Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рецепторные системы человека и их использование для направленного транспорта лекарственных препаратов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Рецепторные системы человека и их использование для направленного транспорта лекарственных препаратов"

РГБ ОЛ

На правах рукописи УДК 577.17:519.240,577.156 -

КАТУКОВ ВАЛЕРИЙ ЮРЬЕВИЧ

РЕЦЕПТОРНЫЕ СИСТЕМЫ ЧЕЛОВЕКА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Специальность: 03.00.04 - "биохимия"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1997 г.

Работа выполнена во Всероссийском научном центре молекулярной диагно-

«

стики и лечения и Московском научно-исследовательском институте медицинской экологии.

Научный консультант: доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор Соколов Е.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корреспондент МАН ИПТ, профессор Свешников П.Г.

доктор биологических наук, член-корреспондент МАН ИПТ Эристави К.А. доктор медицинских наук, академик РАЕН Караулов A.B.

Ведущая организация: Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В Ломоносова.

/Г00

Защита состоится "_29_"_января_1998 года в " часов на заседании

Диссертационного совета Д. 171.02.011. при Центре медико-биологических и экологических проблем по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем РАЕН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Свойства рецепторных систем, представленных в организме человека, во многом определяются их специфичностью по отношению к конкретным эндогенным лигандам. Эти вещества, как правило, играют ключевую роль в патогенезе большинства заболеваний. В этой связи сведения о рецепторных компонентах различных тканей и органов в норме и патологии важны для медицины в плане диагностики, изучения патогенеза конкретной нозологической формы, для создания в конечном итоге направленно действующих лекарственных средств. Методы прижизненного изучения рецепторов низкомолекулярных нейромедиаторов и нейро-модуляторов, а также различных белковых факторов (фактор роста нервов, трансферрин, а-фетопротеин) в настоящее время разработаны недостаточно. Между тем исследования в этом плане представляются весьма актуальными.

Остается нерешенным ряд проблем, связанных с этими исследованиями. К ним относятся следующие направления: создание и апробация адекватной модельной системы, позволяющей производить экспресс-оценку функционального состояния рецепторных систем в разных тканях; синтез и исследование новых биологически активных веществ, способных модулировать процессы обратного захвата и специфического узнавания; разработка методов высокоэффективного выделения и очистки компонентов рецепторных систем с последующей физико-химической и функциональной характеристикой макромолекул; получение лекарственных препаратов направленного действия в соответствии со знаниями о характере работы конкретных рецепторных систем в отдельных органах и тканях человека; испытание биологической активности этих потенциальных лекарственных средств; изучение механизмов действия новых препаратов.

Именно разработке вышеперечисленных проблем и методов и посвящена настоящая работа.

Целью настоящего диссертационного исследования явились: изучение рецепции ряда важнейших нейромедиаторов и нейромодуляторов на препаратах легких, биоптатах печени и клетках крови человека в "норме" и при ряде патологических состояний; выделение и очистка рецепторов к а-фетопро-теину и трансферрину из тканей человека; конструирование органо и тканетроп-ных конъюгатов с заданными свойствами и оценка перспективности их последующего клинического использования.

Для достижения указанной цели были поставлены и разрешены следующие основные задачи:

- Проведено изучение (определение ряда физико-химических параметров) адренергических, холинергических, серотонинергических рецепторных систем, а также рецепторов фактора активации тромбоцитов (ФАТ) модельных объектов легких человека при хронических неспецифических заболеваниях дыхательных путей.

- Осуществлено физико-химическое исследование рецепторов на модельных циркулирующих, возобновляемых элементах бронхо-легочного аппарата - клетках лаважных смывов в "норме" и при патологии.

- Проведено изучение в сравнительном аспекте рецепторного спектра биоп-татов ткани печени при хроническом гепатите.

- Определены характеристики связывания и изучен механизм взаимодействия серотонина и трициклического антидепрессанта психотропного препарата ими-прамина с мононуклеарными лейкоцитами ¿фови человека.

- Изучен процесс рецепции препаратов бензодиазепинового ряда (аналогов транквилизаторов) на мононуклеарных лейкоцитах крови человека.

- Осуществлен синтез и исследована биологическая активность новых производных хинолина - перспективных блокаторов захвата серотонина с использованием в качестве модели тромбоцитов.

- Отработаны оптимальные условия очистки рецепторов к а-фетопрогеину и трансферрину.

- Изучены свойства очищенных препаратов рецепторов к а-фетопротеину и трансферрину.

- Разработаны новые методы противоопухолевой терапии:

- осуществлен синтез и изучен механизм действия конъюгатов факторов роста нервов с карбоксифосфамидом;

- разработаны новые лекарственные соединения для противоопухолевой терапии на основе конъюгатов а-фетопротеина и его рецептора;

- получены конъюгаты а-фетопротеина с различными биологически активными соединениями;

- Разработаны способы направленного транспорта препаратов в клетку-мишень.

- Исследованы механизмы действия конъюгатов а-фетопротеина с противоопухолевыми препаратами на раковые клетки.

- Проведены лабораторные испытания препаратов на экспериментальных животных и дана оценка перспективности их последующего клинического использования.

Научная новизна и теоретическая ценность полученных результатов. Научная новизна и теоретическая ценность результатов работы заключается, прежде всего, в фундаментальном значении концептуально-теоретических выводов из диссертации.

Впервые выявлены центры специфического связывания серотонина и ими-прамина на лимфоцитах человека, не сопряженные с каналом обратного захвата

серотонина. Определены физико-химические параметры указанного связывания. Проведено изучение характеристик рецепторов психотропных препаратов бензо-диазепинового ряда на лимфоцитах человека.

Впервые выявлен факт селективной активации связывания бензодиазепинов с интактными лимфоцитами в присутствии ГАМК и ее функциональных аналогов. Определена избирательность рецепторного действия различных бензодиазепино-вых аналогов. Проведен оригинальный синтез и изучена биологическая активность на модели захвата серотонина в тромбоциты человека для ряда новых производных хинолина.

Впервые изучены характеристики широкого спектра рецепторных систем нейромедиаторов, нейромодуляторов на препаратах легких и печени человека в "норме" и патологических состояниях, а также на модельных объектах-макрофагах бронхоальвеолярных лаважных смывов. Показаны отличия физико-химических параметров вышеуказанных типов рецепторных систем у условно здоровых пациентов и при злокачественных новообразованиях, хронических неспецифических заболеваниях легких (ХНЗЛ). а также хроническом гепатите.

Выделены препараты рецепторов АФП и ТФ. Отработаны методы их очистки. Процесс очистки оптимизирован, достигнут хороший выход при высокой степени чистоты белков. Выход ТФР при использовании разработанного метода в пять раз превышает таковой при использовании методов, описанных в литературе. Изучены такие свойства рецептора ТФ как молекулярная масса, субъединичный состав, константа диссоциации.

Выделен, очищен до гомогенного состояния и охарактеризован рецептор АФП. Показано, что АФПР является мембранным белком с молекулярной массой приблизительно 320-380 кДа и имеет несколько субъединиц: 62, 67, 130 и 200 кДа. На основании иммунологического анализа методом иммуноблоттинга в составе

рецептора АФП показано наличие двух АФП-подобных структур, предложена гипотетическая схема строения рецептора.

Впервые получен конъюгат фактора роста нервов с карбоксифосфамидом. Показана высокая степень специфической активности препарата в отношении клеток РС-12.

Впервые разработаны методы конструирования и получены конъюгаты а-фетопротеина человека с различными противоопухолевыми препаратами: блео-мицетином. винбластином, дауномицином, доксорубицином, калихемицином, карбоксифосфамидом, метотрексатом, хлорбутином и цисплатиной. В опытах на животных впервые показана более высокая терапевтическая эффективность конъ-югатов по сравнению со свободными препаратами.

Практическая ценность результатов проведенной работы определяется тем,

что:

- Разработаны модели для изучения молекулярных механизмов патогенеза паренхиматозных заболеваний легких и печени человека. Полученные данные могут быть в дальнейшем использованы в медицине при диагностике, исследовании и терапии (в том числе фармакотерапии) ряда патологических состояний легких и печени человека.

- Полученные результаты свидетельствуют о том, что лейкоциты крови человека могут служить хорошей моделью для изучения механизмов взаимодействия психотропных препаратов с соответствующими рецепторами. Открывается возможность разработки новых психотропных препаратов - производных бензодиа-зепина (транквилизаторов) и антидепрессантов - блокаторов захвата медиаторных моноаминов, применяемых при лечении маниакально-депрессивных состояний.

- Оригинальный синтез и исследование биологической активности новых производных хинолина вносят реальный практический вклад в создание новых биологически активных антидепрессантов. Физико-химические характеристики

связывания нейромодуляторов* с клетками крови могут быть использованы в медицине при исследовании различных патологий.

- Разработанные методы и полученные результаты могут быть использованы как для создания тест-систем ранней диагностики онкологических заболеваний, так и для дальнейших исследований особенностей опухолевых процессов на уровне белков клеточной мембраны.

- Разработаны методы получения и адресной.доставки лекарственных препаратов, приготовленных на основе конъюгатов биологически активных соединений с а-фетопротеином.

В процессе разработки теоретических и практических основ технологии оценки рецепторных систем и направленного транспорта лекарственных средств оформлен патент на изобретение.

Апробация диссертационной работы.

Результаты, описанные в диссертации, были представлены на Международной конференции по фактору активации тромбоцитов (Париж, Франция, 1990), на

XV Конгрессе Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии (Париж, Франция, май 1992), на 12-м ежегодном семинаре Регионального медицинского центра г.Орландо (г.Орландо, США, март 1991).

Результаты исследований доложены на 5-ом Международном симпозиуме по фармацевтическим наукам (Анкара, Турция, 1997), на XXII конференции ISOBM, September 18-22, 1994, Groningen, The Netherlands; International symposium on biology and clinical usefulness of tumor markers, Febreary 8-11, 1995, Barcelona, Spain; на европейском конгрессе по клинической химии, Tampere, Finland, 2-7 July, 1995; на XXIII конференции ISOBM, September 10-13, 1995, Montreal, Canada; на

XVI конгрессе по клинической химии, London UK, 8-12 July, 1996.

