поднимается в случае развития гепатоцеллюлярного рака (ГЦР) или тератобластом (ТБ) яичка или яичника [1].

Уровень АФП также повышен по сравнению с нормой у беременных женщин, но примерно на порядок меньше, чем при опухолях. Определение уровня АФП в сыворотке крови беременных женщин используется для диагностики некоторых врождённых аномалий плода. Его уровень повышается при врождённом дефекте нервной трубки плода и уменьшается при болезни Дауна [1].

При нормальном развитии у млекопитающих АФП синтезируется главным образом висцеральной энтодермой желточного мешка (ВЭЖМ) и фетальной печенью. Иммуноцитохимически было показано присутствие АФП во многих эмбриональных тканях, отличных от фетальной печени и ВЭЖМ, что связано с поступлением этого бежа из экстрацеллюлярного пространства [94,103].

Продукция АФП при гепатоцеллюлярном раке была впервые описана на экспериментальных моделях Г.И.Абелевым [19], а затем Ю.С.Татариновым у человека [16]. Г.И.Абелев первым предложил использование АФП в качестве опухолевого маркёра [20]. Обнаружение АФП в сыворотке крови онкологических больных способствовало проведению исследований этого бежа.

1.1.2. Свойства и структура АФП.

АФП выделен в чистом виде и охарактеризован. Относительная молекулярная масса АФП колеблется от 67 до 74 кДа, что может быть связано как с различными степенями гликозилирования этого бежа, так и с различиями в методах определения его относительной молекулярной массы. АФП различной видовой принадлежности представляет собой одноцепочечный белок, состоящий примерно из 590 аминокислотных остатков и содержащий углеводную часть, составляющую около 4% от его относительной молекулярной массы.

Показано сходство эмбрионального бежа с бежом, выделенным из опухолевых тканей [1,29].

Для АФП различных видов отмечена большая гомологичность последовательностей аминокислот [49].

Данные анализа последовательностей и структурной гомологичности между мРНК АФП и сывороточного альбумина (СА) показывают, что АФП принадлежит к семейству бежов, филогенетически наиболее тесно связанных с СА. Так первичная, вторичная и третичная структуры АФП сходны с 3-х доменной моделью, предложенной для С А [49,52].

Для АФП характерна микрогетерогенность. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в неденатурирующих условиях выделяет две чётко разделяемые подфракции АФП, иммунологически идентичные [20]. С помощью изоэлектрофокусирования выявляется 67 по-разному заряженных форм бежа. Электрическая гетерогенность в некоторых случаях устраняется после обработки АФП нейраминидазой. Вероятно, микрогетерогенность АФП играет важную роль в функциях АФП. АФП, синтезируемый в фетальной печени и ГЦР, отличается по реакции с конканавалином А (КонА) от АФП, продуцируемого ВЭЖМ. АФП сыворотки крови при хроническом гепатите отличается от АФП, продуцируемого ГЦР, по реактивности с лектином из Lens Culinaris. Вероятно, вклад в микрогетерогенность вносят углеводный компонент АФП и низкомолекулярные лиганды, главным образом, полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), прочно связывающиеся с АФП [1,25,29].

Вариабельность углеводных компонентов АФП, полученных из различных тканей, очевидно, не затрагивает структуру самого бежа. При обработке трипсином АФП человека, полученного от плода или из клеток гепатомы, и анализе полученных пептидов оказалось, что пептидные карты идентичны [29].

В настоящее время методы аффинного электрофореза и аффинной хроматографии с применением лектинов находят всё большее применение для дифференциальной диагностики первичных гепатом, опухолей желточного мешка, метастазах в печень при опухолях желудка, а также других новообразованиях и опухолях из герминативных клеток. АФП, происходящие из клеток гепатомы или желточного мешка, могут быть также определены с помощью моноклональных антител (МАт), которые способны отличать разные

олигосахариды, принадлежащие этим бежам из разных источников. Антитела с такой специфичностью полезны для диагностики типов опухолей на ранних стадиях определённых неопластических процессов [1,29].

Гетерогенный характер имеет также 1М-концевой участок молекулы. Для этой области были отмечены М-концевые остатки -серин, треонин и гистидин [29].

Как видно из табл.1 [47], человеческий АФП (чАФП) имеет большое сходство (идентичность структуры или гомологию) с некоторыми бежами не только семейства альбуминоидов. Отдельные домены имеют свою специфичность и гомологичные участки с очень многими бежами (табл. 2) [47]

Интересно, что белки, выполняющие столь различные функции -обладают такой значительной структурной гомологией, на основании чего было сделано предположение, что АФП является полифункциональным бежом, модификатором биологического ответа, подобно цитокинам [47].

1.1.3. Связывающие свойства АФП и его транспортная роль.

Подобно СА, АФП обнаруживает относительно сильную аффинность к самым разнообразным лигандам [47,58].

Было установлено, что АФП способен связываться с эстрогенами, что особенно выражено у грызунов [65,97]. У новорожденных комплекс АФП-эстроген лишает эстрогенчувствительные ткани, такие как матка, чувствительности к свободному эстрогену [65,89,97].

Важная особенность АФП - способность связываться с жирными кислотами. Отмечено высокое сродство АФП к ПНЖК, из которых основная часть приходится на арахидоновую (С20:4) (предшественнику простагландинов и лейкотриенов) и декозагексеновую (С22:6) кислоты [32,100].

Показана более высокая аффинность человеческого АФП к полиненасыщенным жирным кислотам, по сравнению с СА (разница ~ 5 порядков). В то же время насыщенные жирные кислоты значительно прочнее связываются с СА, нежели с АФП [1,63].

Поскольку ПНЖК не синтезируются в организме плода (и матери) и поступают в организм с пищей, можно предположить, что АФП осуществляет транспорт ПНЖК из кровотока матери в кровоток плода. Связывание ПНЖК может осуществляться в плаценте.

АФП из фетальных тканей человека характеризовался относительно высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот, тогда как для гепатомных материалов было характерно низкое их содержание. Аналогичная картина наблюдается и для АФП мышей и крыс [1,63].

У АФП человека и крыс была обнаружена высокая аффинность к билирубину вследствие наличия участка связывания для этого соединения [47].

Билирубин, по-видимому, до некоторой степени угнетает связывание АФП с арахидоновой кислотой, очевидно, в результате образования

Таблица 1.

Последовательности аминокислот а-фетопротеина человека (чАФП) по сравнению с некоторыми другими белками человека [47].

Полная аминокислотная последовательность (590 аминокислот)

чАФП по сравнению с другими белками человека

Белок Протяжение Идентичность (%) Подобие(%)

аминокислот

Альбумин 1-590 39.96 59.34

человека 42.28

Глутатаон 1-513 24.19 42.27

пероксидаза 38.00

Белок 1-3000 19.43 40.43

ретинобластомы

Витамин О - 1-536 19.00

связывающий

Белок

Лейцин 1-8305 16.99

аминопептцдаза

Сравнение доменов чАФП с доменами других бежов человека

Белок Область 1 Область 2 Область 3

Название / тип Идентичность / Идентичность / Идентичность /

подобие(