По теме диссертации опубликовано 34 работы, 1 описание изобретения по авторским свидетельствам и патентам.

Структура диссертации традиционна. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, общих выводов, указателя литературы, включающего_отечественных

и_иностранных источников. Текст диссертации изложен на_страницах, иллюстрирован_таблицами и_рисунками. Особенностью изложения собственных исследований является их распределение по двум разделам.

Первый из них посвящен исследованию рецепторных систем человека. Второй включает в себя разработку новых методов противоопухолевой терапии и их оценку.

Положения, выносимые на защиту.

1. Функциональная активность рецепторных систем, характерных для органа или ткани, определяет их способность к нормальной жизнедеятельности или развитию патологии. Использование стандартной модельной системы позволяет производить унифицированную экспресс-оценку состояния органа или ткани. Для легких такой моделью являются бронхоальвеолярные макрофаги и бронхоальвео-лярные нейтрофилы, а для печени - биоптаты ее паренхимы.

2. Биохимические особенности организации и функционирования нейроме-диаторных рецепторов на лимфоцитах определяют эффективность влияния и физиологическую роль эндогенных лигандов и синтезированных новых биологически активных веществ. Полученные результаты позволяют рассматривать производные хинолина в качестве эффективных блокаторов захвата 5-ОТ, т.е. перспективных антидепрессантов.

3. Универсальный метод выделения и очистки мембранных белков - рецепторов к а-фетопротеину и трансферрину позволяет получать субстанции, пригодные для дальнейшего биохимического исследования и конструирования направленно действующих лекарственных средств, обладающих противоопухолевой активностью.

4. Конструирование новых лекарственных соединений противоопухолевой терапии на основе конъюгатов а-фетопротеина и его рецептора позволяет получать препараты с заданными терапевтическими свойствами. Использование широкого спектра препаратов приводит к оптимизации способов направленного транспорта конъюгатов в клетку-мишень.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ, РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Главные направления и объем выполненных исследований отражены в структуре диссертации.

Для реализации поставленных задач были использованы наиболее важные достоверные и информативные методы исследования:

- химические (выделение, очистка и концентрирование биологически активных веществ, органический синтез);

- физико-химические (центрифугирование, спектрофотометрия, электрофорез, радиорецепторный анализ, измерение захвата нейромедиатора, хемилюмино-метрия);

- биологические (определение противоопухолевой активности препаратов в опытах in vitro и in vivo);

- иммунологические (иммуноблоттинг);

- статистические методы обработки цифрового массива данных.

Исследование рецепторных систем человека.

Изучение связывания нейромедиаторов с бронхоальвеолярными макрофагами человека в "норме" и при патодогии.

Эксперименты были начаты с исследования широкого спектра рецепторных систем на клетках из бронхоальвеолярных смывов, главным образом представ-

ляющих из себя броихоальвеолярные макрофаги (БАМ). Ранее нами было показано, что эти клетки обогащены различными рецепторами и могут являться моделью легочной ткани. В результате серии экспериментов с использованием меченых лигандов нами были выявлены центры специфического связывания лигандов на БАМ человека и определены параметры их рецепции.

Кинетические закономерности связывания нейромедиаторов с БАМ. Кинетические кривые взаимодействия нейромедиаторов с БАМ, указывают на обратимый и насыщаемый характер связывания меченого лиганда, а также на отсутствие в системе кооперативных эффектов и диффузионных затруднений.

Время установления равновесия общего связывания при 4°С составляет 60 мин, а неспецифического - 5 мин. В течение времени инкубации (3 часа) не происходит заметного снижения связывания.

Физико-химические характеристики взаимодействия нейромедиаторов с БА М человека в "норме " Эксперименты проводились с БАМ, полученными в ходе бронхоскопии

практически здоровых доноров. Определение параметров рецепторного связывания проводили с использованием координат Скэтчарда. В используемом диапазоне концентраций преобразованные изотермы связывания имели линейный характер, что свидетельствует о том, что процессы комплексообразования описываются моделью с участием одного типа центров связывания. Параметры рецепторного связывания исследуемых нейромедиаторов и нейромодуляторов приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Параметры ключевых рецепторных систем БАМ контрольных ("нормальных") образцов (п = 15).

Лиганд Ка, нМ Втах, фмоль/мг белка

1 2 3

3Н-ОНА ((5-адрено) 1,40+0,20 460 ± 54

2—393

1 2 3

3Н-РЯг (си-адрено) 0,90+0,10 1100 + 150

3Н-ИМИ 1,90 ±0,20 3040 ± 450

3Н-С№В 0,40 + 0,05 396 ± 60

Изменения характеристик рецепторов бронхоальвеолярных макрофагов при хронической пневмонии и туберкулезе

В ходе бронхоскопии у 25 пациентов, страдающих хронической пневмонией, и 18 пациентов, страдающих туберкулезом легких, были получены лаважные смывы, из которых были выделены БАМ. Результаты анализа параметров рецептор-ного связывания исследуемых нейромедиаторов представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Параметры рецепторных систем БАМ при хронической пневмонии и туберкулезе. Вта* - фмоль/мг белка.

Лиганд Хроническая пневмония Туберкулез

Ка, нМ Нщах Ка, нМ Втах

3Н-БНА (р-адрено) 1,10 ±0,10 1000 ±190 1,00 ±0,10 844 ±95

3Н-РЯг (ои-адрено) 2,00 ±0,30 1390 ±150 1,90 ±0,20 1100 ±200

3Н-ИМИ 1,40 ±0,08 3120 ±410 1,80 ±0,06 3000 ±425

3Н-С^В 0,10 ±0,01 210 ±30 0,30 ±0,02 175 +26

Из данных, представленных в таблице 2, видно, что сродство соответствующего лигандак мускариновым рецепторам, определяемое значением Ка, претерпевает значительные изменения (снижается в 4 раза) в случае хронической пневмонии. Для остальных исследованных рецепторных систем значения Ка изменяются статистически незначимо. При хронической пневмонии Втах для 0-адренорецепторов снижается в 2 раза, для ш-адренорецепторов и рецепторов

имипрамина - практически не изменяется, а для мускариновых рецепторов возрастает в 1,9 раза. При туберкулезе для всех исследованных рецепторов сродство соответствующих лигандов практически не отличается от контрольного. Значение Вт»* для (5-адренорецепторов возрастает в среднем в 2 раза, а для мускариновых рецепторов снижается в 2,3 раза. В случае других исследованных рецепторных систем Вшах не изменяется.

Таким образом, БАМ являются удобным модельным объектом, обогащенным рецепторами основных типов, характерных для нейронов, принимающих участие в иннервации легочной ткани. В дальнейшем представляет интерес сравнение параметров рецепторов на БАМ с соответствующими параметрами, полученными при анализе непосредственно паренхимы легкого.

Физико-химические характеристики связывания 3Н-ФАТ с БАМ и бронхо-альвеолярными нейтрофилами.

Особое место в биохимических механизмах регуляции функционирования легочной ткани занимают рецепторы универсального клеточного медиатора -ФАТ. Представляло интерес исследовать физико-химические параметры этих рецепторов на БАМ, а также на таких клетках, как нейтрофилы.

Серия экспериментов с использованием меченого ФАТ выявила наличие высокоаффинных центров специфического связывания лиганда на мембранах клеток и на интактных клетках, участвующих в воспалительных реакциях: бронхоальвео-лярных нейтрофилов и БАМ.

Связывание Н3-ФАТ с БАМ носит обратимый насыщаемый характер (время установления равновесия 20 мин при 37°С) и его анализ в координатах Скэтчарда (рис. 1) выявил линейный вид зависимости, что свидетельствует о наличии одного типа центров связывания (Ка = 0,8 ± 0,1 нМ). Максимальное число центров связывания Н3-ФАТ на БАМ : Втах = 430 фмоль/млн клеток. 2*

Ют-Ю-1

Рис. 1. Преобразование изотерм специфического связывания 3Н-ФАТ с БАМ в координатах Скэтчарда. Условия: инкубация 15 мин при 37»С. ( О ) - БАМ, ( • ) - нейтрофилы.

В10-!,иМ

1.0

Кривые дозовой зависимости от концентрации ФАТ на нейтрофилах и макрофагах в координатах Иди-Хофсти, представленные на рис. 2, имеют нелинейный характер, свидетельствующий о наличии двух значений константы Михаэлиса (Км), соответствующих высокоаффинной и низкоаффинной ветвям. Для макрофагов: КМ| = 1,3 ±0,14 нМ и Км2 = 94 ±30 нМ; для нейтрофилов: Км1 = 10 ±2 нМ и КМ2= 110 ±25 нМ.

шУ

J Б, нМ

Рис. 2. Преобразование кривых дозовых зависимостей от концентрации ФАТ на БАМ (кривая 1) и нейтрофилах (кривая 2) в координатах Иди-Хофсти. Условия: инкубация 2 мин при 37°С.

Низкоаффинный участок кривых может отражать неспецифические процессы, происходящие с клетками и не связанные со специфической рецепцией ФАТ на соответствующих центрах связывания. Значение Км] для макрофагов удовлетворительно совпадает со значением Ю на этих клетках; а Кга] для нейтрофилов зна-

2.0

чительно ниже, чем величина К<1. Значение константы Михаэлиса (Км]), характеризующей процесс индукции супероксидных радикалов для нейтрофилов, снижается, а амплитуда ответа увеличивается при преинкубации клеток с форболо-вым эфиром и азидом натрия. Полученные данные указывают на отличие в лимитирующей стадии процесса активации на изученных клетках крови: у макрофагов это - связывание ФАТ с рецептором, а у нейтрофилов - передача сигнала внутри клетки.

Изменения характеристик рецепторов биоптатов ткани легких человека при опухолевом перерождении ткани, хронической пневмонии и туберкулезе.

В работе исследовались изменения рецепторных систем при следующих патологиях легких человека: онкологические заболевания, хроническая пневмония и туберкулез. В качестве контроля ("нормы") рассматривали образцы ткани, полученные в результате хирургического вмешательства на легком. Параметры, характеризующие рецепторные системы контрольных образцов ткани, представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Параметры рецепторных систем контрольных ("нормальных") образцов ткани (п = 10).

Лиганд Ка, нМ Вшах, фмоль/мг белка

'Н-ЭНА (3-адрено) 1,00+0,10 120 + 20

3Н-РЯг (а,-адрено) 1,00 ±0,20 270 ± 85

3Н-ИМИ 2,00 ±0,10 895 + 79

0,20 ±0,03 46 ±6

3Н-ФАТ 0,90 ±0,10 900 ±83

В таблице 4 представлены данные, полученные при исследовании связывания лигандов с образцами легочной ткани, полученными при онкологических опера-

циях, операциях при туберкулезе легких, а также биоптатами ткани легкого при хронической пневмонии.

Таблица 4.

Параметры ключевых рецепторных систем биоптатов ткани легких человека при опухолевом перерождении, хронической пневмонии и туберкулезе (п = 21).

Лиганд Патология Ка,нМ Вша», фмоль/мг белка

3Н-ОНА Рак 0,50 + 0,08 84 ± 14

((3-адрено) Хроническая пневмония 0,90 + 0,10 270 ± 45

Туберкулез 0,80 ±0,10 244 ± 39

зн-ряг Рак 1,40 ±0,27 1049± 117

(си-адрено) Хроническая пневмония 0,90 ± 0,20 250 ± 48

Туберкулез 0,70 ±0,05 220 ± 43

зн-ими Рак 2,30+0,20 2115 ±200

Хроническая пневмония 2,20 ±0,09 1125 ±90

Туберкулез 1,80 ±0,04 938 ± 50

зн-дш Рак 0,100 ±0,009 114± 12

Хроническая пневмония 0,090 ±0,009 75 ±6

Туберкулез 0,20 ±0,01 52 ±6

3Н-ФАТ Рак 0,70 ±0,10 949 + 100

Хроническая пневмония 0,90 ±Ь,10 2119 ± 129

Туберкулез 0,80 ±0,08 814 ± 63

Из данных, представленных в таблицах 3 и 4, следует, что значения Ю при исследуемых патологиях легких по сравнению с контролем изменяются незначительно. Наибольшие изменения Ка наблюдаются в случае мускариновых рецепторов (при раке легкого и хронической пневмонии). В то же время Втм для всех ре-

цепторных систем, за исключением ФАТ и р-адренорецепторов, при раке легкого значительно возрастает (для аг-адренорецепторов и рецепторов имипрамина практически на порядок); для Р-адренорецепторов Вшах при раке снижается в 5,4 раза, при хронической пневмонии в среднем в 2 раза. При туберкулезе значение Вт« для Р-адренорецепторов изменяется в 2 раза.

Выявленные закономерности могут быть использованы при диагностике соответствующих заболеваний.

Сравнение параметров рецепторных систем, полученных для БАМ и биопта-тов паренхимы легкого при хронической пневмонии и туберкулезе, показывает, что изменения параметров для БАМ при рассматриваемых патологиях полностью идентичны изменениям, характерным для легочной ткани. Таким образом, БАМ можно считать адекватной моделью, отражающей состояние рецепторов, определяющих основные характеристики иннервации легочной ткани.

Изменения характеристик рецепторов биоптатов ткани печени при хроническом гепатите.

В ходе экспериментов по изучению связывания лигандов с биоптатами, полученными при пункции печени пациентов, страдающих хроническим гепатитом, и пациентов, находящихся в стадии ремиссии (контроль - "норма"), получены параметры ключевых рецепторных систем. Данные приведены в таблице 5.

Таблица 5.

Параметры ключевых рецепторных систем биоптатов ткани печени человека в норме (усредненные данные по 10 пациентам) и при хроническом гепатите (усредненные данные по 21 пациенту).

Вши - в фмоль/мг белка.

Лиганд Контроль Хронический гепатит

Ка, нМ Вщах Ка, нМ Вшах

1 2 3 4 5

3Н-ОНА (Р-адрено) 3,20 ±0,40 15 ±2 2,90 ±0,40 17 ±2

1 2 3 4 5

3Н-РЯ2 (сц-адрено) 2,00 ±0,30 124 ±21 1,80 ±0,30 159 ± 18

3Н-ИМИ 1,40 ±0,20 1020 ±200 2,00 ±0,30 2450 ±340

3Н-(2Ш 0,30 ±0,04 980 ±120 0,50 ±0,06 2100 ±330

Анализ полученных данных показывает, что значения Ка при хроническом гепатите изменяются по сравнению с контролем незначительно. Наблюдается тенденция к снижению значения Втах для адренорецепторов. Значения В шах ДЛЯ МуС-кариновых рецепторов и рецепторов имипрамина возрастают в среднем в 2 раза, что свидетельствует о возможном участии серотонинергических и холинергиче-ских систем в патогенезе рассматриваемого заболевания, выраженном в гиперэкспрессии белков - рецепторов соответствующего типа.

Природа взаимодействия имипрамина и серотонина с лимфоцитами человека и характеристика этих типов рецепторов.

В ряде работ показано, что 5-ОТ в микромолярных концентрациях необратимо захватывается в синаптосомы крыс и тромбоциты человека, причем значения константы Михаэлиса Км процесса захвата находятся в пределах 2-50 мкМ. Известно также, что имипрамин и его аналоги ингибируют этот процесс с константой ингибирования К порядка нМ.

Было изучено влияние температуры и ионного состава среды инкубации на процесс взаимодействия 3Н-5-ОТ с лимфоцитами крови человека.

На взаимодействие 3Н-5-ОТ с лимфоцитами по механизму необратимого захвата может указывать высокий уровень специфического взаимодействия при- малых временах инкубации (2 мин) и уменьшение этого уровня при инкубации при 4°С. Взаимодействие 5-ОТ с лимфоцитами ингибируется ионами Са2+ и М%2* и не является Иа+ - чувствительным процессом. Все это, а также пониженный уровень . специфического взаимодействия 3Н-5-ОТ на лимфоцитах, в сравнении с тромбо-

цитами, указывает на то, что взаимодействие 'Н-5-ОТ с лимфоцитами, по-видимому, отличается по природе от описанного в литературе процесса обратного захвата 3Н-5-ОТ на тромбоцитах.

С целью выяснения природы взаимодействия 3Н-5-ОТ с лимфоцитами нами была изучена кинетика ассоциации 3Н-5-ОТ с интактными лимфоцитами и мембранами лимфоцитов, полученными путем осмотического шока клеток с последующим лизисом или путем многократного замораживания и оттаивания клеток в жидком азоте.

Уровень специфического взаимодействия 3Н-5-ОТ на разрушенных клетках, полученных обоими способами, составлял лишь около 15% от уровня специфического взаимодействия 3Н-5-ОТ в концентрации 0,2 мкМ с интактными лимфоцитами после 5 мин. инкубации. Поскольку незначительное остаточное связывание на мембранах лимфоцитов может быть связано с существованием неспецифического связывания на разрушенных клетках, то полученные данные не противоречат высказанному предположению о существовании процесса обратного захвата 3Н-5-ОТ на лимфоцитах крови человека.

Как было отмечено ранее, процесс обратного захвата 3Н-5-ОТ на лимфоцитах чувствителен к изменению температуры.

Рис. 3. Кинетика взаимодействия 3Н-5-ОТ с лимфоцитами. Кривая 1 - кинетика ассоциации 3Н-5-ОТ с лимфоцитами, 37°С.

Кривая 2 - то же в присутствие 10 мкМ немеченого имипрамина.

Кривая 3 - кинетика диссоциации 3Н-5-ОТ в присутствии 10 мкМ немеченого имипрамина. Кривая 4 - то же в присутствие 10 мкМ немеченого серотонина.

Кривая 5 - кинетика диссоциации 3Н-5-ОТ, инициированная методом разбавления. Кривая 6 - кинетика ассоциации 3Н-5-ОТ с лимфоцитами, 4°С.

Условия: концентрация 3Н-5-ОТ - 0,2 мкМ.

На рис. 3 приведены кинетические кривые ассоциации 3Н-5-ОТ на лимфоцитах при 37°С (кривая 1) и при 4°С (кривая 6). Общий вид кривых ассоциации свидетельствует о том, что уровень связывания 5-ОТ с лимфоцитами выходит на насыщение после 2-5 мин. инкубации.

Поскольку имипрамин является ингибитором захвата 5-ОТ, была изучена кинетика взаимодействия 'Н-5-ОТ с лимфоцитами в присутствии 10 мкМ немеченого имипрамина (кривая 2). Видно, что кривые 2 и б удовлетворительно совпадают. В то же время резкое снижение уровня взаимодействия меченого лиганда с лимфоцитами при уменьшении температуры или добавлении имипрамина не является доказательством протекания процесса захвата 3Н-5-ОТ. Ключевым в данном случае является вопрос об обратимости взаимодействия 3Н-5-ОТ с лимфоцитами.

Для проверки обратимости взаимодействия 3Н-5-ОТ с лимфоцитами при малых временах инкубации (2-10 мин.) нами были получены кинетические кривые вытеснения меченого лиганда избытком (10~"М) немеченого имипрамина (кривая 3) и 5-ОТ (кривая 4). Радиоактивность при добавлении немеченого 5-ОТ уменьшается до уровня, соответствующего неспецифическому связыванию 3Н-5-ОТ с лимфоцитами, т.е. уровню включения метки при 4°С. Это свидетельствует о полной обратимости взаимодействия. Кривая вытеснения в присутствии 10 мкМ немеченого имипрамина (кривая 3) также выходит на уровень неспецифического связывания 5-ОТ, что указывает на конкурентный характер процесса взаимодействия этих лигандов с центром связывания. Уровень остаточной радиоактивности при инициировании диссоциации путем разбавления (кривая 5) и путем добавления избытка немеченого 5-ОТ (кривая 4) удовлетворительно совпадают, что свидетельствует об отсутствии кооперативных эффектов в изучаемой системе.

Таким образом, полученные данные указывают на то, что взаимодействие 3Н-5-ОТ с лимфоцитами является обратимым, насыщаемым, зависящим от темпе-

ратуры процессом, причем имипрамин является конкурентным ингибитором этого связывания.

В дальнейшем представляло интерес определение параметров специфического связывания 3Н-5-ОТ и изучение влияния имипрамина на это связывание.

На основании полученных данных, нами были определены следующие параметры рецепторного связывания 3Н-5-ОТ на лимфоцитах: константа диссоциации Kd = 150 ± 20 нм, максимальная концентрация центров связывания Вт«х = 2300 ± 300 фмоль/мг белка. Имипрамин вытесняет 3Н-5-ОТ с мест связывания на лимфоцитах с 1Сзо = 280 ± 30 нМ.

Характеристика бензодиазепиновых рецепторов лимфоцитов человека.

Для решения задачи идентификации типа БД рецепторов на лимфоцитах человека был использован метод конкурентного вытеснения. В качестве меченого лиганда был взят 3Н-флунитразепам, который связывается как с центральными, так и с периферическими рецепторами БД. В качестве немеченых вытесняющих агентов были взяты: специфический антагонист центральных рецепторов Ro 1151788, селективный лиганд периферических рецепторов Ro 5-5864 и диазепам-лиганд обоих типов рецепторов.

Рис. 4. Вытеснение 3Н-флунигразепама (9 нМ) на лимфоцитах человека: 1 - Ro 5-4864; 2 - диазепамом; 3 - Ro 15-1788.

На рис. 4 представлены результаты этих исследований. Установлено, что ли-ганд Ro 15-1788 практически не вытесняет 3Н-флунитразепам с лимфоцитов. Периферический агонист Ro 5-4864 наиболее активно конкурирует с 3Н-флунитразепамом-1С5о - 90 нМ. Лиганд диазепам вытесняет 3Н-флунитразепам подобно Ro 5-4864 с IC5o = 120 нМ.

Полученные данные позволяют отнести бензодиазепиновые рецепторы лимфоцитов к классическому периферическому типу.

Поскольку на клетках крови человека нами установлено наличие периферического типа бензодиазепиновых рецепторов, представляется интересным охарактеризовать эти центры, используя селективные лиганды: агонист 3H-Ro 5-4864 и антагонист 3H-PK 11195.

Анализ изотерм специфического связывания 3H-PK 11195 с интактными лимфоцитами и мембранами лимфоцитов в координатах Скэтчарда показал, что зависимость имеет линейный характер. Следовательно, процесс рецепции описывается моделью, учитывающей наличие одного типа центров связывания. Равновесные константы диссоциации (Кд) имеют сходные значения для интактных лимфоцитов и их мембранных препаратов. Для мембран лимфоцитов Кд = 110 нМ, для интактных лимфоцитов Кд = 16 нМ. Максимальные концентрации центров связывания (Вм) 3Н-РК 11195 для мембран лимфоцитов и интактных клеток равны 3940 фмоль/мг белка и 2400 фмоль/мг белка соответственно. При изучении связывания 3H-Ro 5-4864 с лимфоцитами анализ изотерм специфического связывания в координатах Скэтчарда также выявил существование только одного типа центров связывания с Кд - 55 нМ и Вм = 1400 фмоль/мг белка. Мембранные препараты лимфоцитов, получаемые в ходе разрушения клеток, не содержат рецепторов селективного лиганда 3H-Ro 5-4864. Вероятно, при разрушении клеток происходит их инактивация.

Таблица 6

Характеристика связывания селективных лигандов периферических бензодиазепиновых рецепторов с препаратами лимфоцитов человека.

Лиганд 3H-Ro 5-4864 3Н-РК 11195

Кд, нМ Вм, фмоль/мг белка Кд, нМ Вм, фмоль/мг белка

интактные лимфоциты 55 1400 16 2400

мембраны лимфоцитов ~ нет связывания нет связывания 10 3940

Таблица 6 отражает характеристики связывания селективных лигандов периферических бензодиазепиновых рецепторов с препаратами лимфоцитов человека.

Сравнивая характеристики связывания периферических лигандов с бензодиа-зепиновыми рецепторами лимфоцитов, можно сделать предположение, что 3Н-РК 11195 и 3H-Ro 5-4864 взаимодействуют с двумя различными подтипами рецепторов. Сделав такое предположение, важно было изучить влияние ГАМК и ГАМК-ергических лигандов на связывание 3Н-РК 11195 и 3H-Ro 5-4864 с рецепторами интактных лимфоцитов.

ГАМК-ергические лиганды (+)баклофен и (-)баклофен давали различные эффекты. Введение в среду инкубации 5 мМ ГАМК увеличивало связывание агони-ста 3H-Ro 5-4864 в 2 раза и снижало связывание 3Н-РК 11195 на 30%. Стереоизо-меры баклофена незначительно влияли на связывание 3Н-РК 11195, в то время как (+)баклофен в 2 раза активировал связывание 3H-Ro 5-4864, в отличие от своего стереоизомера (-)баклофена.

В литературе обсуждается предположение о возможности регуляции периферических рецепторов бензодиазепинов ГАМК и ее функциональными аналогами in vivo. Результаты изучения влияния ГАМК и баклофена на связывание периферических бензодиазепиновых лигандов с лимфоцитами человека подтверждают

наше предположение о существовании двух различных подтипов периферических бензодиазепиновых рецепторов.

Таким образом, проведено исследование бензодиазепиновых рецепторов на препаратах лимфоцитов человека. Выявлена активация связывания селективного лиганда 'Н-Яо 5-4864 с лимфоцитами в присутствии ГАМК и (+)баклофена, а также показано отсутствие связывания этого лиганда с разрушенными методом гомогенизации и замораживания-оттаивания лимфоцитами в отличие от селективного лиганда 3Н-РК 11195. Установлено, что на лимфоцитах человека находятся бензодиазепиновые рецепторы периферического типа; 3Н-Ко 5-4864 и 3Н-РК 11195 взаимодействуют с различными подтипами этих рецепторов.

Синтез и исследование биологической активности новых производных хино-лина-перспективных блокаторов захвата серотонина.

Нарушение процесса захвата медиаторных моноаминов, в частности 5-ОТ, в синаптические окончания рассматривается как основная причина депрессивных состояний. Моделью синаптических окончаний, захватывающих 5-ОТ, служат тромбоциты периферической крови человека. На этой модели ведется также изучение процессов ингибирования захвата различными экзогенными веществами. Исследования показывают, что перспективными блокаторами захвата оказываются препараты полициклического ряда и, в частности, препарат квипазин (2-пиперазинилхинолин). Возникает предположение, что другие производные хино-лина могут активно блокировать захват серотонина. Нами впервые были синтезированы и испытаны ряд производных хинолина.

Активность изучавшихся соединений в отношении ингибирования захвата меченого тритием серотонина тромбоцитами периферической крови человека, выраженная величинами Ю50 (концентрация лиганда, снижающая захват 3Н-5-ОТ на 50%), представлена в таблице 4 по мере убывания. Из приведенных в таблице данных видно, что аномально высокой ингибирующей активностью в ряду хино-

лина, превышающей в 300 раз активность имипрамина, обладает описанный ранее 6-нитроквипазин (Шж).

У тиоморфолинового аналога 6-нитроквипазина [соединение (III в)] наблюдается снижение активности, которая даже ниже, чем у соединения (III а), не имеющего нитрогруппы (я 1.4 раза). Наличие метиленового фрагмента у соединения (III в) между тиоморфолиновым и хинолиновым остатками во 2-м положении приводит к практически полной потере активности. У 2-тиоморфолиновых производных хинолина активность оказалась несколько ниже, чем у имипрамина.

Сравнительно более высокой активностью, по сравнению с имипрамином, обладали производные 2-метил-6-метоксихинолина (6-метоксихинальдина), содержащие в 4-ом положении фрагменты: пиперидина (III и), пиперазина (III д) и тиоморфолина (III г). Соединения (III д) и (III г) показали практически одинаковую активность, которая выше активности имипрамина почти в 4 раза.

Ярко выраженную способность ингибировать захват 'Н-5-ОТ имеет метилированное производное (IV), описанного ранее фосфамидного производного кви-пазина (III з). Для соединения (IV) активность почти в 20 раз выше, чем у имипрамина. Таким образом, на основе полученных результатов и анализа литературных данных можно сделать заключение, что активности 2-замещенных хинолинов (соединения III а, б, в, ж) сильно зависят от природы циклического заместителя, в отличие от 4-замещенных (соединения III г, д, е). Введение электроноакцепторной группы в положение 6 хинолинового цикла не всегда существенно сказывается на ингибирующей способности 2-замещенных хинолинов. Резкое снижение активности у соединения (III б), по-видимому, вызвано отсутствием сопряжения азота циклического заместителя с бициклом хинолина. Существенное возрастание блокирующей способности соединения (IV), очевидно, связано с фосфорилированием азота пиперазинового цикла.

Таблица 7

Активность 2-,4- и 6-замещенных ряда хинолина и имипрамина по ингибированию захвата Н-5-ОТ тромбоцитами периферической крови человека

Название

Структурная формула

1См, нМ

1

1. 6-Нитроквипазин (Шж)

N 1МН

2. 1 -Метил-2-(4-(0,0-диэтил-1-пиперази-нил)амидофосфато)-хинолиний иодид (IV)

О

N N N — Р(-ОСгН5)2

| ф V—/

СНз

2.0

3. 2-Метил-6-метокси-

4-тиоморфолинохи-

нолин

(Шг)

НзСО,

N СНз

4. 2-Метил-6-метокси-4-(1 -пиперазинил)-хинолин гидрохлорид (Ше)

НзСО.

2НС1

N СНз

11

1 2 3

5. 2-Метил-6-метокси-4-пиперидинохинолин гидрохлорид (1"Д) 0 *2НС| Ы СНз 30

6. Имипрамина гидрохлорид П ' НС1 ^СНз 38

7.2-Тиоморфолинохи-нолин (Ша) ^^ О3 43

8. 6-Нитро-2-тиомор-фолинохинолин 61

9. га-Тиоморфолино-хинальдин (1116) > 1000*

* Захват 3н-5-ОТ максимально ингибируется на 33% при конц. 0116) 10 мкмоль/л.

Разработка новых методов противоопухолевой терапии Современный арсенал химиотерапевтических препаратов, используемых для лечения злокачественных новообразований, к сожалению, не обеспечивает достаточной степени избирательности в поражении опухолевых клеток, что приводит к развитию тяжелых осложнений в результате повреждения нормальных тканей и органов. В специальной литературе последних лет, посвященной разработке новых методов и лекарственных соединений для противоопухолевой терапии, можно отметить появление большого числа публикаций, посвященных изучению подходов, позволяющих существенно повысить избирательность действия таких лекарств с помощью так называемого направленного транспорта лекарственных препаратов с использованием моноклональных антител к раковоспецифическим антигенам. Избирательность действия таких препаратов определяется уникальностью набора поверхностных белков опухолевых клеток, взаимодействуя с которыми антитела, конъюгированные с токсинами или противоопухолевыми препаратами, будут индуцировать рецептор-опосредованный эндоцитоз и как следствие этого процесса транспорт лекарственных препаратов внутрь опухолевой клетки. Такие препараты на основе моноклональных антител получили название иммуно-токсинов. Помимо моноклональных антител для избирательной доставки противоопухолевых средств в клетку-мишень могут быть использованы некоторые факторы роста (фактор роста нервов, фактор роста эпидермия и др.), а также онкофе-тальный белок альфа-фетопротеин (АФП). Преимущество этого подхода заключается в том, что раковоспецифические антигены специфичны для каждого типа опухоли, а некоторые и, вообще, уникальны. Использование системы АФП-рецептор АФП для избирательной доставки противоопухолевых препаратов может оказаться особенно эффективной, поскольку скорость эндоцитоза АФП яв-

ляется достаточно высокой, а сам рецептор АФП представлен практически на всех типах опухолей.

Изучение действия конъюгатов фактора роста нервов с карбоксифосфамидом.

Фактор роста нервов (ФРН) - это низкомолекулярный димерный полипептид (м.м. 26,5 кДа), определяющий нормальное развитие и функционирование симпатических сенсорных и ряда центральных нейронов. Скорость эндоцитоза ФРН составляет порядка 0,3 - 3 фмоль/106 кл.ч. Повышенный уровень экспрессии рецепторов ФРН наблюдается, в частности, на клетках феохромоцитомы РС-12 (опухоль мозгового слоя надпочечников). С помощью растворимого карбодиими-да нами был синтезирован ковалентный конъюгат ФРН и алкилирующего цито-статического агента-карбоксифосфамида (КФА). Последний, как известно, в свободном виде проникает в клетки чрезвычайно плохо. Исследовалась цитотоксич-ность полученного конъюгата в отношении клеток феохромоцитомы РС-12 и клеточной линии мышиных фибробластов ЗТЗ. Как известно, в фибробластах ЗТЗ рецептор ФРН отсутствует. Как видно из рисунка 5 конъюгат ФРН-КФА в концентрации 50 нг/мл при инкубации с клетками в течение 4 часов на 50% блокировал пролиферативную активность клеток РС-12, не оказывая при этом эффекта на клетки ЗТЗ.

Включение Н тимидина (4 часа инкубации)

Жизнеспособность клеток (24 часа инкубации)

У.

100.

У.

100 _

РС12 ЗТЗ (ФРНР+) (ФРНР-)

РС12 ЗТЗ (ФРНР+) (ФРНР-)

ФРН-КФ ФРН-КФ ФРН-КФ ФРН-КФ

*- концентрация конъюгата ФРН-КФ соответствует 50 нг/мл

Рис. 5. Действие конъюгатов фактора роста нервов с карбоксифосфамидом на клетках РС-12 и ЗТЗ.

При инкубации в течение 24 часов конъюгат ФРН-КФА вызывал гибель почти 100% клеток РС-12, цитотоксический эффект на клетки ЗТЗ даже при длительной инкубации обнаружен не был. Следовательно, наблюдаемая нами транслокация в опухолевую клетку цитостатического препарата КФА в комплексе с ФРН осуществляется, по-видимому благодаря связыванию ФРН со специфическим рецептором на ее поверхности и последующему рецептор-опосредованному эндоци-тозу (рис. 6).

Связывание ФРН-КФ конъюгата Нет связывания

| Гибель клетки

Рис. 6. Модель взаимодействия конъюгатов фактора роста нервов с карбоксифосфамидом с клетками-мишенями

Однако, как мы упоминали выше, скорость эндоцитоза молекулы ФРН в клетку невелика. К тому же, количество опухолей, имеющих рецепторы ФРН ограничено. Все это не позволяет говорить о данном белке как об эффективном молекулярном векторе для целевой доставки противоопухолевых препаратов в клетки-мишени. Тем не менее на данном примере нами впервые была убедительно продемонстрирована возможность избирательной доставки противоопухолевого препарата КФА в клетку-мишень посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Выделение и изучение свойств клеточных рецепторов сывороточных белков трансферрина и а-фетопротеина.

Для выделения и изучения АФПР и ТФР был разработан общий метод очистки мембранных белков-рецепторов из тканей человека, который включает четыре этапа: 1- гомогенизация ткани; 2 - тщательное отмывание тканей от эндогенных лигандов; 3 - солюбилизация рецепторов с помощью цвиттерионного детергента CHAPS; 4 - выделение индивидуальных белков-рецепторов, осуществляемое с помощью аффинной хроматографии, при которой в качестве аффинного сорбента используется связанный с сефарозой природный лиганд рецептора. При использовании данного метода возможно одновременное выделение рецепторов различных лигандов из одной порции ткани при последовательной аффинной хроматографии солюбилизированного препарата на колонках с различными сорбентами.

После выделения и очистки АФПР диализовали против PBS и анализировали с помощью электрофореза в 7% ПААГ и в градиентном электрофорезе 5-20% при различных условиях.

Было показано сходство электрофоретических характеристик АФПР. выделенного из эмбриональной ткани и АФПР из ткани рака молочной железы.

Анализ молекулярной массы рецептора проводился также методом гель-фильтрации в FPLC системе (Pharmacia) на колонке Superóse-12.

С помощью иммуноферментного анализа продемонстрировано специфическое связывание выделенных и очищенных препаратов АФПР с АФП, конъюгиро-ванным с пероксидазой хрена.

Рецептор трансферрина выделяли из плаценты человека. Первой стадией очистки была гомогенизация ткани и тщательная отмывка ее от растворимых белков, в том числе от эндогенного трансферрина. Далее гомогенат солюбилизирова-ли в цвиттерионном детергенте CHAPS, белки осаждали при 50%-ом насыщении

сульфатом аммония и после перерастворения в гомогенизационном буфере наносили на аффинную колонку с ТФ-сефарозой. Для избирательной элюции ТФР были использованы условия, при которых осуществляется взаимодействие рецептора с ТФ и с трехвалентным железом при переносе железа в клетку ТФ, а именно после отмывания колонки от несвязавшихся белков экстракта.

С помощью электрофореза показано, что в полученном препарате белка ТФР составляет приблизительно 98%.

Функциональную активность выделенного ТФР оценивали по его способности связывать 1231-меченный трансферрин. Константа диссоциации комплекса рецептора с трансферрином по данным анализа составила 6 х 10-® М, что соответствует данным, приведенным в литературных источниках (G.J.Andersen и соавт.).

Таким образом разработан метод выделения препарата ТФР из плаценты человека, позволяющий получить высокоочищенный препарат ТФР, выход которого превышает получаемый с использованием ранее описанных методов приблизительно в 5 раз.

Разработка новых лекарственных соединений противоопухолевой терапии на основе конъюгатов g-фетопротеина и его рецептора.

К главным преимуществам использования факторов роста и онкофетальных белков в качестве векторов относится достаточно высокий уровень экспрессии их рецепторов во многих опухолевых тканях, практически полное отсутствие имму-ногенных свойств, высокая аффинность к рецепторам, доступность клонированных генов для получения рекомбинантных белков.

Выбор в качестве молекулы-вектора а-фетопротеина объяснялся тем, что рецепторы этого белка значимо представлены на опухолевых клетках независимо от типа опухоли. На нормальных и медленно пролиферирующих клетках взрослого организма рецепторы АФП экспрессируются крайне незначительно. Скорость внутриклеточного эндоцитоза АФП составляет порядка 200 фмолъ/106 кл.ч., что

почти втрое превышает скорость эндоцитоза фактора роста эпидермия. В экспериментах in vitro и in vivo достоверно установлен факт избирательной внутриклеточной интернализации данного онкофетального белка опухолевыми клетками человека различного происхождения.

Получение конъюгатов g-фетопротеина с различными биологически активными соединениями и разработка способов направленного транспорта конъ-югатов в клетки-мишени.

Нами были разработаны методы синтеза и получены биологически активные

в отношении опухолевых клеток конъюгаты АФП человека с девятью противоопухолевыми препаратами: блеомицетином, винбластином, дауномицином, док-сорубицином, калихемицином, карбоксифосфамидом (метаболитом циклофосфа-на), метотрексатом, хлорбутином и цисплатиной. Препараты конъюгатов АФП с . винбластином, доксорубицином и калихемицином приготовлены в количествах, достаточных для изучения их биологических свойств и проведения испытаний на животных.

120

100 1000

120 10080 60 40200

I ПИИ—ПТШТ-1 I 1MB—птпп

10 100 1000 10000

Рис. 7. Ингибирование пролиферации опухолевых клеток линий К562 (а),

(ЗОБ (б), 1т 9 (в), вКОУЗ (г) коныогатами АФП-ДР с соотношением АФП-.ДР 1:3 (1), 1:5 (2), 1:8 (3), 1:21 (4) и свободным ДР (5). По оси абсцисс - концентрация ДР, нМ, по оси ординат - выживаемость, %

Способность конъюгатов АФП с доксорубицином ингибировать пролиферацию раковых клеток в зависимости от концентрации препарата была изучена in vitro на панели опухолевых линий клеток человека различного происхождения: эпителиальных - карциномы яичников, молочной железы, шейки матки; нейро-нальных - нейробластомы, лимфоидных - Т- и В-клеточных лимфом. Ингибирова-ние пролиферации носило дозозависимый характер (рис. 7).

Цитотоксическую активность конъюгатов оценивали по IC511 - концентрации препарата, вызывающей гибель 50% от общего числа клеток. В таблице 8 представлены значения ICso для конъюгата с соотношением АФП: доксорубицин 1:5 и для свободного доксорубицина.

Таблица 8

Цитотоксичность конъюгата с соотношением АФП:ДР 1:5 для разных

линий опухолевых клеток, оцениваемая по IC50.

Опухолевые линии IC50, нМ

Доксорубицин Конъюгат АФП-доксорубицин

QOS ' 50 10

К 562 700 80

1ш9 150 20

SK.OV3 200 20

MCF-7 150 40

HeLa 400 70

IMR-32 70 2

Известно, что в стандартных условиях инкубации клеток с конъюгатами, описанных в материалах и методах, со временем может происходить деградация как самого антибиотика, так и связи, соединяющей АФП с антибиотиком, под действием температуры, факторов сыворотки и продуктов жизнедеятельности самих клеток. Для того, чтобы показать, что цитотоксическая активность конъюгатов вызвана не отщепившимся антибиотиком, а антибиотиком в составе конъюга-

та, который проник внутрь клетки в результате интернализации, были проведены эксперименты с инкубацией опухолевых клеток с конъюгатами в течение 1 часа, после чего клетки тщательно отмывали, добавляли свежую культуральную среду, не содержащую конъюгат, и инкубировали в ней в течение 72 часов. В качестве примера был выбран конъюгат АФП с ДР с соотношением АФП:ДР 1:9, а в качестве модели - клетки карциномы молочной железы линии МСИ-7 и карциномы шейки матки линии НеЬа. Ингибирование носило дозозависимый характер; значение Ю50 составило 0,75 мкМ для конъюгата и 2 мкМ для свободного ДР в случае МСР-7, и, соответственно, 0,45 мкМ и 1,5 мкМ для клеток НеЬа. Полученные результаты свидетельствуют о том, что причиной цитотоксического эффекта, вызываемого конъюгатами АФП с противоопухолевыми антибиотиками, является сам конъюгат, а не отщепившийся от него препарат.

Таким образом, показано, что для всех исследованных конъюгатов их цито-токсическая активность пропорциональна концентрации конъюгатов и длительности их контакта с клетками.

Исследование механизма действия конъюгатов АФП с противоопухолевыми препаратами на опухолевые клетки.

Известно, что основной молекулярной мишенью действия противоопухолевых препаратов в клетке является молекула ДНК. Поэтому на первом этапе исследований мы изучили способность конъюгатов АФП с доксорубицином индуцировать повреждения ДНК в клетках карциномы яичника человека линии БКОУЗ и в клетках карциномы яичника человека линии ЗКУЬВ, полученной из линии 8КОУЗ при селекции по устойчивости к винбластину и обладающей высокой устойчивостью к антрациклиновым антибиотикам, благодаря высокому уровню экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости шс1г 1. Полученные данные представлены в таблице 9 и из них следует, что действительно инкубация клеток с конъюгатами АФП-ДР, также как и при действии свободного ДР, приводит к на-

коплению повреждений ДНК в клетках, причем их выживаемость обратно пропорциональная количеству индуцированных повреждений ДНК. Таким образом, мишенью действия конъюгата АФП-ДР, как и свободного ДР, является ДНК клеток.

Таблица 9.

Уровень повреждений ДНК в клетках линии 8КОУЗ и вКУЬВ после инкубации со свободным ДР и конъюгатом АФП-ДР в % от контроля

Клетки Препарат, мкг/мл Время инкубации, ч Выживаемость, % Повреждение ДНК, %

SKOV3 ДР 0,3 24 60 28

АФП-ДР 0,3 24 40 66

SKVLB ДР 2,0 1 80 33

АФП-ДР 2,0 1 65 51

ДР 1,0 24 90 27

АФП-ДР 1,0 24 65 40

Наличие рецепторов АФП на опухолевых клеточных линиях, используемых нами дои оценки биологических свойств конъюгатов АФП с противоопухолевыми препаратами регистрировали с помощью флуоресцентно-меченных с помощью ФИТЦа препаратов АФП на проточном цитофлуйриметре-сортировщике клеток EPICS-C. Для этого клетки инкубировали с ФИТЦ-АФП на холоду (+4°С) в течение 1 часа, отмывали холодным раствором PBS с 0,11% азида натрия и измеряли интенсивность флюоресценции на EPICS-C. Для оценки способности клеток к поглощению конъюгатов в результате эндоцитоза клетки инкубировали с ФИТЦ-АФП в течение 1 часа при 37°С и после отмывания измеряли интенсивность их флюоресценции. Полученные результаты приведены на рисунке 8.

а

б

в

á

80 "i

1

JÜitk,

40"

—037 °С

Ж

о ^

■•4 °С

О 3,5 7,5 15

30

Рис. 8. Связывание меченого ФИТЦ АФП человека с клетками карциномы яичника человека линии SKOV3 при 4°С (А) и 37°С (Б) и интенсивность связывания и накопления ФИТЦ-АФП в клетках в зависимости от концентрации конъюгата (Б).

Далее, используя флуоресцентные свойства ДР, было прямо показано накопление ДР в клетках в процессе инкубации с конъюгатом АФП-ДР. Для этого клетки QOS предварительно промывали трижды фосфатно—солевым буфером (PBS) и помещали суспензию клеток в PBS (10® клеток/мл) в термостатируемую кювету спектрофлуориметра (Jasco) объемом 1 мл. После добавления доксорубицина в свободном виде и в виде конъюгатов с АФП измеряли начальную флюоресценцию ДР (возбуждения 473 нм, эмиссии 556 нм) и инкубировали при 37°С необходимое время. После инкубации суспензию клеток центрифугировали, осадок лизировали 0,1% раствором додецилсульфата натрия (SDS) и измеряли флюоресценцию. Количество накопленного клетками доксорубицина оценивали в процентах от первоначальной флюоресценции (время 0) или в пикомолях ДР/106 клеток, используя калибровочную кривую зависимости флюоресценции ДР от его концентрации, носящую линейный характер. Полученные результаты представлены на рис.9.

1000

200 -

400-

600 "

800 -

Рис. 9. Накопление ДР в клетках лимфобласто мы QOS.

1 - преинкубация 1 час с ДР,

2 - преинкубация 1 час с конъюгатом АФП-ДР с соотношением 1:8

0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0

Показано, что при инкубации опухолевых клеток с доксорубицином в свободном виде и в виде конъюгата с АФП, более эффективно происходило накопление ДР внутри клеток при использовании конъюгатов. Внутриклеточная концентрация ДР повышалась пропорционально времени инкубации клеток с ДР и конъ-югатами АФП-ДР. Наблюдалось также зависимость накопления ДР в клетках от концентрации ДР в инкубационной среде.

Проведенные исследования механизма действия конъюгатов позволяют заключить, что при действии конъюгатов АФП с противоопухолевыми препаратами не меняется молекулярная мишень действия противоопухолевых препаратов, а их накопление и биологическое действие осуществляется в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Лабораторные испытания препаратов на экспериментальных животных.

Исследование противоопухолевой эффективности конъюгатов АФП с вин-бластином на модели перевиваемых опухолей мышей.

Для исследования противоопухолевого действия ВБ его как в чистом виде,

так и в составе конъюгатов, вводили в суточной дозе 7 - 200 мкг/ кг ежедневно в течение 6 суток. Суточная доза АФП составляла 1,4 мг/кг веса. При в/в и в/б введении препаратов здоровым мышам в указанных дозах не обнаружено ни токсических реакций, ни некротических или атрофических изменений внутренних органов (желудка, селезенки, печени, почек).

Полученные данные позволяют констатировать, что конъюгаты человеческого АФП с ВБ обладают более высокой терапевтической активностью, чем свободный ВБ. Особенно высока терапевтическая активность конъюгатов при лечении мышей с привитой опухолью линии L1210. На этой модели была изучена зависимость увеличение средней продолжительности жизни мышей с привитой опухолью от дозы препаратов (рис. 10).

•2

Рис. 10. Увеличение средней продолжительности жизни мышей с привитой солидной опухолью Ы 210 при лечении свободным ВБ (I) и конъюгатом АФП-ВБ (2). Препараты вводились п/к.

- 40

1

О

о

50 100 150 200 250

Показано, что конъюгаты АФП с ВБ обладают более высокой терапевтической активностью, чем свободный препарат в широком диапазоне исследованных концентраций: от 7.5 до 200 мкг/кг веса животных.

В случае лейкоза Ы210 наибольшее увеличение срока выживания отмечено для группы мышей, которым подкожно вводили конъюгат ВБ-АФП. У всех животных из этой группы на 5-6 сутки после начала лечения появлялись некротические изменения солидной опухоли, достигавшей к этому времени объема 0.2-0.3 см3. В течение последующих 4-5 суток происходило отмирание опухолевой ткани с образованием на ее месте открытой невоспаляющейся раны, которая затем зарубцовывалась, но на 10-15 сутки начиналось развитие новой солидной опухоли по периферии образовавшегося рубца. Это свидетельствует о необходимости повторных поддерживающих курсов терапии при использовании данного конъюгата с интервалом (для данной модели) не более 3 суток.

Исследование противоопухолевой эффективности конъюгатов АФП с доксо-рубицином на модели перевиваемых опухолей мышей.

Для исследования противоопухолевого действия ДР его как в чистом виде,

так и в составе конъюгатов, вводили в суточной дозе 140 мкг/кг. Суточная доза АФП составляла 2,1 мг/кг веса.

Для оценки терапевтической активности препаратов в отношении солидных опухолей, полученных при п/к введении мышам опухолевых клеток линий Р388 и

1Л210 в область спины, использовали только подкожный способ введения лекарственных форм, а для оценки эффективности препаратов в отношении, опухолей, полученных при п/к введении опухолевых клеток линии Эр2/0 и В16 использовали подкожный или внутривенный способ введения препаратов.

Конъюгаты АФП с ДР обладают высокой терапевтической активностью при п/к способе введения, а в модели с меланомой В16 и при в/в введении препарата. При этом обнаружено (таблица 10), что у леченных конъюгатами ДР-АФП животных существенно меньше доля животных с развившимися опухолями, чем при лечении свободным ДР. Аналогичная закономерность обнаружена в модели с использованием линии Бр2/0 на 10 сутки после прививки опухоли (на 10 сутки у всех контрольных животных появились опухоли) и, соответственно на 9 сутки после начала лечения (рис. 11) как при п/к, так и при в/в введении препаратов, причем по этому показателю подкожное введение конъюгатов также оказалось более эффективным.

Таблица 10.

Противоопухолевая активность ДР и его конъюгатов с АФП при лечении солидной формы перевиваемой опухоли линии В16 при подкожном или внутривенном введении препаратов в дозе 140 мкг/кг по ДР.

Способ введения Препарат СПЖ УСПЖ Кол-во животных без опухолей, %

п/к Контроль 36 (36 - 36) - 0

ДР 51 (49 - 52) 13,9 33

ДР-АФП 51 (49 - 52) 13,9 66

в/в Контроль 38 (36 - 40) - 0

ДР 36,7 (27 - 40) -3,4 0

ДР-АФП 44 (22 - 50) 15,8 50

Кол-во животных

с опухолью 100 % 100%

подкожное внутривенное

введение введение

Рис. 11. Ингибирование развития опухолей после введения опухолевых клеток линии Sp 2/0 мышам линии Ва1Ъ/с при п/к и в/в введении конъюгата ДР-АФП. Данные получены на 10 сутки после введения опухолевых клеток, когда у 100% нелеченных животных развились опухоли и, соответственно, на 9 сутки от начала лечения.

Полученные результаты по противоопухолевой активности конъюгатов АФП с ВБ и ДР позволяют заключить, что терапевтическая активность противоопухолевых препаратов может быть значительно усилена при их введении животным в виде конъюгата с АФП.

Резюмируя результаты проведенных исследований можно заключить, что как в экспериментах на культурах опухолевых клеток in vitro, так и в экспериментах на модели перевиваемых опухолей мышей in vivo доказана эффективность использования АФП в качестве молекулы-вектора для направленного транспорта противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Впервые выявлены адренергические, холинергические, серотонинергиче-ские рецепторные системы на бронхоальвеолярных макрофагах человека и изучены их физико-химические параметры в "норме", при хронической пневмонии и туберкулезе. Показано, что при исследованных патологических состояниях легких изменения происходят в значениях максимальных концентрациях центров связы-

вания нейромедиаторов; сродство лиганда изменяется лишь для мускариновых рецепторов.

2. Получены значения физико-химических параметров рецепторов фактора активации тромбоцитов на бронхоальвеолярных макрофагах и бронхоальвеоляр-ных нейтрофилах человека. Определены характеристики воздействия фактора активации тромбоцитов на индукцию дыхательного взрыва в бронхоальвеолярных макрофагах и нейтрофилах. Выявлены различия в реактивности этих клеток и в составе фиксируемых радикальных продуктов дыхательного взрыва.

3. Определены характеристики широкого спектра рецепторных систем из биоптатов паренхимы легких человека в "норме", при раке легкого, хронической пневмонии и туберкулезе. Установлено, что изменения параметров рецепторных систем для бронхоальвеолярных макрофагов при хронической пневмонии и туберкулезе полностью идентичных изменениям, характерным для легочной ткани. Таким образом, показано, что макрофаги являются адекватной моделью, определяющей основные характеристики иннервации легочной ткани в "норме" и при патологии.

4. Выявлены различия в параметра а- и Р-адренергических, холинергических и серотонинергических рецепторных систем в биоптатах тканей печени человека в "норме" и при хроническом гепатите. Сродство соответствующих лигандов изменяется незначительно, в среднем в 2 раза возрастает концентрация центров связывания серотонинергических (имипраминовых) и холинергических рецепторов.

5. Показано, что меченый 3Н-серотонин (3Н-5-ОТ) специфически взаимодействует с лимфоцитами крови человека по типу обратимого, насыщаемого зависимого от температуры рецепторного связывания. Определены физико-химические параметры этого взаимодействия. Связывание 3Н-5-ОТ с лимфоцитами Иа*-нечувствительно, ингибируется ионами Са2+ и имипрамин ингибирует это связывание с 1Сзо на порядок выше соответствующего значения для тромбоцитов.

Взаимодействия 3Н-5-ОТ с лимфоцитами отличается по природе от процесса обратного захвата на тромбоцитах.

6. Проведено исследование бензодиазепиновых рецепторов на препаратах лимфоцитов человека. Выявлена активация связывания селективного лиганда 3Н-Ro 5-4864 с лимфоцитами в присутствии ГАМК и (+)баклофена. Установлено, что на лимфоцитах человека находятся бензодиазепиновые рецепторы периферического типа; селективные периферические лиганды 3H-Ro 5-4864 и 3Н-РК 11195 взаимодействуют с различными подтипами этих рецепторов.

7. Осуществлен синтез и оценена биологическая активность ряда производных хинолина в отношении обратного захвата 3Н-5-ОТ в тромбоциты человека. Выявлена высокая активность 5-препаратов. Полученные результаты позволяют рассматривать производные хинолина в качестве эффективных блокаторов захвата 3Н-5-ОТ, т.е. перспективных антидепрессантов.

8. Разработан универсальный метод выделения и очистки мембранных белков-рецепторов АФП и ТФ, основанный на использовании детергента CHAPS в качестве солюбилизирующего агента и аффинной хроматографии.

Использование нового метода позволило получить высокоочищенный препарат ТФР с молекулярной массой 180 кДа и Кд комплекса ТФР-ТФ, равной 5 х 10"9 М, выход которого превышает, получаемые с использованием ранее описанных методов приблизительно в 5 раз.

9. Получен конъюгат ФРН с карбоксифосфамидом, который обладал специфической токсичностью в отношении РС-12 клеток, несущих на своей поверхности рецепторы ФРН.

10. Разработанны методы синтеза и получены биологически активные в отношении опухолевых клеток конъюгаты АФП человека с девятью противоопухолевыми препаратами: блеомицетином, винбластином, дауномицином, доксоруби-цином, калихемицином, карбоксифосфамидом (метаболитом циклофосфана), ме-

тотрексатом, хлорбутином и цисплатиной. Препараты конъюгатов АФП с вин-бластином, доксорубицином и калихемицином приготовлены в количествах, достаточных для изучения их биологических свойств и проведения испытаний на животных.

11. Изучены биологические свойств конъюгатов АФП с противоопухолевыми препаратами на различных линиях опухолевых клеток человека. Показано, что для всех исследованных конъюгатов их цитотоксическая активность пропорциональна концентрации конъюгатов и длительности их контакта с клетками. ICso конъюгатов АФП ниже, чем свободных противоопухолевых препаратов.

12. Проведенные исследования механизма действия конъюгатов позволяют заключить, что при действии конъюгатов АФП с противоопухолевыми препаратами не меняется молекулярная мишень действия противоопухолевых препаратов, а их накопление и биологическое действие осуществляется в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза.

13. Показано, что конъюгаты противоопухолевых препаратов винбластина и доксорубицина с АФП обладают более высокой терапевтической эффективностью, чем свободный препарат в экспериментах по лечению перевиваемых солидных опухолей у мышей при региональном подкожном введении препаратов.

14. Резюмируя результаты проведенных исследований можно заключить, что как в экспериментах на культурах опухолевых клеток in vitro, так и в экспериментах на модели перевиваемых опухолей мышей in vivo доказана эффективность использования АФП в качестве молекулы-вектора для направленного транспорта противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. N.V.Porodenko, A.V.Karaulov, V.Yu.Katukov - Platelet-activating factor stimulates receptor-mediated formation of reactive oxygen intermediates in human monocytes - in.: Proceedings of IUPHAR Satellite Meeting "Advances in platelet-activating factor research", Paris, p. 49, 1990.

2. V.G.Shumilov, V.Yu.Katukov, N.V.Porodenko - Estimation of disturbances in the system of human neurotransmitter receptors using circulating cells as a model - in: Proceedings of XH-th Regional Meeting of Medical Center of Orlando, Orlando, USA, p. 12, 1991.

3. N.V.Porodenko, A.V.Karaulov, V.Yu.Katukov - The role of the platelet-activating factor in the induction of the oxidative burst in human neutrophils - in.: Proceedings of XV-th Congress of the European Academy of allergology and clinical immunology., Paris, p. 123, 1992.

4. T.Y.Kondratenko, I.V.Zacharova, N.V.Kuzina, V.Yu.Katukov, E.S.Severin, Z.Ch. Kornilova, M.I.Perelman - Alterations in human lung adrenergic receptors in cancer - Biochemistry and molecular biology international, v. 29, N. 1, pp. 123-130, 1993.

5. T.Y.Kondratenko, I.V.Zakharova, V.Yu.Katukov, N.V.Kuzina, E.S.Severin, Z.Ch. Kornilova, M.I.Perelman - The study of histamine HI- and H2-receptors in human lung cancer - Biochemistry and molecular biology international - 1993, v.31, N 3, pp. 399-404.

6. T.Y.Kondratenko, I.V.Zacharova, N.V.Kuzina, V.Yu.Katukov, E.S.Severin - The role of histamine Hl-receptors in the modulation of neurotransmitter receptors activity in human lung cancer - Biochemistry and molecular biology international. 1995, v.36, N 2, pp. 429-437.

7. Е.Ю.Москалева, А.В.Родина, А.О.Чижов, И.Е.Зыкова, В.Ю.Катуков, Р.На-кашьян, С.Е.Северин- Активные компоненты нового иммуномодулятора, стимулирующего противоопухолевую активность - Тезисы II Международ-ного конгресса "Иммунореабилитация и реабилитация в медицине", Анталия, Турция, 1996, №2, с. 288

8. Г.А.Посыпанова, И.И.Шмырев, В.Ю.Катуков, Р.Накашьян, С.Е.Северин - Разработка иммунощадящих методов химиотерапии онкологических заболеваний -Тезисы II Международного конгресса "Иммунореабилитация и реабилитация в медицине", Анталия, Турция, 1996, Ms 2, с. 289

9. В.К.Сологуб, И.А.Коромыслова, В.Ю.Каневский, В.Ю.Катуков, С.Е.Северин, И.Е.Зыкова, Р.Накашьян - Моноклональные антитела (МоАт) к альфа-фето-протеину (АФП). Возможность их использования для диагностики предраковых состояний - Тезисы II Международного конгресса "Иммунореабилитация и реабилитация в медицине", Анталия, Турция, 1996, № 2, с. 291.

10.А.Д.Кондратьев, Г.А.Посыпанова, И.И.Шмырев, В.Ю.Катуков, С.Е.Северин -Роль вторичных посредников в механизмах пролиферации и дифференцировки клеток нейронального происхождения - Тезисы научной конференции по функциональной нейрохимии, посвященной 85-летию со дня рождения Н.Н.Демина, Пущино, 1996.

П.Н.В.Породенко, В.Ю.Катуков - Рецепторы иммунокомпетентных клеток человека как модель рецепторов нейромедиаторов и нейромодуляторов головного мозга - Тезисы научной конференции по функциональной нейрохимии, посвященной 85-летию со дня рождения Н.Н.Демина, Пущино, 1996.

U.E.Yu.Moskaleva, G.A.Posypanova, I.I.Shmyrev, S.E.Severin, Yu.M.Luzhkov, V.Yu.Katukov, R.Nakachian, E.S.Severin - Alpha-fetoprotein-mediated targeting of anti-cancer drugs - the new strategy to overcome multidrug resistance of tumor cells -

The XXIV meeting of the International society for Oncodevelopmental biology and Medicine, 1996, Coronado, California, USA, p. 121. l3.S.E.Severin, N.B.Feldman, G.V.Finakova, A.A.Savitsky, I.V.Myagkikh, Yu.M. Luzhkov, V.Yu.Katukov, R.Nakachian, E.S.Severin - The antitumoral effect of al-pha-fetoprotein conjugates in vivo - The XXIV meeting of the International society for Oncodevelopmental biology and Medicine, 1996, Coronado, California, USA, p. 121.

l4.V.K.Sologub, S.E.Severin, I.A.Koromyslova, L.P.Pozdnyakova, M.E.Severina, Yu.M.Luzhkov, V.Yu.Katukov, R.Nakachian - Human alpha-fetoprotein receptor (AFPR). Monoclonal antibodies to AFPR, its application for diagnostic of cancer -The XXIV meeting of the International society for Oncodevelopmental biology and Medicine, 1996, Coronado, California, USA, p. 123. l5.S.E.Severin, E.Yu.Moskaleva, G.A.Posypanova, I.A.Koromyslova, I.I.Shmyrev, A.V.Krivonos, I.V.Myagkikh, N.B.Feldman, G.V.Finakova, V.Yu.Katukov, Yu.M. Luzhkov, R.Nakachian, J.Andreani, E.S.Severin - In vivo antitumor activity of cytotoxic drugs conjugated with human a-fetoprotein - Tumor Targeting. 1996, N 2, pp. 299-306.

16. E.Yu.Moskaleva, N.B.Feldman, G.V.Finakova, S.E.Severin, G.A.Posypanova, I.I.Shmyrev, A.V.Rodina, R.Nakachian, V.Yu.Katukov - Targeted delivery of antitumor drugs based on oncofetal protein alpha-fetoprotein - 5th European winter oncology conference, France, 1997, p. 59.

17.N.V.Porodenko, I.D.Bobruskin, G.A.Posypanova, V.Yu.Katukov, S.A.Lesnichuk, E.S.Severin - Benzodiazepine receptors on human blood cells as a pharmacological model - 5th international symposium on pharmaceutical sciences, Ankara, 1997, p. 26.

lS.V.Yu.Katukov, N.V.Porodenko, I.D.Bobruskin, S.A.Lesnichuk, I.V.Zaharova, N.V.Kuzina, E.S.Severin - Receptors of pharmacological agents - neuromodulators and antidepressants on human immunocompetent cells - 5th international symposium on pharmaceutical sciences, Ankara, 1997, p. 25.

19. Е.Ю.Москалева, А.В.Родина, С.Е.Северин, В.Ю.Катуков, И.Е.Зыкова, Н.Е. Лобзин, О.Н.Попова, И.И.Шмырев, Е.С.Северин - Исследование интернализа-ции альфа-фетопротеина опухолевыми клетками и лейкоцитами периферической крови человека методом проточной цитофлуориметрии - Второй съезд биохимического общества Российской Академии Наук, Пущино, 1997, с. 454455.

20.Е.И.Асташкин, Н.Д.Егорова, С.В.Елисеева, В.Ю.Катуков, С.Н.Лесничук, А.Н. Новикова, Н.С.Орехова, В.Е.Панфилов, О.Н.Смирнов, С.Н.Силуянова, Ю.Н. Хомяков, Н.А.Чибсиков, Е.Д.Чубарова - Исследование и оценка свойств новых веществ в рядах структурных аналогов лекарственных препаратов рецепторно-го механизма действия - Научно-технический отчет ММА им. Сеченова. 1997, 68с.

21.S.E.Severin, G.A.Posypanova, A.I.Sotnichenko, I.I.Shmyrev, E.Yu.Moskaleva, N.B.Feldman, G.V.Finakova, V.Yu.Katukov, Yu.M.Luzhkov, E.S.Severin, R.Nakachian, J.Andreani - Targeted delivery of esperamicine A1 by using oncofetal protein a-fetoprotein - The European cancer conference ECCO 9, 1997, 389.

22. И.В.Минаев, И.Е.Зыкова, В.Ю.Катуков, Е.А.Иванова, Н.М.Плотникова, А.Т. Чернышева, Т.А.Иванова, Н.Е.Лобзин, М.К.Иваненко, Н.Б.Златорунская, О.Н. Попова, Л.В.Соболевская, Е.А.Зверева, Т.П.Болдина - Диагностика рецептор-ных систем человека и оценка их состояния под воздействием факторов внешней среды" - Научно-технический отчет Всероссийского научного центра моле-

кулярной диагностики и лечения. 1997,176 с.

23.С.Е.Северин, Е.Ю.Москалева, И.И.Шмырев, А.В.Кривонос, В.Ю.Катуков, Ю.МЛужков, Р.Накашьян, Дж.Андреани, Е.С.Северин - Противоопухолевая активность конъюгатов цитотоксических препаратов с альфа-фетопротеином -Российский онкологический журнал. 1997, №4, с. 29-32.

24. С.А.Лесничук, В.Ю.Катуков, Н.В.Породенко - Природа взаимодействия ими-прамина и серотонина с лимфоцитами человека - Экспериментальная и клиническая фармакология. 1997, N¡6.

25.С.А.Лесничук, В.Ю.Катуков, Н.В.Породенко, Е.С.Северин -Характеристика бензодиазепиновых рецепторов лимфоцитов человека - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 1997, (в печати).

26.V.Yu.Kanevsky, L.P.Pozdnyakova, O.A.Aksenova, S.E.Severin, V.Yu.Katukov, E.S. Severin - Isolation and characterisation of AFP-binding proteins from tumor and fetal human tissues - Biochemistry and molecular biology international. 1997, v. 41, N6, pp. 1143-1151.

27.V.Yu.Kanevsky, L.P.Pozdnyakova, V.Yu.Katukov, S.E.Severin - Isolation of the transferrin receptor from human placenta - Biochemistry and molecular biology international, 1997. v. 42. N 2. pp. 309-314.

28. С.А.Лесничук, В.Ю.Катуков, Н.В.Породенко, Л.Н.Крюков, Е.А.Воронцов,

C.Л.Кузнецов, Н.В.Кузина, И.В.Захарова, И.Д.Бобрускин - Синтез и исследование активности производных хинолина по ингибированию захвата серотонина тромбоцитами крови человека - Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1998, № 1.

29. В.Ю.Катуков, Е.Ю.Москалева, Р.Накашьян, Г.А.Посыпанова, А.В.Родина, Е.С.Северин, С.Е.Северин, В.К.Сологуб, Н.Б.Фельдман, Г.В.Финакова, Фриас Пена Ж. - Модулятор клеточного иммунитета - Заявка на выдачу патента РФ №97103487/14(003778) от 14.03.97 г.

30. S.E.Severin, E.Yu.Moskaleva, V.Yu.Katukov, Yu.V.Belousova, A.V.Rodina, S.V.Lutsenko, S.G.Gumanov, I.I.Shmyrev and E.S.Severin - Efficiency of doxorubicin targeting in the form of conjugates with alpha-fetoprotein, epidermal growth factor and growth hormone - The XXVth Anniversary Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Switzerland, Tumor Biology, 1997, p. 45

31.S.V.Lutsenko, S.G.Gumanov, N.V.Gukasova, A.V.Rodina, V.Yu.Katukov,

D.A.Korzhenevsky and S.E.Severin - EGF: a vector for doxorubicin and vincristine delivery to target cells - The XXVth Anniversary Meeting of the International Soci-

ety for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Switzerland, Tumor Biology, 1997, p. 63

32.V.K.SoIogub, I.A.KoromysIova, L.V.Pozdnyakova, V.Yu.Kanevsly, V.Yu.Katukov and S.E.Severin - Study of antigenic determinants and the binding site for the human alpha-fetoprotein receptor using monoclonal antibodies - The XXVth Anniversary Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Switzerland, Tumor Biology, 1997, p. 104

33.S.V.Lutsenko, A.A.Savitsky, S.E.Gelperina, S.G.Gumanov, D.A.Korzhenevsky, V.Yu.Katukov, G.A.Posypanova, V.S.Lebedeva, A.F.Mironov and S.E.Severin -Study of possibility of targeted delivery of photofrine and chlorines e6 to tumor cells - The XXVth Anniversary Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Switzerland, Tumor Biology, 1997, p. 126

34. S.E.Severin, G.A.Posypanova, V.Yu.Katukov, I.I.Shmyrev, Yu.M.Luzhkov, G.K.Gerasimova, O.S.Zhukova, G.N.Vorozhtsov, O.L.Kaliya, E.A.Lukyanets, E.S.Severin - Antitumor activity of conjugates of the oncofetal protein alpha-fetoprotein and phthalocyanines in vitro - Biochemistry and Molecular Biology International. 1997, v. 43, N 5, pp. 1081-1089.

35.E.Yu.Moskaleva, G.A.Posypanova, I.I.Shmyrev, A.V.Rodina, E.L.Muizhnek, E.S.Severin, V.Yu.Katukov, Yu.M.Luzhkov and S.E.Severin - Alpha-fetoprotein-mediated Targeting - A new strategy to Overcome Multidrug Resistance of Tumor Cells in vitro - Cell Biology International - 1997 (in press).

Подписано в печать 22.12.97. Печать офсетная. Формат 60Х84'/н. Объем 3,0 п. л. Тир. 120 экз. Зак. 393.

ОАО «Чертановская типография» 113545, Москва, Варшавское ш., 129а